Summary
Мы описываем пошаговые инструкции: 1) эффективно инженер кишечных органоидов с помощью магнитных наночастиц для ленти- или ретровирусной трансдукции, и, 2) генерировать замороженные секции из инженерных органоидов. Этот подход является мощным инструментом для эффективного изменения экспрессии генов в органоидах для исследования эффектов ниже по течению.
Abstract
Кишечные органоидные культуры предоставляют уникальную возможность исследовать кишечные стволовые клетки и биологии склепа in vitro, хотя эффективные подходы к манипулированию экспрессией генов в органоидах добились ограниченного прогресса в этой области. В то время как технология CRISPR/Cas9 позволяет точно редактировать геном клетки для генерации органоидов, эта стратегия требует тщательного отбора и скрининга путем анализа последовательности, что является одновременно трудоемким и дорогостоящим. Здесь мы предоставляем подробный протокол для эффективного вирусного трансдукции кишечных органоидов. Такой подход является быстрым и высокоэффективным, что сокращает время и расходы, присущие технологии CRISPR/Cas9. Мы также представляем протокол для генерации замороженных участков из нетронутых органоидных культур для дальнейшего анализа с иммуногистохимическим или иммунофлуоресцентным окрашиванием, которое может быть использовано для подтверждения экспрессии генов или замалчивания. После успешного трансдукции вирусных векторов экспрессии генов или замалчивания, кишечные стволовые клетки и функции крипты могут быть быстро оценены. Хотя большинство органоидных исследований использовать в пробирке анализы, органоиды также могут быть доставлены мышам для in vivo функциональный анализ. Кроме того, наши подходы являются выгодными для прогнозирования терапевтических реакций на наркотики, потому что в настоящее время доступны терапии обычно функции модуляции экспрессии генов или белковой функции, а не изменения генома.
Introduction
Способность к культуре мыши или человека склепы клеток, как трехмерные (3D) органоидов из тонкого кишечника или толстой кишки в течение длительных периодов времени при условии крупного прорыва, потому что эти культуры отображают определяющие особенности кишечного эпителия in vivo 1 , 2 , 3. Органоиды, полученные из первичных склепов, способны к самообновлению и самоорганизации, демонстрируя клеточные функции, аналогичные их тканям происхождения. Действительно, органоиды резюмируют не только структурную организацию склепов in vivo, но и многие молекулярные особенности, обеспечивая тем самым полезные инструменты для изучения нормальной биологии и состояния болезней. Чтобы проиллюстрировать, органоидные исследования выявилиновые молекулярные пути, участвующие в регенерации тканей 1,2,3,4,5, а также препараты, которые могли бы улучшить функцию в патологическихусловиях 6,7.
Изучение кишечных стволовых клеток представляет особый интерес, поскольку кишечная подкладка является одной из наиболее регенеративных тканей млекопитающих, обновляя себя каждые 3-5 дней, чтобы защитить организм от бактерий, токсинов и других патогенов в кишечные люмены. Кишечные стволовые клетки (ISCs) несут ответственность за эту замечательную регенеративную способность и, таким образом, обеспечивают уникальную парадигму для изучения функции стволовых клеток взрослых1,2. Линейные исследования экспериментов на мышах показали, что изолированные Lgr5-положительные стволовые клетки могут быть культивированы для генерации 3D-органоидов или «мини-кишки» в пробирке, где они тесно отражают свои аналоги in vivo. Органоидные культуры также могут быть получены из изолятов клеток кишечных склепов, состоящих из прародителей, МЦКов и клеток Панета, последние из которых составляют эпителиальные нишевые клетки in vivo. На самом деле, органоидная культура из первичных клеток кишечного склепа превратилась в относительно рутинную технику, которую легко реализовать в большинстве лабораторий с использованием широко доступных реагентов. Эта модель также поддается количественному анализу экспрессии генов с помощью РНК-секвенирования (РНК-Сек) и белков масс-спектрометрией, иммуногистохимией или иммунофлуоресцентным окрашиванием2,4,8. Кроме того, функциональная генетика может быть изучена с помощью усиления функции (переэкспрессия гена или экспрессии активирующего мутантного гена) или потери функции (заглушение гена или экспрессия мутанта потери функции) приближаетсяк2.
Важно отметить, что низкая эффективность и высокая токсичность стандартной плазмидной ДНК или вирусных протоколов трансдукции с полибреном остаются основным препятствием в этой области. Хотя технология CRISPR/Cas9 позволяет точно редактировать геном, этот подход требует многовремени выбора с последующим проверкой последовательности9. Здесь мы представляем протокол вирусной трансдукции для первичных кишечных органоидов, который оптимизирует доставку вирусных частиц путем спряжения к магнитным наночастицам и применения магнитного поля. Приводятся ключевые измененияв предыдущие протоколы 4,5,10,11,12,13 и рекомендации по повышению эффективности. Мы также описываем подход к созданию замороженных секций из нетронутых органоидов, культивированных в 3D матригель (отсюда называют подвал мембранной матрицы или матрицы) для дальнейшего анализа с иммуногистохимии или иммунофлуоресцентного окрашивания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол был одобрен Комитетом по уходу за животными и использованию медицинских учреждений Джонса Хопкинса (IACUC). Этот протокол изменяется из ранее опубликованных методов10,11,12,13.
1. Подготовка реагентов
- Приготовьте свежий 293T средний несколько часов вперед и теплой до 37 градусов по Цельсию в водяной бане, по крайней мере 10 минут перед использованием (Таблица 1).
- Подготовка плазмид ДНК2,13,14 для вирусной упаковки. (Таблица 2).
- Приобретите все остальные необходимые материалы(Таблицаматериалов).
2. Лентивирус или Производство ретровирусных частиц
- Почка эмбриона человека (HEK) 293T посев клеток (День 1)
- Приготовьте одно культовое блюдо 150 мм, покрыв 50 мкг/мл поли-Д-лисин, растворенный в фосфатном буферном сольнике (PBS; 10 мл/блюдо) на 1 ч при комнатной температуре (RT).
- Удалите фосфат буферный солен (PBS)/поли-D-лизин и промойте покрытую тарелку дважды с 5 мл PBS.
- Семена 293T-клеток (8'u201210 x 106) в среде 293T (таблица1) общим объемом 15 мл.
- Культура 293T клеток на ночь в стандартном инкубаторе культуры тканей (37 КК, 5% CO2).
- Трансфекция клеток HEK 293T (День 2)
- Выполните трансфекцию, как только клетки достигли 70-80% слияния (обычно около 24 ч после посева 8'u201210 х 106 клеток).
- Подготовка трансфекционной смеси с использованием эффективного подхода, такого как коммерческая киционическая липосома формулировка (Таблицы 1'u20122, Таблица материалов)2.
- Разбавленная лентивирусная ДНК строит12 (всего 24 мкг плазмидной ДНК, Таблица 2) в 1,2 мл трансфекционного среднего и инкубирует в течение 5 мин на РТ в 1,5 мл труб (Таблица материалов).
- Разбавить трансфекционный регент (36 л) в 1,2 мл трансфекционной среды(Таблицаматериалов) и инкубировать в 5-мл труб в течение 5 мин в соответствии с инструкциями производителя.
- Добавьте реагент лентивирусного реагента (шаг 2.2.2.1) к реагенту трансфекции (шаг 2.2.2.2) и аккуратно перемешайте, медленно трубачируя вверх и вниз, используя трубку 5 мл.
- Инкубировать смесь в течение 20 минут на RT.
- Аккуратно промыть 293T-клетки 5 мл трансфекционной среды и заменить 10 мл трансфекционного носителя.
- Добавьте ДНК-липидные комплексы (от шага 2.2.2.3) dropwise к среде 293T клеток и тщательно перемешайте носители в культурных блюдах, двигаясь в горизонтальном и вертикальном направлениях, чтобы обеспечить равное распределение ДНК-липидных комплексов в каждом блюде.
- Инкубировать в течение 6 ч в стандартном инкубаторе культурытканей (37 градусов по Цельсию, 5% CO 2).
- После инкубации, заменить средства массовой информации с 20 мл свежего вируса сбора среды (Таблица 1).
- Коллекция вирусов (Дни 3'u20125)
- Собирайте вирусные носители в трубках 50 мл и храните в холодильнике 4 градусов по Цельсию для дальнейшей концентрации.
- Замените 20 мл свежего вируса, собирающего среду каждые 24 ч и культуру за одну ночь (24 ч). Повторите сбор носителей в течение следующих 2 дней (Дни 4'u20125).
- Убедитесь, что общий объем среды, собранной после 5-го дня, составляет 60 мл (20 мл/день х 3 дня).
- Концентрация вируса (День 5)
- Центрифуге собранных носителей (60 мл) в течение 5 мин при 400 х г. Затем, пройти супернатант через фильтр (0,45 мкм поры), чтобы удалить любой клеточный мусор.
- Сосредоточьтесь на вирусе, добавив 15 мл фильтруемых вирусных носителей в центробежный фильтр (Таблица материалов). Центрифуга при 2500 х г в течение 15 мин при 4 градусах По цельсию. Поскольку вирус не может пройти через этот фильтр, он будет сосредоточен в верхней камере фильтра.
- Аспирировать поток через трубку (нижняя камера) и добавить еще 15 мл оставшихся вирусных супернатант средств массовой информации в тот же центробежный фильтр единицы. Центрифуга, как выше (2500 х г в течение 15 мин при 4 градусах Цельсия), чтобы сконцентрировать дополнительный вирус от супернатанта.
- Повторите процесс, используя тот же фильтр для 60 мл носителя с одной трансумции пластины до достижения желаемой концентрации (100 раз).
Примечание: Мы обычно концентрируем 60 мл носителей сбора вирусов до 600 евро. - Удалите концентрированный вирус из верхней камеры фильтра с помощью трубки 1 мл, затем аликот и храните в трубках 1,5 мл (50 х u201260 л/трубка) при -80 градусов по Цельсию для последующего использования. Храните концентрированные частицы в течение 6 кв201212 месяцев.
3. Изолирование склепов
- Эвтаназия мышей с использованием CO2 в соответствии с местными руководящими принципами IACUC.
- Поместите эвтаназии животное на спину и мыть живот, распыляя 70% этанола.
- Выполните продольное щелочное разрез от грудины до паха, сначала разрезая кожу, а затем подкожную ткань.
- Удалить тонкой кишки из желудка в cecum.
- Определение регионов, представляющих интерес в тонкой кишке; склепы могут быть изолированы от двенадцатиперстной кишки, jejunum и ileum.
- Используя шприц 10 мл, промыть изолированный тонкий кишечник с криптой диссоциации буфера (предварительно охлажденный PBS, содержащий 1 мМ дитиотрейтол (DTT), 1% пенициллин / стрептомицин (не Ca2 "и Mg2 ")в 10 см ткани культуры блюдо ( Таблица культуры блюдо (Таблица 1)
- Удалить периферийную жировую ткань и открыть или "филе" кишечной ткани продольно на стерильной стеклянной пластине (15 см х 15 см).
- Аккуратно соскребите кишечные эпителиальные виллы с помощью клеточного скребока.
- Разрежьте тонкой кишки на 2-20123 см длиной в длину разделы.
- Перенесите ткань в трубку 15 мл, содержащую предварительно охлажденные PBS с помощью плоских щипц (116 мм). Вымойте фрагменты ткани, энергично пожимая вручную в течение 30 с (перемещение трубки в противоположных направлениях 60 раз).
- Освежите PBS и повторите мыть, пока PBS становится ясно.
Примечание: Мы обычно мыть фрагменты 2'u20123 раз. - Инкубация ткани в 15 мл конической трубки, содержащей 10 мл крипторазового буфера(Таблица 1) в течение 10 минут при 4 c на орбитальной шейкер на средней скорости, как только PBS ясно.
- Энергично встряхните трубку вручную в течение 30 с (противоположные направления и 60 раз) и перенесите ткань с помощью плоских щипц в другую коническую трубку 15 мл, содержащую 10 мл буфера диссоциации склепа. Инкубировать эту фракцию на льду. Не используйте первую фракцию для органоидной культуры, потому что она содержит в первую очередь villi.
- Повторите шаги 3.11'u20123.13 для 3'u20124 раз, собирая каждую фракцию и помещая их на лед.
- Выберите фракцию, которая обогащается самым высоким процентом кишечных склепов путем сканирования 200 образцов Л Л из каждой фракции под перевернутым микроскопом (4x). Определите склепы по типичной морфологии, как описано ранее (Рисунок 1A)10.
ПРИМЕЧАНИЕ: Они будут появляться круглой или овальной формы и содержать гранулированные клетки Панета. В отличие от этого, вилли являются палец, как структуры, не хватает гранулированных клеток Paneth(Рисунок 1B). - Передайте выбранную фракцию через ситечко 40 мкм, чтобы при необходимости получить склепы аналогичного размера. Кроме того, изолировать lgr5 "стволовые клетки на основе цитометрии потока для зеленого флуоресцентного белка (GFP), если мыши пересекаются на фоне EGFP-Lgr5 "или другой подходящей модели, которая позволяет идентификацию lgr5 " клеток2.
- Подсчитайте общее количество склепов в выбранной фракции следующим образом.
- Пипетка 50 л выбранной фракции в гемоцитометр и подсчитывает количество склепов с помощью перевернутого светового микроскопа (4x). Поместите 100 склепов на скважину при использовании 48-хорошей пластины, чтобы обеспечить эксперименты по трансдукции, в которых скважины 3'u20126 будут транс-индуцированы в экспериментальном состоянии для заглушения генов или переэкспрессии.
- Основываясь на количестве склепов на 50 л, вычислите объем необходимого буфера диссоциации крипты и перенесите этот объем в трубку 1,5 мл.
Примечание: Например, подсчитываются 10 склепов на 50 л, для 300 крипто необходимы 6 х 50 л или 300 л.
- Центрифуги крипты в 1,5-мл труб на 300 х г в течение 5 мин.
- Тщательно отбросить супернатант, аккуратно pipetting от верхнего жидкого слоя и resuspend гранулы в 100 зл. фактор роста снижение подвале мембранной матрицы на льду(Таблица материалов).
- Семя матричных склепов в 37 градусов по Цельсию предварительно прогретые 48-хорошо пластины (30 л/ну, 100 склепов / хорошо). Инкубировать пластину в стандартном инкубаторе культуры тканей в течение 5'u201215 мин, чтобыобеспечить матричную геляцию (37 градусов по Цельсию, 5% CO 2).
- Наложить каждый гель с 250 qL органоидной культуры (ENR) среды (Таблица 1) и поместить 48-колодец пластин обратно в стандартный инкубатор культуры тканей (37 КК, 5% CO2). Проверьте культуры для организации склепа на маленькие, круглые, кистозные формы после 24 ч; почки сформируются через 220125 дней.
- Аккуратно заменяйте медиа-носители ENR каждые 3 дня. Удалите старые носители ENR с нежным всасыванием, заботясь не прикасаться к матрице при замене носителя.
- Прохождение органоидных культур каждые 4'u20127 дней, как ранее описано11.
4. Органоидная подготовка фрагмента
- Преобразуйте органоиды, как только они образуются (в течение 1 кв20122 недель) или после прохождения. Для одного эксперимента трансдукции, подготовить 2'u20123 скважин культивированных органоидов в 48-ну хорошо пластины в состоянии с 100"u2012200 органоидов / хорошо или 200'u2012600 органоидов в экспериментальном состоянии трансдукции.
- Обмен ENR с 250 Л трансдукционного носителя(таблица 1) и культуры в трансдукции средств массовой информации в течение 3 или более дней или до тех пор, пока органоиды принять кистозной морфологии. Включите ингибитор Wnt3a и ROCK (Y27632) в трансдукционную среду для увеличения количества стволовых и панетовых клеток; Никотинамид (Nic) повышает эффективность культуры (см. среду трансдукции в таблице1).
- Механически разрыв куполо-как подвальная мембранная матрима структуры со средствами массовой информации и трубчатый наконечник с помощью 1 мл трубки.
- Перенесите органоиды и носители в стерильную трубку 1,5 мл.
- Механически нарушить матрицу дальше, трубацией с 200 юл пипеткой 10-u201215 раз.
- Центрифуга органоидных фрагментов на RT на 500 х г в течение 5 мин.
- Откажитесь от супернатанта осторожно с помощью пипетки и resuspend гранулы в 1 мл DMEM / F12 среды (Таблица 1).
- Добавить Dispase I (6 л при 10 мг/мл) и DNase I (2,5 л при 10 мг/мл). Хорошо перемешать, аккуратно прокладав трубку, используя трубку 1 мл.
- Инкубировать органоиды при 37 градусах по Цельсию в течение 20 мин в трубке 1,5 мл.
- Добавьте 500 зЛ носителей ENR, чтобы прекратить реакцию диссоциации; сыворотка в ENR прекращает реакцию.
- Передайте органоидные клетки через 20 мкм клеточный ситечко и центрифугите органоидные фрагменты при 400 х г в течение 5 минут.
- Приостановить органоидные фрагменты с 150 йЛ трансдукционной среды(Таблица 1).
5. Генетическая инженерия органоидов или crypt клеток вирусной трансдукции
ПРИМЕЧАНИЕ: Посмотреть рисунок 2.
- Семена органоидных клеточных кластеров с 200 л трансдукции среднего / хорошо в 48-хорошо пластины и инкубировать в стандартном инкубаторе культуры тканей (37 КК, 5% CO2). Кроме того, поместите свежеизолированные клетки криптографических клеток (1000 склепов) в 200-й цЛ трансдукционной среды / хорошо в 48-хорошо пластины и инкубировать в стандартном инкубаторе культуры тканей (37 КК, 5% CO2).
- Оттепель флаконы вируса для трансдукции, позволяющие 50 евро концентрированного вируса для трансдукции каждой скважины в 48-ну хорошо пластины или 100 евро концентрированного вируса на хорошо в 24-наилучшим пластин.
- Инкубировать вирус с 12 л раствора магнитных наночастиц в течение 15 мин на RT в трубке 1,5 мл(таблица 3).
- Добавьте раствор магнитной наночастицы/вирусную смесь к клеткам, которые будут транс-индуцированы.
- Поместите пластину культуры клеток на магнитную пластину и инкубировать, по крайней мере 2 ч (и до 6ч) в стандартном инкубаторе культуры тканей (37 градусов по Цельсию, 5% CO 2).
6. Посев инфицированных фрагментов органоидов
- Перенесите зараженные кластеры органоидных клеток и трансдукционные носители из каждой скважины в трубку 1,5 мл.
- Центрифуга при 500 х г в течение 5 мин.
- Откажитесь от супернатанта нежным всасыванием и охладите трубку, содержащую гранулы на льду в течение 5 мин.
- Добавьте 120 кл. мембранной матрицы подвала и resuspend гранулы труба медленно вверх и вниз.
- Семя 30 капель мматрицно-клеточной смеси в новую 48-колодую пластину.
- Инкубировать пластину при 37 градусах По цельсии в течение 5'u20121in мин до тех пор, пока матрица затвердеет.
- Добавляйте трансдукционную среду к каждой скважине и инкубировать в стандартном инкубаторе культуры тканей в течение 3-х u20124 дней (37 градусов по Цельсию, 5% CO2).
- После 3-х 20124 дней, проверить культуры под легким микроскопом (10x), чтобы обеспечить организацию клеточных кластеров в органоидных структур. Затем аккуратно замените трансдукционные носители на среду 250 Л. ENR.
- Заменяйте средства массовой информации каждые 3-й день20124 дней.
7. Выбор (если применимо)
- После 2'u20123 дней, добавить соответствующие антибиотики или гормоны для отбора в трансдукции среды, если это необходимо.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали пуромицин (2 мкг/мл) для выбора лентивной трансдукции, потому что плазмиды укрывали ген сопротивления пуромицин2,14.
8. Подтверждение успешного трансдукции и экспрессии генов или замалчивания
- При использовании FUGW lentivirus2,14, оценка эффективности трансдукции путем измерения сигналов GFP с помощью флуоресцентного микроскопа или цитометрии потока.
- Проверка переэкспрессии гена или заглушения с помощью количественной обратной транскриптазной цепной реакции (РТ-ПЦР) для количественного сравнения мРНК в контрольных и экспериментальных органоидных культурах.
- Подтвердите уровень белка для белково-кодирующего выражения генов илизаглушения Западным пятном или иммуностоингом 2.
9. Органоидный криосекция в подвале Мембраны Матрица
ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите рисунок 3.
- Удалите ENR среды нежным всасыванием, стараясь не возмущать матрицу мембраны подвала и осторожно мыть один раз с 500 Зл Л PBS.
- Исправьте органоиды с 1,0 мл 4% параформальдегида (PFA) раствор(Таблица материалов) на RT в течение 30 мин.
- Удалить PFA путем всасывания, и осторожно мыть дважды с 1 мл PBS.
- Удалите PBS путем всасывания и добавьте 1,0 мл 30% сахарозного буфера к каждому образцу. Инкубировать фиксированные органоиды в сахарозе по 1 ч при 4 градусах по Цельсию в холодной комнате, холодильнике или на льду для обезвоживания образцов.
- Удалите сахарозу буфера всасывания и добавить достаточно встраивания соединения (Таблица материалов), чтобы покрыть матричного слоя (300 л /хорошо) в каждом колодце.
- Инкубировать на RT в течение 5 мин.
- Поместите образцы в морозильную камеру -80 градусов в течение 10 минут, или до тех пор, пока встраивающее соединение не станет твердым и белым.
- Поместите блюдо с замороженным встраивающим соединением на RT, чтобы обеспечить минимальное плавление соединения по краям. Используйте скальпель, чтобы отделить блок от стенок колодца.
- Удалите матричную встраивающую сяпонический блок с помощью щипц и поместите его в блок образца (например, криомольд), быстро работая, чтобы предотвратить таяние.
- Заполните форму полностью с встраиванием соединения и заморозить на -80 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
- Используйте блок для секции или хранения в морозильной камере -80 градусов по Цельсию для дальнейшего использования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы описываем быструю и высокоэффективную технику трансдукции, которая использует магнитные наночастицы, подвергающиеся воздействию магнитного поля, чтобы доставить лентивирус к клеткам, представляющим интерес. С легкодоступными инструментами, мы применили этот подход не только для преобразовывания свежеизолированных клеток крипто(рисунок 1A),но и для органоидов (Рисунок2)и других клеток, которые огнеупорные к более рутинным подходам transduction. Лентивирусные частицы могут быть легко сопряжены с магнитными наночастицами, а полученные в результате вирусно-наночастицные комплексы поставляются эффективно, применяя магнитное поле с помощью магнитной пластины. Чтобы оптимизировать этот подход, мы сначала протестировали лентивирусные векторы, связанные с GFP, таким образом, что GFP может быть использован для идентификации трансиндуцированных клеток с флуоресценцией микроскопии. GFP может быть визуализированна на каждом этапе в органоидном развитии, в том числе на раннем этапе, когда клетки склепа организуются в кистоподобные структуры(Рисунок 4A),или в более поздние моменты времени, когда органоиды образуют почки (Рисунок4B). Успешно трансиндуцированные кишечные органоиды могут затем пройти функциональный анализ для изменений в развитии путем окрашивания клеточных мембран и ядер, чтобы перечислить общее число клеток в дополнение к линейным маркерам, таким как лизозим для идентификации клеток Панета ( Рисунок 4C).
Генетически модифицированные органоиды могут быть использованы для дальнейшего анализа путем генерации замороженных секций, как указано здесь(рисунок 3). После встраивания органоидов, замороженные блоки могут храниться, а затем сечены для будущих исследований. Этот подход также эффективен (по оценкам, составляет 95% на основе процентной доли органоидов GFP (я) к общей органоидов). Этот подход может быть выполнен со стандартными лабораторными реагентами, обеспечивая тем самым ткани, которые поддаются различнымисследованиям, включая номер клетки, судьбу клеток, а также наличие и уровни конкретных белков 2. Например, мы использовали замороженные секции и иммунофлуоресцентное окрашивание для идентификации отдельных клеток и установления типа клеток(рисунок 4C).
Рисунок 1: Изолированные склепы и вилли с карикатурами, показывающими типичную морфологию. (A) Изолированные склепы образуют круглые или овальные структуры. (B) Вилли идентифицируются как палец, как структуры. Шкала бар 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Схема вирусного трансдукции органоидов с использованием магнитных наночастиц и воздействия магнитного поля. Показаны наиболее важные шаги протокола трансдукции. (A) Инкубировать вирус и раствор магнитных наночастиц в течение 15 мин на RT в 1,5 мл трубки. (B) Добавьте магнитные наночастицы/вирусную смесь к клеткам, которые будут транс-индуцированы. (C) Поместите пластину культуры клеток на магнитную пластину и инкубировать в течение 2 ч в стандартном инкубаторе культуры тканей. Можно также использовать более длительное время инкубации (No6 ч); представитель хорошо показано здесь, на магнитной пластине. (D) Клетка, трансдуцированная с помощью вируса и магнитных наночастиц показано. (E) Передача инфицированных кластеров органоидных клеток и трансдукции средств массовой информации от каждого хорошо в 1,5 мл трубки и центрифуги на 500 х г в течение 5 мин. Отбросьте супернатант с нежным всасыванием и охладить трубку, содержащую гранулы на льду в течение 5 мин. (F) Добавить 120 зл и подвальной мембранной матрицы и resuspend гранулы труба медленно вверх и вниз. (G) Семенные капли 30 qL, содержащие матричную клеточную смесь в каждую скважину в новой 48-хорошей пластине. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Схема замороженного сечения органоидов в 3D-матрице. Отображаются наиболее важные шаги протокола замороженного раздела. (A) Один хорошо в 24-хорошо плиты культуры клеток изображен. (B) Добавить достаточно встраивая соединение, чтобы покрыть матричного слоя (300 л/хорошо) и инкубировать на RT в течение 5 мин. (C) Поместите образцы при -80 C в морозильную камеру в течение 10 минут или до тех пор, пока встраивающее соединение не станет твердым и белым. Затем поместите блюдо на RT, чтобы обеспечить небольшое плавление по краям образца. (D) Используйте скальпель, чтобы отделить блок от стенок колодца. (E) Удалите матричной встраивающей сяграющий блок с помощью щипц и поместите в соответствующий неглубокий контейнер или плесень для замораживания тканей. Заполните форму полностью с встраиванием соединения (OCT). (F) Заморозить блок при -80 C в морозильной камере в течение 30 минут. (G) Блок готов для секции или хранения в -80 C морозильник для дальнейшего использования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Репрезентативные изображения трансиндуцированных кишечных органоидов. (A) Репрезентативное изображение малых кишечных органоидов под световым микроскопом, показывающих (слева) флуоресцентную микроскопию, и (справа) стандартную микроскопию трансгенной экспрессии (EGFP) на 3-й день после трансдукции. Шкала бар 50 мкм. (B) Пример переэкспрессии гена кодирования GFP в органоид после трансдукции с использованием магнитных наночастиц. Органоидные клетки были трансумциированы с лентивирусом, выражающим GFP (FUGW; Вверху) или лентивирусная переэкспрессия Hmga1 (FUGW-Hmga1; Внизу), как показано на 12-й день после трансдукции. Шкала бар 50 мкм. (C) Иммунофлуоресценция изображения формалина фиксированной замороженных раздел органоидов. Органоидные участки (4 мкм) были окрашены анти-изозим (красный), анти-EpCAM (зеленый) и DAPI (синий). EpCAM разграменяет границы клеток, DAPI указывает отдельные ядра, и лизозим пятна Paneth клеток. Шкала бар 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Органоидная культура среды (ENR) | 100 мл |
| DMEM/F12 | 96 мл |
| L-аланил-L-глютамин дипептид дополнение (например, Glutamax) | 1 мл |
| NEAA | 1 мл |
| Ручка/Стреп | 1 мл |
| ГЕПЕС | 1 мл |
| EGF (100 мкг/мл) | 5 зл |
| Ноггин (100 мкг/мл) | 10 зл |
| R-спондин (100 мкг/мл) | 10 зл |
| или R-спондин состояние среднего (CM) | 20 мл |
| Рекомбинантный инсулин человека (10 мг/мл) | 5 зл |
| Трансдукционная среда | 5 мл |
| ENR средний | 2,4 мл |
| Условие Wnt среднее (CM) | 2,5 мл л. |
| Никотинамид (1M) | 100 л |
| Y27632 (10 мкм) | 10 зл |
| Буфер диссоциации склепов | 100 мл |
| PBS (без Ca2", Mg2 ") | 99 мл |
| Ручка/Стреп | 1 мл |
| 0,5 м EDTA | 100 л |
| 0.1 M DTT (дитиотрейтол) | 100 л |
| 293T средний | 100 мл |
| DMEM | 90 мл |
| Fbs | 10 мл |
| Вирус Коллекция Средний | 100 мл |
| DMEM | 99 мл |
| Fbs | 1 мл |
| Буфер органоидного пищеварения | 1 мл |
| DMEM/F12 | 1 мл |
| Диспаза I (10 мг/мл) | 6 зл |
| Dnase I (10 мг/мл) | 2,5 л л |
Таблица 1: Средства массовой информации, используемые в протоколе.
| Пластины | 10 см | 15 см |
| Трансвектообразующий вектор лентивируса | 6 мкг | 9 мкг |
| CMV-R8.91 | 8 мкг | 12 мкг |
| Md. Г | 2 мкг | 3 мкг |
| Всего векторов | 16 мкг | 24 мкг |
Таблица 2: Количество плазмидной ДНК для трансфекции.
| Пластины | Магнитные бусы (Зл) | Объем вируса (КЛ) | Окончательный трансдукционный том (КЛ) |
| 48-ну хорошо | 6 | 50 лет | 250 г. |
| 24-ну а | 12 Лет | 100 | 500 |
Таблица 3: Объем раствора магнитного бисора и вектор.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Первичная культура эпителия кишечника у взрослых в качестве органоидов обеспечивает мощный инструмент для изучения молекулярных механизмов, участвующих в функции стволовых клеток, эпителиального гомеостаза кишечника и патологии1,2, 4. Хотя технология CRISPR/Cas9 может быть использованадля генетически инженерных органоидов 9, она ограничена необходимостью обширного скрининга и отбора на основе анализа последовательности для желаемых генетических изменений. Цель этого протокола заключается в предоставлении четких и кратких инструкций с видео-учебники для магнитной наночастиц доставки ленти- или ретровирус для кишечных органоидов, а затем замороженные секции для дальнейшего анализа.
Этот протокол является быстрым и эффективным методом генетически инженера кишечных органоидов и анализировать последствия генной переэкспрессии или глушиния из замороженных секций. Критические шаги изложены на рисунке 2, Рисунок 3. Эта стратегия позволяет исследует биологическое значение генетических изменений (переэкспрессия или глушитель) в кишечных стволовых клетках и их потомство культивируется в 3D условиях2,13. Мы также использовали эту магнитную наночастицу на основе доставки вирусных векторов для повышения передаваемого клеток и трансгенного экспрессии в пробирке в различных первичных клетках2,13.
При таком подходе вирусные частицы покрываются магнитными наночастицами и доставляются в клетки при воздействии магнитного поля. По сравнению с современными методами трансдукции, такими как полибрен с или без спинокуляции10,15, магнитные наночастицы-вирусные комплексы менее токсичны для клеток, потому что поглощение генетического материала опосредовано эндоцитозом и пиноцитоз, два естественных биологических процесса, которые не вызывают значительного повреждения клеточных мембран. Таким образом, повышается жизнеспособность клеток и эффективность трансдукции. Эффективность трансдукции может быть увеличена с помощью небольших фрагментов склепа или одиночных ячеек (см. шаг 4.8) вместо больших склепов или целых органоидов, как сообщалось ранее2,10,13,16. Магнитно управляемые поставки наночастиц приводит к быстрому накоплению, проникновению и поглощению вирусных векторов в клетки-мишени2,13. Магнитные наночастицы изготовлены из оксида железа, который полностью биоразлагается и покрыт специфическими запатентованные катионными молекулами. Связь наночастиц с вирусными вектором достигается за счет соляной коллоидной агрегации и электростатических взаимодействий. Затем наночастицы концентрируются на клетках внешним магнитным полем, генерируемым магнитной пластиной, помещенной под блюдом культуры. В то время как эффективность трансдукции приближается к 95%, не все клетки трансумции трансмодцированы, что является ограничением для этого метода. Кроме того, эндогенно выраженные гены интереса не изменяются, как с CRISPR/Cas9 подходов.
После переэкспрессии генов или заглушения, органоиды могут быть использованы для множества исследований, в зависимости от научных целей, включая анализ экспрессии генов, протеомные изменения в клетках или выделяемые клетками, метаболические изменения, и морфологические изменения. Как и в отношении живых тканей, замороженные секции могут быть получены для иммуногистохимических и иммунофлуоресценции исследований конкретных белков, таких как транскрипционные факторы, цитоплазматические молекулы, или маркеры поверхности клеток. Наша статья включает в себя эффективный подход к получению замороженных секций от органоидов, не нарушая их положение и организацию в 3D-культуре. Это выгодно, потому что предыдущие методы требуют удаления органоидов из подвальной мембранной матрицы перед замораживанием16. Обработка органоидов путем удаления из матрицы может нарушить структурную организацию органоида, а не отражать рост и развитие in vitro.
Этот протокол для генетически инженерных кишечных органоидов также может быть адаптирован для изучения других клеточных моделей и органоидных систем. Например, с помощью такого подхода можно было бы перевести поджелудочную, колонийную, печеночную, сердечную и церебральную органоидные системы. Даже клетки, растущие в соответствии с более стандартными методами культуры, поддаются технологии наночастиц. Кроме того, этот подход может быть применен для изучения молекулярных механизмов заболеваний, не только в контексте стволовых клеток, полученных органоидных систем, но и в опухолевых органоидов.
Таким образом, ключевые изменения, описанные в этих протоколах для кишечных органоидных исследований, мы надеемся, расширение прав и возможностей ученых, чтобы выяснить роль важных факторов и вниз по течению пути, участвующие в биологии кишечных стволовых клеток и их потомство . Эти подходы должны обеспечить средства, чтобы узнать больше о молекулярных механизмов, лежащих в основе самообновления, определение судьбы клеток, ткани гомеостаза, и кишечной эпителиальной регенерации, как при физиологических и патологических условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами От Национального института здравоохранения (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), Мэриленд Stem Cell Research Fund (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), Американской ассоциации легких, Allegheny Health Network - Johns Научно-исследовательский фонд Хопкинса и Центр основных исследований в области заболеваний пищеварения Хопкинса.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Base medium for 293T cells |
| DMEM/F12+ | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer |
| OPTI-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Virus plasmids transfection medium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | Component of virus collection medium and 293T medium |
| Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer |
| PBS (without Ca2+, Mg2+) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | A wash buffer and component of crypt dissociation buffer |
| Mem-NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Component of organoid culture medium |
| GlutamaxII | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Component of organoid culture medium |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Component of organoid culture medium |
| EGF | Millipore Sigma | E9644 | Component of organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 250-38 B | Component of organoid culture medium |
| R-spondin | R&D | 7150-RS-025/CF | Component of organoid culture medium |
| Human recombinant insulin | Millipore Sigma | I9278-5ml | Component of organoid culture medium |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N3376-100G | Component of Transduction medium |
| Wnt3A | R&D | 5036-WN-010 | Component of Transduction medium |
| Y27632 | Millipore Sigma | Y0503-1MG | Component of Transduction medium |
| 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Component of Crypts dissociation buffer |
| DTT (dithiothreitol) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | Component of Crypts dissociation buffer |
| Dispase I | Millipore Sigma | D4818-2MG | Component of organoid digestion buffer |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Component of organoid digestion buffer |
| matrigel(Growth factor reduced) | Corning | 356231 | Used as a matrix to embed organoids |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Medium for transfection in viral production |
| ViralMag R/L | Oz Biosiences | RL40200 | Magnetic particles of viral transduction |
| Magnetic plate | Oz Biosiences | MF10000 | Magnetic plate to facilitate viral transduction |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Transfection agent in viral production |
| Poly-D-Lysine | Millipore Sigma | A-003-E | Coating for plates before seeding 293T cells |
| 4% Formaldehyde Solution | Boster | AR1068 | Solution to fix organoids |
| O.C.T embedding compound | Thermo Fisher Scientific | 4583S | For embedding of the the organoids |
| 5 mL Falcon polystyrene tubes | Corning | 352054 | |
| 50 mL Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.100 | |
| Orbitron rotator II Rocker Shaker | Boekel Scientific | 260250 | |
| Olympus Inverted microscop CK30 | Olympus | CK30 | for scanning and counting crypts |
| Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence | Nikon | Axiovert 200 | for viewing fluorescence in the crypts |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane | Milipore Sigma | UFC910024 | For concentrating viruses |
| pluriStrainer 20 µm (Cell Strainer) | pluriSelect | SKU 43-50020 | For preparing organoid fragments |
| Falcon Cell Strainer | Fisher Scientific | 352340 | For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid) | Millipore Sigma | M8937-100EA | ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments |
| Animal strain: C57BL/6J | Jackson Lab | #000664 | For organoid culture |
References
- Cheung, E. C., et al. TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis. Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).
- Xian, L., et al. HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment and Paneth cell niche. Nature Comm. , (2017).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).
- Kabiri, Z., et al. Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts. Development. 141, 2206-2215 (2014).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. J Vis Exp. (120), (2017).
- Muñoz, J., et al. The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent '+4' cellmarkers. EMBO J. 31 (14), 3079-3091 (2012).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2014).
- Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture. J Vis Exp. (90), e51765 (2014).
- Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods Mol Biol. 945, 319-328 (2013).
- Ye, Z., Yu, X., Cheng, L. Lentiviral gene transduction of mouse and human stem cells. Methods Mol Biol. 430, 243-253 (2008).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Tesfaye, A., et al. The High-Mobility Group A1 gene up-regulates Cyclooxygenase-2 expression in uterine tumorigenesis. Cancer Res. 67 (9), 3998-4004 (2007).
- Haim, H., et al. Synchronized infection of cell cultures by magnetically controlled virus. J. Virol. 79 (1), 622-625 (2005).
- Xue, X., Shah, Y. M. In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors. J Vis Exp. (75), e50210 (2013).
