Summary
Biz adım adım talimatları tarif: 1) etkin bir şekilde bağırsak organoidleri Lenti-veya retroviral dönüştürücü için manyetik nano maddeler kullanarak mühendis ve 2) mühendislik organoidler dondurulmuş bölümler oluşturmak. Bu yaklaşım, akım etkilerinin incelenmesi için organoidlerde gen ifadesini verimli bir şekilde değiştirmek için güçlü bir araç sağlar.
Abstract
İntestinal nevuslardır kültürler, bağırsak kök hücresini araştırmak için benzersiz bir fırsat sağlar ve biyoloji içinde yer alan biyolojisi, organoidlerde gen ifadesini manipüle etmek için etkili yaklaşımlar bu arenada sınırlı ilerleme kaydetmesine karşın. Crispr/Cas9 teknolojisi, nevuslardır üretimi için hücrelerin hassas genom düzenlemesine izin verirken, bu strateji hem zaman alıcı hem de pahalı olan sıra analizi ile geniş seçim ve tarama gerektirir. Burada, intestinal organoidlerin verimli viral dönüştürücü için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşım hızlı ve son derece etkilidir, böylece CRISPR/Cas9 teknolojisinin doğasında zaman ve gider azalır. Ayrıca immünohistokimyasal veya immünofluorescent boyama ile daha fazla analiz için bozulmamış nevuslardır kültürlerden dondurulmuş bölümler oluşturmak için bir protokol sunuyoruz, hangi gen ifadesi veya susturma onaylamak için kullanılabilir. Gen ifadesi veya susturulması için viral vektörler başarılı dönüştürücüden sonra elde edilir, bağırsak kök hücresi ve Crypt fonksiyonu hızla değerlendirilebilir. Çoğu nevuslardır etütler in vitro olarak çalışsa da, organoidler in vivo fonksiyonel analizler için farelere de teslim edilebilir. Dahası, şu anda mevcut tedaviler genellikle genomu değiştirmek yerine gen ifadesi veya protein fonksiyonuyla işlev gördükleri için ilaçlara yönelik terapötik tepkiler tahmin etmek için yaklaşımlarımız avantajlıdır.
Introduction
Kültür fare veya insan kript hücreleri üç boyutlu olarak (3D) küçük bağırsak veya kolon uzun süre boyunca organoids gibi hücreler büyük bir atılım sağladı çünkü bu kültürler intestinal epitelyum içinde vivo tanımlama özellikleri görüntüleme 1 , 2 , 3. organoids birincil kript türetilen kendi kendine yenileme ve kendi kendine organizasyon, cep fonksiyonları kökeni kendi dokularına benzer sergileyen yeteneğine sahiptir. Nitekim, organoids sadece kript in vivo yapısal organizasyonu değil, aynı zamanda birçok moleküler özellikleri, böylece normal biyoloji ve hastalık Devletler çalışmak için yararlı araçlar sağlayan reapitulate. Göstermek için, nevuslardır çalışmalar doku rejenerasyon dahil yeni moleküler yollar ortaya koydu1,2,3,4,5 yanı sıra fonksiyonu artırabilir ilaçlar patolojik ayarlar6,7.
İntestinal astar en son derece rejeneratif memeliler dokuları arasında olduğu için, her 3-5 gün içinde bakteri, toksinler ve diğer patojenlerden organizmayı korumak için kendini yenileyen bağırsak kök hücrelerinin çalışma özellikle ilgi bağırsak lümen. Bağırsak kök hücreleri (ISCs) bu olağanüstü rejeneratif yeteneği sorumludur ve böylece yetişkin kök hücre fonksiyonu1,2eğitim için benzersiz bir paradigma sağlar. Lineage-farelerde izleme denemeler izole Lgr5-pozitif kök hücreleri 3D organoids veya ' mini-cesareti ' in vitro oluşturmak için kültürlü olabilir gösterdi nerede yakından onların in vivo karşı ayna. Organoid kültürler Ayrıca progenitors oluşan bağırsak Crypt hücre yalıtımlarından elde edilebilir, ISCs, ve Paneth hücreleri, ikincisi epitel niş hücreleri oluşturmaktadır in vivo. Aslında, primer bağırsak Crypt hücrelerinden nevuslardır kültür yaygın olarak kullanılabilir reaktifler kullanarak çoğu laboratuvarlarda uygulanması kolay nispeten rutin bir teknik haline gelmiştir. Bu model aynı zamanda RNA sıralaması (RNA-seq) ve kütle spektrometresi, immünhistokimya veya immünofluorescent boyama2,4,8proteinleri tarafından Gen ifadesinin nicel analizine imkan tanır. Buna ek olarak, fonksiyonel genetik (gen aşırı ifade veya aktive mutant geni ifadesi) veya fonksiyon kaybı (gen susturma veya bir fonksiyon kaybı mutant ifade) yaklaşımlar2kullanılarak incelenebilir.
Önemlisi, düşük verimlilik ve standart plazmid DNA 'Sı yüksek toksisitesi veya polybrene ile viral iletim protokolleri alanında büyük bir engel kalır. CRISPR/Cas9 teknolojisi hassas genom düzenleme için izin verir, ancak bu yaklaşım sıra doğrulama9tarafından izlenen zaman alıcı seçim gerektirir. Burada, manyetik nanopartiküllere konjugasyon ve manyetik alanın uygulanması ile viral partiküllerin teslimatını optimize eden primer bağırsak organoidleri için viral bir dönüştürücü Protokolü sunuyoruz. Önceki protokollerde önemli değişiklikler4,5,10,11,12,13 ve önerileri verimliliği artırmak için sağlanır. Ayrıca immunohistokimya veya immünofluorescent boyama ile daha fazla analiz için 3D matrigel (bundan böyle Bodrum membran matris veya matris olarak da adlandırılır) kültürlü bozulmamış organoidlerden dondurulmuş bölümler oluşturmak için bir yaklaşım açıklanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol Johns Hopkins Tıp Kurumları hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıTUC) tarafından onaylanmıştır. Bu protokol daha önce yayımlanan yöntemlerden10,11,12,13değiştirilir.
1. Reaktiflerin hazırlanması
- Yeni 293T orta birkaç saat önceden hazırlayın ve sıcak için 37 ° c bir su banyosunda en az 10 dakika önce kullanmadan (Tablo 1).
- Viral paketleme için Plasmid DNA2,13,14 hazırlayın. (Tablo 2).
- Diğer tüm gerekli materyalleri (malzeme tablosu) edinin.
2. Lentivirus veya retrovirus parçacık üretimi
- İnsan embriyo böbreği (HEK) 293T hücre tohumlama (1. gün)
- 1 150 mm Kültür tabağı ile kaplama ile hazırlamak 50 μg/mL Poly-D-lizin fosfat tamponlu tuz içinde çözülmüş (PBS; 10 mL/yemek) Oda sıcaklığında 1 saat (RT).
- Fosfat tamponlu tuz (PBS)/Poly-d-lizine çıkarın ve kaplanmış tabağı 5 mL PBS ile iki kez yıkayın.
- (Tablo 1) 293t Orta (8 \ u201210 x 106) tohum 293t hücreleri 15 ml toplam hacmine.
- Kültür 293T hücreler bir gecede standart doku kültürü kuluçta (37 °C, 5% CO2).
- HEK 293T hücre transfeksiyon (2. gün)
- Hücreleri% 70-80 konfluence ulaştığında transfeksiyon gerçekleştirin (genellikle yaklaşık 24 saat tohumlama sonra 8 \ u201210 x 106 hücreler).
- Transfeksiyon karışımı, ticari katyonik lipozom formülasyonu gibi verimli bir yaklaşım kullanarak hazırlayın (Tablolar 1 \ u20122, malzeme tablosu)2.
- Seyreltme Lentivirus DNA oluşturur12 (Toplam ~ 24 μg PLAZMID DNA, Tablo 2) içinde 1,2 ml transfeksiyon orta ve inkük 5 dk RT 1,5 ml tüpler (malzeme tablosu).
- Transfeksiyon Orta (malzeme tablosu) 1,2 ml 'de (36 μL) dilüt transfeksiyon Regent ve üreticinin talimatlarına göre 5 dk Için 5 ml tüplerde inkübe.
- Lentivirus reaktif (adım 2.2.2.1) transfeksiyon reaktif (adım 2.2.2.2) ekleyin ve yavaşça yukarı ve aşağı 5 mL pipet kullanarak yavaş pipetleme ile karıştırın.
- Karışımı RT 'de 20 dakika boyunca inkübe etme.
- 5 mL transfeksiyon orta ile 293T hücreleri yavaşça yıkayın ve 10 mL transfeksiyon orta ile değiştirin.
- DNA-lipid kompleksleri (adım 2.2.2.3) 293T hücrelerin orta dropwise ekleyin ve dikkatle her çanak DNA-lipid kompleksleri eşit dağılımı sağlamak için yatay ve dikey yönde hareket ederek kültür yemeklerinde medya karıştırın.
- Standart doku kültürü kuluçta 6 h için inkübe (37 °C, 5% CO2).
- Kuluçdan sonra, 20 mL taze virüs toplama Orta (Tablo 1) ile medyayı değiştirin.
- Virüs toplama (gün 3 \ u20125)
- 50 mL tüplerde virüs ortamını toplayın ve daha fazla konsantrasyon için 4 °C ' lik buzdolabında saklayın.
- 20 mL taze virüs toplama orta her 24 saat ve kültür gecede (~ 24 saat) değiştirin. Sonraki 2 gün (gün 4 \ u20125) üzerinden medya koleksiyonunu yineleyin.
- 5 gün sonra toplanan orta toplam hacminin ~ 60 mL (20 mL/gün x 3 gün) olduğundan emin olun.
- Virüs konsantrasyonu (5. gün)
- Toplanan medyayı (60 mL) 400 x g 'de 5 dakika santrifüjün. Daha sonra, herhangi bir hücresel enkaz kaldırmak için bir filtre (0,45 μm gözenekler) üzerinden süpernatant geçirin.
- Santrifüj filtre ünitesinde (malzeme tablosu) 15 mL filtrelenmiş virüs ortamı ekleyerek virüslere konsantre olun. 2.500 x g 'de 4 °c ' de 15 dakika Santrifüjü. Virüs bu filtreden geçemez çünkü, filtre üst odasında konsantre edilecektir.
- Tüp (alt oda) gelen akışı aspirate ve aynı santrifüj filtre ünitesine kalan viral toplama medya süpernatant başka 15 ml ekleyin. Yukarıdaki santrifüjün (2.500 x g Için 4 °c ' de 15 dk) supernatant 'tan ek virüsü konsantre etmek.
- İstenen konsantrasyon (~ 100-kat) ulaşılana kadar tek bir transed plakadan 60 mL medya için aynı filtreyi kullanarak işlemi tekrarlayın.
Not: Biz genellikle ~ 600 μL için virüs toplama ortamı ~ 60 mL konsantre. - 1 ml pipet kullanarak filtre üst odasından konsantre virüs çıkarın, sonra kısım ve 1,5 ml tüpler (50 \ u201260 μL/tüp) at-80 °c daha sonra kullanmak için saklayın. 6 \ u201212 ay kadar konsantre parçacıklar saklayın.
3. izolasyon Crypts
- Yerel ıAŞUC yönergelerine göre CO2 kullanarak ötenize fareler.
- Geri ötenize hayvan yerleştirin ve% 70 etanol ile püskürterek karın yıkayın.
- Sternum 'dan kasık 'ye kadar uzunlamasına orta çizgi kesi gerçekleştirin, önce deriyi ve ardından subkutan dokusunu yakın.
- İnce bağırsak karnından çekum çıkarın.
- İnce bağırsak içindeki ilgi bölgelerini tanımlayın; kript duodenum, jejunum ve ileum izole edilebilir.
- 10 ml 'lik bir şırınga kullanarak, 10 cm 'lik doku kültürü yeminde (1 mm ditiyotreitol (DTT), 1% penisilin/streptomisin (No CA2 + ve mg2 +) içeren ön soğutulmuş PBS) ile izole ince bağırsak (masa 1)
- Periferik yağ dokusu çıkarın ve açık veya steril bir cam plaka (15 cm x 15 cm) üzerinde uzunlamasına bağırsak dokusu "radyus".
- Bir hücre sıyırıcı kullanarak bağırsak epitelyal Villi yavaşça kazıyın.
- 2 \ u20123 cm uzunluğunda-Wise bölümler içine ince bağırsak kes.
- Dokuyu, düz forseps (116 mm) kullanarak önceden soğutulmuş PBS içeren 15 ml 'lik bir tüpe aktarın. ~ 30 s (ters yönde tüp hareketli ~ 60 kez) için şiddetle elle sallayarak doku parçalarını yıkayın.
- PBS 'i yenileyin ve PBS temizlenene kadar tekrar yıkayın.
Not: Biz genellikle 2 \ u20123 kez parçaları yıkayın. - PBS açık olduğunda orta hızda orbital Shaker üzerinde 4 °c ' de 10 dk için 10 ml Crypt ayrışma Buffer (Tablo 1) içeren 15 ml konik tüpte dokuyu inkübasyon yapın.
- Şiddetle ~ 30 s (tersi yönde ≈ 60 kez) için elle tüp sallayın ve başka bir 15 ml konik tüp içeren düz forseps kullanarak doku aktarmak 10 crypt ayrışma tampon ml. Bu fraksiyonu buzun üzerine ininin. Öncelikle Villi içerdiğinden nevuslardır kültürü için ilk kesir kullanmayın.
- Her kesir toplama ve buz üzerine yerleştirerek, 3 \ u20124 kez için 3.11 \ u 20123.13 adımları yineleyin.
- Tersine çevrilmiş bir mikroskop (4X) altında her bir fraksiyondan 200 μL numuneleri tarayarak, en yüksek intestinal kript yüzdesi ile zenginleştirilen kesir seçin. Daha önce açıklandığı gibi tipik morfoloji tarafından kript tanımlamak (Şekil 1a)10.
Not: Onlar yuvarlak veya oval şeklinde görünür ve granüle Paneth hücreleri içerir. Buna karşın Villi, granül Paneth hücrelerinin bulunmayan parmak benzeri yapılardır (Şekil 1B). - Gerekirse, benzer boyutta kript almak için bir 40 μm hücre süzgeci aracılığıyla seçilen kesir geçirin. Alternatif olarak, Lgr5 + kök hücreleri yeşil floresan protein (GFP) için Akış sitometrisi dayalı izole Eğer fareler EGFP-Lgr5 + arka plan veya Lgr5 + hücreler2tanımlaması sağlayan başka bir uygun model üzerine geçti.
- Seçili kesir içindeki toplam kript sayısını aşağıdaki gibi say.
- Pipet 50, seçilen fraksiyonunun μL değerini bir hemokytometreye çevirir ve ters ışık mikroskobu (4X) kullanarak kriptolar sayısını sayar. Yer ~ 100 kripts iyi bir 48-iyi plaka kullanarak hangi 3 \ u20126 kuyuları gen susturma veya overexpression için deneysel koşul başına transilme olacak dönüştürücü deneyler için izin vermek.
- 50 μL başına kript sayısına göre, gerekli Crypt ayrışma tampon hacmi hesaplamak ve bir 1,5 ml tüp içine bu hacmi aktarmak.
Not: Örneğin, 50 μL başına 10 kript sayılır, 300 kript için 6 x 50 μL veya 300 μL gereklidir.
- 1,5 mL 'Lik tüplerde 5 dakika boyunca 300 x g 'de şifreli santrifüj yapın.
- Üst sıvı katmanını hafifçe pipetleme ve 100 μL 'de Pelet artışını, buz üzerindeki Bodrum membran matrisini (malzeme tablosu) küçültülür.
- Matris içeren kript 'ı 37 °c ön ısıtılmış 48-kuyu plakasına (30 μL/Well, ~ 100 kript/Well) yerleştirin. Matris jelleşme (37 °c, 5% Co2) için izin vermek için 5 \ u201215 dakika için standart bir doku kültürü kuluçta plaka inkübe.
- Her bir Jeli 250 μL nevuslardır kültürü (ENR) Orta (Tablo 1) ile yerleştirin ve 48-kuyu plakalarını standart doku kültürü kuluçta (37 °c,% 5 Co2) içine yerleştirin. 24 saat sonra küçük, yuvarlak, kistik şekiller içine Crypt organizasyon için kültürler kontrol edin; tomurcuklar 2 \ u20125 gün sonra oluşturacaktır.
- ENR medyasını her 3 günde bir hafifçe değiştirin. Eski ENR medyasını nazik emiş ile çıkarın, medyayı değiştirirken matrise dokunmayın.
- Passage nevuslardır kültürler her 4 \ u20127 gün daha önce açıklandığı gibi11.
4. organoid parça hazırlama
- Bir kez (1 \ u20122 hafta içinde) veya pasaj olduktan sonra formu transduce organoids. Tek bir dönüştürücü deney için, hazırlamak 2 \ u20123 kuyuları kültürlü organoids bir 48-iyi plaka ile koşul başına ~ 100 \ u2012200 organoids/iyi veya ~ 200 \ u2012600 organoids deneysel dönüştürücü durumu başına.
- 250 μL dönüştürücü medyası (Tablo 1) ve 3 veya daha fazla gün veya organoids bir kistik morfoloji benimsemeye kadar dönüştürücü medyada kültür ile Exchange ENR. Kök ve Paneth hücrelerinin sayısını artırmak için dönüştürücü ortamda Wnt3a ve ROCK inhibitörü (Y27632) hem de dahil; Nikotinamid (Nic) kültür verimliliğini geliştirir ( Tablo 1' de dönüştürücü ortamına bakın).
- 1 mL 'Lik pipet kullanarak kubbe benzeri Bodrum membran matris yapısını medya ve pipet ucu ile mekanik olarak yırtılması.
- Orgoidleri ve medyayı steril 1,5 mL tüpüne aktarın.
- 200 μL pipet ~ 10 \ u201215 kez pipetleme ile matrisi mekanik olarak daha da bozar.
- 500 x g 'de 5 dakika boyunca RT 'de nevuslardır parçaları Santrifüjü.
- Bir pipet kullanarak dikkatle süpernatant atın ve 1 ml dmem/F12 Orta (Tablo 1) Pelet pelletini.
- Dispase ı (10 mg/mL 'de 6 μL) ve DNase ı (2,5 μL 'de 10 mg/mL) ekleyin. 1 mL pipet kullanarak yavaşça pipetleme ile karıştırın.
- 1,5 mL 'Lik tüpte 20 dakika boyunca 37 °C ' de organoidleri kulküat.
- Ayrışma reaksiyonu sonlandırmak için 500 μL ENR medyası ekleyin; ENR 'deki serum reaksiyonu sonlandırır.
- Orgoid hücrelerini 20 μm hücre süzgeci ile geçirin ve 400 x g 'de nevuslardır parçaları 5 dakika santrifüjler.
- 150 μL dönüştürücü orta ile resuspend nevuslardır parçaları (Tablo 1).
5. viral dönüştürücü tarafından Organoids veya Crypt hücrelerinin genetik mühendisliği
Not: Bkz. Şekil 2.
- 200 μL dönüştürücü orta/iyi bir 48-kuyu plakalı tohum nevuslardır hücre kümeleri ve standart doku kültürü kuluçta (37 °c, 5% Co2) inküpleme. Alternatif olarak, bir 48-Well plaka içinde 200 μL dönüştürücü orta/iyi taze izole Crypt hücreleri (~ 1.000 Crypts) yerleştirin ve standart bir doku kültürü kuluçta (37 °C, 5% CO2) inküpleme.
- 48-kuyu plakaları ya da ~ 100 μL her iyi, 24-kuyu plakaları başına konsantre virüs ~ 50 μL konsantre virüs için izin dönüştürücü için virüs çözülme şişeleri çözmek.
- 1,5 mL 'Lik bir tüpte (Tablo 3) RT 'de 15 dakika boyunca 12 μL manyetik nanopmakale çözeltisi ile virüs inküye yapın.
- Manyetik nanopartikül çözeltisi/virüs karışımını hücrelere dönüştürücülere ekleyin.
- Hücre kültürü plakasını manyetik bir plakaya yerleştirin ve standart doku kültürü kuluçta (37 °C, 5% CO2) en az 2 h (ve ~ 6 h 'ye kadar) için inküye yapın.
6. enfekte organoid parçaları tohumlama
- Virüslü nevuslardır hücre kümelerini ve dönüştürücü medyasını her iyi bir 1,5 ml tüpüne aktarın.
- 500 x g 'de 5 dakika Santrifüjü
- Nazik emiş ile süpernatant atın ve 5 dakika buz üzerinde Pelet içeren tüp serin.
- 120 μL Bodrum membran matrisi ekleyin ve yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme ile Pelet pelletini.
- Yeni 48-Well plaka içine matris hücre karışımı tohum 30 μL damla.
- Matris katılaşıncaya kadar 5 \ u201215 dakika için 37 °C ' de plakayı kulbe eder.
- Her bir kuyu için dönüştürücü orta ekleyin ve 3 \ u20124 gün (37 °C, 5% CO2) için standart doku kültürü kuluçta inkübe.
- 3 \ u20124 gün sonra, hücre kümeleri nevuslardır yapılara organizasyonu sağlamak için bir ışık mikroskop (10X) altında kültürler inceleyin. Ardından, dönüştürücü medyasını 250 μL ENR medyası ile hafifçe değiştirin.
- Her 3 \ u20124 gün medya değiştirin.
7. seçim (varsa)
- Sonra 2 \ u20123 gün, ilgili antibiyotik veya hormon seçim için dönüştürücü orta uygunsa ekleyin.
Not: Plazmids bir puromisin direnci gen2,14harbored çünkü lentivrial dönüştürücü seçimi için puromisin (2 μg/ml) kullanılır.
8. başarılı dönüştürücü ve gen Ifadesi veya susturma onayı
- Fugw Lentivirus2,14kullanıyorsanız, floresan mikroskop veya akış cytometri aracılığıyla Gfp sinyalleri ölçerek transtion verimliliği tahmin.
- Kontrol ve deneysel nevuslardır kültürlerde mRNA 'nın nicel karşılaştırması için nicel ters transcriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) kullanarak gen ekspresyonu veya susturmayı doğrula.
- Protein kodlama gen ifadesi veya Batı Blot veya immünostasyonu2tarafından susturulması için protein düzeylerini onaylayın.
9. Bodrum membran matrisinde organoid Kriyobölüm
Not: Bkz. Şekil 3.
- İnce emme ile ENR orta çıkarın, Bodrum membran matris Perturb dikkatli olmak ve yavaşça bir kez 500 μL PBS ile yıkayın.
- 1,0 ml 'lik 4% civarında formaldehite (PFA) çözeltisi (malzeme tablosu) ile 30 dakika boyunca RT 'de organoidleri düzeltin.
- PFA 'yı emiş ile çıkarın ve 1 mL PBS ile hafifçe iki kez yıkayın.
- PBS emme ile çıkarın ve her örneğe% 30 sakaroz tampon 1,0 ml ekleyin. Soğuk bir odada, buzdolabında veya buzda numuneleri susuz bırakmak için 1 saat 4 °C ' de sakaroz içinde sabit organoidleri inkük.
- Sükroz tamponunu emiş ile çıkarın ve her bir kuyunda matris katmanını (~ 300 μL/Well) kapsayacak kadar sadece yeterli gömme bileşiği (malzeme tablosu) ekleyin.
- RT 'de 5 dakika boyunca inküye yapın.
- Numuneleri a-80 °C ' ye 10 dakika boyunca veya gömme bileşik katı ve beyaz olana kadar yerleştirin.
- Kenarları boyunca bileşik en az erime için izin RT dondurulmuş gömme bileşik ile çanak yerleştirin. Kuyunun duvarlarından blok ayırmak için bir neşter kullanın.
- Matris katıştırma bileşik bloğunu forseps kullanarak çıkarın ve bir numune bloğuna yerleştirin (örn. cryomold), erime önlemek için hızlı bir şekilde çalışır.
- Bileşiği gömme ile tamamen doldurun ve 30 dakika boyunca-80 °C ' de dondurunuz.
- Blok, daha fazla kullanım için-80 °C ' deki buzluğu kesme veya depolama için kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, bir manyetik alana maruz kalan manyetik Nanopartiküllerin ilgi hücrelerine Lentivirus teslim edilmesini sağlayan hızlı ve son derece verimli bir dönüştürücü tekniği açıklanmaktadır. Kolayca kullanılabilir araçlar ile, sadece taze izole Crypt hücreleri (Şekil 1a), aynı zamanda Organoids (Şekil 2) ve daha rutin dönüşüm yaklaşımlar refrakter diğer hücreler için değil, bu yaklaşım uyguladıysanız. Lentiviral parçacıklar kolayca manyetik nanolevha ve ortaya çıkan virüs-nanopartiküller kompleksleri bir manyetik plaka kullanarak bir manyetik alan uygulayarak verimli bir şekilde teslim edilebilir. Bu yaklaşımı optimize etmek için, ilk olarak Gfp 'ye bağlı lentiviral vektörler test ettik, böylece GFP floresan mikroskobu ile dönüştürücü hücreleri tanımlamak için kullanılabilir. GFP, nevuslardır gelişiminde her aşamada görselleştirilebilir ve bu hücreler kist benzeri yapılara (Şekil 4A) veya daha sonra organoids tomurcuklar (Şekil 4b) oluştururken daha sonra zaman noktalarında düzenlenir. Başarılı bir şekilde bağırsak organoidleri dönüştürücünden sonra Paneth hücrelerini tanımlamak için lizozim gibi Lineage işaretçileri, ek olarak toplam hücre numarasını numaralandırmak için hücre zarları ve çekirdekleri boyama tarafından gelişiminde değişiklikler için işlevsel analiz geçmesi ( Şekil 4C).
Genetik olarak tasarlanan organoids, burada özetlenen dondurulmuş bölümler oluşturarak daha fazla analiz için kullanılabilir (Şekil 3). Organoidleri katıştırdıktan sonra, dondurulmuş bloklar saklanabilir ve gelecekteki çalışmalar için daha sonra kesilebilir. Bu yaklaşım da verimlidir (tahmini ~ 95% GFP (+) organoidlerin toplam organoidler yüzdesi dayalı). Bu yaklaşım, Standart laboratuvar reaktifleri ile yapılabilir, böylece hücre numarası, hücre kaderi ve belirli proteinlerin varlığı ve seviyeleri de dahil olmak üzere çeşitli soruşturmalara imkan veren dokular sağlar2. Örneğin, ayrı hücreleri ve belirli hücre tipini belirlemek için dondurulmuş bölümler ve immünofluorescent boyama kullandık (Şekil 4c).
Resim 1: tipik morfoloji gösteren karikatürler Ile izole kripts ve Villi. (A) izole kripts yuvarlak veya oval yapıları oluşturur. (B) Villi parmak benzeri yapılar olarak tanımlanır. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Şekil 2: Manyetik Nano opartikülleri kullanarak organoidlerin viral dönüştürücülerin şematik ve manyetik bir alana maruz kalma. İletim protokolünün en önemli adımları gösterilir. (A) 1,5 ml 'lik BIR tüpte RT 'de 15 dakika boyunca virüs ve manyetik nanopmakale çözeltisi inküye. (B) Manyetik Nanopartiküller/virüs karışımından transmanli hücrelere ekleyin. (C) hücre kültürü plakasını manyetik plakaya yerleştirin ve standart bir doku kültürü olan kuluçta 2 h için inküye yapın. Daha uzun kuluçk süreleri de kullanılabilir (~ 6 h); Burada Manyetik plaka üzerinde gösterilir. (D) virüs ve Manyetik Nano madde ile dönüştürücülü bir hücre gösterilir. (E) her iyi bir 1,5 ml tüp içine enfekte nevuslardır hücre kümeleri ve dönüştürücü medya transferi ve 5 dk için 500 x g Santrifüjü. nazik emiş ile süpernatant atmak ve 5 dakika boyunca buzda Pelet içeren tüp serin. (F) Ekle 120 μL Bodrum membran matrisi ve pelletini pelet tarafından yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme. (G) yeni 48-kuyu plakasında her bir kuyun içine matris hücresi karışımı Içeren 30 μL tohum damlası. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3:3D matrisdeki organoidlerin dondurulmuş bölümleme şematik. Dondurulmuş bölümleme protokolünün en kritik adımları gösterilir. (A) 24-iyi hücre kültürü plaka içinde tek bir kuyu tasvir edilir. (B) matris katmanını kapsayacak şekilde sadece yeterli gömme bileşik ekleyin (~ 300 μL/Well) ve RT 'de 5 dk. (C) bir dondurucu içinde-80 C 'de örnekleri 10 dakika veya gömme bileşik katı ve beyaza dönüşene kadar yerleştirin. Sonra, örnek kenarları boyunca hafif erime için izin RT çanak yerleştirin. (D) kuyunun duvarlarından blok ayırmak için bir neşter kullanın. (E) matris katıştırma bileşik bloğunu forseps kullanarak çıkarın ve donma dokularına uygun sığ bir kap veya kalıp yerleştirin. Kalıbı gömme bileşiği (OCT) ile tamamen doldurun. (F) Freeze blok at-80 C dondurucu içinde 30 dk. (G) blok, daha fazla kullanım için kesit veya depolama-80 c dondurucu için hazırdır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: transbe edilen bağırsak organoidlerinin temsili görüntüleri. (A) ışık mikroskobu altında küçük bağırsak organoidlerin temsili görüntü (sol) Floresan mikroskopisi, ve, (sağ) transgen ifade standart mikroskobu (EGFP) 3 gün içinde dönüştürücü. Ölçek çubuğu = 50 μm. (B) Manyetik Nanopartiküller kullanılarak transmansiyon sonrası nevuslardır olarak Gfp kodlama geninin ekspresyonu örneği. Organoid hücreleri Lentivirus GFP ifade ile dönüştürücü edildi (FUGW; Üst) veya Lentivirus Hmga1 aşırı ifade (fugw-Hmga1; Alt) olarak gösterildiği gibi 12 gün transtranyon sonra. Ölçek çubuğu = 50 μm. (C) formalin immünofluorescence görüntülemede dondurulmuş organoidlerin sabit kısmı. Organoid bölümler (4 μm) Anti-lysozyme (kırmızı), Anti-EpCAM (yeşil) ve DAPı (mavi) ile lekelenmiş. EpCAM hücre sınırlarını demarcates, dapi bireysel çekirdekler belirtilen, ve lizozim lekeleri Paneth hücreler. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
| Organoid kültür orta (ENR) | 100 mL |
| DMEM/F12 + | 96 mL |
| L-alanil-L-glutamin dipeptid takviyesi (örneğin Glutamax) | 1 mL 'Lik |
| NEAA | 1 mL 'Lik |
| Kalem/strep | 1 mL 'Lik |
| HEPES | 1 mL 'Lik |
| EGF (100 μg/mL) | 5 μL |
| Noggin (100 μg/mL) | 10 μL |
| R-spondin (100 μg/mL) | 10 μL |
| veya R-spondin durum Orta (CM) | 20 mL 'Lik |
| İnsan rekombinant insülin (10 mg/mL) | 5 μL |
| İletim orta | 5 mL 'Lik |
| ENR orta | 2,4 mL |
| WNT durum Orta (CM) | 2,5 mL |
| Nikotinamid (1M) | 100 (μL) |
| Y27632 (10 μM) | 10 μL |
| Crypts ayrışma tampon | 100 mL |
| PBS (CA2 +, mg2 +olmadan) | 99 mL |
| Kalem/strep | 1 mL 'Lik |
| 0,5 M EDTA | 100 (μL) |
| 0,1 M DTT (dithiothreitol) | 100 (μL) |
| 293T orta | 100 mL |
| DMEM | 90 mL |
| Fbs | 10 mL 'Lik |
| Virüs toplama orta | 100 mL |
| DMEM | 99 mL |
| Fbs | 1 mL 'Lik |
| Organoid sindirim tamponu | 1 mL 'Lik |
| DMEM/F12 + | 1 mL 'Lik |
| Dispase ı (10 mg/mL) | 6 μL |
| DNase ı (10 mg/mL) | 2,5 (μL) |
Tablo 1: iletişim kuralında kullanılan medya.
| Plaka | 10 cm 'lik | 15 cm 'lik |
| Lentivirus dönüştürücü vektör | 6 μg | 9 μg için |
| CMVΔR 8.91 | 8 μg | 12 μg |
| MD. G | 2 μg | 3 μg |
| Toplam vektörler | ≤ 16 μg | ≤ 24 μg |
Tablo 2: transfeksiyon için Plasmid DNA 'Sı miktarı.
| Plaka | Manyetik boncuk (μL) | Virüs hacmi (μL) | Son dönüştürücü hacmi (μL) |
| 48-Well | 6 | 50 | 250 |
| 24-Well | 12 | 100 | 500 |
Tablo 3: manyetik boncuk çözeltisi ve vektörünün hacmi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Organoids olarak yetişkin intestinal epitelin primer kültürü, kök hücre fonksiyonunda yer alan moleküler mekanizmalar, intestinal epitelyal homeostaz ve patoloji1,2,3, 4' ü yapın. CRISPR/Cas9 teknolojisi genetik mühendisliği organoids için kullanılabilir olsa da9, istenilen genetik değişiklikler için sıra analizi dayalı geniş tarama ve seçim için ihtiyaç ile sınırlıdır. Bu protokolün amacı, Lenti-veya retrovirüsü intestinal organoidlere manyetik nanopmadde teslimi için video tabanlı öğreticiler ile net ve özlü talimatlar sağlamak, daha fazla analiz için dondurulmuş kesme izledi.
Bu protokol, intestinal organoidleri genetik olarak düzenleyen ve gen aşırı ifadesinin sonuçlarını analiz etmek veya dondurulmuş bölümlerden susturulması için hızlı ve verimli bir yöntemdir. Kritik adımlar Şekil 2, Şekil 3' te özetlenmiştir. Bu strateji, bağırsak kök hücrelerinde genetik değişikliklerinin (overexpression veya susturulması) biyolojik önemini ve 3D koşullarda2,13altında kültürlerini incelemenizi sağlar. Ayrıca, farklı primer hücrelerde hücre dönüştürücülerinin ve transgene ifadesinin artırmak için viral vektörler bu manyetik Nanoparticle tabanlı teslim kullandık2,13.
Bu yaklaşımla, viral parçacıklar manyetik nanopartiküllerle kaplıdır ve manyetik alana maruz kalarak hücrelere teslim edilir. Polybrene ile veya spinokülasyon olmadan10,15, manyetik nanopetikler-viral kompleksleri gibi mevcut dönüştürücü yöntemleri ile karşılaştırıldığında, genetik malzemenin alımı endositoz tarafından aracılı çünkü hücreler için daha az toksik pinsitoz, hücre zarlarına önemli hasar vermemek için doğal olarak oluşan iki biyolojik süreç. Böylece, hem hücre canlılığı ve iletim verimliliği geliştirilmiştir. Dönüştürücü verimliliği daha önce2,10,13,16bildirilen daha büyük kripts veya tüm organoids yerine küçük Crypt parçaları veya tek hücreler (bkz adım 4,8) kullanarak daha fazla artış olabilir. Manyetik olarak yönlendirilen nanopartikül teslim sonuçları hızlı birikme, penetrasyon, ve viral vektörler hedef hücrelere almak2,13. Manyetik Nanopartiküller, tamamen biyolojik olarak çözünebilir ve özel özel katyonik moleküllerle kaplanmış demir oksit ile üretilmiştir. Viral vektörler ile Nanoparticle Birliği tuz kaynaklı kolloidal toplama ve elektrostatik etkileşimler ile elde edilir. Nanopartiküller daha sonra kültür çanak altında yerleştirilen Manyetik plaka tarafından oluşturulan harici bir manyetik alan tarafından hücrelere yoğunlaşmıştır. İletim verimliliği yaklaşımlar% 95 ise, tüm hücreler dönüştürücü, bu tekniği için bir sınırlama olduğunu. Buna ek olarak, Endogenously ilgi genler CRISPR/Cas9 yaklaşımlar ile değiştirilmez ifade.
Gen aşırı ifade veya susturulması sonrasında, organoidler, gen ifadesi analizi, hücreler içinde proteomik değişiklikler veya hücreler tarafından salgılanan, metabolik değişiklikler ve morfolojik değişiklikler. Yaşayan dokularda olduğu gibi, transkripsiyon faktörleri, sitoplazmik moleküller veya hücre yüzeyi işaretçileri gibi spesifik proteinlerin immünohistokimyasal ve immünofluoresesans çalışmaları için dondurulmuş bölümler elde edilebilir. Makalemiz, 3D kültüründe konumlarını ve örgütlerini rahatsız etmeden organoidlerden dondurulmuş bölümler elde etmek için etkili bir yaklaşım içerir. Önceki teknikler donma önce Bodrum membran matrisinden nevuslardır kaldırılması gerektirdiğinden bu avantajlıdır16. Matrix 'ten çıkarılarak organoidlerin işlenmesi, in vitro büyüme ve gelişimini yansıtmak yerine nevuslardır yapısal organizasyonunu bozabilir.
İntestinal organoidlerin genetik mühendisliği için bu protokol de diğer hücre tabanlı modeller ve nevuslardır sistemleri incelemek için adapte edilebilir. Örneğin, pankreas, kolonik, hepatik, kardiyak, ve serebral nevuslardır sistemleri bu yaklaşımla dönüştürücü olabilir. Hatta daha standart kültür teknikleri altında büyüyen hücreler nanopartikül teknolojisine imkan sağlar. Ayrıca, bu yaklaşım, sadece kök hücre türetilen nevuslardır sistemleri bağlamında değil, aynı zamanda tümör organoidlerde, hastalıkların moleküler mekanizmaları incelemek için uygulanabilir.
Özetle, bağırsak nevuslardır çalışmaları için bu protokollerde açıklanan önemli değişiklikler Umarım bilim adamlarının, bağırsak kök hücrelerinin biyolojisinde yer alan önemli faktörlerin ve aşağı yol yollarının rolünü aydınlatmak etmek için güçlendirecek ve onların Döl . Bu yaklaşımlar, fizyolojik ve patolojik koşullar altında kendi kendine yenileme, hücre kaderi belirlenmesi, doku homeostaz ve intestinal epitelyal rejenerasyon temel moleküler mekanizmalar hakkında daha fazla bilgi edinmek için Araçlar sağlamalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar açıklamak için hiçbir şey var
Acknowledgments
Bu çalışma Sağlık Ulusal Enstitüsü (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), Maryland kök hücre araştırma fonu (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), Amerikan Akciğer Derneği, Allegheny Sağlık Ağı-Johns tarafından hibe tarafından desteklenmektedir Hopkins Araştırma Fonu ve Hopkins sindirim hastalıkları temel araştırma çekirdek merkezi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Base medium for 293T cells |
| DMEM/F12+ | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer |
| OPTI-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Virus plasmids transfection medium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | Component of virus collection medium and 293T medium |
| Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer |
| PBS (without Ca2+, Mg2+) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | A wash buffer and component of crypt dissociation buffer |
| Mem-NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Component of organoid culture medium |
| GlutamaxII | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Component of organoid culture medium |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Component of organoid culture medium |
| EGF | Millipore Sigma | E9644 | Component of organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 250-38 B | Component of organoid culture medium |
| R-spondin | R&D | 7150-RS-025/CF | Component of organoid culture medium |
| Human recombinant insulin | Millipore Sigma | I9278-5ml | Component of organoid culture medium |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N3376-100G | Component of Transduction medium |
| Wnt3A | R&D | 5036-WN-010 | Component of Transduction medium |
| Y27632 | Millipore Sigma | Y0503-1MG | Component of Transduction medium |
| 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Component of Crypts dissociation buffer |
| DTT (dithiothreitol) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | Component of Crypts dissociation buffer |
| Dispase I | Millipore Sigma | D4818-2MG | Component of organoid digestion buffer |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Component of organoid digestion buffer |
| matrigel(Growth factor reduced) | Corning | 356231 | Used as a matrix to embed organoids |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Medium for transfection in viral production |
| ViralMag R/L | Oz Biosiences | RL40200 | Magnetic particles of viral transduction |
| Magnetic plate | Oz Biosiences | MF10000 | Magnetic plate to facilitate viral transduction |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Transfection agent in viral production |
| Poly-D-Lysine | Millipore Sigma | A-003-E | Coating for plates before seeding 293T cells |
| 4% Formaldehyde Solution | Boster | AR1068 | Solution to fix organoids |
| O.C.T embedding compound | Thermo Fisher Scientific | 4583S | For embedding of the the organoids |
| 5 mL Falcon polystyrene tubes | Corning | 352054 | |
| 50 mL Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.100 | |
| Orbitron rotator II Rocker Shaker | Boekel Scientific | 260250 | |
| Olympus Inverted microscop CK30 | Olympus | CK30 | for scanning and counting crypts |
| Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence | Nikon | Axiovert 200 | for viewing fluorescence in the crypts |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane | Milipore Sigma | UFC910024 | For concentrating viruses |
| pluriStrainer 20 µm (Cell Strainer) | pluriSelect | SKU 43-50020 | For preparing organoid fragments |
| Falcon Cell Strainer | Fisher Scientific | 352340 | For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid) | Millipore Sigma | M8937-100EA | ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments |
| Animal strain: C57BL/6J | Jackson Lab | #000664 | For organoid culture |
References
- Cheung, E. C., et al. TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis. Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).
- Xian, L., et al. HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment and Paneth cell niche. Nature Comm. , (2017).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).
- Kabiri, Z., et al. Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts. Development. 141, 2206-2215 (2014).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. J Vis Exp. (120), (2017).
- Muñoz, J., et al. The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent '+4' cellmarkers. EMBO J. 31 (14), 3079-3091 (2012).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2014).
- Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture. J Vis Exp. (90), e51765 (2014).
- Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods Mol Biol. 945, 319-328 (2013).
- Ye, Z., Yu, X., Cheng, L. Lentiviral gene transduction of mouse and human stem cells. Methods Mol Biol. 430, 243-253 (2008).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Tesfaye, A., et al. The High-Mobility Group A1 gene up-regulates Cyclooxygenase-2 expression in uterine tumorigenesis. Cancer Res. 67 (9), 3998-4004 (2007).
- Haim, H., et al. Synchronized infection of cell cultures by magnetically controlled virus. J. Virol. 79 (1), 622-625 (2005).
- Xue, X., Shah, Y. M. In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors. J Vis Exp. (75), e50210 (2013).
