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Immunology and Infection

Évaluation de la cytotoxique et effets immunomodulateurs de Substances dans des tranches de poumon humain de coupe de précision

Published: May 9, 2018 doi: 10.3791/57042
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 2, 2, 3, 4, 4, 5, 1,6, 1
1Fraunhofer Institute for Toxicology and Experimental Medicine (ITEM), German Center for Lung Research (DZL), Biomedical Research in Endstage and Obstructive Lung Disease Hannover (BREATH), Member of REBIRTH Cluster of Excellence, 2Institute for Pathology, Hannover Medical School, German Center for Lung Research (DZL), Biomedical Research in Endstage and Obstructive Lung Disease Hannover (BREATH), 3Division of Thoracic and Vascular Surgery, Klinikum Region Hannover (KRH), 4Department of Cardiothoracic, Transplantation and Vascular Surgery (HTTG), Hannover Medical School, German Center for Lung Research (DZL), Biomedical Research in Endstage and Obstructive Lung Disease Hannover (BREATH), 5Institute of Pharmacology and Toxicology, RWTH Aachen University, 6Institute for Immunology, Hannover Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Compte tenu du principe des 3 r, modèles respiratoires comme des alternatives aux études sur les animaux évoluent. Surtout pour l’évaluation des risques des substances respiratoires, il y a un manque d’essais appropriés. Nous décrivons ici l’utilisation de tranches de poumon humain de coupe de précision pour l’évaluation des substances véhiculées.

Abstract

Maladies respiratoires dans leur vaste diversité besoin de systèmes de modèle approprié pour comprendre les mécanismes sous-jacents et permettre le développement de nouvelles thérapeutiques. De plus, l’inscription de nouvelles substances exige évaluation appropriée des risques avec des systèmes de tests adéquats pour éviter le risque d’individus mis à mal, par exemple, dans le milieu de travail. Ces évaluations des risques sont habituellement menées chez l’animal. Étant donné le principe des 3R et le scepticisme public contre l’expérimentation animale, humaines autres méthodes, comme des tranches de coupe de précision du poumon (CIP), ont aussi évolué. Le présent document décrit la technique ex vivo de PCLS humaine pour étudier le potentiel immunomodulateur des substances de faible poids moléculaire, comme diammonium d’ammonium (HClPt). Paramètres mesurés comprennent viabilité et une inflammation locale respiratoire, marquée par la sécrétion altérée de cytokines et de chimiokines. Cytokines pro-inflammatoires, facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α), et alpha de l’interleukine 1 (IL-1α) ont augmenté de PCLS humaine importante après exposition à une concentration des toxique de HClPt. Même si la technique du CIP a été considérablement optimisée ces dernières décennies, son applicabilité à l’essai de l’immunomodulation est encore en développement. Par conséquent, les résultats présentés ici sont préliminaires, même si ils montrent le potentiel de PCLS humain comme un outil précieux dans la recherche en pneumologie.

Introduction

Maladies respiratoires comme l’asthme allergique, asthme professionnel, maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC), l’emphysème et les infections des voies respiratoires supérieures et inférieures sont en augmentation et représentent une santé dans le monde entier fardeau1,2. Systèmes de test appropriée sont nécessaires, afin d’identifier certains des mécanismes fondamentaux qui sous-tendent ces maladies, en plus de la mise au point et l’essai des substances appropriées. La recherche fondamentale ainsi que le développement préclinique de drogue se concentrent sur les résultats obtenus lors d’essais in vitro ou in vivo . Ces tests, cependant, ont leurs limites3. Tout d’abord, in vitro tests utilisent des cellules humaines qui ont été isolés et retirés des organes ou des tissus adjacents et ne sont donc plus en mesure d’interagir avec ou être protégés par d’autres cellules3. Deuxièmement, les modèles animaux ne sont souvent pas traduisibles pour l’être humain en raison des différences dans la physiologie et les divergences biochimiques4. Afin de minimiser ces limites et dans le contexte des 3R (remplacement, réduction, raffinement) principe5, nouveaux modèles alternatifs sont en constante évolution.

Modèles alternatifs de tissus humains 3D, tels que PCLS, constituent un lien entre humains in vitro et complexe animales in vivo modèles. PCLS refléter l’hétérogénéité fonctionnelle avec tous les types de cellules pertinents présents dans les voies respiratoires6. En outre, la technique PCLS a l’avantage de préparation reproductible de plusieurs fines tranches d’épaisseur précise provenant d’un donneur unique tissu animal ou humain. Cela permet un contrôle interne, ainsi que des concentrations différentes ou pour tester des médicaments.

Depuis la première introduction de tranches de poumon humain rempli d’agar en 1994 par Fisher et al. 7 la technique de tranchage et mise en culture des tissus pulmonaires a été considérablement amélioré. Christian Martin et al. ont amélioré cette technique pour davantage les applications chimiques et pharmacologiques8. Notre groupe a été présenté à cette technique par Christian Martin en 2007. Depuis lors, la demande de CIP en recherche a élargi des essais de réponses fonctionnelles, telles que des voies9,10 et la vasoconstriction11, à immunologiques, pharmacologiques12,13, et toxicologiques7 essais chez diverses espèces dans plusieurs laboratoires. Par exemple, Schlepütz et al. 14 a étudié les réactions des voies respiratoires pour les différences entre les espèces et comparé activation du neurone périphérique par une stimulation électrique (EFS) ou par la capsaïcine chez les souris, rats, cochons, moutons, ouistitis et l’homme. Ils ont trouvé les diverses espèces d’avoir des motifs distincts mais différentes de la bronchoconstriction induite par le nerf et a conclu que les animaux de laboratoire couramment utilisés (souris et rats) ne reflètent pas toujours la réponse de l’homme. Pour les essais de toxicité pulmonaire et de réduire le nombre d’animaux dans ce contexte, Hess et al. 15 prévalidées rat PCLS comme alternative ex vivo pour les études de toxicité par inhalation. Cette étude multicentrique de pré-validation a abouti dans le développement des deux modèles de prédiction à l’aide de PCLS avec des résultats prometteurs.

En outre, dans la recherche fondamentale, PCLS ont été utilisés pour élucider le calcium signalisation16, premières réactions allergiques17et infection virale réponses18,19. Progrès technique sont en cours et nouvelles avancées sont explorées. Par exemple, le champ augmente l’avantage du tissu humain par le stockage et la réutilisation des tissus congelés. Rosner et coll. décrit une technique de gel et dégel PCLS murin qui préserve la capacité des voies respiratoires se contracter lors de la stimulation : par conséquent, la technique prolonge la fenêtre de temps limité, dans lequel les tissus restent viables et donc plus des essais peuvent être appliqués au fil du temps au même donneur20. En plus de ces avancées de la recherche, Lauenstein et al. 21 a récemment étudié évaluation des risques de divers produits chimiques qui pourraient agir comme des sensibilisateurs potentiels pour l’asthme professionnel dans PCLS humaine.

L’asthme professionnel, dont les symptômes sont l’obstruction de la circulation de l’air et l’hyperréactivité des voies aériennes, semblables à l’asthme allergique, est induite par une exposition à haut poids moléculaire (HMW)22 ou de faible poids moléculaire (HBPM) substances23 (par exemple , composés de platine) dans le milieu de travail. LMW agents ont une potentiel élevé de sensibilisation lors de la formation des haptènes et lient au transporteur protéines21. Inscription de nouvelles substances chimiques HMW ou LMW nécessite l’évaluation de risque in vitro et in vivo au sujet de leur potentiel de sensibilisation putatif (e.g., 429 lignes directrices de l’OCDE)24. Les tests utilisés pour déterminer la potentiel, de sensibilisation putative cependant, initialement ne visaient pas d’évaluation des risques des sensibilisants respiratoires, mais sensibilisateurs contact, bien qu’il ne semblait pas certaine congruence pour un petit sous-ensemble des substances25 . Le travail de Lauenstein et coll. a été conçu dans le cadre du projet européen Sens-it-iv, à élaborer des stratégies d’expérimentation alternatives pour l’évaluation des risques de contact putatif ou poumon sensibilisants21. Pour ce projet, nous nous sommes concentrés sur le test de l’utilisabilité des PCLS humain comme un outil de test alternatif. Par conséquent, un ensemble de points de terminaison immunomodulateurs (sécrétionpar exemple, la viabilité et cytokines) a été choisi afin de déterminer le potentiel irritant ou inflammatoire des produits chimiques, tels que les composés LMW platine. Lauenstein al ne trouvé aucune tendance générale qui pourrait s’appliquer à tous les sensibilisants respiratoires ; Cependant, leur travail fourni la Fondation pour les protocoles publiés récemment26.

En résumé, le protocole présenté ici pour la préparation et l’exposition subséquente de PCLS humaine fournit une méthode utile pour l’évaluation du poumon toxiques et/ou substances immunomodulatrices qui pourraient être impliqués dans le développement des voies respiratoires maladies comme l’asthme professionnel.

Protocol

Expériences avec PCLS humaine doivent être effectués selon Le Code de déontologie de l’Association médicale mondiale et approuvés par le Comité d’éthique local (les expériences PCLS exemplaires ci-contre ont été approuvées par le Comité d’éthique local de la Hannover Faculté de médecine ; nombre 2701-2015). Consentement éclairé à l’utilisation du matériel du poumon humain est exigé de tous les donateurs patients ou leurs proches. Les résultats décrits dans ce manuscrit ont été obtenus avec des tranches de tissus provenant de donneurs de tous âges, sexes, antécédents médicaux et cause de résection, bien que la plupart des tissus a reçu provenait de patients souffrant de cancer du poumon. Seulement exempt de tumeur a été utilisé pour des expériences.

1. Généralités préparation de PCLS humaine et une exposition ultérieure à des produits chimiques

Remarque : Deux personnes sont nécessaires pour remplir un poumon. Un carnet de vaccination à jour pour l’hépatite A et B est recommandé. Les patients sont systématiquement testées pour VHC et le VIH avant la transplantation de poumon. Si une infection active par le Mycobacterium tuberculosis est diagnostiquée ou suspectée, le poumon devrait être rejeté. Néanmoins, tous les tissus pulmonaires humains frais et échantillons dérivées de celui-ci doivent être traités comme potentiellement infectieux et correspondants des mesures de protection doivent être prises (masques de filtre de particule (FFP2), des lunettes de protection, gants) afin d’assurer la sécurité au travail de la personnel. La procédure prend 60-90 min.

  1. Confirmer le caractère intact du lobe du poumon humain.
    Remarque : Une déchirure dans la plèvre empêche un remplissage homogène du tissu. Matériau du poumon humain doit être dès le jour de la résection. Les périodes de stockage d’environ 2 h à température ambiante (RT) avant de remplir avec du gel d’agarose sur glace sont tolérés. Le tissu que nous utilisons dans le présent protocole est obtenu à partir des patients devant subir une résection. Il n’est pas de patients décédés. Si le tissu a été stocké sur glace, préchauffer à RT avant de le remplir, sinon l’agarose se polymérisent immédiatement et aucun remplissage homogène ne sera possible.
    ATTENTION : Veiller à ce que toutes les personnes en contact avec la matière humaine native mis sur les vêtements de protection composé d’une blouse de laboratoire, deux paires de gants, chapeau, masque et une paire de lunettes de sécurité. Matériel humain est potentiellement infectieux.
  2. Pèsent 7,5 g d’agarose basse-gélifiant et ajoutez-le à 250 mL d’eau bi-distillée. Faire bouillir l’agarose dans un four à micro-ondes jusqu'à ce que l’agarose est dissoute. Refroidir à environ 40 ° C, selon le point de fusion et gélifiant de l’agarose.
    Remarque : Plusieurs flacons sont nécessaires, selon la taille du lobe.
  3. Réchauffez et garder le milieu de culture (Table des matières) à 37 ° C.
    Remarque : Si l’agarose est trop chaude, vitamines dans le milieu de culture perdront efficacité et cellules risquent d’être endommagés. Si la température de la solution de support / d’agarose est inférieure à 37 ° C, le processus de gélification débutera et porter atteinte à un remplissage homogène du poumon. Qu’une gamme de température de 37 ° C à 39 ° C est recommandée.
  4. Placer tout le matériel requis à portée de main avant de commencer : 5-10 pinces, cathéter souple d’environ 1 m de longueur, une seringue appropriée (p. ex., 50 mL) raccord de connexion au cathéter et une boîte de glace rempli de glaçons.
  5. Cathétériser la bronche trachée/main en insérant le tube de silicone et il fixer avec un collier de serrage orientés parallèlement au tube, afin que la pince serre les tissus ensemble aux côtés du tube de silicone sans pincement elle éteint. Vérifiez que le tube de silicone est fixé à l’intérieur et qu’il ne puisse pas glisser dehors au cours de la procédure de remplissage. Fermez toutes les autres bronches, les vaisseaux sanguins et les blessures avec des pinces, afin qu’aucun agarose ne peut échapper au cours de la procédure de remplissage.
  6. Mélanger un volume équivalent de gel d’agarose de la bas-gélifiant de 3 % avec milieu de culture dans un bécher. Inculquer le mélange dans les poumons à l’aide d’une seringue de 50 mL. Avant le remplissage de la seringue avec support, pince ferme le cathéter avec les doigts ou une pince pour éviter les bulles d’air et d’agarose reflux. Remplir le lobe pulmonaire jusqu'à ce qu’elle est bien gonflée. Soigneusement de toucher la plèvre pulmonaire sur le côté ; la plèvre soit même et dur.
    Remarque : Selon la taille du lobe pulmonaire, jusqu'à 2 ou 3 L de solution d’agarose/moyennes peuvent être requis.
  7. Répétez les étapes 1,5 à 1,6 pour chaque bronche dans le cas de plusieurs bronches au sein d’un seul spécimen.
  8. Mettre le poumon sur la glace pour la polymérisation de l’agarose à gel pour 20 à 40 min, selon la quantité d’agarose instillée. Soigneusement de toucher la plèvre sur plusieurs côtés pour vérifier si c’est dur et froid, ce qui indique que la polymérisation est terminée, sinon patientez. Laissez les pathologistes couper le poumon en tranches, leurs échantillons et entreposer le matériel de poumon sur la glace pour le transport.
  9. Couper le tissu pulmonaire humain en tranches de 3 à 5 cm avec un couteau bien aiguisé.
    Remarque : Utiliser une lame neuve pour chaque poumon pour assurer la netteté.
  10. Remplir la coupeuse de tissu avec la solution saline équilibrée de 400 mL glacee Earle (EBSS). Carottes de tissu cylindrique sur les dalles de poumon avec un tournevis semi-automatique avec un outil de carottage du diamètre préféré provoquer la coupure immédiate (p. ex., 8 mm, 10 mm).
    Remarque : Ce diamètre doit être équivalent au diamètre du détenteur du tissu à l’intérieur de la machine.
  11. Ajuster l’épaisseur des tranches du poumon à la valeur de l’épaisseur désirée.
    Remarque : Une épaisseur d’environ 250 µm est couramment utilisée dans les expériences de la CIP. Le fabricant de la coupeuse de tissu recommande leur jauge d’épaisseur de tissu tranche pour la vérification de l’épaisseur de la tranche. Par ailleurs, entier-Montez la coloration combinée avec la microscopie confocale peut être utilisé pour déterminer l’épaisseur de la tranche, tel que décrit par Brismar et al. 27
  12. Transférer les noyaux du tissu dans le support papier de la coupeuse de tissu. Mettre le poids (partie du porte-tissu) sur le dessus de la base de tissu. Régler la vitesse de bras et de la vitesse de lame à 6 sur la trancheuse de tissu. Commencer le découpage le noyau de tissu en PCLS.
  13. Compléter à 500 mL de Dulbecco disponibles dans le commerce modifié Eagle (DMEM) : mélange de nutriments F-12 DMEM/F12 (1:1) avec 5 mL de pénicilline (10 000 unités/mL) et à la streptomycine (10 000 µg/mL). Conserver le milieu de culture pendant plusieurs jours dans des conditions stériles dans un réfrigérateur. Réchauffez le volume requis de médium.
    Remarque : La pénicilline sera inactive si maintenue à 37 ° C pendant une période prolongée. Utiliser le milieu de culture sans sérum et sans colorant, comme sérum composition varie d’un lot à l’autre et colorants, comme le phénol-rouge, peuvent interférer avec les dosages.
  14. Remplir une boîte de Pétri (100 x 15 mm) avec 25 mL glacee milieu de culture. Milieu doit être vidée hors de la coupeuse de tissu dans un bécher en ouverture de la pince de la bouteille de verre. Transférer les tranches d’un bécher dans la boîte de Pétri avec milieu de culture à l’aide d’un applicateur (par exemple, l’inoculation loop). Mettre la boîte de Pétri dans un incubateur (37 ° C, 5 % de CO2, 100 % d’humidité). Laisser le milieu pour se réchauffer avant les étapes de lavage.
    Remarque : Toutes les autres mesures sont effectuées dans des conditions stériles.
  15. Placer une passoire de cellule dans la boîte de Pétri pour laver le PCLS. Supprimer le milieu de culture avec une pipette sérologique de 10 mL à travers le tamis cellulaire complètement et ajouter 25 mL de milieu frais préchauffé de 37 ° C. Répétez cette étape 3 - 4 fois toutes les 30 minutes.
    Remarque : Le filtre de la cellule empêche les tranches d’être aspiré dans la pipette, pour éviter d’endommager les tranches.
  16. Transférer les tranches de poumon soigneusement dans une plaque 24 puits de culture avec un minimum de 500 µL de milieu de culture pour deux tranches par puits. Exposer le tissu pulmonaire aux substances (voir étapes 3.1 à 3.4), par exemple, pendant 24 h à 37 ° C, 5 % de CO2.
    Remarque : Pour le transfert, préférence utiliser une boucle de l’inoculation et laissez le flotteur de tranches sur la boucle pour éviter d’abîmer le tissu. Aucun encore de la séparation des tranches n’est nécessaire, comme seulement manque de milieu frais suffisamment va entraîner la mort cellulaire dans des tranches de tissu. Tranches de peuvent se chevaucher ou se touchent dans le puits : cela n’a aucune influence sur la viabilité des tissus.
  17. Mettre tout le matériel humain résiduel dans une fiole en plastique avec un fixatif (par exemple, 10 % tamponnée de formaldéhyde) pendant au moins 24 h et cela brûle dans le processus d’élimination.
    ATTENTION : Le formaldéhyde est toxique, effectuez cette étape sous une hotte.

2. histologique analyse de CIP

  1. Préparer des cassettes de la biopsie avec deux coussinets en mousse imbibés de fixateur (e.g., 4 % tamponnée formaldéhyde). Placez les PCLS entre les coussinets en mousse dans la cassette de biopsie et transférer immédiatement le tissu dans une solution de fixation. Mise en mémoire tampon de formaldéhyde Fix le tissu nuit à 4 %.
  2. Traiter le tissu paraffine incorporation par déshydratation des échantillons dans l’éthanol (70 %, 90 %, 100 %, 100 %, 100 %, 100 %) pendant 1 h chacun, suivi par le lavage dans le xylène (3 x 1 h) et de la paraffine liquide (3 x 1 h), conformément aux protocoles standard de l’histopathologie.
  3. Transférer le PCLS dans un moule d’encastrement. Utilisez une boucle de l’inoculation. Incorporer le tissu PCLS dans la paraffine liquide. Veillez à placer le tissu uniformément dans le moule, lors de la coulée du bloc de paraffine.
  4. Couper le bloc de tissu contenant le PCLS avec un microtome rotatif jusqu'à ce qu’il ait une surface plane et même. Prendre des coupes sériées de l’épaisseur désirée (e.g., 4 µm), en les plaçant individuellement sur numérotés consécutivement des lames de verre enduit (généralement 25-30 sections peuvent être prises) jusqu'à ce que le CIP entier a été traitée.
  5. Tacher les lames de verre unique (tous les articles 8-10) avec coloration hématoxyline et éosine (H & E) pour l’orientation. Sélectionner des sections pour l’expérience basée sur les diapositives de l’orientation (les premiers et le derniers 8 sections sont souvent incomplets).
    NOTE : (Facultatif) pour une conservation prolongée, diapositives peuvent être plongés dans la paraffine liquide pour la conservation.

3. préparation des Solutions pour les Substances

NOTE : Préparer des solutions de travail et contrôles immédiatement avant utilisent.

ATTENTION : Manipuler des substances selon les consignes de sécurité ou, s’il est inconnu, comme potentiellement dangereux et suivre les consignes de sécurité courantes.

  1. Dissoudre les substances solubles dans l’eau directement dans le milieu de culture. Pour les produits chimiques insolubles ou peu solubles, tout d’abord dissoudre la substance présente dans le solvant approprié selon la solubilité de la substance. Substances solubles dans l’eau limité (< 0,1 mg/mL) peut être dissous, par exemple, dans le DMSO ou l’éthanol. Concentrations de solvants non toxique doivent être déterminées par titration à l’avance. Veillez à ce que les substances ne donnent pas de précipitations hors de la solution en dilution dans un milieu.
    Remarque : HClPt sodium laureth sulfate (SLS) solutions sont préparées.
  2. Préparer les substance solutions à 100 fois de la concentration maximale souhaitée dans le milieu de culture ou de solvant. Pèsent 12,5 mg HClPt et 34,4 mg SLS et préparer les solutions en dissolvant les produits chimiques dans 1 mL de milieu de culture.
    Remarque : Aucun solvant n’est nécessaire pour ces produits chimiques.
  3. Préparer une dilution finale de 1/100 en moyenne préchauffé. Dans le cas d’une utilisation antérieure de solvant, cette approche se traduit par la même concentration en solvant finale pour toutes les concentrations de la substance.
  4. Utiliser la concentration finale en solvant (par exemple, 1 %, tel que décrit à l’étape 3.3) pour le traitement de référence de la CIP. Aucun solvant contrôle n’était nécessaire pour les produits chimiques mentionnés dans la section résultats.

4. positifs et négatifs des références pour les analyses de cytotoxicité

  1. Pour tous les dosages de viabilité, préparer les contrôles positifs et négatifs suivants :
    1. Contrôle de tissu : incuber PCLS dans le milieu de culture uniquement comme référence PCLS non traitée pendant 24 h à des conditions de culture de cellules (37 ° C, 5 % de CO2, 100 % d’humidité).
    2. Contrôle du véhicule (si nécessaire) : incuber PCLS avec la concentration finale de solvant comme une référence pour PCLS traités avec le véhicule seulement (Voir l’étape 3.4) pendant 24 h à des conditions de culture de cellules (37 ° C, 5 % de CO2, 100 % d’humidité).
    3. Contrôle positif : incuber PCLS avec 1 % de détergent dans la solution tampon pendant 1 h à 4 ° C.
      Remarque : Si PCLS deviennent sans couleur, le tissu est mort. Total L-lactate déshydrogénase (LDH) est déterminé dans le surnageant, avec une absorption d’environ 1,9 à 2,3 (voir étapes 6.1-6.4). Le tissu est utilisé pour le dosage de WST-1 (voir étapes de 5,1 à 5,5), avec une absorption d’environ 0.

5. mesure de la cytotoxicité induite chimiquement dans PCLS humaine par WST-1 dosage

Remarque : L’analyse de WST-1 est réalisée dans une plaque 24 puits avec deux CIP / puits. De préférence, utiliser des doublons pour chaque paramètre et le mettre en commun les résultats de ces doublons après la mesure.

  1. Préparer la solution de travail en diluant réactif WST-1 dans un milieu immédiatement avant de commencer. La quantité nécessaire de solution de travail est 250 µL/puits d’une plaque 24 puits. Par conséquent, mélanger 25 µL de réactif avec 225 µL de milieu de culture pour un puits.
  2. Après une incubation de PCLS de l’étape 1.16, jeter ou utiliser le surnageant pour mesures de cytokines ou d’autres tests tels que l’essai de la LDH. Le tissu restant est utilisé pour l’étape suivante.
  3. Pipette 250 µL de la concentration de travail du réactif par WST-1 puits et incuber les plaques à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 1 h. veiller à ce que le CIP est entièrement couverts par le réactif de WST-1 durant l’incubation.
  4. Placer la plaque dans un agitateur orbital (200 tr/min) et agiter soigneusement pendant 30 s pour assurer un mélange intime du réactif WST-1. Prendre une nouvelle plaque de 96 puits à fond plat et ajouter 100 µL des doublons du surnageant de chaque puits de la plaque 24 puits.
  5. Mesurer l’absorption de chaque puits à 450 nm (référence : 630 nm) à l’aide d’un lecteur de microplaques. Soustraire l’absorption à 630 nm de 450 nm. Ces valeurs seront utilisées pour le calcul au point 5.6).
    NOTE : Données fiables pour l’évaluation de la cytotoxicité peuvent être obtenues qu’à partir de tissus viables. Par conséquent, ces critères d’acceptation publiées par Hess et al. 15 devraient être respectées dans chaque expérience. Si ces critères ne sont pas remplies, l’expérience doit être répétée.
  6. Absorption du contrôle moyen non traitée sera au-dessus de 0,6, sinon que l’expérience doit être répétée. Si les données respectent cette exigence, définir la valeur d’absorption de la commande de tissus à 100 % et calculer la WST-1 réduction des échantillons traités par rapport à la commande de tissus.

6. dosage LDH

Remarque : L’analyse de la LDH est réalisée dans une plaque à 96 puits avec la culture 100 µL surnageant au total après la période d’incubation après.

  1. Après incubation de la CIP avec ou sans les agents de test, prendre 50 µL de surnageant de l’étape 1.16 et transférer des doublons dans une nouvelle plaque de 96 puits. Cela génère des doublons de chaque traité bien d’une plaque de 24 puits.
  2. Préparer la solution de réactif LDH immédiatement avant le dosage. La solution de travail se compose de la solution de catalyseur (lyophilisat dissous dans 1 mL d’eau Watercooling) et teindre la solution fournie par le fabricant. Pour une plaque à 96 puits, mélanger soigneusement 125 µL de solution de catalyseur avec 6,25 mL de solution de colorant.
    ATTENTION : Ne pas exposer la solution pour diriger la lumière.
  3. Pipetter 50 µL de la solution de travail dans chaque bien déjà contenant 50 µL de liquide surnageant et incuber la plaque pendant 20 min à ta dans l’obscurité. Aucun autre mélange est nécessaire.
  4. Mesurer l’absorption de chaque puits à 492 nm (référence : 630 nm) à l’aide d’un lecteur de microplaques. Soustraire l’absorption à 630 nm de 492 nm. Ces valeurs serviront pour le calcul à l’étape 6.5.
    NOTE : Données fiables pour l’évaluation de la cytotoxicité peuvent être obtenues qu’à partir de tissus viables. Absorption du contrôle imprégnées de détergent doit être supérieure à 1.
  5. Pour l’analyse, définir la valeur d’absorption du contrôle positif de l’étape 4.1 comme 100 % et calculer le rejet de la LDH dans les échantillons traités en ce qui concerne le contrôle positif (c'est-à-dire, libération de LDH maximale).

7. analyse de viabilité de microscopique avec Confocal Laser Scanning Microscope (cLSM)

Remarque : Pour le test de viabilité microscopiques, deux de la CIP de 250-µm d’épaisseur normale sont teint 250 µL/puits d’une plaque 24 puits. Comme chaque tranche est photographié séparément, sans doublon supplémentaires est nécessaires.

  1. Après incubation de PCLS avec ou sans éléments de test, jeter le surnageant ou utilisez-le pour mesures de cytokines ou d’autres tests tels que l’essai de la LDH. Utilisez le tissu restant pour la procédure décrite ici.
  2. Préparer la dilution de travail de calcéine-AM et éthidium homodimère 1 (EthD-1) avec une concentration de travail de ces deux réactifs de 4 µM dans le milieu de culture. Pour cela, ajouter 1 µL de calcéine-AM (4 mM) et 2 µL de EthD-1 (2 mM) à 997 µL de milieu de culture. Ce volume est nécessaire pour colorer les 4 puits avec deux PCLS chaque.
    NOTE : Éviter l’exposition des réactifs à la lumière directe.
  3. Pipette 250 µL de la dilution de travail dans chaque puits et incuber la plaque 24 puits pendant 45 min à ta dans l’obscurité. Placer la plaque dans un agitateur orbital à 150 tr/min pendant l’incubation pour assurer la meilleure exposition du tissu à la solution colorante.
  4. Après 45 min, jeter la solution colorante et laver le PCLS avec 1 mL de solution tampon par le biais de secousse à 150 tr/min pendant 3 à 5 min à ta dans l’obscurité. Répéter cette étape deux fois.
  5. Appliquer 500 µL de solution tampon dans chaque cupule contenant le PCLS teinté pour éviter l’autofluorescence de milieu de culture. Pour évaluation microscopique, effectuez au moins deux piles z distribués au hasard avec un cLSM.
  6. Cliquez sur l’onglet oculaire choisir un 10 X / 0,3 objectif et cliquez sur Online utilise le cLSM comme un microscope optique standard pour trouver la surface du CIP. Cliquez sur hors connexion pour quitter le réglage oculaire.
  7. Cliquez sur l’onglet Acquisition et allumer le laser approprié pour les fluorophores.
    NOTE : Nous avons utilisé un laser argon avec une longueur d’onde de 488 nm pour le polyanioniques colorant calcéine (excitation longueur d’onde de 495 nm) et par un laser HeNe avec une longueur d’onde de 543 nm pour la détection du complexe ADN-1/EthD (excitation longueur d’onde de 533 nm). Le laser à argon doit tourner en général 30 à 50 % du courant maximum pour permettre à un tube de courant d’environ 5,7 A, car cela prolonge la durée de vie de laser significativement.
  8. Cliquez sur le Chemin de lumière sous l’onglet Acquisition et mettre en place les filtres nécessaires et les miroirs pour l’expérience.
    Remarque : Dans la présente étude, un système de filtre a été utilisé avec un séparateur de faisceau dichroïque principal (e.g., HFT 488/543) qui sépare la lumière d’excitation et d’émission. À travers un miroir réfléchissant, que cette lumière est ordonnée pour le séparateur de faisceau dichroïque secondaire (p. ex., NFT 545) à encore séparé la lumière émise par l’échantillon en deux canaux.
  9. Mettre en place la bande passe filtres (p. ex., BP 505-530 pour le signal de calcéine et BP 560-615 le signal complexe EthD-1/ADN) qui transmettent seulement une certaine gamme de longueurs d’onde et assigner le signal de calcéine à canal 2 et le signal complex ADN-1/EthD au canal 3.
  10. Cochez la case Z-piles pour définir les limites supérieures et inférieures pour le volume microscopique. Appuyez sur le bouton Live pour voir une vue en direct de la couche correspondante sur l’écran. Déplacer le focus vers le haut ou vers le bas pour trouver la surface de la CIP avec un signal de forte.
  11. Cliquez sur la sous-section de canaux et cochez la case Afficher tous. Verrouiller la table en appuyant sur le bouton du canal correspondant sous l’image en direct et activer la couleur de la chaîne.
    Remarque : Une couleur bleue dans l’image en direct indique qu’il n’y a aucun signal, alors qu’un signal élevé apparaîtront en blanc et un signal surexposé apparaîtra en rouge.
  12. Affectez le trou d’épingle pour le canal EthD-1 rouge 1 unité aérée pour le meilleur compromis entre l’efficacité de collecte lumineuse et sectionnant optique et régler le canal de calcéine en conséquence. Augmenter le signal détecté du gain telle qu’elle apparaît blanc mais pas rouge dans l’image en direct avec tableau de blocage couleur canal activé.
    Remarque : Le gain de maître ne doit pas dépasser 600 unités.
  13. Augmentez ou diminuez l’offset numérique pour ajuster le fond tel qu’il apparaît en bleu dans l’image en direct avec tableau de blocage couleur canal activé.
  14. Cliquez sur l’onglet pile Z rubrique achat multidimensionnel et utiliser la mise au point de passer à un z-couche d’intérêt. Appuyez sur Set premier pour sauver cette position pour l’acquisition ultérieure. Lentement détourner l’attention vers le haut ou vers le bas jusqu'à ce qu’une gamme de 30 µm a été atteint et appuyez sur le Dernier Set pour enregistrer.
  15. Cliquez sur le Live une fois de plus à désactiver l’image en direct et appuyez sur Start expérience pour commencer l’imagerie.
    NOTE : Tissus viables sont détecté par fluorescence de la polyanioniques colorant calcéine. Les cellules mortes sont discriminés par la formation d’un complexe de EthD-1 et des acides nucléiques.

8. rendu d’image

Remarque : La recommandation concernant l’ordinateur du logiciel de rendu d’image doit tenir compte, que ce programme nécessite le matériel approprié.

  1. Chargez le fichier LSM acquis de viabilité microscopique coloration du CIP (voir Section 7) dans le logiciel de rendu d’image. Enregistrez-le en tant que fichier .ims avant de continuer. Définir tous les paramètres du contrôle de tissus et s’appliquent à toutes les images. Aucuns autres changements ne sont autorisés.
  2. Utilisez le bouton de Volume pour la reconstruction de surface des tissus viables (coloration de calcéine) (complémentaire de la Figure 1 a) et le bouton de Spots pour les noyaux des cellules mortes (Figure supplémentaire 1 H). Lors du rendu d’un seul canal, éteindre l’autre canal à l’écran de réglage.
  3. Commencer par rendre le volume de tissu vital : régler le canal de la surface, traiter l’image entière, régler le facteur lisse à 0,5 µm et utiliser l’intensité absolue de seuil (Figure supplémentaire 1 b, C). Appuyez sur la flèche bleue.
  4. Régler le seuil d’intensité absolue du volume reconstruit ; intensité de bruit et d’arrière-plan doit être soustrait. Recouvrement de surface apparaît en gris et l’exactitude de la couverture de la surface doit être vérifié (complémentaire Figure 1). Après avoir terminé le réglage, appuyez sur la flèche bleue. La plupart du temps cette étape est requise pour le calcul des paramètres. Si le logiciel n’est pas en mesure de calculer le volume, augmenter le facteur de douceur.
  5. Dans la dernière étape, choisissez un filtre. Utilisez le filtre de sphéricité (avec environ 10 µm) pour le rendu de surface pour filtrer les macrophages dans l’espace alvéolaire (1E Figure supplémentaire). Appuyez sur le bouton vert vers l’avant.
  6. Optiquement, réglez l’image de sortie et exporter les statistiques sous forme de fichiers .xls. Le volume total (somme) sera utilisé pour une analyse ultérieure (complémentaire Figure 1F, G). Enregistrer les paramètres et utilisez-les pour toutes les analyses plus poussées des z-cheminées prises le même jour avec les mêmes paramètres cLSM (Figure supplémentaire 1I).
  7. Reconstituer la couche rouge (taches) pour les noyaux des cellules mortes. Au hasard mesurer la taille de point en µm d’échelle dans la fenêtre de surpass ; taille de la dot est environ 5 µm. Mark Enable et définissez la taille de point. Vérifiez que tous les points sont marqués et chaque point est compté qu’une seule fois. Corriger manuellement si nécessaire (Figure supplémentaire 1 b, H, J). Appuyez sur la flèche bleue.
  8. Appuyez sur le bouton vert avant de laisser le programme calculer/comptage le nombre total de points selon les paramètres défini et exporter le résultat en tant que fichier .xls (Figure supplémentaire 1 K, L, M). Pour l’analyse graphique ou statistique de l’image définie le nombre de noyaux de cellules mortes calculée en rapport au volume de tissu vital.

9. mesure des Cytokines et chimiokines dans PCLS humaine

Remarque : La réponse immunitaire de cytokines et de chimiokines peut être mesurée extracellulaire dans le surnageant de culture et intracellulaire dans les lysats de tissu après la période d’incubation. ELISA est mesurée en doublons dans une plaque à 96 puits avec 100 µL/puits.

  1. Préparer une solution de 1 % de détergent en mélangeant 5 mL de détergent à 495 mL de solution tampon. La solution peut être conservée à la droite depuis plusieurs mois.
  2. Mélanger la solution de détergent 1 % avec inhibiteur de protéase (PI) à un ratio de 1/500. La quantité requise dépend de la plaque de culture ; par exemple, utilisez 500 µL/puits d’une plaque 24 puits. Pour un puits, mélanger 1 µL de PI avec 499 µL de solution détergente.
  3. Préparer les tubes avec 1 µL de solution de PI et de recueillir 500 µL de surnageant dans ces tubes de culture. Remplacer immédiatement le milieu de la plaque 24 puits de 500 µL de solution de détergent contenant PI tel qu’établi à l’étape 9.2. Lyse tissulaire pendant 1 h en plaçant la plaque 24 puits à 4 ° C. Pipette le lysat dans un nouveau tube de tissu et de conserver ces tubes à-80 ° C jusqu'à l’analyse ultérieure.
    Remarque : Le protocole ELISA dépend fortement du fabricant, et doivent suivre les instructions du fabricant. Un protocole standard d’ELISA est décrite ci-après.
  4. Effectuer le test ELISA pour évaluer le niveau de cytokine dans le surnageant ou lysat selon les instructions du fabricant. Pour mesurer le TNF-α et IL-1α, manteau plaque a96-puits de pipetage 100 µL de l’anticorps de capture (pour une dilution se conformer aux instructions du fabricant) et incuber une nuit à température ambiante.
  5. Préparer le tampon de lavage en dissolvant une tablette de tampon de lavage dans 1 L eau Watercooling. Supprimer l’anticorps de capture et µL de tampon de lavage pipette 400 dans chaque puits. Remplacer ce volume trois fois. Bloquer la plaque en ajoutant à la solution de saturation (par exemple, 1 % de BSA dans la solution tampon, selon les instructions du fabricant). Incuber à RT pendant 1 h.
    Remarque : Standard ELISA disponibles dans le commerce nécessitent 2 x 100 µL de tissu surnageant ou lysat. Échantillons doivent être une fois décongelés et juste avant utilisation. Selon la sensibilité du dosage et sur les cytokines libérées, les échantillons doivent être dilués avant mesures. Par conséquent, diluer l’échantillon dans le réactif fourni par le test.
  6. Enlever la solution de blocage et ajouter des échantillons dilués pour la courbe d’étalonnage (pour une dilution se conformer aux instructions du fabricant) et 100 µL de tissu surnageant ou 100 µL de lysat en doublons recueillies à l’étape 9.3 des tissus. Incuber pendant 2 h à température ambiante.
  7. Supprimer les échantillons et µL de tampon de lavage pipette 400 dans chaque puits. Remplacer ce volume trois fois. Ajouter 100 µL détection biotinylé (pour une dilution se conformer aux instructions du fabricant) et incuber pendant 2 h à température ambiante.
  8. Enlever les anticorps et les µL de tampon de lavage pipette 400 dans chaque puits. Remplacer ce volume trois fois. Ajouter 100 µL/puits de streptavidine marquée HRP (pour une dilution se conformer aux instructions du fabricant) et incuber pendant 20 min à ta (Vérifiez les instructions du fabricant).
  9. Supprimer la Streptavidine et µL de tampon de lavage pipette 400 dans chaque puits. Remplacer ce volume trois fois.
  10. Ajouter 100 µL de substrat (recommandé par le fabricant) et incuber pendant 20 min à l’obscurité (Vérifiez les instructions du fabricant).
    Remarque : Cette étape est sensible à la lumière. Éviter l’exposition à la lumière du substrat et plaque.
  11. Arrêter la réaction en ajoutant 50 µL de solution stop (1 M H2SO4). Mesurer l’absorption de chaque puits à 450 nm (référence : 570 nm) à l’aide d’un lecteur de microplaques. Soustraire l’absorption à 570 nm de 450 nm.
    Remarque : N’est pas traité et/ou commandes de tissus véhicule servent de témoins négatifs. Pour induire une réponse immunitaire dans les tissus pulmonaires, utiliser une stimulation appropriée (p. ex., lipopolysaccharide (LPS) de 100 ng/mL) comme témoin positif. Incuber les deux puits avec deux automates / puits avec 100 ng/mL LPS dans le milieu de culture, par exemple, pendant 24 h et de recueillir le surnageant et le tissu lysat comme indiqué au point 9.3.
    Remarque : Les valeurs mesurées sont acceptées, si l’absorption de la plus grande qualité est égale ou supérieure à 1,0 ; sinon la mesure doit être répétée. La courbe d’étalonnage doit suivre l’ajustement de courbe dose-réponse sigmoïde.
  12. Des concentrations de cytokines (pg) par ELISA a déterminé à l’étape 9.11 sont normalisées à la teneur en protéines totale déterminée dans le tissu de lysat de chaque échantillon (voir Section 10).

10. mesure de la teneur en protéines totales dans PCLS humaine

Remarque : Les PCLS doivent être lysées pour mesurer la concentration en protéines. Les lysats de tissu de l’étape 9.3 sont utilisés pour cette étape. L’analyse est réalisée dans une plaque à 96 puits plat avec 25 µL/puits de tissu lysat, éjectant des doublons.

  1. Élaborer une norme de BSA de 7 points avec des concentrations de BSA de 2 000 µg/mL, 1 500 µg/mL, 1 000 µg/mL, 750 µg/mL, 500 µg/mL, 250 µg/mL et 125 µg/mL. Appliquez 25 µL des doublons pour chaque norme et utilisez 25 µL de solution de tampon comme blanc sur une plaque à 96 puits (utiliser une plaque avec une plaque de couverture).
  2. Pipetter 25 µL des lysats (voir étape 9.3) dans chaque puits en doublons dans une plaque de 96 puits. Au total, 50 µL de chacune est bien nécessaire. Préparer le réactif de travail de solution BCA par BCA diluant réactif B 01:50 dans réactif BCA A. Pour une plaque à 96 puits utiliser 400 µL de réactif B et 20 000 µL de réactif A.
  3. Soigneusement ajouter 200 µL de réactif au travail dans chaque puits, en évitant les bulles d’air. Placer la plaque dans un agitateur orbital (150 tr/min) pendant 30 s pour obtenir un bon mélange de lysats et réactif et mettre une couverture plat sur la plaque. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 30 min à l’obscurité. Mesurer l’absorption de chaque puits à 540-590 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.
    Remarque : Les résultats de mesure sont acceptés, si l’absorption de la BSA plus haute standard est égale ou supérieure à 0,8 ; sinon la mesure doit être répétée. La courbe d’étalonnage doit suivre l’ajustement de courbe dose-réponse sigmoïde.
  4. Pour l’analyse, calculer la courbe d’étalonnage en utilisant une équation 4-paramètre de Marquardt après soustraction du blanc. Calculer les concentrations de protéine d’échantillons inconnus en utilisant l’ajustement de la courbe standard.

Representative Results

Avec la méthode de recherche actuelle, PCLS humaines ont été préparés et exposés à des cinq concentrations des substances industrielles pour évaluer les effets immunomodulateurs chimiquement induites en matière de poumon humain. Les tissus pulmonaires a été exposé dans des conditions submergées comme culture permanente pendant 24 h. toxicité a été évaluée par la mesure de la LDH libérée, l’activité mitochondriale et viabilité microscopique coloration. En outre, la teneur totale en protéines pour la normalisation et des cytokines pro-inflammatoires ont été mesurés. La mesure du possible, la concentration inhibitrice (IC) 75 valeurs ont été calculées par un montage non linéaire courbe sigmoïde. Les substances de référence positive, détergents pour cytotoxicité et LPS pour la réponse cytokine innée, ont été utilisés pour la validation de chaque course. La transformation logarithmique IC75 [µM] valeurs (Journal CI50) ont été utilisées comme concentrations « irritantes » pour les mesures de libération ultérieure de cytokine.

Figure 1 et Figure 2 illustrent la procédure de mastic du poumon humain et coloration H & E exemplaire de PCLS humaine. Procédures de routine hygiéniques doivent être suivies pour éviter des effets négatifs sur la santé et assurer la sécurité du personnel de manutention des matériaux du poumon humain. La technique nécessite la formation du personnel et la pratique. Connu des pathologistes qui distinguent les différentes régions (lobes supérieur et inférieur et sous-pleurales versus plus central) et malades par rapport aux zones saines sont nécessaires pour évaluer l’état pathologique de la matière du poumon humain. Le PCLS humain généré doit être utilisé pour la préparation de H & E-teint les coupes minces, qui peuvent être réévaluées par un pathologiste. Cette procédure permet aux utilisateurs d’acquérir pratique en discriminants différentes zones malades et emplacements dans les poumons.

Figure 3 présente les résultats de mesure pour l’activité LDH et WST-1 humaine PCLS après 24 h d’incubation avec SLS. La moyenne non traitée sans SLS, montré à 0 µg/mL SLS, est un contrôle de qualité important. Valeurs doivent être inférieurs à 20 % pour LDH comparé avec tissu de détergent-lysées et > 0,7 unités d’absorbance de l’essai de WST-1. Ces contrôles de qualité servent également d’indicateurs de viabilité des tissus insuffisant. La réactivité du tissu humain vers la solution détergente, comme une substance toxique efficace, doit être incluse à titre de témoin positif. Il devrait se traduire par une augmentation de 300 à 500 % (> 2,0 unités d’absorbance) de LDH par rapport aux tissus non traités et dans les valeurs < 0,1 unités d’absorbance de l’essai de WST-1. SLS a entraîné une réduction dose-dépendante de la viabilité cellulaire telle que mesurée par une augmentation des LDH et une diminution de l’activité métabolique dans le dosage de WST-1 à des concentrations > 87 µg/mL. Un modèle de concentration-réponse sigmoïde a été ajusté aux données, afin qu’il soit possible de calculer les valeurs IC75 ou CI50. Ces valeurs peuvent par la suite utilisées pour sélectionner les concentrations pour les niveaux de cytokines et de chimiokines : des concentrations hautement toxique, généralement no ou seulement diminuée de cytokines et chimiokines peuvent être détectées. Par conséquent, des concentrations non toxiques ou seules légèrement toxiques (IC75) sont recommandées. Il est important de noter ici que l’augmentation prévue de l’activité LDH dans le surnageant de culture cellulaire est souvent influencée par la substance appliquée21. Fréquemment, les interférences se produisent entre l’activité enzymatique et de la substance, conduisant à une mauvaise interprétation des résultats si le dosage LDH est le test de cytotoxicité seul utilisé. Ainsi, il est important et nécessaire d’effectuer plusieurs analyses de cytotoxicité pour obtenir des résultats fiables et valides. En outre, il convient de mentionner que la sensibilité des essais LDH et WST-1 est très comparable.

Dans la Figure 4, images microscopiques de la viabilité de PCLS démontrent réactivité du tissu humain à détergent comme substance toxique efficace. Les résultats sont très utiles pour confirmer d’autres données de viabilité, mais cela nécessite un équipement supplémentaire. Les effets toxiques sont visuellement évalués par évaluation du tissu de calcéine positifs par rapport aux noyaux des cellules EthD-1 positives. Segments choisis au hasard au sein du parenchyme généralement lieu à données comparables, alors que les voies respiratoires ou des vaisseaux sanguins doivent être évités, comme les plus grandes cavités peuvent se déplacer les résultats. De notre expérience et avec les paramètres microscopiques décrits ci-dessus, un volume moyen entre 1.5 x 106 et 5 x 106 µm3 du tissu contrôle est mesuré. Les valeurs dépendent de qualité matérielle du poumon, qualité PCLS et aussi sur la maladie du donneur de tissus pulmonaires. Même si la viabilité des tissus pulmonaires humains varie entre les donateurs, le nombre de noyaux de cellules mortes par rapport aux tissus viables ne doit pas dépasser 15 % du contrôle des tissus. Si les noyaux des cellules mortes sont principalement présents dans le contrôle de tissus, cependant, l’expérience devrait être abandonnée.

Figure 5 affiche des données représentatives pour l’effet immunomodulateur de HClPt et SLS sur le tissu de poumon humain. Les cytokines pro-inflammatoires TNF-α et IL-1α sont des marqueurs biologiques de l’inflammation, indiquant le début des processus inflammatoires après exposition à stimuler des substances. Les deux cytokines ont été mesurés par ELISA. IL-1α extracellulaire est généralement faible dans PCLS humaine, alors qu’IL-1α intracellulaire atteint des niveaux de 1 000 pg/mL et plus. Une diminution de IL-1α intracellulaire indique les processus cytotoxiques en cours - et est plus souvent observée après exposition des PCLS humaine aux produits chimiques. Si le tissu est stimulé avec le LPS, un activateur du système immunitaire inné et comme tel la bientraitance contrôler, puis la plus grande partie de l’IL-1α induite ne peut être détectées dans les cellules après 24h. En revanche, la sécrétion de TNF-α induite par la stimulation de la LPS principalement mesurable extracellulaire. L’utilisation d’un contrôle positif approprié, tels que des disques vinyles, démontre la validité d’une méthode. Avec la méthode de recherche actuelle, PCLS humains ont été exposés à trois concentrations de HClPt (32, 64 et 125 µg/mL) ou deux concentrations de SLS (1 et 10 µg/mL) pendant 24 h sécrétion a été déterminée comme une somme des cytokines intracellulaires et extracellulaires de Cytokine normalisé à des concentrations de protéines totales, comme illustré à la Figure 5. Il est à noter ici que le test de BCA est généralement utilisé pour la détermination de la teneur en protéines totales, cependant, elle reflète aussi la cytotoxicité induite par la substance. Par conséquent, à des concentrations hautement toxiques la teneur totale en protéines ne peut servir pour la normalisation des données de cytokine. Sécrétion d’IL-1α a augmenté significativement de 263 ± 38 pg/mg à 887 ± 216 pg/mg et de TNF-α de 263 ± 38 pg/mg à 1 160 ± 286 pg/mg (Figure 5A, B). En outre, la sécrétion de TNF-α et IL-1α induite par LPS est présentée par rapport à un contrôle de tissus non stimulées. Induction de cytokines pro-inflammatoires par les profils moléculaires de micro-organismes pathogènes associés, tels que des disques vinyles, démontre la validité d’une méthode et est fortement recommandée à utiliser lorsque vous travaillez avec PCLS humaine pour étudier les effets immunomodulateurs. Pour plus de détails sur les données HClPt et SLS, veuillez vous reporter à l’étude de Lauenstein et al. 21

Figure 1
Figure 1 : Procédure pour le garnissage du poumon humain. Le poumon humain est préparé immédiatement après résection. Le poumon doit être conservé à température ambiante pendant remplissage compatible avec agarose et d’éviter la polymérisation d’agarose soudaine pendant le remplissage. Le poumon est positionné horizontalement, avec les lobes étalés pour une vue optimale sur la bronche ou des bronches (A & B pour les gros plan sur les bronches). Les bronches sont canulés avec un tube souple en silicone et fixés avec des colliers de serrage (C). Après le remplissage intérieur et agarose polymérisation dans les tissus, formés pathologistes couper le poumon en tranches d’environ d’épaisseur 3-5 cm (D). Ces tranches de carottes de tissu cylindrique (Ø par exemple, 8 mm) sont préparés avec un outil de carottage (E). Ces noyaux de tissus est coupés avec une trancheuse de tissu en CIP, qui est immédiatement transférés en milieu rempli de Pétri pour incubation dans des conditions de culture de cellules normales (E). Après que plusieurs étapes de lavage le PCLS sont transférées dans des plaques de culture cellulaire (p. ex., plaque 24 puits avec deux PCLS par puits et 500 µL de milieu) pour supprimer les débris cellulaires résiduelle et médiateurs cellulaires libérés (F). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Détermination de l’état de santé de PCLS humaine par la coloration H & E. Le PCLS dans cette image, préparée à partir d’un donneur avec une tumeur du poumon, montre le tissu de poumon intact avec parenchyme alvéolaire, périphérique airways (*) et les vaisseaux sanguins (pointes de flèche) dans la vue d’ensemble (A). À fort grossissement, conduite airways avec l’épithélium respiratoire cilié intact (pointes de flèches) (B), une structure alvéolaire intacte bordée de pneumocytes viables, y compris un capillaire avec nombreux érythrocytes (pointes de flèches) (C), les espaces alvéolaires contenant des macrophages alvéolaires (CD68 immunohistochimie) (D), ainsi que les vaisseaux sanguins avec l’endothélium intact (CD31 immunohistochimie) (E) peut être observée. Seulement le tissu exempt de tumeur a été utilisé pour le CIP, c’est pourquoi aucune zone macroscopiquement malades n’est visibles. Contrairement à PCLS préparés à partir de donneurs avec d’autres maladies pulmonaires, comme l’emphysème ou la fibrose, la structure alvéolaire n’est pas perturbée et le CIP est seulement légèrement effiloché à la frontière extérieure, probablement en raison des étapes de préparation. Barres d’échelle indiquent 1 000 µm (A) et 50 µm (B–E), respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Détermination de la cytotoxicité induite par SLS dans PCLS humaine, mesurée par la fuite de l’enzyme LDH dans le milieu de culture (A) et la perte de l’activité enzymatique métabolique évaluée avec le colorant WST-1 B. PCLS humains ont été exposés à des concentrations croissantes de SLS. Un modèle de concentration-réponse sigmoïde a été par la suite ajusté aux données, afin que les valeurs IC75 ou CI50 (concentration inhibitrice à 25 % et 50 % de réduction de la viabilité des cellules) peuvent être calculés (figures de droite). Les données sont présentées comme moyenne ± et, n = 3-5. Absorbance de l’essai de la LDH a été mesurée à 492 nm (référence à 630 nm) et de dosage de WST-1 à 450 nm (référence à 630 nm). Données ont été adaptées et modifiées de Lauenstein et al. 21 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Des images représentatives du rendu de coloration et de l’image microscopique en trois dimensions de humaine PCLS. Contrôle des tissus vivants et la réactivité des tissus à détergent, comme une substance toxique efficace, sont indiqués après coloration de PCLS humaine avec calcéine AM (jaune) et EthD-1 (rouges). Piles de 30 µm ont été prises avec un objectif 10 X (A) et (B) a rendu. La barre d’échelle indique 100 µm. Excitation longueurs d’onde 488 nm et 543 nm, émission filtres BP 505-550 nm et LP 560 nm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Diammonium d’ammonium (HClPt)-induite par la sécrétion de TNF-α et IL-1α dans PCLS humaine après 24 h d’exposition. PCLS ont été exposés à trois concentrations (µg/mL 32, 64 µg/mL et 125 µg/mL de HClPt) et deux concentrations différentes (1 µg/mL et 10 µg/mL) de SLS. Extracellulaires et intracellulaires de IL-1α (A) et de TNF-α (B) ont été déterminées par ELISA et normalisée à la teneur totale en protéines. Pour montrer la validité de la méthode un positif activateur du système immunitaire inné, LPS, est montré comme une référence intracellulaire IL-1α (A) et libération de TNF-α (B) extracellulaire, normalisée à la teneur totale en protéines. Les données sont présentées comme moyenne ± SEM, *p < 0,05 et ***p < 0,001 ; HClPt et SLS : n = 9, IL-1αLPS: n = 5, TNF-αLPS: n = 4 en technique double (test de Mann-Whitney). Ce chiffre a été modifié par Lauenstein et al. 21 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Supplementary Figure 1
Supplémentaire Figure 1 : détaillé traitement algorithmique pour les images de viabilité microscopique coloration à l’aide du logiciel de rendu. Opératoire étape par étape pour l’analyse d’image des images téléchargées de LSM pour rendu de surface des tissus viables calcéine teinté (A–G, I) et spot détection des noyaux des cellules colorées homodimère d’éthidium (H, J–M). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Supplementary Figure 2
Supplémentaire Figure 2 : vue d’ensemble de l’analyse d’image informatique de viabilité microscopique coloration des tissus pulmonaires humains. Des tissus viables (jaune) a été analysée par le rendu de surface (B–j’ai) et des noyaux de cellules mortes (rouges) ont été détectés par détection spot (J–P). Le mode de capture instantanée a été utilisé pour exporter l’image (Q). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

La technique PCLS humaine est bien établie dans notre laboratoire. Le présent document donne une description de cette technique et son utilisation pour l’évaluation toxicologique des substances dans les tissus pulmonaires ex vivo. En général, n’importe quel laboratoire à l’aide de que cette technique devrait s’efforcer de mettre en place un test associés définition des gammes quantifiables, estimation des variabilités et des contrôles de qualité garantissant la validité de l’expérience. Procédures standards possibles pourraient être, par exemple, de répéter à chaque point de terminaison, par exemple, le test de cytotoxicité, en un minimum de trois donateurs biologiques (exécutions individuelles) avec un minimum de deux ou trois répétitions techniques par échantillon y compris positive et références négatives. Personnel de laboratoire doit être formé pour améliorer la cohérence de l’analyse et de réduire la variabilité du dosage.

Paramètres fréquemment utilisés pour évaluer les effets immunomodulateurs des substances sur les tissus pulmonaires comprennent la cytotoxicité des mesures à l’aide de différentes épreuves (p. ex., dosage LDH, WST-1 test, test de coloration microscopique), analyses de cytokines, ainsi que changements dans le profil d’expression et la caractérisation de l’évolution des populations cellulaires par immunohistopathological méthodes6. En outre, il y a des techniques décrivant la visualisation des cellules, comme les cellules dendritiques pulmonaires, murin PCLS28 qui peuvent aussi être transférées à PCLS humain et pourrait ainsi fournir un aperçu plus détaillé de la composition cellulaire avant et après le traitement avec des substances cytotoxiques putatifs.

Ce protocole de base et la technique pour la préparation des coupes de tissus pulmonaires humains est comparable aux techniques qui ont été bien décrits dans les publications29. En bref, le matériel organique est obtenu chez des patients souffrant de maladies chroniques vivent en danger telles que le cancer du poumon, qui doivent subir une intervention chirurgicale de résection ou de la transplantation. Les études doivent être approuvés par le Comité d’éthique local. Consentement écrit éclairé des patients est nécessaire. Mise en place d’un flux de travail clinique et le laboratoire est une question essentielle et requiert la communication et la définition des interfaces et des infrastructures entre les deux sites. Poumon humain matériel doit être traitée directement après résection de préserver la viabilité des tissus. Il est à noter que la technique décrite ici pour PCLS humaine peut être appliquée aux jeunes et moins jeunes poumons et à poumons sains et malades. Aux États-Unis, par exemple, il est possible d’obtenir des poumons de donneurs d’organes sains qui sont morts dans des accidents ou dont les organes ont été rejetés à la transplantation.

La première étape critique dans le protocole est l’inflation des voies respiratoires et parenchyme environnant avec une solution d’agarose. Cette étape est nécessaire pour consolider le tissu très doux pour la suite de la procédure tranchage. La qualité du matériau du poumon humain, basé sur le fond de la maladie, est ici essentielle. Seulement les lobes avec plèvre intacts peuvent être remplis. Les tumeurs de stade près de la bronche empêchent parfois le processus de remplissage. Avant de gonfler le matériel humain, la température de la solution d’agarose doit être soigneusement vérifié. Trop de sang (ou autres fluides, exsudats) à l’intérieur de l’homme tissu pulmonaire se traduira par une dilution intempestif d’agarose et influera sur le procédé de polymérisation. Après inflation du tissu pulmonaire et gélifiants d’agarose sur glace, les poumons sont découpées en sections de 200 à 300 µm d’épaisseur. La cohérence du tissu est un problème très sérieux. Si le tissu est trop mou, il est difficile de trancher de sections égales. Même si le microtome même paramètres sont définis pour chaque donneur, l’épaisseur des tranches entre bailleurs de fonds peut-être varier, les due à des conditions et les changements pendant le gonflage du processus pour chaque poumon. Remplissage non homogène du tissu se traduira par tranche de différentes épaisseurs. Au lieu de mesurer et de normaliser l’épaisseur des tranches, mesure de la teneur totale en protéines peut être utilisé pour surveiller indirectement les épaisseurs de tranches de poumon. Plusieurs maladies terminale d’entraver le processus de découpage en tranches ; par exemple, le sang navires sont très épaissies dans l’hypertension pulmonaire et de tissu fibreux peut être si raide que découper des cylindres de tissu n’est guère possible, et la lame microtome doit être remplacé très souvent.

Après la préparation des humains PCLS et intensifs, étapes de lavage, qui sont nécessaires pour éliminer les débris cellulaires et libéré des enzymes, tissu sections peuvent être utilisées pour des expériences29. PCLS humaines sont cultivées dans des conditions de culture cellulaire normale et exposés, par exemple, aux produits chimiques, médicaments ou lipopolysaccharides. La contamination occasionnelle des PCLS due à des infections (inconnues) est un numéro spécial dans la culture du matériel de poumon humain. Les cultures de tissus présentant des infections doit être abandonnées et l’équipement doit être soigneusement désinfecté. Séparation spatiale entre lieux de laboratoire utilisés pour la préparation d’une part et la mise en culture en revanche peut aider à éviter les infections croisées. En ce qui concerne l’équipement, le microtome peut fuir, et vis à six pans lâches peuvent conduire à endommager le moteur et l’arrêt du mouvement de la lame. Pas toutes les parties de la trancheuse sont faite d’acier inoxydable, et donc il va s’oxyder si ne pas séché modifier immédiatement le nettoyage. Pour surmonter les problèmes de matériel, il peut être nécessaire d’avoir au moins une unité de sauvegarde.

Dans des publications antérieures, agarose a été signalé à être rincés et enlevé au cours intensifs étapes de lavage après confection. En fait, ce n’est pas possible, l’agarose ne peuvent pas être supprimé. Vue de l’élimination complète de l’agarose, il doit être re-fondu à haute température, ce qui détruirait le tissu. L’agarose dans les alvéoles et airways n’interfère pas avec les points de terminaison décrits. Autres points de terminaison peuvent être influencées par la présence d’agarose (voir aussi les limites). La nécessité de préparer des coupes de tissus très frais doit souligner que la viabilité des tissus est une question essentielle dans la culture. Bronchoconstriction n’est pas un paramètre valide pour la viabilité. Nous recommandons d’utiliser au moins deux ou trois analyses de cytotoxicité indépendants pour vérifier la viabilité du parenchyme environnant ; Cela doit être vérifié à chaque expérience30. Contrôles de la qualité dans les analyses de cytotoxicité servir d’indicateurs de viabilité des tissus insuffisant. Par conséquent, il est recommandé d’évaluer la souplesse des tissus, par exemple, la substance toxique efficace comme un détergent dans toutes les analyses de cytotoxicité. Basées sur les courbes dose-réponse, les valeurs minimale et maximale d’absorption doivent être définis pour les analyses de cytotoxicité et rencontré des expériences subséquentes. Autres modifications au protocole dépendent principalement de produits chimiques appliqués et les points de terminaison d’intérêt. L’applicabilité des produits insolubles ou très réactifs chimiques est limitée. La plus forte concentration de solvant pour DMSO est limitée à 1 %. Des concentrations plus élevées peuvent être utilisées mais pouvant entraîner un rejet prononcé des cytokines pro-inflammatoires, telles que l’IL-8. En revanche, le stimulus utilisé peut être relativement faible. Dans ce cas, la quantité de tissu peut être augmentée de deux à quatre tranches / puits. Cette approche limite la viabilité à 24h.

Une limitation majeure de PCLS humaine, c’est qu’en Allemagne ils peuvent seulement être préparés de matériel du poumon humain malade. Les patients qui subissent une chirurgie sont normalement plus de 50 ans et 80 % des patients atteints de cancer du poumon sont ou l’habitude d’être des fumeurs. Médicaments des patients, comme les glucocorticoïdes, peuvent également influencer l’issue des expériences utilisant des tissus humains. Par conséquent, il est essentiel de : i) valider chaque expérience de références positives, vérifier la viabilité, la fonctionnalité et la sensibilité du tissu individuel et ii) Croix-valider les résultats à l’aide du tissu pulmonaire sain, non malades, âge moyen de animaux de laboratoire (des primates comme les macaques et, si possible, souris, rat, cochon d’Inde). Le mieux le score de pathologie des tissus malades, plus les résultats expérimentaux. Tissu fortement malade difficilement utilisable et montre très souvent limité la viabilité, des niveaux de cytokine insuffisamment basse ou très élevée, des infections bactériennes ou fongiques et moins bronchoconstriction. Donateurs-à-donneur variation est plus élevés comparée aux résultats obtenus provenant d’animaux de laboratoire, reflétant la variabilité individuelle de l’homme. Il s’agit, cependant, pas une limitation en général ; comme mentionné ci-dessus, dans d’autres pays (par exemple, aux États-Unis), qu'il est possible d’obtenir des poumons en santé de donneurs d’organes décédée a rejeté à la transplantation. La réactivité du tissu a été bien décrit pour la première jusqu'à 48 h dans les expériences d’exposition aiguë. Viabilité et la fonctionnalité du tissu est réduite après plusieurs jours de culture ou après stockage à-80 ° C. Il est possible de tissu de poumon humain de la culture pour jusqu'à environ 14 jours. La viabilité continue pendant cette période ; Toutefois, une augmentation de la variabilité, mais aussi une perte de fonctionnalité de plusieurs populations de cellules, tels que les macrophages dans les tissus est observée, aboutissant à la libération de cytokines limitée en réponse aux mitogènes. Une autre limite pour certains critères d’évaluation est la présence d’agarose dans le tissu, entraver, par exemple, l’isolement des montants suffisants et de qualité de RNA31 ou la préparation des suspensions de cellules individuelles pour cytométrie ultérieures et phénotypage des cellules. La possibilité d’éclairer mécaniste dans réponses unicellulaire et la fonctionnalité est donc limitée.

Organotypique tissu modèles, tels que PCLS humaine, sont considérés comme avoir un fort impact sur la recherche fondamentale et non cliniques. Poumon humain matériel a une composition biologique qui reflète fidèlement l’architecture de l’organe normal. Il contient, par exemple, des cellules épithéliales alvéolaires et bronchiques résidentiels, cellules musculaires lisses, fibroblastes, cellules endothéliales, des fibres nerveuses et les macrophages. Le tissu est viable et cellules répondent à plusieurs stimuli. Nerveuses des fibres, bien coupé, peut être activée localement, conduisant à des réponses réflexes borne14. Par conséquent, ce modèle ex vivo offre la possibilité d’étudier cellulaire les réponses immunitaires innées, réactions de défense, cytokine signalisation et induction de marqueurs de surface cellulaire. Plusieurs améliorations dans la technique, mise en culture et validation des points de terminaison de permettent l’utilisation de PCLS humain dans la science translationnelle. Exemples d’approches futures sont : i) validation de nouveau cible dans les tissus pulmonaires humains, ii) évaluation de la réponse immunitaire après l’exposition, par exemple, aux produits chimiques, médicaments, nanoparticules, etc., iii) supplémentation du tissu pulmonaire avec des cellules immunitaires, telle comme les lymphocytes T, iv) identification et modification des profils moléculaires, par exemple, après une exposition à des sensibilisants respiratoires, substances inductrices de la maladie ou actifs composés inhibant les voies ; en outre, v) remodelage des voies aériennes et vi) Règlement neuronale32. Le domaine scientifique s’intéresse à ces approches actuelles et futures avec PCLS. En outre, il existe une variété de différents développements qui contribueront à améliorer la technique PCLS, tels que la cryo-préservation20et tissus qui s’étend de33 qui imite le mouvement naturel des tissus au cours de la respiration ou mécanique ventilation.

L’avantage majeur de PCLS humaine par rapport aux autres modèles 3D est la présence de cellules immunitaires et des fibres nerveuses. Expériences peuvent également être effectuées en souris, rat et les primates non humains, qui sont les espèces animales qui sont encore plus souvent utilisés en pharmacologie et en toxicologie. La complexité du tissu pulmonaire humaine prend en charge la traduction des résultats d’un animal à l’homme et de l' in vitro à in vivo. Dans le cadre des essais alternatifs existants pour l’identification des sensibilisants respiratoires, PCLS humaines sont très complexes et ne permettent pas d’aperçus de réponses de cellule unique. Encore, microscopie et écoulement cytometry pourrait donner des informations sur les réponses cellulaires, si le marqueur droite cellulaire est utilisé en combinaison, par exemple, avec les marqueurs intracellulaires, nécrose ou apoptose. Il y a des essais publiés qui ont été validés et déclarés avoir été utilisé pour l’identification des sensibilisants respiratoires. Toutefois, les progrès dans l’utilisation de la CIP avec tous leurs avantages par rapport aux analyses unicellulaires font une contribution précieuse en ce sens que la technique peut être utilisée pour le criblage à haut débit, telle que décrite par Watson et al. 34 , ils ont développé un test de criblage à haut débit pour prédire la toxicité des voies respiratoires chez les murins PCLS cryoconservés. Avec leur format PCLS 96 puits miniaturisé, on détecte lectures similaires dans le liquide de lavage murine, rendant PCLS un test haut débit possible.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer. POINT de Fraunhofer est un organisme de recherche à but non lucratif public indépendant pour la recherche appliquée, faisant de la recherche de contrat au nom des industries biotechnologiques, pharmaceutiques, chimiques et cosmétiques. Financement de l’Institut provient de projets publics, nationaux et internationaux.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier Lan Lauenstein pour son travail préliminaire au sujet des stratégies alternatives de tests d’évaluation des risques avec PCLS humaine. Certains aspects de la recherche a été financée par une subvention de la Commission européenne dans le programme de cadre 6ème SENS-IT-IV « Roman Testing and Strategies for In Vitro Assessment d’allergènes ».

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon hose 3.0 x 5.0 mm A. Hartenstein (Leipzig, Germany) SS04
Syringe Faust Lab Science (Klettgau, Germany) 9.410 050
Coring tools custom-made custom-made
Trimming Blade Handle (FEATHER) pfm medical ag  (Cologne, Germany) 205530001
Trimming Blades (FEATHER) pfm medical ag  (Cologne, Germany) 205500000
Microtome: Tissue Slicer Alabama R&D (Bad Homburg, Germany) 303400-ADPT Krumdieck Tissue Slicer (MD6000)
Microtome blade Wilkinson Sword (Solingen, Germany) ENR-4027800011506
Tissue culture dishes Sigma (München, Germany) Z666246-420EA
Cell strainer filter (100 µm Nylon) Becton Dickinson (Heidelberg, Germany) BD352360
Inoculation loop Copan Diagnostics (Murrieta, USA)  CD176S01
TPP Tissue culture plates 24wells Sigma (München, Germany) Z707791-126EA
Cassette Thermo Scientific (Schwerte, Germany) 1000957
Nunc MaxiSorp flat-bottom Fisher Scientific GmbH (Hannover, Germany) 44-2404-21
Nunc MicroWell 96-Well  Thermo Scientific (Schwerte, Germany) 260836
Confocal Microscope Zeiss (Jena, Germany) Confocal LSM Meta 510
Image rendering software Bitplane AG (Zürich, Switzerland) IMARIS 7.6
LSM Image Browser Zeiss (Jena, Germany)
Multiwell-Reader Tecan Group Ltd. (Männedorf, Switzerland) Tecan infinite F200Pro Plate Reader
Plate shaker Edmund Buehler GmbH (Hechingen, Germany) KM-2 Akku
BenchMark ULTRA Ventana Medical Systems (Tucson, USA) Automated IHC/ISH slide staining system
Assays
Cell Proliferation Reagent WST-1 Roche (Basel, Switzerland) 11644807001
Cytotoxicity Detection Kit (LDH) Roche (Basel, Switzerland) 11644793001
Microscopical vitality staining  Invitrogen (Carlsbad, USA) L-3224 LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit
BCA Protein Assay Thermo Scientific (Schwerte, Germany) 23225
ELISA assay kit R & D systems various, e.g. DY210 (TNF-α) or DY200 (IL-1α) DuoSet
Reagents
Agarose, low gelling temperature  Sigma (München, Germany) A9414-100G
Balanced Salt Mixtures and Solutions, Cell Culture, Classic Media and Salts, Earle’s Balanced Salts (EBSS) Sigma (München, Germany) E2888-500ML
Penicillin and streptomycin Lonza (Verviers, Belgium) 17-602E
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM F-12) Gibco (Darmstadt, Germany) 11039-047 Culture medium
Dulbecco´s Phosphate with Ca and Mg (DPBS) Lonza (Verviers, Belgium) BE17-513F   Buffer solution
Albumin from bovine serum (BSA) Sigma (München, Germany) A9647-500G
Detergent Sigma (Saint Louis, USA) X100-100ML Triton X-100
Washing buffer Merck (Darmstadt Germany) 524653  0.05% Tween 20 in PBS

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References

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Neuhaus, V., Danov, O., Konzok, S.,… More

Neuhaus, V., Danov, O., Konzok, S., Obernolte, H., Dehmel, S., Braubach, P., Jonigk, D., Fieguth, H. G., Zardo, P., Warnecke, G., Martin, C., Braun, A., Sewald, K. Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices. J. Vis. Exp. (135), e57042, doi:10.3791/57042 (2018).

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