Vurdering af den cytotoksiske og immunmodulerende virkninger af stoffer i menneskelige præcision-cut lunge skiver

Summary

I betragtning af 3R-princippet, respiratorisk modeller som alternativer til dyreforsøg er under udvikling. Især for risikovurdering af respiratorisk stoffer er der en mangel på passende assays. Her, beskriver vi brugen af menneskelige præcision-cut lunge skiver til vurdering af luftbårne stoffer.

Abstract

Respiratoriske sygdomme i den brede mangfoldighed har brug for passende modelsystemer til at forstå de underliggende mekanismer og muliggør udvikling af nye lægemidler. Desuden kræver registrering af nye stoffer passende risikovurdering med passende test systemer til at undgå risikoen for enkeltpersoner at blive skadet, for eksempel i arbejdsmiljøet. Disse risikovurderinger er normalt udført i dyreforsøg. På baggrund af 3R-princippet og offentlige skepsis mod dyreforsøg, menneskelige alternative metoder, såsom præcision-cut lunge skiver (PCLS), har været under udvikling. Den nuværende papir beskriver ex vivo -teknik af menneskelige PCLS at studere immunmodulerende potentiale af lav molekylvægt stoffer, såsom ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Målte slutpunkter omfatter levedygtighed og lokale respiratorisk betændelse, præget af ændrede sekretion af cytokiner og kemokiner. Pro-inflammatoriske cytokiner, tumor nekrose faktor alfa (TNF-α), og interleukin 1 alpha (IL-1α) var steget betydeligt i menneskelige PCLS efter udsættelse for en sub toksiske koncentration af HClPt. Selv om teknikken med PCLS er blevet betydeligt optimeret i de seneste årtier, er dens anvendelighed til afprøvning af immunomodulation stadig under udvikling. Resultaterne præsenteres her er derfor foreløbig, selvom de vise potentialet af menneskelige PCLS som et værdifuldt redskab i respiratoriske forskning.

Introduction

Luftvejssygdomme såsom allergisk astma, arbejdsbetinget astma, kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL), emfysem, og infektioner i de øvre og nedre luftveje er stigende og udgør en verdensomspændende sundhed byrde^1,2. Passende testsystemer er nødvendige for at identificere nogle af de grundlæggende mekanismer, der ligger til grund for disse sygdomme, ud over udviklingen og afprøvning af relevante stoffer. Grundlæggende forskning samt udvikling af prækliniske lægemidler er fokuseret på resultaterne opnået i mutagenicitetstest in vitro- eller i vivo . Disse assays, men har deres begrænsninger³. For det første, in vitro- assays udnytte menneskelige celler, der blev isoleret og fjernet fra tilstødende væv eller organer og er således ikke længere i stand til at interagere med eller være beskyttet af andre celler³. For det andet er dyremodeller ofte ikke oversættes til mennesker på grund af forskelle i fysiologi og biokemiske forskelle⁴. For at minimere disse begrænsninger, og i forbindelse med 3R (udskiftning, raffinement, reduktion) princippet⁵, nye alternative modeller under konstant udvikling.

Alternative menneskelige 3D væv modeller, såsom PCLS, er en forbindelse mellem menneske-baserede in vitro- og komplekse dyr i vivo modeller. PCLS afspejler den funktionelle heterogenitet med alle relevante celletyper i luftveje⁶. PCLS teknik har desuden fordelen, at reproducerbare forberedelse af flere tynde skiver af præcise tykkelse fra en enkelt menneskers eller dyrs vævsdonor. Dette giver mulighed for en intern kontrol samt forskellige koncentrationer eller narkotika skal testes.

Siden den første introduktion af agar-fyldt menneskelige lunge skiver i 1994 af Fisher et al. ⁷ teknik til udskæring og dyrkning af lungevæv er blevet væsentligt forbedret. Christian Martin et al. har forbedret denne teknik til yderligere kemisk og farmakologisk programmer⁸. Vores gruppe blev introduceret til denne teknik af Christian Martin i 2007. Siden da, har anvendelsen af PCLS i forskning udvidet fra test af funktionelle svar, såsom luftveje^9,10 og vasokonstriktion¹¹, til immunologiske, farmakologiske^12,13, og toksikologiske⁷ test i forskellige arter i flere laboratorier. For eksempel, Schlepütz et al. ¹⁴ undersøgt luftvejene Svar nemlig arter forskelle og sammenlignet perifere neuron aktivering af elektrisk felt stimulation (EFS) eller af capsaicin i mus, rotter, marsvin, får, silkeaber og mennesker. De fandt de forskellige arter at have forskellige, men forskellige mønstre af nerve-medieret bronchoconstriction og konkluderede, at de almindeligt anvendte forsøgsdyr (mus og rotter) ikke altid afspejler den menneskelige reaktion. For lunge toksicitetstest og at reducere antallet af dyr i denne sammenhæng, Hess et al. ¹⁵ pre valideret rotte PCLS som ex vivo alternativ for indånding toksicitetstest. Denne polycentrisk pre-validering undersøgelse resulterede i udviklingen af to forudsigelse modeller ved hjælp af PCLS med lovende resultater.

Desuden, i grundforskning, PCLS har været brugt til at belyse calcium signalering¹⁶, tidlig allergiske reaktioner¹⁷og viral infektion svar^18,19. Tekniske fremskridt foregår løbende og yderligere forskud er ved at blive undersøgt. For eksempel, stiger feltet gavn for humant væv med opbevaring og genbrug af frossen væv. Rosner et al. beskrev en teknik til nedfrysning og optøning murine PCLS, der bevarer evnen af luftvejene til kontrakt ved stimulation: derfor teknikken forlænger vinduet begrænset tidsrum inden for hvilket væv forbliver levedygtig, og så videre assays kan anvendes over tid på den samme donor²⁰. Ud over disse forskning forskud, Lauenstein et al. ²¹ for nylig undersøgt risikovurdering af forskellige kemikalier, der kan fungere som potentielle sensibiliserende for arbejdsbetinget astma i menneskelige PCLS.

Arbejdsbetinget astma, hvis symptomer er airflow obstruktion og luftvejene hyperresponsivitet, svarer til allergisk astma, er forårsaget af eksponering for høj molekylvægt (HMW)²² eller lav molekylvægt (LMW) stoffer²³ (f.eks. , platin forbindelser) i arbejdsmiljø. LMW agenter har en høj sensibilisering potentielle når danner habtener og binder til transportøren proteiner²¹. Registrering af nye HMW eller LMW kemikalier kræver in vitro og i vivo risikovurdering vedrørende deres formodede sensibilisering potentielle (fx., OECD Guideline 429)²⁴. De test, der anvendes til at bestemme den formodede sensibilisering af potentielle, dog blev oprindeligt ikke udviklet for risikovurdering af respiratorisk sensibiliserende, men for kontakt sensibiliserende, men der syntes at være nogle kongruens for en lille delmængde af stoffer²⁵ . Arbejde af Lauenstein et al. var designet som en del af EU-projektet Sens-it-iv, til at udvikle alternative teststrategier for risikovurdering af formodede kontakt eller lunge sensibiliserende²¹. Til dette projekt fokuseret vi på teste anvendeligheden af menneskelige PCLS som en alternativ test værktøj. Derfor, et sæt af immunmodulerende slutpunkter (fx, levedygtighed og cytokin sekretion) blev valgt til at bestemme den irriterende eller inflammatorisk potentiale for kemikalier, såsom LMW platin forbindelser. Lauenstein et al. fandt ingen generelle mønster, der kan anvendes til alle respiratorisk sensibiliserende; deres arbejde leveres dog grundlaget for nylig publicerede protokoller²⁶.

I Resumé giver protokollen præsenteret her for forberedelse og efterfølgende eksponering af menneskelige PCLS en nyttig metode til evaluering af potentielt lunge-giftige og/eller immunmodulerende stoffer, der kan være involveret i udviklingen af respiratorisk sygdomme, som arbejdsbetinget astma.

Protocol

Forsøg med menneskelige PCLS må udføres ifølge The Code of Ethics af World Medical Association og godkendt af de lokale etiske udvalg (de eksemplariske PCLS eksperimenter vist her blev godkendt af det lokale etiske udvalg fra Hannover Medical School; antal 2701-2015). Skriftlig informeret samtykke til anvendelsen af menneskelige lunge materiale er påkrævet fra alle donor patienter eller deres pårørende. Resultaterne er beskrevet i dette manuskript blev opnået med væv skiver fra donorer i forskellige aldre, køn, sygehistorie og årsag til resektion, selvom de fleste af vævet modtog var fra patienter, der lider af lungekræft. Kun tumor-fri væv blev brugt til eksperimenter.

1. generelle forberedelse af menneskelige PCLS og efterfølgende eksponering for kemikalier

Bemærk: To personer er forpligtet til at udfylde en lunge. En up-to-date vaccination rekord for hepatitis A og B anbefales. Patienter er rutinemæssigt screenet for HCV og HIV forud for lunge transplantation. Hvis en aktiv infektion med Mycobacterium tuberculosis er diagnosticeret eller mistænkt, bør lunge forkastes. Ikke desto mindre alle friske menneskelige lungevæv og prøver stammer fra det skal behandles som potentielt smittefarlige og tilsvarende beskyttelsesforanstaltninger skal tages (partikel filtermasker (FFP2), beskyttende briller, handsker) at sikre, at arbejdsmiljø af de personale. Proceduren tager 60-90 min.

1. Bekræfte handelsformer af den menneskelige lunge lap.
   Bemærk: En tåre i lungehinden forhindrer homogene påfyldning af væv. Menneskelige lunge materiale skal være fra dag af resektion. Oplagringsperioder i ca 2 timer ved stuetemperatur (RT) før fylde den med Agarosen på isen er tolereret. Det væv, som vi bruger i denne protokol er fremstillet af patienter, der gennemgår resektion. Det er ikke fra afdøde patienter. Hvis vævet er blevet opbevaret på isen, pre varme det til RT før påfyldning det, ellers Agarosen vil polymerisere straks, og ingen homogene fyldet vil være muligt.
   Forsigtig: Sikre, at alle personer i kontakt med indfødte humant materiale på beskyttende tøj består af en laboratoriekittel, to par handsker, hætte, ansigtsmaske og et par af sikkerhedsbriller. Humant materiale er potentielt infektiøse.
2. Vejer 7,5 g af lav-geldannende Agarosen og føje den til 250 mL bi-destilleret vand. Kog Agarosen i en mikroovn, indtil Agarosen er opløst. Afkøles det til ca. 40 ° C, afhængig af Agarosen smeltning og geldannende punkt.
   Bemærk: Flere kolber er påkrævet, afhængigt af størrelsen lap.
3. Pre varme og holde næringssubstratet (Table of Materials) ved 37 ° C.
   Bemærk: Hvis Agarosen er for varmt, vitaminer i dyrkningsmediet mister effektivitet og celler vil blive beskadiget. Hvis temperaturen på medium/Agarosen løsning er under 37 ° C, vil geldannende processen starte og forringe homogene påfyldning af lungen. Kun et temperaturområde på 37 ° C til 39 ° C anbefales.
4. Placere alle de nødvendige materialer inden for rækkevidde inden du starter: 5-10 klemmer, fleksibel kateter omtrent 1 m lange, en egnet sprøjte (fx, 50 mL) montering forbindelsen til kateteret og en is kasse fyldt med is.
5. Kanyleres luftrør/vigtigste Bronkie ved at indsætte silikone rør og fikserer det med en klemme orienteret parallelt med røret, så at klemmen presser vævet sammen sammen med silikone rør uden klemme det ned. Kontroller, at silikone rør er fikseret inde og kan ikke glide ud under påfyldning procedure. Luk alle andre bronkier, blodkar og skader med klemmer, således at ingen Agarosen kan sive ud under påfyldning procedure.
6. Bland et tilsvarende volumen af 3% lav-geldannende Agarosen med næringssubstratet i et bægerglas. Indgyde blandingen ind i lungen ved hjælp af en 50 mL sprøjte. Før genpåfyldning sprøjte med medium, lukker klemme kateter med fingrene eller en klemme til at undgå luftbobler og Agarosen refluks. Fyld den lunge lap, indtil det er fuldt oppustet. Omhyggeligt touch lunge brysthinden side; brysthinden skal være jævn og hårdt.
   Bemærk: Afhængigt af størrelsen af den lunge lap, op til 2 eller 3 L Agarosen/medium opløsning kan være påkrævet.
7. Gentag trin 1.5-1.6 for hver Bronkie for flere bronkier inden for et enkelt eksemplar.
8. Sætte lungen på isen for polymerisering af Agarosen til gel til 20-40 min, afhængig af mængden af indpodet agarosegelelektroforese. Omhyggeligt touch lungehinden på flere sider til at kontrollere, om det er hårdt og cool, der angiver, at polymerisering er komplet, ellers fortsætter med at vente. Lad patologer vil skære lungen i skiver, tage deres prøver og gemme lunge materiale om is for transport.
9. Skær den menneskelige lungevæv i 3-5 cm plader med en skarp kniv.
   Bemærk: Brug en ny klinge for hver lunge for at sikre skarphed.
10. Fyld væv slicer med 400 mL iskold Earles afbalanceret saltopløsning (EBSS). Straks skæres cylindrisk væv kerner ud af lunge plader med en semi-automatiske skruetrækker med en coring værktøj af den foretrukne diameter (f.eks.8 mm, 10 mm).
    Bemærk: Denne diameter skal være svarende til diameteren af væv indehaveren inde i maskinen.
11. Justere tykkelsen af lunge skiver til den ønskede tykkelse værdi.
    Bemærk: En tykkelse på ca. 250 µm er almindeligt anvendt i PCLS eksperimenter. Producenten af væv slicer anbefaler deres væv skive tykkelse Gauge for verifikation af skive tykkelse. Alternativt, hele-mount farvning kombineret med Konfokal mikroskopi kan bruges til at bestemme skive tykkelse som beskrevet af Brismar et al. ²⁷
12. Overføre væv kerner i væv indehaveren af væv slicer. Sætte vægt (del af væv indehaveren) på toppen af væv kerne. Indstil arm hastighed og blade hastighed til 6 på væv slicer. Start udskæring væv kerne i PCLS.
13. Supplere 500 mL af kommercielt tilgængelige Dulbecco ændret Eagle Medium (DMEM): næringsstof blanding F-12 DMEM/F12 (1:1) med 5 mL (10.000 enheder/mL) penicillin og streptomycin (10.000 µg/mL). Gemme næringssubstratet i flere dage under sterile forhold i køleskab. Pre varme kun den krævede mængde af medium.
    Bemærk: Penicillin vil deaktiveres, hvis holdt ved 37 ° C i længere perioder. Brug serumfrit og dye-fri næringssubstrat, kan som serum sammensætning varierer fra batch til batch og farvestoffer, såsom phenol-rød, interferere med assays.
14. Fyld en petriskål (100 x 15 mm) med 25 mL iskold næringssubstratet. Medium skal drænes ud af væv pålægsmaskine i et bægerglas ved at åbne klemme af glas cylinder. Overføre skiver fra et bægerglas ind petriskål med dyrkningsmediet ved hjælp af en applikator (fx, podning loop). Sætte petriskålen i en inkubator (37 ° C, 5% CO₂, 100% fugtighed). Tillad medium at varme op før vask trin.
    Bemærk: Alle skridt udføres under sterile forhold.
15. Sted en celle si i petriskålen til vask af PCLS. Helt fjerne næringssubstratet med en 10-mL serologisk pipette gennem celle si og tilsættes 25 mL af 37 ° C pre varmede frisk medium. Gentag dette trin 3 - 4 gange hver 30 min.
    Bemærk: Celle si forhindrer skiver i at blive suget ind i pipette, undgå eventuelle skader på skiver.
16. Overføre lunge skiver omhyggeligt til en 24-godt kultur plade med et minimum af 500 µL næringssubstrat for to skiver pr. brønd. Udsætte lungevæv stoffer (Se trin 3.1-3.4), fxi 24 timer ved 37 ° C, 5% CO₂.
    Bemærk: For overførsel, helst bruge en podning loop og lad skiver float på løkken for at forhindre vævsskade. Ingen yderligere adskillelse af skiver er nødvendig, da kun mangel på tilstrækkelig frisk medium vil fremkalde celledød i væv skiver. Skiver kan overlappe eller røre hinanden i brønden: dette har ingen indflydelse på væv levedygtighed.
17. Sætte alle resterende menneskeligt materiale i en plastik kolbe med fikseringsmiddel (f.eks, 10% buffered formaldehyd) i mindst 24 timer og brænde det i forbindelse med bortskaffelse.
    Forsigtig: Formaldehyd er giftige, udføre dette trin under en hætte.

2. histologiske analyse af PCLS

1. Forberede biopsi kassetter med to skum puder gennemblødt i fiksativ (fx., 4% buffered formaldehyd). Sted PCLS mellem skum puder i biopsi kassette og straks overføre vævet i Fikseringsvæske løsning. Fix væv overnatter i 4% buffered formaldehyd.
2. Behandle væv til paraffin indlejring af tørring prøver i ethanol (70%, 90%, 100%, 100%, 100%, 100%) i 1 time hver, efterfulgt af vask i xylen (3 x 1 h) og paraffinolie (3 x 1 h) som standard histopatologisk protokoller.
3. Overføre PCLS i en indlejring støber. Bruge en podning løkke. Integrere PCLS væv i flydende paraffin. Sørg for at placere væv jævnt i formen når støbning paraffin blok.
4. Skære væv blokken indeholder PCLS med en Rotationsmikrotom, indtil det har en flad og endda overflade. Tage seriel afsnit af den ønskede tykkelse (fx., 4 µm), placere dem individuelt på fortløbende nummereret coatede glas dias (normalt 25-30 afsnit kan træffes) indtil hele PCLS er blevet behandlet.
5. Pletten enkelt glas dias (hver 8-10 sektioner) med hæmatoxylin og eosin pletten (H & E) til orientering. Vælg sektioner for eksperimentet baseret på orientering dias (de første og sidste 8 sektioner er normalt ufuldstændige).
   Bemærk: (Valgfrit) For langvarig oplagring, dias kan være dyppet i flydende paraffin for bevarelse.

3. forberedelse af løsninger for stoffer

Bemærk: Forberede arbejde løsninger og kontrol umiddelbart før brug.

Forsigtig: Håndtere stoffer ifølge sikkerhedsinstruktioner eller, hvis det er ukendt, som potentielt skadelige og følg rutinemæssig sikkerhedsforanstaltninger.

1. Opløse vandopløselige stoffer direkte i dyrkningsmediet. Til uopløselige eller tungtopløselige kemikalier, først opløse stoffet i de passende opløsningsmidler afhængigt af stof opløselighed. Stoffer med begrænset vandopløselighed (< 0,1 mg/mL) kan opløses, for eksempel i DMSO eller ethanol. Ikke-giftige opløsningsmidler koncentrationer bør bestemmes ved titrering på forhånd. Kontroller, at stofferne ikke bundfald af løsning når fortyndet i medium.
   Bemærk: HClPt og sodium laureth sulfate (SLS) løsninger er forberedt.
2. Forberede stof stamopløsninger på 100 af de ønskede højeste koncentration i dyrkningsmediet eller opløsningsmiddel. Vejer 12,5 mg HClPt og 34,4 mg SLS og forberede stamopløsninger ved at opløse kemikalierne i 1 mL næringssubstratet.
   Bemærk: Ingen opløsningsmiddel er nødvendig for disse kemikalier.
3. Forberede en endelige fortynding på 1: 100 i pre varmede medium. I tilfælde af tidligere brug af opløsningsmiddel resulterer denne tilgang i de samme opløsningsmiddel slutkoncentration for alle stof koncentrationer.
4. Bruge den endelige opløsningsmiddel koncentration (f.eks.1% som beskrevet i trin 3.3) for reference behandling af PCLS. Ingen opløsningsmidler kontrol var påkrævet for de kemikalier, der er nævnt i afsnittet resultater.

4. positive og Negative referencer for cytotoksicitet Assays

1. For alle levedygtighed assays, udarbejde de følgende positive og negative kontroller:
   1. Væv kontrol: inkuberes PCLS i dyrkningsmediet kun som reference for ubehandlet PCLS i 24 timer ved celle kultur betingelser (37 ° C, 5% CO₂, 100% fugtighed).
   2. Køretøjet kontrol (hvis nødvendigt): inkuberes PCLS med den endelige opløsningsmiddel koncentration som en reference for PCLS behandlet med køretøjet kun (Se trin 3.4) i 24 timer ved celle kultur betingelser (37 ° C, 5% CO₂, 100% fugtighed).
   3. Positiv kontrol: inkuberes PCLS med 1% vaskemiddel i stødpudeopløsning i 1 time ved 4 ° C.
      Bemærk: Hvis PCLS bliver farveløs, væv er døde. Samlede L-lactat dehydrogenase (LDH) bestemmes i supernatanten, med en optagelse af ca 1,9-2.3 (Se trin 6.1-6.4). Væv bruges til WST-1 assay (Se trin 5.1-5.5), med en optagelse af ca 0.

5. måling af kemisk induceret cytotoksicitet i menneskelige PCLS af WST-1 Assay

Bemærk: WST-1 analysen er udført i en 24-godt plade med to PCLS pr. brønd. Helst bruge dubletter for hver parameter og samle resultaterne af disse dubletter efter måling.

1. Forberede brugsopløsning ved fortynding WST-1 reagens i medium umiddelbart før du starter. Den nødvendige mængde af brugsopløsning er 250 µL/brønd af en 24-godt plade. Derfor, bland 25 µL reagens med 225 µL af substratet for én godt.
2. Efter inkubation af PCLS fra trin 1.16, kassere eller bruge supernatanten til cytokin målinger eller andre tests såsom LDH assay. De resterende væv bruges til næste trin.
3. Med pipette overfoeres 250 µL af den arbejdende koncentration af WST-1 reagens pr. godt og Inkuber plade på 37 ° C og 5% CO₂ for 1 h. sikre at PCLS er fuldt ud omfattet af WST-1 reagens under inkubation.
4. Pladen anbringes på en orbitalryster (200 rpm) og omrystes forsigtigt i 30 s til at sikre grundig blanding af WST-1 reagens. Tage en ny flat 96-brønd bundplade og afpipetteres 100 µL i dubletter fra supernatanten af hver brønd af 24-godt plade.
5. Måle absorptionen af hver brønd ved 450 nm (reference: 630 nm) ved hjælp af en mikrotiterplade læser. Subtrahere absorption på 630 nm fra 450 nm. Disse værdier vil blive brugt til beregning i skridt 5.6).
   Bemærk: Pålidelige data for cytotoksicitet vurdering kan opnås kun fra levedygtige væv. Derfor, disse acceptkriterier, der er udgivet af Hess et al. ¹⁵ bør opfyldes i hvert forsøg. Hvis disse kriterier ikke er opfyldt, bør forsøget gentages.
6. Absorption af ubehandlede mellemstore kontrol skal være over 0,6, ellers forsøget skal gentages. Hvis dataene, der opfylder dette krav, skal værdien absorption af kontrolelementet væv til 100% og beregne WST-1 reduktion af behandlede prøver i forbindelse med kontrolelementet væv.

6. LDH Assay

Bemærk: LDH analysen er udført i en 96-brønd plade med 100 µL kultur supernatanten i alt efter post inkubationstiden.

1. Efter inkubation af PCLS med eller uden test agenter, tage 50 µL af supernatanten fra trin 1.16 og overføre det i dubletter til en ny 96-brønd plade. Dette genererer dubletter fra hver behandlet godt af en 24-godt plade.
2. Forberede brugsopløsning LDH reagens umiddelbart før analysen. Brugsopløsning består af katalysator løsning (lyophilisate opløses i 1 mL bidistilled vand) og farvestof løsning leveret af fabrikanten. For en 96-brønd plade, blandes grundigt 125 µL af katalysator løsning med 6,25 mL af farvestof.
   Forsigtig: Udsæt ikke løsningen at direkte lys.
3. Med pipette overfoeres 50 µL af brugsopløsning i hver godt allerede indeholdende 50 µL af supernatanten og Ruger på pladen i 20 min. på RT i mørke. Der kræves ingen yderligere blanding.
4. Måle absorptionen af hver brønd ved 492 nm (reference: 630 nm) ved hjælp af en mikrotiterplade læser. Subtrahere absorption på 630 nm fra 492 nm. Disse værdier vil blive brugt til beregning i skridt 6,5.
   Bemærk: Pålidelige data for cytotoksicitet vurdering kan opnås kun fra levedygtige væv. Absorption af kontrolelementet vaskemiddel-behandlet skal være over 1.
5. For analyse, ØNSKEVÆRDI absorption af den positive kontrol fra trin 4.1 som 100% og beregne LDH udgivelse i behandlede prøver i forhold til den positive kontrol (dvs., maksimale LDH release).

7. mikroskopisk levedygtighed Assay med Konfokal Laser Scanning mikroskop (cLSM)

Bemærk: For mikroskopiske levedygtighed analysen, er to af de normale 250 µm tykt PCLS farves i 250 µL/brønd af en 24-godt plade. Da hver skive er afbildet separat, kræves ingen yderligere dubletter.

1. Efter inkubation af PCLS med eller uden teststoffer, supernatanten eller bruge det til cytokin målinger eller andre tests såsom LDH assay. Bruge den resterende væv under proceduren beskrevet her.
2. Forberede Arbejdsfortyndingen af calcein-AM og ethidium homodimer 1, (EthD-1), med en arbejdende koncentration af begge reagenser af 4 µM i dyrkningsmediet. Til dette formål, skal du tilføje 1 µL af calcein-AM (4 mM) og 2 µL af EthD-1 (2 mM) til 997 µL næringssubstratet. Denne diskenhed er forpligtet til at plette 4 brønde med to PCLS.
   Bemærk: Undgå eksponering af reagenser for direkte lys.
3. Med pipette overfoeres 250 µL af arbejdsfortynding i hvert godt og Inkuber 24-godt plade for 45 min på RT i mørke. Pladen anbringes på en orbitalryster på 150 rpm under inkubation at sikre bedre eksponering af væv til Farvningsopløsningen.
4. Efter 45 min, kassere Farvningsopløsningen og vaske PCLS med 1 mL stødpudeopløsning gennem ryster på 150 rpm i 3-5 min. på RT i mørke. Gentag dette trin to gange.
5. Anvende 500 µL stødpudeopløsning til hver brønd, der indeholder de farvede PCLS for at undgå autofluorescence fra dyrkningsmediet. Mikroskopiske vurdering, udføre mindst to tilfældigt fordelte z-stakke med en cLSM.
6. Klik på fanen okulær at vælge en 10 X / 0,3 mål og klik på Online for at bruge cLSM som en standard lysmikroskop for at finde overfladen af PCLS. Klik på Offline for at afslutte indstillingen okulær.
7. Klik på fanen erhvervelse og tænde de passende lasere til fluorophores.
   Bemærk: Vi brugte en argon laser med en bølgelængde på 488 nm for polyanionic farvestof calcein (excitation bølgelængde af 495 nm) og en HeNe laser med en bølgelængde på 543 nm til påvisning af EthD-1/DNA-komplekset (excitation bølgelængde af 533 nm). Argon laser bør generelt kører på 30-50% af den maksimale strøm til at aktivere en tube strøm på omkring 5,7 A, da det forlænger laser levetid betydeligt.
8. Klik på Lyset sti under fanen erhvervelse og oprette de nødvendige filtre og spejle for eksperimentet.
   Bemærk: I den nuværende undersøgelse, en filter-baserede system blev brugt med en vigtigste dichroic stråledeler (fx., HFT 488/543) adskille excitations- og lys. Gennem en reflekterende spejl dette lys er rettet til den sekundære dichroic beam splitter (fxNFT 545) til yderligere separat lyset udsendes fra prøven i to kanaler.
9. Sæt op band pass filtre (f.eks.BP 505-530 for calcein signal og BP 560-615 for EthD-1/DNA komplekse signal), der sender kun et bestemt interval af bølgelængder og tildele calcein signal til kanal 2 og EthD-1/DNA komplekse signal på kanal 3.
10. Afkrydsningsfeltet Z-stakke for at angive de øvre og nedre grænser for den mikroskopiske mængde. Tryk på knappen Live at se en levende opfattelse af det tilsvarende lag på skærmen. Flytte fokus, op eller ned for at finde overfladen af PCLS med en skarp signal.
11. Klik på kanaler underafdeling, og Marker afkrydsningsfeltet Vis alle. Låse op i tabellen ved at trykke på knappen for den pågældende kanal nedenunder det levende billede og aktivere kanal farven.
    Bemærk: En blå farve i det levende billede vil indikere, at der ikke er noget signal, der henviser til, at et højt signal vises i hvidt og en overeksponeret signal bliver vist med rødt.
12. Indstil pinhole for den røde EthD-1 kanal til 1 luftige enhed for den bedste afvejning mellem effektivitet af lys indsamling og optiske skære og justere calcein kanal i overensstemmelse hermed. Øge det detekterede Signals af gevinsten, sådan at det vises hvid, men ikke rød i live-aftrykket med aktiveret kanal lockup farvetabel.
    Bemærk: Master gevinst bør ikke overstige 600 enheder.
13. Forøge eller formindske den digitale forskydning for at justere baggrunden, sådan at det vises i blåt i den levende billede med aktiveret kanal lockup farvetabel.
14. Klik på fanen Z-stakken under Multidimensional erhvervelse og bruge fokus til at skifte til en z-lag af interesse. Tryk på Sæt første gemme denne holdning med henblik på senere erhvervelse. Langsomt flytte fokus op eller ned indtil en række 30 µm er nået og tryk på Angiv sidste gemme.
15. Klik på Live igen at deaktivere det levende billede og tryk på Start eksperiment for at starte imaging.
    Bemærk: Levedygtige væv er opdaget ved fluorescens af polyanionic farvestof calcein. Døde celler er diskrimineret af komplekse dannelsen af EthD-1 og nukleinsyrer.

8. billedgengivelsen

Bemærk: Indstillingen computer image rendering software skal tages hensyn, som dette program kræver passende hardware.

1. Indlæse filen LSM erhvervet fra mikroskopiske levedygtighed farvning af PCLS (Se afsnit 7) ind i image rendering software. Gemme det som .ims filen, før du fortsætter. Indstille alle parametre på kontrolelementet væv og anvende disse til alle billeder. Ingen yderligere ændringer er tilladt.
2. Brug lydstyrkeknappen til overflade genopbygning af levedygtige væv (calcein farvning) (supplerende figur 1A) og knappen steder for døde cellekerner (tillægs figur 1 H). Når rendering én kanal, skifte ud anden kanalen i vinduet skærm tilpasning.
3. Start ved at gøre mængden af vitale væv: sæt kanal af overfladen, behandle hele billedet, indstille den glatte faktor til 0,5 µm, og bruge absolut intensitet for tærskel (supplerende figur 1B, C). Tryk på den blå Frempilen.
4. Justere den absolutte intensitet tærskel på den rekonstruerede volumen; støj og baggrunden intensitet skal trækkes. Overflade overlay er vist med gråt og nøjagtigheden af overfladedækning bør kontrolleres (tillægs figur 1 d). Efter endt justering, tryk på den blå Frempilen. Det meste af tiden er dette trin nødvendige for beregning af indstillinger. Hvis softwaren ikke er i stand til at beregne volumen, øge den glatte faktor.
5. I det sidste trin, skal du vælge et filter. Brug filteret kugleform (med ca. 10 µm) til overflade rendering for at bortfiltrere makrofager i den alveolære rum (supplerende figur 1E). Tryk på den grønne fremad-knappen.
6. Optisk justere output billede og eksportere statistikker som .xls-filer. Det samlede volumen (sum) vil blive brugt til yderligere analyse (supplerende figur 1F, G). Gem indstillingerne og bruge dem til alle yderligere analyser af z-stakke taget samme dag med de samme cLSM indstillinger (supplerende figur 1I).
7. Rekonstruere den røde kanal (steder) for døde cellekerner. Tilfældigt måle dot størrelse i µm skalering i vinduet overgå; prik størrelse er ca 5 µm. Mark Enable og indstille dot størrelse. Kontrollere, om alle prikker er markeret og hver prik tælles kun en gang. Rette manuelt hvis påkrævet (supplerende figur 1B, H, J). Tryk på den blå Frempilen.
8. Tryk på grøn fremad-knappen til at lade programmet beregne/tælle det samlede antal steder efter parametrene sat og eksportere resultatet som .xls-fil (Tillægs figur 1 K, L, M). For grafisk eller statistisk analyse af billedet, skal du angive antallet af beregnede døde cellekerner i forhold til mængden af vitale væv.

9. måling af cytokiner og kemokiner i menneskelig PCLS

Bemærk: Immunrespons cytokin og chemokine kan måles extracellularly i cellekultur supernatant og intracellulært i væv lysates efter inkubationstiden. ELISA måles i dubletter i en 96-brønd plade med 100 µL/brønd.

1. Forberede en 1% opløsning ved at blande 5 mL af vaskemiddel med 495 mL stødpudeopløsning. Opløsningen kan opbevares ved RT i flere måneder.
2. Bland 1% rengøringsmiddel med protease inhibitor (PI) i forholdet 1: 500. Den nødvendige mængde afhænger af kultur plade; for eksempel brug 500 µL/brønd for en 24-godt plade. For et godt mix 1 µL af PI med 499 µL af rengøringsmiddel.
3. Forberede rør med 1 µL af PI løsning og indsamle 500 µL af kultur supernatanten i disse rør. Umiddelbart erstatte medium i 24-godt plade af 500 µL opløsning indeholdende PI, som er udarbejdet i trin 9.2. Lyse væv i 1 time ved at placere den 24-godt plade i ved 4 ° C. Med pipette overfoeres væv lysate i en ny tube og gemme disse rør ved-80 ° C indtil videre analyse.
   Bemærk: ELISA protokol afhænger stærkt af producenten og producentens anvisninger skal følges. En standardprotokol ELISA er beskrevet i det følgende.
4. Udføre ELISA for at måle cytokin niveauer i supernatanten eller lysate ifølge producentens anvisninger. For at måle IL-1α og TNF-α, frakke a96-godt plade af pipettering 100 µL af capture antistof (for fortynding Følg fabrikantens anvisninger) og der inkuberes natten over ved RT.
5. Forberede vask buffer ved at opløse en vask buffer tablet i 1 L bidistilled vand. Fjerne capture antistof og afpipetteres 400 µL vask buffer i hver brønd. Erstatte dette bind tre gange. Blokere pladen ved at tilføje den blokerende løsning (f.eks.1% BSA i stødpudeopløsning ifølge fabrikantens anvisninger). Der inkuberes ved RT i 1 h.
   Bemærk: Standard kommercielt tilgængelige ringprøver kræver 2 x 100 µL af væv supernatanten eller lysate. Prøverne bør optøede én gang og lige før brug. Afhængigt af følsomheden af analysen og på den frigivne cytokin skal prøver fortyndes før måling. Derfor, fortyndes prøven i reagenset leveres af analysen.
6. Fjern blokering løsningen og tilføje fortyndede prøver til standardkurven (for fortynding Følg fabrikantens anvisninger) og 100 µL af væv supernatanten eller 100 µL af væv lysate i dubletter indsamlede i trin 9.3. Der inkuberes i 2 timer ved RT.
7. Fjerne prøver og afpipetteres 400 µL vask buffer i hver brønd. Erstatte dette bind tre gange. Afpipetteres 100 µL biotinylated påvisning antistof (for fortynding følge producentens anvisninger), og der inkuberes i 2 timer ved RT.
8. Fjerne antistof og afpipetteres 400 µL vask buffer i hver brønd. Erstatte dette bind tre gange. Tilføje 100 µL/brønd af HRP-mærket streptavidin (for fortynding følge producentens anvisninger), og der inkuberes i 20 min. på RT (check fabrikantens anvisninger).
9. Fjern streptavidin og afpipetteres 400 µL vask buffer i hver brønd. Erstatte dette bind tre gange.
10. Tilsæt 100 µL af substratet (anbefalet af producenten), og der inkuberes i 20 min. i mørke (check fabrikantens anvisninger).
    Bemærk: Dette trin er lysfølsomt. Undgå lys eksponering af substrat og plade.
11. Reaktionen standses ved at tilføje 50 µL stopopløsning (1 M H₂SO₄). Måle absorptionen af hver brønd ved 450 nm (reference: 570 nm) ved hjælp af en mikrotiterplade læser. Subtrahere absorption ved 570 nm fra 450 nm.
    Bemærk: Ubehandlet og/eller væv betjeningsanordninger tjene som negative kontroller. For at fremkalde en immunrespons i lungevæv, skal du bruge passende stimulation (f.eks.100 ng/mL LPS (LPS)) som positiv kontrol. Inkuber to brønde med to PLC'ER pr. brønd med 100 ng/mL LP'ER dyrkningsmedium, for eksempel, i 24 timer, og indsamle supernatanten og væv lysate som beskrevet i trin 9.3.
    Bemærk: De målte resultater er accepteret, hvis optagelsen af den højeste standard er lig med eller overstiger 1,0; Ellers skal måling gentages. Standardkurven skal følge sigmoide dosis-respons kurve montering.
12. Cytokin koncentrationer (pg) bestemmes ved hjælp af ELISA taktfast 9,11 normaliseres til den samlede proteinindhold bestemmes i væv lysate af hver prøve (Se afsnit 10).

10. måling af Total proteinindhold i menneskelig PCLS

Bemærk: PCLS skal være mængden for at måle samlede proteinkoncentration. Væv lysates fra trin 9.3 anvendes til dette trin. Analysen er udført i et fladt 96-brønd plade med 25 µL/brønd af væv lysate, pipetted i dubletter.

1. Forberede en 7-punkts BSA standard med BSA koncentrationer af 2.000 µg/mL, 1.500 µg/mL, 1000 µg/mL, 750 µg/mL, 500 µg/mL, 250 µg/mL og 125 µg/mL. Anvende 25 µL i dubletter for hver standard og bruge 25 µL bufferopløsning som en tomme på en 96-brønd tallerken (brug en plade med en plade cover).
2. Med pipette overfoeres 25 µL af lysates (Se trin 9.3) fra hver brønd i dubletter til en 96-brønd plade. I alt er 50 µL af hver godt påkrævet. Forberede arbejde reagens af BCA løsning ved at fortynde BCA reagens B 1:50 i BCA reagens A. For en 96-brønd plade bruge 400 µL af reagens B og 20.000 µL af reagens A.
3. Omhyggeligt afpipetteres 200 µL arbejder reagens til hver brønd, undgå luftbobler. Placere plade på en orbitalryster (150 rpm) for 30 s til at sikre korrekt blanding af lysates og arbejder reagens, og sætte en plade dække på pladen. Inkuber plade ved 37 ° C i 30 min. i mørke. Måle absorptionen af hver brønd på 540-590 nm ved hjælp af en mikrotiterplade læser.
   Bemærk: Måleresultaterne er accepteret, hvis optagelsen af den højeste BSA standard er lig med eller overstiger 0,8; Ellers skal måling gentages. Standardkurven skal følge sigmoide dosis-respons kurve montering.
4. Analyse, beregne standard kurven ved hjælp af en 4-parameter Marquardt ligning efter subtraktion af tom. Beregne protein koncentrationer af ukendte prøver ved hjælp af standardkurven passer.

Representative Results

Med metoden nuværende forskning var menneskelige PCLS forberedt og udsat for fem koncentrationer af industrielle stoffer at vurdere kemisk inducerede immunmodulerende virkninger i menneskets lunge materiale. Lungevæv blev udsat neddykket betingelser som permanent kultur for 24 h. toksicitet blev vurderet ved måling af frigivne LDH, mitokondrie-aktivitet og mikroskopiske levedygtighed farvning. Derudover samlede proteinindhold for normalisering og pro-inflammatoriske cytokiner blev målt. Når det er muligt, blev hæmmende koncentration (IC) 75 værdier beregnet ved ikke-lineære sigmoide kurve montering. De positive referencestoffer, vaskemiddel til cytotoksicitet og LP'ER til medfødte cytokin respons, blev anvendt til validering af hver kørsel. Den logaritmisk transformerede IC75 [µM] værdier (log IC50) blev brugt som "lokalirriterende" koncentrationer for efterfølgende cytokin release målinger.

Figur 1 og figur 2 viser proceduren for påfyldning menneskelige lunge materiale og eksemplarisk H & E farvning af menneskelige PCLS. Rutinemæssig hygiejnisk procedurer skal følges for at undgå skadelige virkninger på sundhed og sikre sikkerheden for de personer, der håndterer menneskelige lunge materiale. Teknikken kræver personaleuddannelse og praksis. Oplevet patologer, der adskiller forskellige regioner (øvre/nedre kamre og subpleural versus mere central) og syge versus sunde områder er nødvendige for at vurdere den patologiske status af menneskelige lunge materiale. Den genererede menneskelige PCLS bør anvendes til forberedelse af H & E-farvede tynde sektioner, som kan blive revurderet af en patolog. Denne procedure hjælper brugerne få praksis i kræsne forskellige syge områder og steder i lungerne.

Figur 3 præsenterer måleresultaterne for LDH og WST-1 aktivitet i menneskelige PCLS efter 24 timers inkubation med SLS. Den ubehandlede mellemstore kontrol uden SLS, vist på 0 µg/mL SLS, er en vigtig kvalitetskontrol. Værdier skal være under 20% for LDH sammenlignet med vaskemiddel-mængden væv og > 0,7 absorbans enheder for WST-1 assay. Disse kvalitetskontroller også tjene som indikatorer for utilstrækkelig væv levedygtighed. Lydhørhed af det menneskelige væv mod rengøringsmiddel, som effektivt giftige stof, skal medtages som positiv kontrol. Det bør resultere i en stigning af 300-500% (> 2,0 absorbans enheder) af LDH sammenlignet med ubehandlet væv og i værdier < 0,1 absorbans enheder for WST-1 assay. SLS resulterede i en dosisafhængig reduktion af cellernes levedygtighed som målt ved en forøgelse af LDH og et fald af metaboliske aktivitet i WST-1 analysen ved koncentrationer > 87 µg/mL. En sigmoid koncentration-respons model var udstyret til data, således at det er muligt at beregne IC75 eller IC50 værdier. Disse værdier kan efterfølgende bruges til at vælge koncentrationer for cytokin og chemokine niveau: ved stærkt giftige koncentrationer, normalt ingen eller kun formindsket cytokiner og kemokiner kan påvises. Derfor, ikke-giftige eller kun lidt giftige koncentrationer (IC75) anbefales. Det er vigtigt at bemærke her, at den forventede stigning i LDH aktivitet i cellekultur supernatanten påvirkes ofte af de anvendte stof²¹. Ofte, forekommer interferens mellem stof og enzym aktiviteten, fører til fejlfortolkning af resultater, hvis LDH analysen var eneste cytotoksicitet analysen anvendes. Det er således vigtigt og nødvendigt at udføre flere cytotoksicitet assays for at opnå pålidelige og valide resultater. Desuden bør det nævnes at følsomheden af LDH og WST-1-assays er meget sammenlignelige.

I figur 4vise mikroskopiske levedygtighed billeder af PCLS lydhørhed af det menneskelige væv til vaskemiddel som en effektiv giftigt stof. Resultaterne er meget nyttigt at bekræfte andre levedygtighed data, men det kræver yderligere udstyr. Toksiske virkninger vurderes visuelt ved evaluering af calcein-positive væv i forhold til EthD-1-positive cellekerner. Tilfældigt udvalgte segmenter i parenkym generelt resultere i sammenlignelige data, airways eller blodkar bør undgås, da større hulrum kan flytte resultaterne. Fra vores erfaring og med mikroskopiske indstillingerne beskrevet ovenfor målt et gennemsnitlig volumen mellem 1.5 x 10⁶ og 5 x 10⁶ µm³ kontrol væv. Værdierne afhænger lunge kvalitet, PCLS kvalitet, og også vævsdonor lunge sygdom. Selv om levedygtigheden af menneskelige lungevæv varierer blandt donorer, bør antallet af døde cellekerner sammenlignet med levedygtige væv ikke overstige 15% af kontrolelementet væv. Hvis døde cellekerner findes overvejende i kontrolelementet væv, men bør forsøget opgives.

Figur 5 viser repræsentative data for immunmodulerende effekt af HClPt og SLS på menneskelige lungevæv. De pro-inflammatoriske cytokiner IL-1α og TNF-α er biomarkører for betændelse, der angiver begyndelsen af de inflammatoriske processer efter udsættelse for stimulerende stoffer. Begge cytokiner blev målt ved ELISA. Ekstracellulære IL-1α er normalt lav i menneskers PCLS, højhastighedssporenes intracellulære IL-1α på 1.000 pg/mL eller derover. Et fald i intracellulær IL-1α angiver igangværende cytotoksiske processer - og er for det meste observeret efter menneskers PCLS eksponering for kemikalier. Hvis væv stimuleres med LP'ER, en aktivator af den medfødte immunsystem og som sådan den positive behandling kontrol, så de fleste af de inducerede IL-1α kan kun påvises intracellulært efter 24 timer. Derimod kan TNF-α sekretion induceret af LP'ER stimulation hovedsagelig måles extracellularly. Brug af en egnet positiv kontrol, såsom LP'ER, viser gyldigheden af en metode. Med den nuværende Forskningsmetode,, blev human PCLS udsat for tre koncentrationer af HClPt (32, 64 og 125 µg/mL) eller to koncentrationer af SLS (1-10 µg/mL) for 24 h. cytokin sekretion blev fastsat som en sum af den ekstracellulære og intracellulære cytokiner normaliseret til total protein koncentrationer som afbilledet i figur 5. Det er værd at nævne her, at BCA assay er generelt bruges til bestemmelse af total proteinindhold, men det afspejler også stof-induceret cytotoksicitet. Derfor, i stærkt giftige koncentrationer det samlede proteinindhold kan ikke bruges til normalisering af cytokin data. Sekretion af IL-1α steg betydeligt fra 263 ± 38 pg/mg 887 ± 216 pg/mg og for TNF-α fra 263 ± 38 pg/mg 1,160 ± 286 pg/mg (figur 5A, B). Derudover præsenteres LPS-induceret IL-1α og TNF-α sekretion i forhold til en unstimulated væv kontrol. Induktion af pro-inflammatoriske cytokiner af patogen-associeret molekylære mønstre, såsom LP'ER, viser gyldigheden af en metode og anbefales stærkt at blive brugt når du arbejder med menneskelige PCLS for at undersøge immunmodulerende virkninger. For flere detaljer om HClPt og SLS data, henvises til undersøgelsen af Lauenstein et al. ²¹

Figur 1 : Procedure for påfyldning menneskelige lunge materiale. Den menneskelige lunge er udarbejdet umiddelbart efter resektion. Lungerne skal opbevares ved stuetemperatur til konsekvent påfyldning med Agarosen og undgå pludselige Agarosen polymerisering under fyldningen. Lungerne er placeret vandret, med lapper spredes ud til en optimal udsigt på de vigtigste Bronkie eller bronkier (A & B for closeup på bronkier). Bronkier er kanylerede med et fleksibelt silikone slange og fast med skruetvinger (C). Efter påfyldning procedure og Agarosen polymerisering i vævet skæres uddannet patologer lungen i skiver af om 3-5 cm tykkelse (D). Fra disse skiver tilberedes cylindrisk væv kerner (Ø fx, 8 mm) med en coring værktøj (E). Disse væv kerner er skåret med et væv udsnitsfilter ind i PCLS, som umiddelbart overføres til medium-fyldt petriskåle til udrugning under normal celle kultur betingelser (E). Efter flere vask trin af PCLS overføres til celle kultur plader (f.eks., 24-godt plade med to PCLS pr. brønd og 500 µL medium) for at fjerne resterende celle debris og frigivne celle mæglere (F). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2 : Bestemmelse af menneskelige PCLS af H & E farvning sundhedsstatus. PCLS i dette billede, tilberedt af en donor med en lunge tumor, viser intakt lungevæv med alveolær parenkym, perifere airways (*), og blodkar (pilespidser) i oversigt (A). Ved højere forstørrelse, gennemføre airways med intakt ciliated respiratorisk epitel (pilespidser) (B), en intakt alveolær struktur foret med levedygtige pneumocytes, herunder en kapillær med talrige erytrocytter (pilespidser) (C), alveolære rum indeholdende alveolær makrofager (CD68 Immunhistokemi) (D), samt blodkar med intakt endotelet (CD31 Immunhistokemi) (E) kan observeres. Kun tumor-fri væv blev brugt til PCLS, og derfor ikke makroskopisk syge områder er synlige. I modsætning til PCLS fremstillet af donorer med andre lungesygdomme, såsom emfysem eller fibrose, alveolær struktur ikke forstyrres og PCLS er kun lidt flosset på den ydre pensionær, sandsynligvis på grund af præparationstrin. Skalaen angiver 1.000 µm (A) og 50 µm (B-E), henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3 : Bestemmelse af cytotoksicitet induceret af SLS i menneskers PCLS, målt ved lækage af enzymet LDH i substratet a og tab af metaboliske enzymaktivitet vurderet med farvestof WST-1 (B). Menneskelige PCLS blev udsat for stigende koncentrationer af SLS. En sigmoid koncentration-respons model blev efterfølgende monteret data, således at IC75 eller IC50 værdier (hæmmende koncentration på 25% og 50% reduktion af cellernes levedygtighed) kan være beregnet (højre tal). Data præsenteres som betyder ± SEM, n = 3-5. Absorbansen af LDH assay blev målt ved 492 nm (reference på 630 nm) og WST-1 assay ved 450 nm (reference på 630 nm). Data blev tilpasset og ændret fra Lauenstein et al. ²¹ Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4 : Repræsentant billeder af den tre-dimensionelle mikroskopiske farvning og image rendering af menneskelige PCLS. Levende væv kontrol og lydhørhed af væv til vaske-og rengøringsmiddel, som effektivt giftige stof, er vist efter farvning af menneskelige PCLS med calcein AM (gul) og EthD-1 (rød). Stakke af 30 µm blev taget med en 10 X mål (A) og gengives (B). Skalalinjen angiver 100 µm. Excitation bølgelængder 488 nm og 543 nm, emission filtre BP 505-550 nm og LP 560 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5 : Ammonium hexachloroplatinate (HClPt)-induceret IL-1α og TNF-α sekretion i menneskelige PCLS efter 24 timers eksponering. PCLS blev udsat for tre koncentrationer (32 µg/mL, 64 µg/mL og 125 µg/mL HClPt) og to forskellige koncentrationer (1 µg/mL og 10 µg/mL) af SLS. Ekstracellulære og intracellulære IL-1α (A) og TNF-α (B) blev bestemt af ELISA og normaliseres til den samlede proteinindhold. For at vise gyldigheden af metoden er en positiv aktivator af den medfødte immunsystem, LP'ER, vist som en reference for intracellulære IL-1α (A) og ekstracellulære TNF-α (B) frigivelse, normaliseret til samlede proteinindhold. Data præsenteres som betyder ± SEM, *p < 0,05 og ***p < 0,001; HClPt og SLS: n = 9, IL-1α_LP'ER: n = 5, TNF-α_LP'ER: n = 4 i tekniske dubletter (Mann-Whitney test). Dette tal er blevet ændret fra Lauenstein et al. ²¹ Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Tillægs figur 1: detaljeret beregningsprogram behandling for billeder af mikroskopiske levedygtighed farvning bruger rendering software. Driftsmæssige trinvis til billedanalyse af uploadede LSM billeder til overflade rendering af calcein-farvede levedygtige væv (A-G, jeg) og plet påvisning af ethidium homodimer-farvede cellekerner (H, J-M). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Tillægs figur 2: oversigt over beregningsmæssige billedanalyse af mikroskopiske levedygtighed farvning af menneskelige lungevæv. Levedygtige væv (gul) blev analyseret af overflade rendering, (B-jeg) og døde cellekerner (rød) blev opdaget af plet påvisning (J-P). Snapshot mode blev brugt til at eksportere billede (Q). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Den menneskelige PCLS teknik er veletableret i vores laboratorium. Den nuværende papir giver en beskrivelse af denne teknik og dets anvendelse til toksicitetstest af stoffer i lunge væv ex vivo. Generelt, relateret enhver laboratorium ved hjælp af denne teknik bør søge at oprette en assay definition af kvantificerbare intervaller, estimering af variabilitet og kvalitetskontrol sikrer gyldigheden af eksperimentet. Mulige standard procedurer kunne være, for eksempel, at gentage hvert slutpunkt, fxcytotoksicitet assay, i mindst tre biologiske donorer (enkelte kørsler) med et minimum af to til tre tekniske replikater pr. prøve herunder positive og negative referencer. Laboratoriepersonalet skal uddannes til at øge assay konsistens og minimere assay variation.

Slutpunkter, der ofte bruges til at vurdere immunmodulerende virkninger af stoffer på lungevæv omfatter cytotoksicitet målinger ved hjælp af forskellige assays (fx, LDH assay, WST-1 assay, mikroskopiske farvning assay), cytokin release undersøgelser, såvel som ændringer i udtryk profil og karakterisering af ændringer i cellulære populationer af immunohistopathological metoder⁶. Desuden er der teknikker der beskriver visualisering af celler, såsom pulmonal dendritiske celler, i murine PCLS²⁸ , der kan også overføres til menneskelige PCLS og kan dermed give mere detaljeret indsigt i den cellulære sammensætning før og efter behandling med formodede cytotoksiske stoffer.

Denne grundlæggende protokol og teknik til præparation af menneskelige lunge væv sektioner er sammenlignelig med teknikker, der har været godt beskrevet i publikationer²⁹. Kort sagt, er orgel materiale fremstillet af patienter lider af live-truende kroniske sygdomme som lungekræft, der opereres for resektion eller transplantation. Undersøgelserne skal godkendes af det lokale etiske udvalg. Patienternes informeret skriftligt samtykke er påkrævet. At oprette en arbejdsproces mellem klinik og laboratorium er et kritisk spørgsmål og kræver kommunikation, og definitionen af grænseflader og infrastruktur mellem begge steder. Menneskelige lunge materiale har skal behandles direkte efter resektion at bevare levedygtigheden af væv. Det er værd at nævne, at den teknik beskrevet her for menneskelige PCLS kan anvendes til både unge og gamle lunger og raske og syge lunger. I USA, for eksempel, er det muligt at få lungerne fra sunde organdonorer, der døde i ulykker eller hvis organer er blevet afvist til transplantation.

Det første vigtige skridt i protokollen er inflation i luftvejene og omkringliggende parenkym med Agarosen løsning. Dette trin er nødvendigt at befæste de meget bløde væv for den efterfølgende procedure, udskæring. Kvaliteten af menneskelige lunge materiale, baseret på sygdom baggrunden, er afgørende her. Kun lapper med intakt lungehinden kan udfyldes. Slutstadium tumorer nær Bronkie forhindre nogle gange fyldet processen. Inden oppumpning af humant materiale, har temperaturen af løsningen ved agarosegelelektroforese skal kontrolleres grundigt. For meget blod (eller andre væsker, ekssudater) inde i menneskelige lungevæv vil resultere i uønskede fortynding af Agarosen og vil påvirke polymerisering processen. Efter inflationen af lungevæv og geldannende af Agarosen på is, skæres lungerne i sektioner af 200 til 300 µm tykkelse. Konsekvens af væv er et meget kritisk spørgsmål. Hvis væv er for blød, er udskæring af lige dele vanskelige. Selv om samme mikrotom-parametrene er angivet for hver donor, tykkelsen af skiverne er mellem donorerne kan variere, grund af individuelle forhold og ændringer under den oppumpning proces for hver lunge. Inhomogene påfyldning af væv vil resultere i forskellige skive tykkelser. I stedet for at måle og standardisere tykkelsen på skiver, kan måling af samlede proteinindhold bruges til indirekte overvåge lunge skive tykkelser. Flere slutstadiet sygdomme hæmme udskæring processen; f.eks, blod fartøjer er meget fortykket i pulmonal hypertension og fibrotisk væv kan være så stive, at udskæring af væv cylindre er næppe muligt og mikrotomen blade skal udskiftes meget ofte.

Efter udarbejdelse af menneskelige PCLS og intensiv vask trin, som er nødvendige for at fjerne celle debris og udgivet enzymer, væv sektioner kan bruges til eksperimenter²⁹. Menneskets PCLS er kulturperler under normal celle kultur betingelser og udsat, for eksempel, kemikalier, lægemidler eller lipopolysaccharides. Lejlighedsvis forurening af PCLS på grund af (ukendte) infektioner er en særudgave på kultur af human lunge materiale. Vævskulturer viser infektioner skal kasseres og udstyr skal desinficeres grundigt. Fysisk adskillelse mellem laboratorium steder bruges til forberedelse på den ene side og dyrkning kan på den anden side bidrage til at undgå cross-infektioner. Med hensyn til udstyr, mikrotomen kan lække og løs hex skruer kan føre til motor skader og stop klinge bevægelighed. Ikke alle dele af udsnitsfilteret er lavet af rustfrit stål, og så det vil oxidere hvis ikke tørres straks ændre rengøring. For at overvinde udstyr spørgsmål, kan det være nødvendigt at have mindst én sikkerhedskopieringsenhed.

I tidligere publikationer, Agarosen rapporteret at blive renset og fjernet under intensiv vask trin efter tilberedning. Faktisk er det ikke muligt, at Agarosen kan ikke fjernes. For fuldstændig fjernelse af agarosegelelektroforese skal det være re smeltet ved høje temperaturer, som ville ødelægge vævet. Agarosen i alveolerne og luftvejene interfererer ikke med de beskrevne slutpunkter. Andre slutpunkter kan påvirkes af tilstedeværelsen af Agarosen (Se også begrænsninger). Behovet for at forberede meget frisk væv sektioner har understreges, da væv levedygtighed er et kritisk spørgsmål i kultur. Bronchoconstriction er ikke en gyldig parameter for bæredygtighed. Vi anbefaler at bruge mindst to eller tre uafhængige cytotoksicitet assays til at kontrollere levedygtigheden af de omkringliggende parenkym; Dette har at være kontrolleret i hvert eksperiment³⁰. Kvalitetskontrol i cytotoksicitet assays tjene som indikatorer for utilstrækkelig væv levedygtighed. Det anbefales derfor, at vurdere lydhørhed af væv, for eksempel, at en effektiv giftigt stof såsom et rengøringsmiddel i alle cytotoksicitet assays. Baseret på dosis-respons-kurver, mindste og største værdier af absorption skal defineres for cytotoksicitet assays og mødte for efterfølgende forsøg. Yderligere ændringer til protokollen afhænger for det meste af de anvendte kemikalier og slutpunkterne på interesse. Anvendeligheden af uopløselige eller meget reaktive kemikalier er begrænset. Den højeste opløsningsmiddel koncentration af DMSO er begrænset til 1%. Højere koncentrationer kan bruges, men kan resultere i udtales udgivelsen af pro-inflammatoriske cytokiner som IL-8. På den anden side kan den stimulus anvendes være relativt svage. I dette tilfælde kan væv forhøjes fra to til fire skiver pr. brønd. Denne tilgang begrænser levedygtighed til 24 h.

En stor begrænsning af menneskelig PCLS er, at i Tyskland de kan kun fremstilles af syge menneskers lunge materiale. Patienter, der gennemgår kirurgi er normalt ældre end 50 år og 80% af patienter med lungekræft er eller plejede at være rygere. Medicinsk behandling af patienter, som glukokortikoider, kan også påvirke resultatet af eksperimenter med humant væv. Derfor er det vigtigt at: i) validere hvert eksperiment af positive referencer kontrollere bæredygtighed, funktionalitet og følsomheden af de enkelte væv, og ii) Kors-validere resultaterne ved hjælp af sund, ikke-syge, midaldrende lungevæv fra forsøgsdyr (ikke-menneskelige primater såsom cynomolgus og, hvis det er muligt, mus, rotter, marsvin). Jo bedre patologi score på det syge væv, jo bedre de eksperimentelle resultater. Stærkt sygt væv kan næppe bruges og meget ofte viser begrænset levedygtighed, utilstrækkeligt lav eller meget høj cytokin niveauer, bakterie- eller svampeinfektion infektioner og mindre bronchoconstriction. Donor-til-donor variation er højere sammenlignet med resultaterne fra forsøgsdyr, som afspejler den individuelle variation af mennesker. Dette er dog ikke en begrænsning i almindelighed; som nævnt ovenfor, i andre lande (fxUSA) det er muligt at opnå sunde lunger fra afdøde organdonorer afvist til transplantation. Lydhørhed af væv er blevet godt beskrevet for den første op til 48 h i akut eksponering eksperimenter. Levedygtighed og funktionalitet af væv er reduceret efter mange dage af kultur eller efter oplagring ved-80 ° C. Det er muligt at kultur menneskelige lungevæv for op til ca. 14 dage. Levedygtighed fortsætter i løbet af denne tid; imidlertid er en stigning i variabilitet, såvel som et tab af funktionalitet af adskillige cellepopulationer, såsom makrofager, i væv observeret, hvilket resulterer i begrænset cytokin udgivelse i svar til mitogens. En anden begrænsning for nogle slutpunkter er tilstedeværelsen af Agarosen i væv, hindre, for eksempel, isolering af høj kvalitet og tilstrækkelige mængder af RNA³¹ eller forberedelse af encellede suspensioner for efterfølgende flowcytometri og fænotyper af celler. Mulighed for at få mekanistiske indblik i én celle svar og funktionalitet er dermed begrænset.

Organotypic væv modeller, såsom menneskelige PCLS, anses for at have en stor indvirkning på grundlæggende og ikke-kliniske forskning. Menneskelige lunge materiale har en biologisk sammensætning, som nøje afspejler den normale organ arkitektur. Det indeholder for eksempel boliger alveolær og bronchiale epitelceller, glatte muskelceller, fibroblaster, endotelceller, nerve fibre og makrofager. Vævet er levedygtig og celler reagerer på flere stimuli. Nerve fibre, selvom klippe, kan være lokalt aktiveret, fører til terminal refleks svar¹⁴. Derfor tilbyder denne ex vivo -model muligheden for at studere cellulær medfødte immunrespons, forsvar svar, cytokin signalering og induktion af celle overflade markører. Flere forbedringer i teknik, dyrkning og validering af slutpunkter tillade brugen af menneskelige PCLS i translationel videnskab. Eksempler på fremtidige tilgange er: i) validering af nye mål i menneskelige lungevæv, ii) vurdering af immunrespons efter eksponering, for eksempel, kemikalier, lægemidler, nanopartikler, osv., iii) tilskud af lungevæv med immunceller, sådan som T-lymfocytter, iv) identifikation og ændring af molekylære mønstre, for eksempel, efter udsættelse for respiratorisk sensibiliserende, sygdom-fremkaldende stoffer eller aktive forbindelser hæmme veje; Derudover v) luftvejene remodellering og vi) neuronal forordning³². Det videnskabelige felt er interesseret i disse nuværende og fremtidige strategier med PCLS. Derudover findes en række forskellige udviklinger, der vil bidrage til at forbedre PCLS teknik, såsom cryo-bevarelse²⁰og væv stretching³³ for at efterligne den naturlige bevægelse af væv under vejrtrækning eller mekanisk ventilation.

Den største fordel ved menneskelige PCLS sammenlignet med andre 3D modeller er tilstedeværelsen af immunceller og nervefibre. Eksperimenter kan også udføres i mus, rotte, og ikke-menneskelige primater, der er de dyrearter, der stadig bruges oftest i farmakologi og toksikologi. Kompleksiteten af menneskelige lungevæv understøtter oversættelse af resultater fra dyr til menneske og fra in vitro- til in vivo. I forbindelse med eksisterende alternative assays til identifikation af respiratorisk sensibiliserende, menneskets PCLS er meget kompleks og tillader ikke indsigt i enkelt celle svar. Endnu, mikroskopi og flow flowcytometri kan give oplysninger om cellulære svar, hvis den lige cellulære markør bruges i kombination, for eksempel med apoptose, nekrose eller intracellulære markører. Der er publiceret assays, som er godkendt og rapporteret at have været anvendt til identifikation af respiratorisk sensibiliserende. Men fremskridt inden for brug af PCLS med alle deres fordele i forhold til én celle assays gør et værdifuldt bidrag i den forstand, at teknikken kan bruges til high throughput screening, som beskrevet af Watson et al. ³⁴ de udviklet en høj overførselshastighed screening assay for at forudsige luftvejene toksicitet i murine cryo-konserveret PCLS. Med deres miniaturized 96-brønd PCLS format påvist de lignende udlæsninger i murine lavage væske, hvilket gør PCLS en gennemførlig høj overførselshastighed assay.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silicon hose 3.0 x 5.0 mm	A. Hartenstein (Leipzig, Germany)	SS04
Syringe	Faust Lab Science (Klettgau, Germany)	9.410 050
Coring tools	custom-made	custom-made
Trimming Blade Handle (FEATHER)	pfm medical ag  (Cologne, Germany)	205530001
Trimming Blades (FEATHER)	pfm medical ag  (Cologne, Germany)	205500000
Microtome: Tissue Slicer	Alabama R&D (Bad Homburg, Germany)	303400-ADPT	Krumdieck Tissue Slicer (MD6000)
Microtome blade	Wilkinson Sword (Solingen, Germany)	ENR-4027800011506
Tissue culture dishes	Sigma (München, Germany)	Z666246-420EA
Cell strainer filter (100 µm Nylon)	Becton Dickinson (Heidelberg, Germany)	BD352360
Inoculation loop	Copan Diagnostics (Murrieta, USA)	CD176S01
TPP Tissue culture plates 24wells	Sigma (München, Germany)	Z707791-126EA
Cassette	Thermo Scientific (Schwerte, Germany)	1000957
Nunc MaxiSorp flat-bottom	Fisher Scientific GmbH (Hannover, Germany)	44-2404-21
Nunc MicroWell 96-Well	Thermo Scientific (Schwerte, Germany)	260836
Confocal Microscope	Zeiss (Jena, Germany)		Confocal LSM Meta 510
Image rendering software	Bitplane AG (Zürich, Switzerland)		IMARIS 7.6
LSM Image Browser	Zeiss (Jena, Germany)
Multiwell-Reader	Tecan Group Ltd. (Männedorf, Switzerland)	Tecan infinite F200Pro	Plate Reader
Plate shaker	Edmund Buehler GmbH (Hechingen, Germany)	KM-2 Akku
BenchMark ULTRA	Ventana Medical Systems (Tucson, USA)		Automated IHC/ISH slide staining system
Assays
Cell Proliferation Reagent WST-1	Roche (Basel, Switzerland)	11644807001
Cytotoxicity Detection Kit (LDH)	Roche (Basel, Switzerland)	11644793001
Microscopical vitality staining	Invitrogen (Carlsbad, USA)	L-3224	LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit
BCA Protein Assay	Thermo Scientific (Schwerte, Germany)	23225
ELISA assay kit	R & D systems	various, e.g. DY210 (TNF-α) or DY200 (IL-1α)	DuoSet
Reagents
Agarose, low gelling temperature	Sigma (München, Germany)	A9414-100G
Balanced Salt Mixtures and Solutions, Cell Culture, Classic Media and Salts, Earle’s Balanced Salts (EBSS)	Sigma (München, Germany)	E2888-500ML
Penicillin and streptomycin	Lonza (Verviers, Belgium)	17-602E
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM F-12)	Gibco (Darmstadt, Germany)	11039-047	Culture medium
Dulbecco´s Phosphate with Ca and Mg (DPBS)	Lonza (Verviers, Belgium)	BE17-513F	Buffer solution
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma (München, Germany)	A9647-500G
Detergent	Sigma (Saint Louis, USA)	X100-100ML	Triton X-100
Washing buffer	Merck (Darmstadt Germany)	524653	0.05% Tween 20 in PBS