Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Beoordeling van de cytotoxische en immunomodulerende effecten van stoffen in menselijke precisie-cut Lung plakjes

doi: 10.3791/57042 Published: May 9, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Met het oog op het 3V-principe, respiratoire modellen als alternatieven voor dierproeven evolueren. Met name voor risico-evaluatie van respiratoire stoffen is er een gebrek aan adequate tests. Hier beschrijven we het gebruik van menselijke precisie-cut Long segmenten voor de beoordeling van airborne stoffen.

Abstract

Aandoeningen van de luchtwegen in hun brede verscheidenheid moeten passende modelsystemen om te begrijpen van de onderliggende mechanismen en ontwikkeling van nieuwe therapeutics. Bovendien, vereist registratie van nieuwe stoffen adequate risico-evaluatie met adequate testen systemen om het risico van natuurlijke personen worden geschaad, bijvoorbeeld in het arbeidsmilieu te bevorderen. Deze risicobeoordelingen worden meestal uitgevoerd in dierstudies. Met het oog op het 3V-principe en de openbare scepsis tegen dierproeven, hebben menselijke alternatieve methoden, zoals precisie-cut Long segmenten (Thuiskopieerheffingen), zich ontwikkeld. De huidige paper beschrijft de ex vivo -techniek van menselijke Thuiskopieerheffingen te bestuderen van het potentieel van de immunomodulerende van laag-moleculair-gewicht stoffen, zoals ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Gemeten eindpunten zijn levensvatbaarheid en lokale respiratoire ontsteking, gekenmerkt door veranderde afscheiding van cytokines en chemokines. Pro-inflammatoire cytokines, tumor necrose factor alpha (TNF-α) en interleukine 1 alpha (IL-1α) werden aanzienlijk verhoogd in menselijke Thuiskopieerheffingen na blootstelling aan een sub giftige concentratie van HClPt. Hoewel de techniek van Thuiskopieerheffingen is in de afgelopen decennia aanzienlijk geoptimaliseerd, is de toepasbaarheid ervan voor het testen van immunomodulatie nog in ontwikkeling. Daarom zijn de resultaten die hier gepresenteerd voorronde, hoewel ze het potentieel van menselijke Thuiskopieerheffingen als een waardevol instrument in respiratoir onderzoek weergeven.

Introduction

Respiratoire aandoeningen zoals allergisch astma, beroepsastma, chronische obstructieve longziekte (COPD), emfyseem en infecties van de bovenste en onderste luchtwegen zijn over de opkomst en vertegenwoordigen een wereldwijde gezondheid last1,2. Geschikte testsystemen zijn nodig, om enkele van de fundamentele mechanismen die ten grondslag liggen aan deze ziekten, naast de ontwikkeling en het testen van geschikte stoffen identificeren. Fundamenteel onderzoek evenals preklinische Geneesmiddelenontwikkeling zijn gericht op resultaten die opgedaan in in vitro of in vivo tests. Deze tests, hebben echter hun beperkingen3. Ten eerste, in vitro testen gebruik maken van menselijke cellen die zijn geïsoleerd en verwijderd uit de aangrenzende weefsels of organen en zijn dus niet langer kunnen communiceren met of door andere cellen3worden beschermd. Ten tweede, dierlijke modellen zijn vaak niet worden vertaald voor de mens als gevolg van verschillen in fysiologie en biochemische verschillen4. Oog op het minimaliseren van deze beperkingen, en in het kader van de 3V (vervanging, verfijning, vermindering) principe5, nieuwe alternatieve modellen zijn voortdurend in ontwikkeling.

Alternatieve menselijk weefsel van 3D modellen, zoals Thuiskopieerheffingen, zijn een link tussen mens-gebaseerde in vitro en complexe dieren in vivo modellen. Thuiskopieerheffingen weerspiegelen de functionele heterogeniteit met alle relevante celtypes aanwezig in de luchtwegen6. Bovendien, heeft de Thuiskopieerheffingen techniek het voordeel van reproduceerbare voorbereiding van enkele dunne plakjes van exacte dikte van een enkele menselijke of dierlijke weefsel donor. Dit kan een interne controle evenals verschillende concentraties of drugs om te worden getest.

Sinds de eerste introductie van menselijke longen agar gevulde segmenten in 1994 door Fisher et al. 7 de techniek voor het snijden en het kweken van longweefsel heeft aanzienlijk verbeterd. Christian Martin et al. Deze techniek voor verdere chemische en farmacologische toepassingen8verbeterd. Onze fractie was ingevoerd om deze techniek door Christian Martin in 2007. Sindsdien, is de toepassing van Thuiskopieerheffingen in onderzoek van testen van functionele reacties, zoals airway9,10 en vasoconstrictie11, op immunologische, farmacologische12,13, uitgebreid en toxicologische7 testen in verschillende soorten in verschillende laboratoria. Bijvoorbeeld, Schlepütz et al. 14 airway Responsie voor soorten verschillen onderzocht en vergeleken perifere neuron activering elektrisch veld stimulatie (EFS) of door capsaïcine in muizen, ratten, cavia's, schapen, zijdeaapjes en mens. Ze vond de verschillende soorten hebben verschillende maar verschillende patronen van zenuw-gemedieerde bronchoconstrictie en concludeerde dat de gebruikte proefdieren (muizen en ratten) niet altijd met de menselijke reactie overeen komen. Voor het testen van de toxiciteit van de Long en aan het verminderen van het aantal dieren in dit verband, Hess et al. rat Thuiskopieerheffingen 15 vooraf gevalideerd als ex vivo alternatief voor onderzoek naar toxiciteit bij inademing. Deze multicentrische pre valideringsonderzoek geresulteerd in de ontwikkeling van twee voorspellingsmodellen Thuiskopieerheffingen met veelbelovende resultaten.

Bovendien, bij het basisonderzoek, Thuiskopieerheffingen zijn gebruikt ophelderen van calcium signalering16, vroege allergische reacties17en18,19van de reacties van de virale infectie. Technische vooruitgang is een voortdurend en verdere vooruitgang worden onderzocht. Het veld bijvoorbeeld toeneemt het voordeel van menselijk weefsel met de opslag en het hergebruik van bevroren weefsel. Rosner et al. beschreef een techniek van bevriezen en ontdooien lymfkliertest Thuiskopieerheffingen die het vermogen van de luchtwegen bewaart te contracteren op stimulatie: dus de techniek verlengt het venster van de beperkte tijd waarbinnen weefsels levensvatbare, en zo verder blijven testen kunnen na verloop van tijd worden toegepast op de dezelfde donor20. Naast deze onderzoek vooruitgang, Lauenstein et al. 21 onderzocht onlangs risicobeoordeling van verschillende chemische stoffen die als potentiële sensibilisatoren voor beroepsastma in menselijke Thuiskopieerheffingen fungeren kunnen.

Beroepsastma, waarvan symptomen luchtstroom obstructie en luchtwegen hyperresponsiveness, vergelijkbaar met allergisch astma zijn, wordt veroorzaakt door blootstelling aan hoog-moleculair-gewicht (HMW)22 of laag-moleculair-gewicht (LMW) stoffen23 (bv , platina verbindingen) in de omgeving van de werkplek. LMW agenten een potentiële hoge overgevoeligheid bij het vormen van haptens en binden aan vervoerder eiwitten21. Registratie van nieuwe HMW of LMW chemicaliën vereist in vitro en in vivo risico-evaluatie met betrekking tot hun vermeende sensibilisatie potentiële (bv., OESO-richtsnoer 429)24. De tests gebruikt om te bepalen van de vermeende sensibilisatie potentiële, echter waren oorspronkelijk niet bedoeld voor risicobeoordeling van respiratoire allergenen, maar voor contact sensibilisatoren, hoewel er leek te zijn sommige congruentie voor een kleine ondergroep van stoffen25 . Het werk van Lauenstein et al. werd ontworpen als onderdeel van het project van de Europese Unie Sens-it-iv, voor de ontwikkeling van alternatieve testmethoden voor risico-evaluatie van vermeende contactpersoon of Long sensibilisatoren21. Voor dit project zijn we gericht op het testen van de bruikbaarheid van menselijke Thuiskopieerheffingen als een alternatieve testen hulpmiddel. Daarom werd een aantal immunomodulerende eindpunten (bijvoorbeeld, de levensvatbaarheid en cytokine secretie) geselecteerd voor het bepalen van de irriterende of inflammatoire potentieel van chemicaliën, zoals LMW platina verbindingen. Lauenstein et al. vond geen algemene patroon dat kan worden toegepast op alle respiratoire allergenen; hun werk evenwel de Stichting voor de onlangs gepubliceerde protocollen26.

Kortom voorziet het protocol gepresenteerd hier voor voorbereiding en latere blootstelling van menselijke Thuiskopieerheffingen een nuttige methode evaluatie van potentieel Long-toxisch en/of immunomodulerende stoffen die kunnen worden betrokken bij de ontwikkeling van respiratoire ziekten, zoals beroepsastma.

Protocol

Experimenten met menselijke Thuiskopieerheffingen moeten worden uitgevoerd volgens De Code van ethiek van de World Medical Association en goedgekeurd door de lokale ethische Commissie (de voorbeeldige Thuiskopieerheffingen experimenten die hier getoond worden goedgekeurd door de lokale ethische commissie van de Hannover Medical School; nummer 2701-2015). Schriftelijke geïnformeerde toestemming tot het gebruik van menselijke longen materiaal is nodig van alle donor patiënten of hun nabestaanden. De resultaten die worden beschreven in dit manuscript waren verkregen met weefsel segmenten van donoren van verschillende leeftijden, geslachten, medische geschiedenis en oorzaak van resectie, hoewel het grootste deel van het weefsel ontvangen was van patiënten die lijden aan longkanker. Alleen tumor-vrije weefsel werd gebruikt voor experimenten.

1. algemene voorbereiding van menselijke Thuiskopieerheffingen en latere blootstelling aan chemische stoffen

Opmerking: Twee personen zijn verplicht te vullen een Long. Een up-to-date vaccinatie-record voor hepatitis A en B wordt aanbevolen. Patiënten worden routinematig gescreend voor HCV en HIV vóór longtransplantatie. Als een actieve infectie met Mycobacterium tuberculosis is gediagnosticeerd of vermoed, moet de Long worden afgewezen. Niettemin, alle verse menselijke longweefsel en monsters afgeleid moeten worden behandeld als potentieel besmettelijk en bijbehorende beschermende maatregelen moeten worden genomen (deeltje filtermaskers (FFP2), beschermende brillen, handschoenen) om de veiligheid van de personeel. De procedure duurt 60-90 min.

  1. Bevestig de intactheid van de menselijke Long kwab.
    Noot: Een scheur in het borstvlies voorkomt dat homogene vullen van het weefsel. Menselijke longen materiaal moet vanaf de dag van de resectie. Opslagperioden van ongeveer 2 h vóór op kamertemperatuur (RT) vullen met agarose op ijs worden getolereerd. Het weefsel dat we in dit protocol gebruiken wordt verkregen van patiënten die een resectie. Het is niet van overleden patiënten. Als het weefsel is opgeslagen op het ijs, warme het vooraf aan RT alvorens het te vullen, anders de agarose onmiddellijk zal polymeriseren en geen homogene vulling mogelijk zal zijn.
    Let op: Ervoor zorgen dat alle personen die in contact met inheemse menselijk materiaal op beschermende kleding, bestaande uit een laboratoriumjas, twee paar handschoenen, pet, gezichtsmasker, en een paar veiligheidsbril. Menselijk materiaal is potentieel besmettelijk.
  2. Weeg 7,5 g van lage-gelerend agarose en toe te voegen aan 250 mL bi-gedestilleerd water. Kook de agarose in de magnetron totdat het agarose is opgelost. Afkoelen tot ongeveer 40 ° C, afhankelijk van het smelten en geleermiddelen punt van het agarose.
    Opmerking: De verschillende kolven zijn vereist, afhankelijk van de grootte van de kwab.
  3. Vooraf warm en houden het kweekmedium (Tabel of Materials) bij 37 ° C.
    Opmerking: Als de agarose te warm is, vitaminen in het kweekmedium doeltreffendheid zullen verliezen en cellen zal worden beschadigd. Als de temperatuur van het medium/agarose oplossing lager dan 37 ° C is, zal de gelerend proces begint en afbreuk doen aan homogene vullen van de longen. Alleen een temperatuurbereik van 37 ° C tot 39 ° C wordt aanbevolen.
  4. Plaats alle vereiste materialen binnen handbereik voordat u begint: 5-10 klemmen, flexibele katheter van ongeveer 1 m lengte, een geschikte injectiespuit (b.v., 50 mL) montage van de verbinding met de katheter, en een koelbox gevuld met ijs.
  5. Cannulate van de luchtpijp/main bronchiën door het invoegen van de Siliconen slang en fixering van het met een klem georiënteerde parallel aan de buis, zodat de klem van de samendrukking van het weefsel samen naast de Siliconen slang zonder het af te knijpen. Controleer of de Siliconen slang is gefixeerd binnen en niet kan uitglijden uit tijdens de procedure van de vulling. Sluit alle andere bronchiën, bloedvaten en verwondingen met klemmen, zodat geen agarose tijdens de procedure van het vullen kan uitlekken.
  6. Meng een gelijkwaardige hoeveelheid 3% laag-gelerend agarose met gestolde voedingsbodem in een bekerglas. Het mengsel in de longen met behulp van een 50 mL injectiespuit inboezemen. Voorafgaand aan het bijvullen van de spuit met medium, sluit de klem de katheter met vingers of een klem om luchtbellen en agarose reflux te voorkomen. Vul de Long kwab totdat het volledig is opgepompt. Zorgvuldig raken de longen pleura aan de kant; het borstvlies moet zelfs en hard.
    Opmerking: Afhankelijk van de grootte van de Long kwab, maximaal 2 of 3 L van agarose/medium oplossing kunnen worden vereist.
  7. Herhaal stap 1.5-1.6 voor elke bronchiën in het geval van verschillende bronchi binnen een enkel exemplaar.
  8. Zet de longen op het ijs voor de polymerisatie van het agarose gel voor 20-40 min, afhankelijk van de hoeveelheid agarose ingeprent. Zorgvuldig raak het borstvlies van verschillende kanten om te controleren of het is hard en cool, die aangeeft dat polymerisatie is voltooid, anders blijven wachten. Laat de pathologen zal de Long snijd in plakjes, hun monsters te nemen en opslaan van het Long-materiaal op ijs voor vervoer.
  9. Snijd de menselijke longweefsel in 3-5 cm platen met een scherp mes.
    Opmerking: Gebruik een nieuwe mes voor elke Long om scherpte.
  10. Vul de slicer weefsel met 400 mL ijskoud Earle's evenwichtige zoutoplossing (EBSS). Onmiddellijk gesneden cilindrische weefsel kernen uit de platen van de longen met behulp van een semi-automatische schroevendraaier met een grondonderzoek gereedschap van de gewenste diameter (bijvoorbeeld8 mm, 10 mm).
    Opmerking: Deze diameter moet gelijkwaardig zijn aan de diameter van de houder van het weefsel in de machine.
  11. De dikte van de segmenten van de longen naar de waarde van de gewenste dikte aanpassen.
    Opmerking: Een dikte van ongeveer 250 µm wordt vaak gebruikt in Thuiskopieerheffingen experimenten. De fabrikant van de weefsels slicer raadt aan hun weefsel segment Laagdiktemeter voor verificatie van de dikte van het segment. Als alternatief, geheel-mount kleuring gecombineerd met confocale microscopie kan worden gebruikt voor het bepalen van de dikte van het segment, zoals beschreven door Brismar et al. 27
  12. Breng de kernen van weefsel in het weefsel houder voor de slicer weefsel. Zet het gewicht (onderdeel van de weefsel-houder) op de top van de kern van het weefsel. Stel de arm snelheid en blade snelheid tot en met 6 op de slicer weefsel. Start de kern van het weefsel in Thuiskopieerheffingen opsplitsen.
  13. Vullen van de 500 mL van de verkrijgbare Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM): nutriënt mengsel F-12 DMEM/F12 (1:1) met 5 mL penicilline (10.000 eenheden/mL) en streptomycine (10.000 µg/mL). Bewaar het kweekmedium meerdaagse onder steriele omstandigheden in een koelkast. Vooraf warm alleen de benodigde hoeveelheid medium.
    Opmerking: Penicilline zal worden geïnactiveerd als bij 37 ° C gedurende langere periodes. Gebruik serum-gratis en kleurstof-gratis-kweekmedium, kan als serum samenstelling van charges varieert en, zoals fenol-rood kleurstoffen, interfereren met testen.
  14. Vul een petrischaal (100 x 15 mm) met 25 mL ijskoud kweekmedium. Medium moet worden afgetapt uit de slicer weefsel in een bekerglas door het openen van de klem van de glazen cilinder. De segmenten van een bekerglas overboeken naar de petrischaal met voedingsbodem met behulp van een applicator (b.v., inoculatie lus). De petrischaal gebracht in een incubator (5% CO2, 37 ° C, luchtvochtigheid van 100%). Het toestaan van het medium om op te warmen voordat wassen stappen.
    Opmerking: Alle verdere stappen worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden.
  15. Plaats de zeef van een cel in de petrischaal voor het wassen van de Thuiskopieerheffingen. Volledig verwijderen van het kweekmedium met een serologische pipet 10 mL door de cel zeef en voeg 25 mL van 37 ° C voorverwarmde verse medium. Herhaal deze stap 3 - 4 keer elke 30 min.
    Opmerking: De zeef van de cel verhindert de segmenten worden meegezogen in de pipet, om te voorkomen dat schade aan de segmenten.
  16. Breng de Long segmenten zorgvuldig in een 24-well cultuur plaat met een minimum van 500 µL cultuurmedium voor twee sneetjes per putje. Bloot het longweefsel stoffen (Zie maatregelen 3.1-3.4), bijvoorbeeldgedurende 24 uur bij 37 ° C, 5% CO2.
    Opmerking: Voor de overdracht, bij voorkeur een inenting lus gebruiken en laat de vlotter van de segmenten op de lus om weefselschade te voorkomen. Geen verdere scheiding van de segmenten is nodig, omdat alleen tekort van voldoende verse medium celdood in plakjes weefsel zal veroorzaken. Segmenten kunnen overlappen of raken elkaar in de put: dit heeft geen invloed op de levensvatbaarheid van het weefsel.
  17. Zet alle resterende menselijk materiaal in een kunststof kolf met een fixeer (bv, 10% gebufferd formaldehyde) gedurende ten minste 24 uur en branden dit in het verwijderingsproces.
    Let op: Formaldehyde is giftig, het uitvoeren van deze stap onder een kap.

2. histologische analyse van Thuiskopieerheffingen

  1. Bereiden biopsie cassettes met twee schuim pads gedrenkt in fixeer (bv., 4% gebufferd formaldehyde). Plaats de Thuiskopieerheffingen tussen de schuim pads in de biopsie cassette en onmiddellijk overdracht van het weefsel in kleefpoeders oplossing. Fix het weefsel overnachting in 4% gebufferd formaldehyde.
  2. Verwerken het weefsel voor paraffine insluiten door het drogen van de monsters in ethanol (70%, 90%, 100%, 100%, 100%, 100%) gedurende 1 uur, gevolgd door wassen in xyleen (3 x 1 h) en vloeibare paraffine (3 x 1 h) per standaard histopathologie protocollen.
  3. Breng de Thuiskopieerheffingen in een insluiten schimmel. Gebruik een lus van de inenting. Het weefsel van Thuiskopieerheffingen insluiten in vloeibare paraffine. Zorg ervoor dat het weefsel gelijkmatig in de mal plaatsen bij het gieten van het blok van paraffine.
  4. Knip het weefsel blok met de Thuiskopieerheffingen met rotary microtome, totdat er een vlakke en zelfs ondergrond. Seriële secties van de gewenste dikte nemen (bijv., 4 µm), plaatsen hen individueel op opeenvolgend genummerd gecoat glas dia's (meestal 25-30 secties kunnen worden genomen) tot de hele Thuiskopieerheffingen is verwerkt.
  5. Enkel glas dia's (elke 8-10 afdelingen) vlek met haematoxyline en eosine vlek (H & E) voor oriëntatie. Selecteert u de secties voor het experiment op basis van de afdrukstand dia's (de eerste en de laatste 8 secties zijn meestal onvolledig).
    Opmerking: (Optioneel) voor langdurige opslag, de dia's kunnen worden ondergedompeld in vloeibare paraffine voor behoud.

3. bereiding van de oplossingen voor stoffen

Opmerking: Werkoplossingen en besturingselementen onmiddellijk voor het gebruik voorbereiden.

Let op: Verwerken stoffen volgens de veiligheidsinstructies of, indien onbekend, als potentieel schadelijk en volg routine veiligheid voorzorgsmaatregelen.

  1. Los op in water oplosbare stoffen direct in het kweekmedium. Voor onoplosbare of slecht oplosbare chemicaliën, los eerst de stof in de geschikte oplosmiddelen afhankelijk van de oplosbaarheid van de stof. Stoffen met een oplosbaarheid in water beperkt (< 0,1 mg/mL) kan worden ontbonden, bijvoorbeeld in DMSO of ethanol. Niet-toxisch oplosmiddel concentraties moeten worden bepaald door titratie vooraf. Zorg ervoor dat de stoffen niet doen precipiteren uit oplossing wanneer verdund tot medium.
    Opmerking: HClPt en sodium laureth sulfate (SLS) oplossingen bereid zijn.
  2. Bereiden stof stamoplossingen op 100-fold van de gewenste hoogste concentratie in het kweekmedium of oplosmiddel. Weeg 12,5 mg HClPt en 34.4 mg SLS en bereiden van stamoplossingen door ontbinding van de chemische stoffen in 1 mL gestolde voedingsbodem.
    Opmerking: Geen oplosmiddel is vereist voor deze chemische stoffen.
  3. Maak een uiteindelijke verdunning van 1:100 in voorverwarmde medium. In geval van voorafgaande gebruik van oplosmiddel resulteert deze aanpak in de dezelfde oplosmiddel eindconcentratie voor alle concentraties van de stof.
  4. Gebruik de uiteindelijke concentratie oplosmiddel (bijvoorbeeld, 1% zoals beschreven in stap 3.3) voor referentie behandeling van Thuiskopieerheffingen. Geen oplosmiddelen controle was nodig voor de chemische stoffen vermeld in de sectie resultaten.

4. positieve en negatieve verwijzingen voor cytotoxiciteit Assays

  1. Voor alle tests van de levensvatbaarheid, de volgende positieve en negatieve controles te bereiden:
    1. Weefsel controle: Thuiskopieerheffingen broeden in een kweekvloeistof alleen als referentie voor onbehandelde Thuiskopieerheffingen gedurende 24 uur op cel kweekomstandigheden (5% CO2, 37 ° C, luchtvochtigheid van 100%).
    2. Voertuig controle (indien nodig): Thuiskopieerheffingen broeden met de eindconcentratie oplosmiddel als een referentie voor Thuiskopieerheffingen voertuig alleen behandeld (zie stap 3.4) gedurende 24 uur op cel kweekomstandigheden (5% CO2, 37 ° C, luchtvochtigheid van 100%).
    3. Positieve controle: Thuiskopieerheffingen Incubeer met 1% wasmiddel in bufferoplossing gedurende 1 uur bij 4 ° C.
      Opmerking: Als Thuiskopieerheffingen kleurloos geworden, het weefsel is dood. Totale L-lactaat dehydrogenase (LDH) wordt bepaald in het supernatant, met een opname van ongeveer 1,9-2,3 (Zie stappen 6.1-6.4). Het weefsel wordt gebruikt voor de WST-1 assay (Zie stappen 5.1-5.5), met een opname van ongeveer 0.

5. meting van de cytotoxiciteit wordt chemisch geïnduceerde in menselijke Thuiskopieerheffingen door WST-1 Assay

Opmerking: De WST-1-test wordt uitgevoerd in een 24-well plaat met twee Thuiskopieerheffingen per putje. Bij voorkeur gebruik van duplicaten voor elke parameter en bundelen van de resultaten van deze dubbele vermeldingen na meting.

  1. De werkoplossing bereid door verdunning van het reagens WST-1 medium onmiddellijk voordat u begint. Het normbedrag van de werkoplossing is 250 µL per putje van de plaat van een 24-well. Meng daarom 25 µL van het reagens met 225 µL van de voedingsbodem voor een goed.
  2. Na incubatie van Thuiskopieerheffingen uit stap 1.16, negeren of gebruik het supernatant voor cytokine metingen of andere tests zoals de LDH-bepaling. Het resterende weefsel wordt gebruikt voor de volgende stap.
  3. Pipetteer 250 µL van de concentratie van de werken van het reagens WST-1 per goed en Incubeer de plaat bij 37 ° C en 5% CO2 voor 1 h. Zorg ervoor dat de Thuiskopieerheffingen volledig door de WST-1 reagens tijdens de incubatie gedekt zijn.
  4. Plaats de plaat op een roteerschudapparaat (200 rpm) en schud voorzichtig voor 30 s om homogenisatie van het mengsel van het reagens WST-1. Neem een nieuwe flat-96-Wells bodemplaat en Pipetteer 100 µL in duplicaten van het supernatant van elk putje van de plaat 24-well.
  5. Meten van de absorptie van elk putje bij 450 nm (Referentie: 630 nm) met behulp van een microplate-lezer. Aftrekken van de absorptie bij 630 nm van 450 nm. Deze waarden worden gebruikt voor de berekening in stap 5.6).
    Opmerking: Betrouwbare gegevens voor de beoordeling van de cytotoxiciteit kan worden verkregen slechts levensvatbaar weefsel. Daarom deze criteria voor acceptatie gepubliceerd door Hess et al. 15 moet worden voldaan in elk experiment. Indien niet aan deze criteria wordt voldaan, moet het experiment herhaald worden.
  6. Absorptie van het onbehandelde middellange besturingselement moet boven de 0.6, anders die het experiment moet worden herhaald. Als de gegevens voldoen aan deze eis, de waarde van de absorptie van het weefsel besturingselement instelt op 100% en de WST-1 vermindering van behandelde steekproeven met betrekking tot de controle van het weefsel te berekenen.

6. LDH Assay

Opmerking: De LDH test is uitgevoerd in een 96-wells-plaat met 100 µL cultuur supernatant in totaal na de post incubatieperiode.

  1. Na incubatie van de Thuiskopieerheffingen met of zonder de agenten van de test, neem 50 µL van supernatans uit stap 1.16 en breng dit in de duplicaten in een nieuwe 96-wells-plaat. Dit genereert duplicaten van elk goed voor een 24-well plaat behandeld.
  2. Bereid de werkoplossing van LDH reagens onmiddellijk voorafgaand aan de test. De werkoplossing bestaat van de katalysator-oplossing (lyophilisate opgelost in 1 mL bidistilled water) en kleurstof van oplossing geleverd door de fabrikant. Voor een 96-wells-plaat, grondig Meng 125 µL van katalysator oplossing met 6,25 mL oplossing kleurstof.
    Let op: Niet de oplossing direct licht blootstellen.
  3. Pipetteer 50 µL van de werkoplossing in elk goed al met 50 µL van supernatant en de plaat gedurende 20 minuten op RT in het donker uit te broeden. Geen verdere mengen is vereist.
  4. Meten van de absorptie van elk putje bij 492 nm (Referentie: 630 nm) met behulp van een microplate-lezer. Aftrekken van de absorptie bij 630 nm van 492 nm. Deze waarden worden gebruikt voor de berekening in stap 6.5.
    Opmerking: Betrouwbare gegevens voor de beoordeling van de cytotoxiciteit kan worden verkregen slechts levensvatbaar weefsel. Absorptie van het besturingselement wasmiddel-behandeld moet worden meer dan 1.
  5. Voor analyse, stelt u de waarde van de absorptie van de positieve controle uit stap 4.1 als 100% en de LDH-release in behandelde steekproeven met betrekking tot de positieve controle (dat wil zeggen, maximale LDH release) te berekenen.

7. de microscopische levensvatbaarheid Assay met Confocale Laser Scanning Microscoop (cLSM)

Opmerking: Voor de microscopische levensvatbaarheid assay, zijn twee van de normale 250-µm-dikke Thuiskopieerheffingen gekleurd in 250 µL per putje van de plaat van een 24-well. Zoals elk segment is afzonderlijk beeld, zijn geen verdere duplicaten vereist.

  1. Na incubatie van Thuiskopieerheffingen met of zonder test items, verwijder het supernatant of gebruiken voor cytokine metingen of andere tests zoals de LDH test. Gebruik het resterende weefsel voor de hier beschreven procedure.
  2. De werkverdunning van calceïne-AM en ethidium homodimer 1, (EthD-1) met een concentratie van de werken van beide reagentia 4 µm in een kweekvloeistof voor te bereiden. Voor dit doel, 1 µL van calceïne-AM (4 mM) en 2 µL van EthD-1 (2 mM) toevoegen aan 997 µL cultuurmedium. Dit volume is vereist om 4 putjes met twee Thuiskopieerheffingen elke vlek.
    Opmerking: Vermijd blootstelling van de reagentia aan direct licht.
  3. Pipetteer 250 µL van de werkverdunning in elk goed en de 24-well plaat voor 45 min op RT in het donker uit te broeden. Plaats de plaat op een roteerschudapparaat bij 150 omwentelingen per minuut tijdens de incubatie om betere Gasbedwelming met behulp van het weefsel de kleurstofoplossing.
  4. Na 45 min, negeren de kleurstofoplossing en spoelen de Thuiskopieerheffingen met 1 mL bufferoplossing door schudden bij 150 omwentelingen per minuut gedurende 3-5 min. op de RT in het donker. Herhaal deze stap tweemaal.
  5. Toepassing 500 µL van de bufferoplossing aan elk putje met de gekleurde Thuiskopieerheffingen om te voorkomen dat autofluorescence van kweekmedium. Voor de microscopische beoordeling, ten minste twee willekeurig verdeelde z-stacks met een cLSM uit te voeren.
  6. Klik op het tabblad oogbeschadigingen en/of kies een 10 X / 0.3 doelstelling en klik op Online de cLSM gebruiken als een standaard lichte Microscoop te vinden van het oppervlak van Thuiskopieerheffingen. Klik op Offline om af te sluiten de oogbeschadigingen en/of instelling.
  7. Klik op het tabblad overname en inschakelen van de juiste lasers voor de fluorophores.
    Opmerking: We gebruikten een argon laser met een golflengte van 488 nm voor de polyan kleurstof calceïne (excitatie golflengte van 495 nm) en een HeNe laser met een golflengte van 543 nm voor de detectie van de EthD-1/DNA-complex (excitatie golflengte van 533 nm). De argon laser moet over het algemeen uitgevoerd op 30-50% van de maximale stroom om de stroom van een buis van ongeveer 5,7 A, zoals dit de levensduur van de laser aanzienlijk verlengt.
  8. Klik op Licht pad onder het tabblad overname en opzetten van de nodige filters en spiegels voor het experiment.
    Opmerking: In de huidige studie, werd een filter-systeem gebruikt met een splitter dichroïde hoofdbalk (bv., HFT 488/543) scheiden de excitatie en uitstoot licht. Door een reflecterende spiegel die dit licht is gericht aan de secundaire dichroïde balk splitter (bijvoorbeeldNFT 545) tot verdere afzonderlijke het uitgestraalde licht uit het monster in twee kanalen.
  9. Instellen van de band pass filters (bijvoorbeeldBP 505-530 voor het calceïne signaal en BP 560-615 voor de EthD-1/DNA complex signaal) die zendt alleen een bepaald bereik van golflengtes en het calceïne signaal op kanaal 2 en de EthD-1/DNA complex signaal toewijzen aan kanaal 3.
  10. Het Z-Stacks selectievakje Als u wilt instellen van de boven- en ondergrenzen voor de microscopische volume. Druk op de Live knop om te zien een actuele weergave van de bijbehorende laag op het scherm. De focus verplaatsen omhoog of naar beneden het oppervlak van de Thuiskopieerheffingen met een scherpe signaal.
  11. Klik op de Subsectie kanalen en het selectievakje Alles weergeven. Opsluiten van de tabel door te drukken op de knop van het desbetreffende kanaal onder het live beeld en activeer de kleur van het kanaal.
    Opmerking: Een blauwe kleur in het live beeld zal aangeven dat er geen signaal, is overwegende dat een hoog signaal in het wit verschijnen zal en een overbelichte signaal zal in rood verschijnen.
  12. Het gaatje voor het rode kanaal van de EthD-1 ingesteld op 1 luchtige eenheid voor de beste trade-off tussen efficiëntie van lichte collectie en optische afdelen en het kanaal van calceïne dienovereenkomstig aan te passen. Verhoog het ontdekte signaal van de winst dat wit, maar niet rood in het live beeld met geactiveerde kanaal vastloper kleurentabel lijkt.
    Opmerking: De meester winst mag niet hoger zijn dan 600 eenheden.
  13. Verhoog of verlaag de digitale offset om het aanpassen van de achtergrond, zodat het wordt weergegeven in het blauw in het live beeld met geactiveerde kanaal vastloper Kleurentabel.
  14. Klik op het tabblad Z-Stack onder multidimensionale verwerving en gebruik van de focus te verschuiven naar een z-laag van belang. Druk op Eerste instellen om op te slaan dit standpunt voor latere overname. Langzaam de focus omhoog of omlaag totdat een bereik van 30 µm is bereikt en op Laatste instellen om op te slaan.
  15. Klik op Live nogmaals te deactiveren van het live beeld en drukt u op Experiment starten om te beginnen met de beeldvorming.
    Opmerking: Levensvatbare weefsel wordt gedetecteerd door middel van fluorescentie van de polyan kleurstof calceïne. Dode cellen worden gediscrimineerd door complexvorming van EthD-1 en nucleïnezuren.

8. de beeldweergave

Opmerking: De aanbeveling van de computer van de afbeelding rendering software moet rekening worden gehouden, als dit programma de juiste hardware vereist.

  1. Laad het bestand van de LSM verworven van microscopische levensvatbaarheid kleuring van Thuiskopieerheffingen (zie sectie 7) in de afbeelding rendering software. Opslaan als .ims bestand voordat u verdergaat. Alle parameters op het weefsel besturingselement instellen en toepassen op alle afbeeldingen. Geen verdere wijzigingen zijn toegestaan.
  2. Gebruik van de Volume-knop voor oppervlakte wederopbouw van levensvatbare weefsel (calceïne kleuring) (aanvullende figuur 1A) en de Spots knop voor dode celkernen (aanvullende figuur 1 H). Bij het weergeven van één kanaal, schakel het andere kanaal in de etalage van de aanpassing.
  3. Start door de hoeveelheid vitale weefsel: Stel het kanaal van het oppervlak, verwerken van de hele afbeelding, de gladde factor ingesteld op 0,5 µm en absolute intensiteit gebruiken voor drempel (aanvullende figuur 1B, C). Druk op de blauwe pijl naar rechts.
  4. Aanpassen van de drempel van de absolute intensiteit van het gereconstrueerde volume; lawaai en achtergrond intensiteit moet worden afgetrokken. Oppervlakte overlay in het grijs wordt weergegeven en de nauwkeurigheid van de oppervlakte van de dekking moet worden gecontroleerd (aanvullende figuur 1 d). Na de voltooiing van de aanpassing, drukt u op de blauwe pijl naar rechts. Allermeest naar de tijd is deze stap vereist voor de berekening van de instellingen. Als de software niet kundig voor berekenen van het volume is, de gladde factor te verhogen.
  5. Kies een filter in de laatste stap. Gebruik het filter van de bolvorm (met ongeveer 10 µm) voor oppervlakte rendering uitfilteren van macrofagen in de alveolaire ruimte (aanvullende figuur 1E). Druk op de groene knop.
  6. Optisch aanpassen van de output afbeelding en statistieken als .xls-bestanden exporteren. Het totale volume (som) zal worden gebruikt voor verdere analyse (aanvullende figuur 1F, G). De instellingen opslaan en gebruik hen voor alle verdere analyses van z-stacks genomen op dezelfde dag met dezelfde cLSM instellingen (aanvullende figuur 1I).
  7. Het reconstrueren van het rode kanaal (vlekken) voor dode celkernen. Willekeurig meten de puntgrootte in µm schaling in het venster surpass; dot grootte is ongeveer 5 µm. Mark Enable en de puntgrootte ingesteld. Controleer of alle stippen zijn gemarkeerd en elke stip is slechts één keer geteld. Handmatig corrigeren indien nodig (aanvullende figuur 1B, H, J). Druk op de blauwe pijl naar rechts.
  8. Druk op de groene knop om te laten het programma berekenen/count het totale aantal plekken volgens de parameters ingesteld en het resultaat exporteren als xls-bestand (Aanvullende figuur 1 K, L, M). Stel het aantal berekende dode celkernen in verhouding tot de omvang van de vitale weefsels voor grafische of statistische analyse van het beeld.

9. meting van de Cytokines en Chemokines in menselijke Thuiskopieerheffingen

Opmerking: De cytokine en chemokinereceptoren immuunrespons kan worden gemeten extracellularly in het supernatant van cultuur en intracellulair in weefsel lysates na de incubatietijd. ELISA wordt gemeten in de dubbele waarden in een 96-wells-plaat met 100 µL per putje.

  1. Bereid een wasmiddel 1%-oplossing door het mengen van 5 mL afwasmiddel met 495 mL van de bufferoplossing. De oplossing kan worden achtergelaten bij RT voor enkele maanden.
  2. Meng de 1% schoonmaakmiddel met proteaseinhibitor (PI) in een verhouding van 1:500. Het normbedrag is afhankelijk van de cultuur-plaat; Gebruik bijvoorbeeld 500 µL per putje van een 24-well-plaat. Voor een goed, meng 1 µL van PI met 499 µL van schoonmaakmiddel.
  3. Buizen met 1 µL van PI oplossing voor te bereiden en het verzamelen van 500 µL van cultuur supernatant in deze buizen. Onmiddellijk vervangen het medium in de 24-well plaat door 500 µL schoonmaakmiddel met PI die opgesteld zijn in stap 9.2. Lyse van weefsel voor 1 h door het plaatsen van de 24-well plaat in bij 4 ° C. Pipetteer het weefsel lysate in een nieuwe buis en bewaren deze buizen bij-80 ° C tot verdere analyse.
    Opmerking: Het protocol ELISA zeer afhankelijk van de fabrikant en de instructies van de fabrikant dient te worden gevolgd. Een standaardprotocol voor ELISA wordt beschreven in de volgende.
  4. Het uitvoeren van de ELISA voor het meten van cytokine niveaus in bezinken of lysate volgens de instructies van de fabrikant. Voor het meten van de IL-1α en TNF-α, jas u a96-well plaat door pipetting 100 µL van het antilichaam vastleggen (voor verdunning volg instructies van de fabrikant) en na een nacht bebroeden bij RT.
  5. Bereiden wassen buffer door het oplossen van een wassen buffer-tablet in 1 L water van de bidistilled. Verwijder de opname antilichaam en Pipetteer 400 µL wassen buffer in elk putje. Vervang dit volume driemaal. Het blokkeren van de plaat door de blokkerende oplossing (bijvoorbeeld, 1% BSA in bufferoplossing, volgens de instructies van de fabrikant) toe te voegen. Incubeer bij RT gedurende 1 h.
    Opmerking: Standaard verkrijgbare ELISAs vereisen 2 x 100 µL van weefsel bezinken of lysate. Monsters moet eenmaal ontdooide en enkel voorafgaand aan gebruik. Afhankelijk van de gevoeligheid van de test en de vrijgegeven cytokine, moeten de monsters vóór metingen worden verdund. Daarom, Verdun het monster in het reagens geboden door de bepaling.
  6. De blokkerende oplossing verwijderen en toevoegen van verdunde monsters voor de standaard curve (voor verdunning volg instructies van de fabrikant) en 100 µL van weefsel bezinken of 100 µL van weefsel lysate dubbele verzameld in stap 9.3. Incubeer gedurende 2 uur op RT.
  7. Verwijder de monsters en Pipetteer 400 µL wassen buffer in elk putje. Vervang dit volume driemaal. Pipetteer 100 µL biotinyleerd detectieantilichaam (voor verdunning volg instructies van de fabrikant) en incubeer gedurende 2 uur op RT.
  8. Verwijder de antilichaam en Pipetteer 400 µL wassen buffer in elk putje. Vervang dit volume driemaal. 100 µL per putje van HRP-geëtiketteerden daar toevoegen (voor verdunning volg instructies van de fabrikant) en incubeer gedurende 20 min op RT (Controleer de instructies van de fabrikant).
  9. Verwijder daar en Pipetteer 400 µL wassen buffer in elk putje. Vervang dit volume driemaal.
  10. Voeg 100 µL van het substraat (aanbevolen door de fabrikant) en incubeer gedurende 20 min in het donker (Controleer de instructies van de fabrikant).
    Opmerking: Deze stap is lichtgevoelig. Vermijd blootstelling aan licht van het substraat en plaat.
  11. Zet de reactie stop door het toevoegen van 50 µL eindeoplossing (1 M H2SO4). Meten van de absorptie van elk putje bij 450 nm (Referentie: 570 nm) met behulp van een microplate-lezer. Aftrekken van de absorptie bij 570 nm van 450 nm.
    Opmerking: Onbehandeld en/of voertuig weefsel controles dienen als negatieve controles. Gebruiken om het opwekken van een immuunrespons bij longweefsel, passende stimulatie (bv100 ng/mL lipopolysaccharide (LPS)) als positieve controle. Twee putjes met twee PLCS per putje met 100 ng/mL LPS in cultuurmedium, bijvoorbeeld, Incubeer gedurende 24 h, en het verzamelen van de bovendrijvende substantie en weefsel lysate zoals beschreven in stap 9.3.
    Opmerking: De gemeten resultaten worden geaccepteerd, als de absorptie van het hoogste niveau gelijk is aan of hoger dan 1.0; anders moet de meting worden herhaald. De standaard curve moet de sigmoïdale dosis / respons-curve-fitting volgen.
  12. Cytokine concentraties (pg) bepaald door ELISA in stap 9.11 zijn genormaliseerd naar de totale proteïne inhoud in weefsel lysate van elk monster worden bepaald (zie punt 10).

10. meting van de totale eiwitgehalte in menselijke Thuiskopieerheffingen

Opmerking: De Thuiskopieerheffingen moet worden voor het meten van totale eiwitconcentratie lysed. Het weefsel lysates uit stap 9.3 worden gebruikt voor deze stap. De test wordt uitgevoerd in een plat 96-wells-plaat met 25 µL per putje van weefsel lysate, afgepipetteerde in duplicaten.

  1. Voorbereiden van een 7-punt BSA standaard met BSA concentraties van 2.000 µg/mL, 1.500 µg/mL, 1000 µg Mn/mL, 750 µg/mL, 500 µg/mL, 250 µg/mL en 125 µg/mL. 25 µL dubbele voor elke norm van toepassing en gebruik van 25 µL bufferoplossing als een leeg op een 96-wells-plaat (gebruik een plaat met een omslag van de plaat).
  2. Pipetteer 25 µL van de lysates (zie stap 9.3) van elk putje in de duplicaten in een 96-wells-plaat. In totaal is 50 µL van elk goed vereist. Voorbereiden van de reagens van de werken van BCA oplossing door verdunnen BCA reagens B 1:50 in BCA reagens A. Gebruik voor een 96-wells-plaat 400 µL van het reagens B en 20.000 µL van het reagens A.
  3. Zorgvuldig Pipetteer 200 µL van het reagens van de werken in elk putje, luchtbellen vermijden. Plaats de plaat op een roteerschudapparaat (150 rpm) voor 30 s om te zorgen voor goede vermenging van lysates en werkende reagens, en een plaat cover op de plaat gezet. Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 30 minuten in het donker. Het meten van de absorptie van elk putje op 540-590 nm microplate lezer gebruikt.
    Opmerking: De meetresultaten worden geaccepteerd, als de absorptie van de hoogste BSA standaard gelijk is aan of hoger dan 0.8; anders moet de meting worden herhaald. De standaard curve moet de sigmoïdale dosis / respons-curve-fitting volgen.
  4. Berekenen voor analyse, de standaard curve met behulp van een 4-parameter Marquardt vergelijking na aftrekken van de blanco. Bereken de eiwit-concentratie van de onbekende monsters met behulp van de standaard curve past.

Representative Results

Met de huidige onderzoeksmethode, werden menselijke Thuiskopieerheffingen voorbereid en blootgesteld aan vijf concentraties van industriële stoffen te beoordelen van chemisch geïnduceerde immunomodulerende effecten in de menselijke longen materiaal. Longweefsel werd blootgesteld verzonken omstandigheden zoals permanente cultuur voor 24 h. toxiciteit werd beoordeeld door meting van vrijgegeven LDH mitochondriale activiteit en microscopische levensvatbaarheid kleuring. Bovendien totaal eiwitgehalte voor normalisatie en pro-inflammatoire cytokines werden gemeten. Waar mogelijk, werden remmende concentratie (IC) 75 waarden berekend door niet-lineaire sigmoïdale curve-fitting. De positieve referentiestoffen, wasmiddel voor de cytotoxiciteit en LP's voor de reactie van de aangeboren cytokine, werden gebruikt voor de validatie van elke serie. De logaritmisch getransformeerde IC75 [µM] waarden (log IC50) werden gebruikt als "irriterend" concentraties voor latere cytokine release metingen.

Figuur 1 en Figuur 2 weergeven de procedure van het vullen van de menselijke Long materiaal en voorbeeldige H & E kleuring van menselijke Thuiskopieerheffingen Routine hygiënische procedures moeten worden gevolgd om de voorkoming van negatieve effecten op de gezondheid en veiligheid van het personeel de menselijke longen materiaal. De techniek vereist personeel opleiding en oefening. Ervaren pathologen die het onderscheiden van verschillende regio's (hoofdletters/kleine lobben en subpleural versus meer centrale) en zieke versus gezonde gebieden nodig zijn om te beoordelen van de pathologische status van het menselijke longen materiaal. De gegenereerde menselijke Thuiskopieerheffingen dient voor de voorbereiding van H & E gebeitste dunne secties, die opnieuw kunnen worden geëvalueerd door een patholoog. Deze procedure helpt gebruikers krijgen praktijk in discriminerende verschillende zieke gebieden en locaties binnen de longen.

Figuur 3 geeft de meetresultaten voor LDH en WST-1 activiteit in menselijke Thuiskopieerheffingen na 24 uur incubatie met SLS. De onbehandelde middellange controle zonder SLS, vertoond op 0 µg Mo/mL SLS, is een belangrijke kwaliteitscontrole. Waarden moeten onder de 20% voor LDH met wasmiddel-lysed weefsel vergeleken en > 0.7 absorptie-eenheden voor de WST-1 assay. Deze kwaliteitscontroles dienen ook als indicatoren van ontoereikend weefsel levensvatbaarheid. Responsiviteit van de menselijke weefsel naar het schoonmaakmiddel, als een effectieve giftige stof, moet worden opgenomen als positieve controle. Het moet leiden tot een verhoging met 300-500% (> 2.0 absorptie-eenheden) van LDH vergeleken met onbehandelde weefsel en in waarden < 0.1 absorptie-eenheden voor de WST-1 assay. SLS resulteerden in een daling van de dosis-afhankelijke van levensvatbaarheid van de cellen zoals gemeten door een toename van LDH en een daling van de metabole activiteit in de bepaling van de WST-1 bij concentraties > 87 µg/mL. Een sigmoid concentratie-reactie-model was uitgerust met de gegevens, zodat is het mogelijk om IC75 of IC50 waarden te berekenen. Deze waarden kunnen vervolgens worden gebruikt om concentraties voor cytokine en chemokinereceptoren niveaus selecteren: bij zeer toxische concentraties, meestal geen of alleen verminderde cytokines en chemokines kan worden gedetecteerd. Dus, niet-toxisch of slechts geringe mate giftig concentraties (IC75) worden aanbevolen. Het is belangrijk hier op te merken dat de verwachte toename van de LDH activiteit in de celcultuur supernatant wordt vaak beïnvloed door de toegepaste stof21. Vaak optreden storingen tussen de stof en enzym activiteit, leidt tot een verkeerde interpretatie van de resultaten als de LDH test de enige cytotoxiciteit assay gebruikt was. Het is dus belangrijk en noodzakelijk is voor het uitvoeren van verschillende cytotoxiciteit testen om betrouwbare en geldige resultaten te verkrijgen. Bovendien moet worden vermeld dat de gevoeligheid van het LDH en WST-1 tests zeer vergelijkbaar is.

In Figuur 4tonen de microscopische levensvatbaarheid beelden van Thuiskopieerheffingen responsiviteit van de menselijke weefsel aan wasmiddel als een effectieve giftige stof. De resultaten zijn zeer nuttig om te bevestigen de gegevens van andere levensvatbaarheid, maar dit vereist extra apparatuur. Toxische effecten zijn visueel beoordeeld aan hand van calceïne-positieve weefsel in vergelijking met EthD-1-positieve celkernen. Willekeurig gekozen segmenten binnen parenchym resulteren over het algemeen in vergelijkbare gegevens, overwegende dat airways of bloedvaten moeten worden vermeden, zoals grotere holten de resultaten kunnen verschuiven. Uit onze ervaring en met de microscopische instellingen hierboven beschreven, wordt een gemiddelde volume tussen de 1.5 x 106 en 5 x 106 µm3 van het controle-weefsel gemeten. De waarden zijn afhankelijk van longkanker materiaalkwaliteit, Thuiskopieerheffingen kwaliteit, en ook de ziekte van de Long weefsel donor. Ook al de levensvatbaarheid van menselijke longweefsel tussen donors varieert, het aantal dode celkernen vergeleken met levensvatbare weefsel mag niet meer dan 15% van het weefsel-besturingselement. Als dode celkernen hoofdzakelijk aanwezig in het besturingselement weefsel zijn, echter moet het experiment worden gestaakt.

Figuur 5 geeft representatieve gegevens voor de immunomodulerende effect van HClPt en SLS op menselijke longweefsel. De pro-inflammatoire cytokines IL-1α en TNF-α zijn biomarkers van ontsteking, met vermelding van het begin van de inflammatoire processen na blootstelling aan stoffen stimuleren. Beide cytokines werden gemeten door ELISA. Extracellulaire IL-1α is meestal laag in menselijke Thuiskopieerheffingen, terwijl intracellulaire IL-1α niveaus van 1.000 pg/mL en hierboven bereikt. Een afname van de intracellulaire IL-1α geeft lopende cytotoxische processen - en wordt meestal waargenomen na blootstelling van menselijke Thuiskopieerheffingen aan chemische stoffen. Als weefsel wordt gestimuleerd met LPS, een activator van het aangeboren immuunsysteem en als zodanig de positieve behandeling bepalen, dan de meeste van de geïnduceerde IL-1α kunnen alleen worden gedetecteerd intracellulair na 24 h. TNF-α secretie geïnduceerd door LPS stimulatie kan daarentegen voornamelijk extracellularly worden gemeten. Het gebruik van een geschikt positieve controle, zoals LPS, bewijst de geldigheid van een methode. Met de huidige onderzoeksmethode, werden menselijke Thuiskopieerheffingen blootgesteld aan drie concentraties van HClPt (125, 32 en 64 µg/mL) of twee concentraties van SLS (1 en 10 µg/mL) voor 24 h. Cytokine secretie werd bepaald als de som van de extracellulaire en intracellulaire cytokines genormaliseerd naar totale proteïne concentraties zoals afgebeeld in Figuur 5. Vermeldenswaard is hier dat de BCA bepaling wordt meestal gebruikt voor de bepaling van het totale eiwitgehalte, maar het weerspiegelt ook stof-geïnduceerde cytotoxiciteit. Vandaar, bij zeer toxische concentraties het totale eiwitgehalte kan niet worden gebruikt voor de normalisatie van cytokine gegevens. Secretie van IL-1α aanzienlijk gestegen van 263 ± 38 pg/mg 887 ± 216 pg/mg en voor TNF-α van 263 ± 38 pg/mg naar 1160 ± 286 pg/mg (Figuur 5A, B). Bovendien, LPS-geïnduceerde IL-1α en TNF-α-secretie wordt gepresenteerd in vergelijking met de controle van een ongestimuleerde weefsel. Inductie van pro-ontsteking cytokinen door pathogen-geassocieerde moleculaire patronen, zoals LPS, toont de geldigheid van een methode en wordt sterk aanbevolen om bij het werken met menselijke Thuiskopieerheffingen u nagaan immunomodulerende effecten worden gebruikt. Voor meer informatie over HClPt en SLS gegevens, gelieve te verwijzen naar de studie door Lauenstein et al. 21

Figure 1
Figuur 1 : Procedure voor het vullen van de menselijke longen materiaal. De menselijke Long is bereid onmiddellijk na resectie. De longen moet worden bewaard bij kamertemperatuur voor consistente vullen met agarose en om te voorkomen dat plotselinge agarose polymerisatie tijdens het vullen. De Long is horizontaal geplaatst met de kwabben verspreid voor een optimale weergave op de belangrijkste bronchiën of de bronchiën (A & B voor close-up op de bronchiën). De bronchiën zijn gecanuleerd met een flexibele Siliconen slang en vastgesteld met klemmen (C). Na het vullen procedure en agarose polymerisatie in het weefsel snijd opgeleide pathologen de Long in reepjes van over 3-5 cm dikte (D). Van deze segmenten worden cilindrische weefsel kernen (Ø bv, 8 mm) bereid met een grondonderzoek gereedschap (E). Deze kernen van weefsel worden gesneden met een slicer weefsel in Thuiskopieerheffingen, die onmiddellijk worden overgebracht naar medium gevulde petrischalen voor incubatie onder normale cel kweekomstandigheden (E). Na verschillende wassen stappen de Thuiskopieerheffingen worden overgebracht naar cel cultuur platen (bijv., 24-well plaat met twee Thuiskopieerheffingen per goed en 500 µL medium) om overblijvende cel puin en vrijgegeven cel bemiddelaars (F) te verwijderen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Bepaling van de gezondheidsstatus van menselijke Thuiskopieerheffingen door H & E kleuring. De Thuiskopieerheffingen in dit beeld, bereid uit een donor met een tumor van de Long, toont intact longweefsel met alveolaire parenchym, perifere airways (*), en bloedvaten (pijlpunten) in het overzicht (A). Op hogere vergroting, het uitvoeren van airways met intact ciliated respiratoire epitheel (pijlpunten) (B), een intact alveolaire structuur bekleed met levensvatbare pneumocytes, met inbegrip van een capillair met talrijke erytrocyten (pijlpunten) (C), alveolaire ruimten waarin de alveolaire macrofagen (CD68 immunohistochemistry) (D), evenals de bloedvaten met intact endotheel (CD31 immunohistochemistry) (E) kunnen worden waargenomen. Alleen tumor-vrije weefsel werd gebruikt voor de Thuiskopieerheffingen, heeft daarom geen macroscopisch zieke gebieden zichtbaar zijn. In tegenstelling tot Thuiskopieerheffingen bereid van donors met andere longziekten, zoals emfyseem of fibrose, de alveolaire structuur, hierdoor niet wordt verstoord en de Thuiskopieerheffingen is alleen iets op de buitenste grens, meest waarschijnlijk te wijten aan voorbereiding stappen gerafeld. Schaal staven geven 1.000 µm (A) en 50 µm (B-,E), respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Bepaling van de cytotoxiciteit geïnduceerd door SLS in menselijke Thuiskopieerheffingen, gemeten door lekkage van het enzym LDH in kweekmedium (A) en verlies van metabole enzymactiviteit beoordeeld met de kleurstof WST-1 (B). Menselijke Thuiskopieerheffingen werden blootgesteld aan toenemende concentraties van SLS. Een sigmoid concentratie-reactie-model werd vervolgens gemonteerd op de gegevens, zodat IC75 of IC50 waarden (remmende concentratie op 25% en 50% vermindering van de levensvatbaarheid van de cellen) worden kunnen berekend (juiste cijfers). Gegevens worden gepresenteerd zoals bedoel ± SEM, n = 3-5. Absorptie van LDH test werd gemeten op 492 nm (reference op 630 nm) en van WST-1 test bij 450 nm (reference op 630 nm). Gegevens zijn aangepast en gewijzigd van Lauenstein et al. 21 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : Representatief beelden van de driedimensionale microscopische kleuring en beeld weergave van menselijke Thuiskopieerheffingen. Levend weefsel controle en reactievermogen van wasmiddel, als een effectieve giftige stof, weefsel worden weergegeven na de kleuring van menselijke Thuiskopieerheffingen met calceïne AM (geel) en EthD-1 (rood). Stapels van 30 µm werden gegrepen met een 10 X doelstelling (A) en (B) weergegeven. Het geeft de schaal-balk 100 µm. excitatie golflengten 488 nm en 543 nm, emissie filters BP 505-550 nm en LP 560 nm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 : Ammonium hexachloroplatinate (HClPt)-IL-1α en TNF-α secretie in menselijke Thuiskopieerheffingen na 24 uur blootstelling geïnduceerde. Thuiskopieerheffingen werden blootgesteld aan drie concentraties (32 µg/mL, 64 µg/mL en 125 µg/mL HClPt) en twee verschillende concentraties (1 µg/mL en 10 µg Fe/mL) van SLS. Extracellulaire intracellulaire IL-1α (A) en TNF-α (B) werden bepaald door ELISA en genormaliseerd naar het totale eiwitgehalte. Om aan te tonen van de geldigheid van de methode wordt een positieve activator van het aangeboren immuunsysteem, LPS, weergegeven als een referentie voor intracellulaire IL-1α (A) en voor extracellulaire TNF-α (B) release, genormaliseerd naar totale eiwitgehalte. Gegevens worden gepresenteerd zoals bedoel ± SEM, *p < 0,05 en ***p < 0,001; HClPt en SLS: n = 9, IL-1αLPS: n = 5, TNF-αLPS: n = 4 technische dubbele (Mann-Whitney-test). Dit cijfer is gewijzigd van Lauenstein et al. 21 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Supplementary Figure 1
Aanvullende figuur 1: gedetailleerde computationele verwerking voor foto's van microscopische levensvatbaarheid kleuring rendering softwarematig. Stapsgewijze werkwijze voor beeldanalyse van geüploade LSM beelden voor oppervlakte weergave van calceïne gebeitste levensvatbare weefsel (A--G, ik) en ter plaatse detectie van ethidium homodimer gebeitste celkernen (H, J-M). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Supplementary Figure 2
Aanvullende figuur 2: overzicht van computationele beeldanalyse van microscopische levensvatbaarheid kleuring van menselijke longweefsel. Levensvatbare weefsel (geel) werd geanalyseerd door oppervlakte weergave (B-ik) en dode celkernen (rood) werden ontdekt door ter plaatse detectie (J--P). De modus momentopname werd gebruikt om de afbeelding (Q) te exporteren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

De menselijke Thuiskopieerheffingen techniek is goed ingeburgerd in ons laboratorium. Het huidige artikel geeft een beschrijving van deze techniek en het gebruik ervan voor toxiciteitstests voor stoffen in het Long weefsel ex vivo. In het algemeen, gerelateerde een laboratorium met behulp van die deze techniek streven moet naar het instellen van een bepaling definitie van de kwantificeerbare bereiken, schatting van de variabiliteiten en kwaliteitscontroles garanderen de geldigheid van het experiment. Mogelijke standaard procedures zou kunnen worden, bijvoorbeeld, te herhalen van elk eindpunt, bijvoorbeeldde bepaling van de cytotoxiciteit, in een minimum van drie biologische donoren (individuele sessies) met een minimum van twee tot drie technische duplo's per monster inclusief positieve en negatieve verwijzingen. Laboratoriumpersoneel moeten worden opgeleid om assay samenhang en minimaliseren assay variabiliteit.

Eindpunten vaak gebruikt ter beoordeling van de immunomodulerende effecten van stoffen op longweefsel omvatten cytotoxiciteit metingen met behulp van verschillende tests (bv, LDH assay, WST-1 assay, microscopische kleuring assay), cytokine versie testen, zo goed als wijzigingen in expressie profiel en karakterisering van veranderingen van cellulaire populaties door immunohistopathological methoden6. Verder zijn er technieken beschrijven de visualisatie van de cellen, zoals pulmonaire dendritische cellen, in lymfkliertest Thuiskopieerheffingen28 die ook kunnen worden overgedragen aan menselijke Thuiskopieerheffingen en kan dus meer gedetailleerde inzicht geven in de cellulaire samenstelling vóór en na behandeling met vermeende cytotoxische stoffen.

Deze basisprotocol en techniek voor bereiding van menselijke longen weefselsecties is vergelijkbaar met technieken die goed beschreven in publicaties29zijn geweest. Kortom, wordt het orgel materiaal verkregen van patiënten met chronische ziekten zoals longkanker, live-bedreigende die operatie voor resectie of transplantatie ondergaan. De studies moeten worden goedgekeurd door de lokale ethische commissie. Patiënten geïnformeerde schriftelijke toestemming is vereist. Opzetten van een workflow tussen kliniek en laboratorium is een kritieke kwestie en vereist communicatie, en de definitie van interfaces en infrastructuur tussen beide sites. Menselijke longen materiaal moet direct na resectie voor het behoud van de levensvatbaarheid van het weefsel worden verwerkt. Het is vermeldenswaard dat de hier beschreven voor menselijke Thuiskopieerheffingen techniek kan worden toegepast, zowel jonge als oude longen en longen van gezonde en zieke. In de VS, bijvoorbeeld, is het mogelijk te krijgen van de longen van gezonde orgaandonoren die stierf in ongelukken of wier organen voor transplantatie hebben verworpen.

De eerste kritieke stap in het protocol is inflatie van de luchtwegen en de omringende parenchym met agarose oplossing. Deze stap is noodzakelijk om te stollen het zeer zacht weefsel voor de vervolgprocedure snijden. De kwaliteit van menselijke longen materiaal, gebaseerd op de achtergrond van de ziekte, is hier essentieel. Alleen lobben met intact borstvlies kunnen worden ingevuld. Einde-fase tumoren in de buurt van de bronchiën is soms voorkomen dat de vulling-proces. Voor het oppompen van het menselijk materiaal, moet de temperatuur van de agarose oplossing grondig gecontroleerd worden. Teveel bloed (of andere vloeistoffen, exsudaat) binnen de menselijke longweefsel zal resulteren in ongewenste verdunning van agarose en beïnvloedt de polymerisatie-proces. Longen zijn na inflatie van het longweefsel en geleermiddelen van agarose op ijs, snijd in secties van 200 tot 300 µm dikte. Samenhang van het weefsel is een zeer kritieke kwestie. Als het weefsel te zacht is, is het moeilijk om snijden van gelijke secties. Zelfs als het dezelfde microtoom parameters worden ingesteld voor elke donor, de dikte van de plakjes tussen donoren kan variëren, moeten afzonderlijke voorwaarden wijzigingen tijdens het opblazen proces en voor elke Long. Inhomogene vullen van het weefsel zal resulteren in verschillende segment diktes. In plaats van meten en standaardisering van de dikte van de plakjes, kan meting van het totale eiwitgehalte worden gebruikt voor niet indirect controle Long segment diktes. Diverse eind-fase ziekten belemmeren de segmenteringshulplijnen proces; bijvoorbeeld, kunnen bloed vaartuigen zijn uiterst verdikt in pulmonale hypertensie en fibrotische weefsel zo stijf dat snijden van weefsel cilinders nauwelijks mogelijk is en de microtoom blade moet vaak worden vervangen.

Na de voorbereiding van menselijke Thuiskopieerheffingen en intensief wassen stappen, die nodig zijn om te verwijderen cel puin en vrijgegeven enzymen, weefsel secties kunnen worden gebruikt voor experimenten29. Menselijke Thuiskopieerheffingen zijn gekweekt onder normale cel kweekomstandigheden en blootgesteld, bijvoorbeeld aan chemische stoffen, drugs of lipopolysacchariden. Incidentele verontreiniging van Thuiskopieerheffingen als gevolg van de (onbekende) infecties is een themanummer in de cultuur van de menselijke longen materiaal. Weefselcultures tonen infecties moeten worden weggegooid en de apparatuur moet grondig worden ontsmet. Ruimtelijke scheiding tussen laboratorium plaatsen gebruikt voor bereiding aan de ene kant en kweken kan aan de andere kant bijdragen tot het vermijden van cross-infecties. Met betrekking tot de apparatuur, de microtoom kan gaan lekken en losse hex schroeven kunnen leiden tot motor schade en stop van blade beweging. Niet elk deel van de slicer is gemaakt van roestvrij staal, en zo zal het oxideren als niet gedroogd onmiddellijk veranderen schoonmaken. Om te overwinnen problemen met apparatuur, het mogelijk moet ten minste één back-upapparaat.

In eerdere publicaties, is agarose gemeld te worden uitgewassen en tijdens intensieve wassen stappen na bereiding verwijderd. In feite, dit is niet mogelijk, de agarose kan niet worden verwijderd. Voor volledige verwijdering van het agarose moet het opnieuw gesmolten bij hoge temperaturen, die zou het vernietigen van het weefsel. De agarose in longblaasjes en airways interfereert niet met de beschreven eindpunten. Andere eindpunten kunnen worden beïnvloed door de aanwezigheid van agarose (Zie ook beperkingen). De noodzaak om te bereiden zeer verse weefselsecties dient benadrukt te worden, zoals weefsel levensvatbaarheid een kritieke kwestie in cultuur is. Bronchoconstrictie is geen geldige parameter voor leefbaarheid. We raden ten minste twee of drie onafhankelijke cytotoxiciteit testen om te controleren van de levensvatbaarheid van de omringende parenchym; Dit moet worden gecontroleerd in elke experiment30. Kwaliteitscontroles in cytotoxiciteit testen dienen als indicatoren van ontoereikend weefsel levensvatbaarheid. Daarom is het aangeraden om te beoordelen van het reactievermogen van het weefsel, bijvoorbeeld om een effectieve giftige stof zoals een detergent in alle tests van de cytotoxiciteit. Gebaseerd op de dosis / respons-curven, minimale en maximale waarden van absorptie moeten worden gedefinieerd voor het testen van de cytotoxiciteit en voldaan voor latere experimenten. Verdere wijzigingen in het protocol is meestal afhankelijk van de toegepaste chemische stoffen en de eindpunten van belang. De toepasselijkheid van onoplosbare of zeer reactieve chemicaliën is beperkt. De hoogste concentratie oplosmiddel DMSO is beperkt tot 1%. Hogere concentraties kunnen worden gebruikt, maar kunnen leiden tot uitgesproken versie van pro-ontsteking cytokinen, zoals IL-8. Aan de andere kant, misschien de stimulus gebruikt wel relatief zwak. In dit geval, kan de hoeveelheid weefsel worden verhoogd van twee naar vier sneetjes per putje. Deze aanpak beperkt de levensvatbaarheid tot 24 h.

Een belangrijke beperking van menselijke Thuiskopieerheffingen is dat in Duitsland zij kunnen alleen bereid worden uit zieke menselijke longen materiaal. Patiënten die operatie ondergaan zijn meestal ouder dan 50 jaar en 80% van de patiënten die lijden aan longkanker of gebruikt als rokers. Medicatie van patiënten, zoals glucocorticoïden, kan ook invloed op de resultaten van experimenten met behulp van menselijk weefsel. Het is daarom essentieel om: i) elk experiment te valideren door positieve referenties verifiëren van levensvatbaarheid, functionaliteit en gevoeligheid van de individuele weefsel en ii) kruis-valideren de resultaten met behulp van gezonde, niet-zieke, middelbare leeftijd longweefsel uit proefdieren (niet-menselijke primaten zoals cynomolgus en, indien mogelijk, muis, rat, cavia). Hoe beter de score voor pathologie van het zieke weefsel, des te beter de experimentele resultaten. Zwaar zieke weefsel kan nauwelijks worden gebruikt en heel vaak blijkt beperkte levensvatbaarheid, onvoldoende lage of zeer hoge cytokine niveaus, bacteriële of schimmel infecties en minder bronchoconstrictie. Donor-naar-donor variatie is hoger in vergelijking met de resultaten van de proefdieren, als gevolg van de individuele variabiliteit van de mens. Dit is echter niet een beperking in het algemeen; zoals hierboven vermeld, in andere landen (bijvoorbeeldde VS) is het mogelijk om te verkrijgen van gezonde longen van overleden orgaandonoren verworpen voor transplantatie. Reactievermogen van het weefsel is goed beschreven voor de eerste tot 48u in acute blootstelling experimenten. Levensvatbaarheid en de functionaliteit van het weefsel is verminderd na vele dagen van cultuur of na de opslag in-80 ° C. Het is mogelijk om cultuur menselijke longweefsel voor tot ongeveer 14 dagen. Levensvatbaarheid blijft gedurende deze tijd; echter, een toename van de variabiliteit, evenals een verlies van functionaliteit van verschillende cel populaties, zoals macrofagen, in het weefsel wordt waargenomen, wat resulteert in beperkte cytokine release in reactie op mitogenen. Een andere beperking voor aantal eindpunten is de aanwezigheid van agarose in het weefsel, belemmeren, bijvoorbeeld, de isolatie van hoge kwaliteit en toereikende hoeveelheden RNA31 of de voorbereiding van eencellige schorsingen voor latere stroom cytometry en fenotypering van cellen. De mogelijkheid om inzichten te krijgen mechanistische in eencellige reacties en functionaliteit is dus beperkt.

Organotypic weefsel modellen, zoals menselijke Thuiskopieerheffingen, worden beschouwd als een hoge impact hebben op fundamenteel en niet-klinische onderzoek. Menselijke longen materiaal heeft een biologische samenstelling die aansluit bij de normale orgel-architectuur. Het bevat, bijvoorbeeld, residentiële alveolaire en bronchiale epitheliale cellen, zachte spiercellen, fibroblasten, endotheliale cellen, zenuwvezels en macrofagen. Het weefsel is levensvatbaar en cellen reageren op verschillende stimuli. Zenuwen van vezels, hoewel knippen, lokaal kan worden geactiveerd, wat leidt tot terminal reflex reacties14. Bijgevolg biedt dit model ex vivo de mogelijkheid te bestuderen van cellulaire aangeboren immuunresponsen, defensie reacties, cytokine signalering en inductie van oppervlakte markeringen in een cel. Enkele verbeteringen in de techniek, kweken en validatie van eindpunten staan het gebruik van menselijke Thuiskopieerheffingen in translationeel wetenschap. Voorbeelden van toekomstige benaderingen zijn: i) validering van nieuwe doelstellingen in menselijke longweefsel, ii) beoordeling van immuunresponsen na blootstelling, bijvoorbeeld aan chemische stoffen, drugs, nanodeeltjes, enz., iii) suppletie van longweefsel met immune cellen, dergelijke Als T-lymfocyten, iv) identificatie en wijziging van moleculaire patronen, bijvoorbeeld, na blootstelling aan respiratoire allergenen, ziekte-inducerende stoffen of actieve verbindingen remming van trajecten; Bovendien, v) het remodelleren van de luchtwegen en vi) neuronale verordening32. Het wetenschappelijke veld is geïnteresseerd in deze huidige en toekomstige benaderingen met Thuiskopieerheffingen. Daarnaast zijn er een verscheidenheid van verschillende ontwikkelingen die helpen zullen om de Thuiskopieerheffingen techniek, zoals cryo-behoud20en weefsel dat zich uitstrekt van33 om na te bootsen de natuurlijke beweging van het weefsel tijdens de ademhaling of mechanische ventilatie.

Het grote voordeel van menselijke Thuiskopieerheffingen vergeleken met andere 3D-modellen is de aanwezigheid van immuuncellen en zenuwvezels. Experimenten kunnen ook worden uitgevoerd in de muis, rat en niet-menselijke primaten, die de diersoorten die nog vaak in de farmacologie en toxicologie gebruikt worden. De complexiteit van menselijke longweefsel ondersteunt de vertaling van de resultaten van dier naar mens en van de in vitro in vivo. In het kader van bestaande alternatieve tests voor de identificatie van respiratoire allergenen, menselijke Thuiskopieerheffingen zijn zeer complex en inzicht in één cel reacties niet toestaan. Nog, misschien microscopie en stroom cytometry geven informatie over cellulaire reacties, als de rechts cellulaire markering wordt gebruikt in combinatie, bijvoorbeeld met apoptosis, necrose of intracellulaire markeringen. Er zijn gepubliceerde testen die zijn gevalideerd en gemeld te zijn gebruikt voor de identificatie van respiratoire allergenen. Echter, de vooruitgang in het gebruik van Thuiskopieerheffingen met alle hun voordelen ten opzichte van eencellige testen zijn levert een waardevolle bijdrage in die zin dat de techniek kan worden gebruikt voor high-throughput screening, zoals beschreven door Watson et al. 34 ontwikkelden ze een high-throughput screening test te voorspellen airway toxiciteit in lymfkliertest cryo-bewaard Thuiskopieerheffingen. Met hun verkleinde 96-Wells Thuiskopieerheffingen formaat ontdekt ze soortgelijke uitlezingen in lymfkliertest lavage vloeistof, maken van Thuiskopieerheffingen een haalbaar high-throughput assay.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen. Fraunhofer ITEM is een onafhankelijke non-profit overheidsonderzoek organisatie voor toegepast onderzoek, uitvoeren van contractonderzoek namens de biotech-, farmaceutische-, chemische- en cosmetica-industrie. Financiering van het Instituut komt van nationale en internationale openbare projecten.

Acknowledgments

Wij wil Lan Lauenstein bedanken voor haar pre werk met betrekking tot alternatieve testmethoden voor risico-evaluatie met menselijke Thuiskopieerheffingen. Een deel van het onderzoek werd gesteund door een subsidie van de Europese Commissie binnen de 6th kader programma SENS-IT-IV "Roman testen strategieën voor In Vitro beoordeling van allergenen".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon hose 3.0 x 5.0 mm A. Hartenstein (Leipzig, Germany) SS04
Syringe Faust Lab Science (Klettgau, Germany) 9.410 050
Coring tools custom-made custom-made
Trimming Blade Handle (FEATHER) pfm medical ag  (Cologne, Germany) 205530001
Trimming Blades (FEATHER) pfm medical ag  (Cologne, Germany) 205500000
Microtome: Tissue Slicer Alabama R&D (Bad Homburg, Germany) 303400-ADPT Krumdieck Tissue Slicer (MD6000)
Microtome blade Wilkinson Sword (Solingen, Germany) ENR-4027800011506
Tissue culture dishes Sigma (München, Germany) Z666246-420EA
Cell strainer filter (100 µm Nylon) Becton Dickinson (Heidelberg, Germany) BD352360
Inoculation loop Copan Diagnostics (Murrieta, USA)  CD176S01
TPP Tissue culture plates 24wells Sigma (München, Germany) Z707791-126EA
Cassette Thermo Scientific (Schwerte, Germany) 1000957
Nunc MaxiSorp flat-bottom Fisher Scientific GmbH (Hannover, Germany) 44-2404-21
Nunc MicroWell 96-Well  Thermo Scientific (Schwerte, Germany) 260836
Confocal Microscope Zeiss (Jena, Germany) Confocal LSM Meta 510
Image rendering software Bitplane AG (Zürich, Switzerland) IMARIS 7.6
LSM Image Browser Zeiss (Jena, Germany)
Multiwell-Reader Tecan Group Ltd. (Männedorf, Switzerland) Tecan infinite F200Pro Plate Reader
Plate shaker Edmund Buehler GmbH (Hechingen, Germany) KM-2 Akku
BenchMark ULTRA Ventana Medical Systems (Tucson, USA) Automated IHC/ISH slide staining system
Assays
Cell Proliferation Reagent WST-1 Roche (Basel, Switzerland) 11644807001
Cytotoxicity Detection Kit (LDH) Roche (Basel, Switzerland) 11644793001
Microscopical vitality staining  Invitrogen (Carlsbad, USA) L-3224 LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit
BCA Protein Assay Thermo Scientific (Schwerte, Germany) 23225
ELISA assay kit R & D systems various, e.g. DY210 (TNF-α) or DY200 (IL-1α) DuoSet
Reagents
Agarose, low gelling temperature  Sigma (München, Germany) A9414-100G
Balanced Salt Mixtures and Solutions, Cell Culture, Classic Media and Salts, Earle’s Balanced Salts (EBSS) Sigma (München, Germany) E2888-500ML
Penicillin and streptomycin Lonza (Verviers, Belgium) 17-602E
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM F-12) Gibco (Darmstadt, Germany) 11039-047 Culture medium
Dulbecco´s Phosphate with Ca and Mg (DPBS) Lonza (Verviers, Belgium) BE17-513F   Buffer solution
Albumin from bovine serum (BSA) Sigma (München, Germany) A9647-500G
Detergent Sigma (Saint Louis, USA) X100-100ML Triton X-100
Washing buffer Merck (Darmstadt Germany) 524653  0.05% Tween 20 in PBS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. D'Amato, G., et al. Climate change, air pollution and extreme events leading to increasing prevalence of allergic respiratory diseases. Multidiscip Respir Med. 8, (1), 12 (2013).
  2. Pawankar, R., et al. State of world allergy report 2008: allergy and chronic respiratory diseases. World Allergy Organ J. 1, (6), Suppl 4-17 (2008).
  3. Hartung, T., Daston, G. Are in vitro tests suitable for regulatory use. Toxicol Sci. 111, (2), 233-237 (2009).
  4. Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, (7252), 208-212 (2009).
  5. Balls, M., Straughan, D. W. The three Rs of Russell & Burch and the testing of biological products. Dev Biol Stand. 86, 11-18 (1996).
  6. Sewald, K., Braun, A. Assessment of immunotoxicity using precision-cut tissue slices. Xenobiotica. 43, (1), 84-97 (2013).
  7. Fisher, R. L., et al. The use of human lung slices in toxicology. Hum Exp Toxicol. 13, (7), 466-471 (1994).
  8. Ressmeyer, A. R., et al. Characterisation of guinea pig precision-cut lung slices: comparison with human tissues. Eur Respir J. 28, (3), 603-611 (2006).
  9. Donovan, C., et al. Rosiglitazone elicits in vitro relaxation in airways and precision cut lung slices from a mouse model of chronic allergic airways disease. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 309, (10), 1219-1228 (2015).
  10. Koziol-White, C. J., et al. Inhibition of spleen tyrosine kinase attenuates IgE-mediated airway contraction and mediator release in human precision cut lung slices. British journal of pharmacology. 173, (21), 3080-3087 (2016).
  11. Paddenberg, R., Mermer, P., Goldenberg, A., Kummer, W. Videomorphometric analysis of hypoxic pulmonary vasoconstriction of intra-pulmonary arteries using murine precision cut lung slices. J Vis Exp. (83), e50970 (2014).
  12. Lamb, D. J., et al. Bl 1002494, a Novel Potent and Selective Oral Spleen Tyrosine Kinase Inhibitor, Displays Differential Potency in Human Basophils and B Cells. J Pharmacol Exp Ther. 357, (3), 554-561 (2016).
  13. Leus, N. G., et al. HDAC 3-selective inhibitor RGFP966 demonstrates anti-inflammatory properties in RAW 264.7 macrophages and mouse precision-cut lung slices by attenuating NF-kappaB p65 transcriptional activity. Biochem Pharmacol. 108, 58-74 (2016).
  14. Schleputz, M., et al. Neurally mediated airway constriction in human and other species: a comparative study using precision-cut lung slices (PCLS). PLoS One. 7, (10), 47344 (2012).
  15. Hess, A., et al. Prevalidation of the ex-vivo model PCLS for prediction of respiratory toxicity. Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 32, 347-361 (2016).
  16. Bergner, A., Sanderson, M. J. Acetylcholine-induced calcium signaling and contraction of airway smooth muscle cells in lung slices. J Gen Physiol. 119, (2), 187-198 (2002).
  17. Wohlsen, A., et al. The early allergic response in small airways of human precision-cut lung slices. Eur Respir J. 21, (6), 1024-1032 (2003).
  18. Wu, W., et al. Innate immune response to H3N2 and H1N1 influenza virus infection in a human lung organ culture model. Virology. 396, (2), 178-188 (2010).
  19. Zmora, P., et al. Non-human primate orthologues of TMPRSS2 cleave and activate the influenza virus hemagglutinin. PLoS One. 12, (5), 0176597 (2017).
  20. Rosner, S. R., et al. Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation. Am J Respir Cell Mol Biol. 50, (5), 876-881 (2014).
  21. Lauenstein, L., et al. Assessment of immunotoxicity induced by chemicals in human precision-cut lung slices (PCLS). Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 28, (4), 588-599 (2014).
  22. Wild, L. G., Lopez, M. Occupational asthma caused by high-molecular-weight substances. Immunol Allergy Clin North Am. 23, (2), 235-250 (2003).
  23. Di Stefano, F., et al. Occupational asthma due to low molecular weight agents. Int J Immunopathol Pharmacol. 17, (2), Suppl 77-82 (2004).
  24. Buonsante, V. A., Muilerman, H., Santos, T., Robinson, C., Tweedale, A. C. Risk assessment's insensitive toxicity testing may cause it to fail. Environ Res. 135, 139-147 (2014).
  25. Boverhof, D. R., et al. Respiratory sensitization and allergy: current research approaches and needs. Toxicol Appl Pharmacol. 226, (1), 1-13 (2008).
  26. Johansson, H., Albrekt, A. S., Borrebaeck, C. A., Lindstedt, M. The GARD assay for assessment of chemical skin sensitizers. Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 27, (3), 1163-1169 (2013).
  27. Brismar, H., Patwardhan, A., Jaremko, G., Nyengaard, J. Thickness estimation of fluorescent sections using a CSLM. Journal of Microscopy. 184, (2), 106-116 (1996).
  28. Lyons-Cohen, M. R., Thomas, S. Y., Cook, D. N., Nakano, H. Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells. J Vis Exp. (122), (2017).
  29. Switalla, S., et al. Natural innate cytokine response to immunomodulators and adjuvants in human precision-cut lung slices. Toxicol Appl Pharmacol. 246, (3), 107-115 (2010).
  30. Henjakovic, M., et al. Ex vivo testing of immune responses in precision-cut lung slices. Toxicol Appl Pharmacol. 231, (1), 68-76 (2008).
  31. Niehof, M., et al. RNA isolation from precision-cut lung slices (PCLS) from different species. BMC Res Notes. 10, (1), 121 (2017).
  32. De Proost, I., et al. Purinergic signaling in the pulmonary neuroepithelial body microenvironment unraveled by live cell imaging. FASEB J. 23, (4), 1153-1160 (2009).
  33. Davidovich, N., Chhour, P., Margulies, S. S. Uses of Remnant Human Lung Tissue for Mechanical Stretch Studies. Cell Mol Bioeng. 6, (2), 175-182 (2013).
  34. Watson, C. Y., et al. Screening for Chemical Toxicity Using Cryopreserved Precision Cut Lung Slices. Toxicol Sci. 150, (1), 225-233 (2016).
Beoordeling van de cytotoxische en immunomodulerende effecten van stoffen in menselijke precisie-cut Lung plakjes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Neuhaus, V., Danov, O., Konzok, S., Obernolte, H., Dehmel, S., Braubach, P., Jonigk, D., Fieguth, H. G., Zardo, P., Warnecke, G., Martin, C., Braun, A., Sewald, K. Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices. J. Vis. Exp. (135), e57042, doi:10.3791/57042 (2018).More

Neuhaus, V., Danov, O., Konzok, S., Obernolte, H., Dehmel, S., Braubach, P., Jonigk, D., Fieguth, H. G., Zardo, P., Warnecke, G., Martin, C., Braun, A., Sewald, K. Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices. J. Vis. Exp. (135), e57042, doi:10.3791/57042 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter