Summary
על רקע העיקרון 3Rs, מודלים הנשימה חלופות מחקרים שנעשו בבעלי חיים כמו מתפתחים. במיוחד עבור הערכת סיכונים מחומרים בדרכי הנשימה, יש מחסור של מבחני המתאים. כאן, אנו מתארים את השימוש אמבריולוגיה דיוק-לחתוך פרוסות להערכה לחומרים הנישאים באוויר.
Abstract
מחלות נשימה בתוך המגוון הרחב שלהם צריכים מערכות מודל המתאים כדי להבין את המנגנונים שבבסיס ולאפשר התפתחות חדשה הרפוי. בנוסף, רישום של חומרים חדשים דורש הערכת סיכונים המתאים עם מערכות בדיקה נאותה כדי למנוע את הסיכון של אנשים שייפגעו, לדוגמה, סביבת העבודה. הערכות סיכונים כאלה נערכים בדרך כלל במחקרים שנעשו בבעלי חיים. לאור עיקרון 3Rs, ספקנות הציבור נגד ניסויים בבעלי חיים, אנושי שיטות אלטרנטיביות, כגון ריאות דיוק-לחתוך פרוסות (PCLS), יש כבר מתפתח. המאמר הנוכחי מתאר שמחוץ הטכניקה של האדם PCLS ללמוד את הפוטנציאל immunomodulatory של חומרים נמוך משקל מולקולרי, כגון אמוניום hexachloroplatinate (HClPt). נקודות קצה נמדד כוללים הכדאיות דלקת בדרכי הנשימה מקומית, מסומן על ידי שינו הפרשת ציטוקינים ו נוגדנים. ציטוקינים פרו-דלקתיים, נמק הגידול גורם אלפא (TNF-α), אלפא אינטרלוקין 1 (IL-1α) היו גדל באופן משמעותי ב- PCLS אנוש לאחר חשיפה ריכוז רעיל המשנה של HClPt. אף-על-פי הטכניקה של PCLS הותאם באופן משמעותי במהלך העשורים האחרונים, את תחולתן לבדיקה של immunomodulation נמצא עדיין בפיתוח. לכן, התוצאות המובאות כאן הן ראשוניות, למרות שהם ולהראות את הפוטנציאל של PCLS האנושי ככלי חשוב במחקר הנשימה.
Introduction
מחלות בדרכי הנשימה כגון אסטמה אלרגית, אסטמה תעסוקתית, מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), אמפיזמה, זיהומים של דרכי הנשימה העליונים והתחתונים בעלייה, מייצגים1,בעול2בריאות ברחבי העולם. מערכות בחינה מתאימים נדרשים, על מנת לזהות חלק המנגנונים הבסיסיים שבבסיס מחלות אלו, בנוסף לפיתוח ולבדיקה של חומרים המתאימים. מחקר בסיסי, כמו גם פיתוח תרופות פרה מתמקדים תוצאות זכו מבחני במבחנה או ויוו . מבחני אלה, אולם, יש את המגבלות שלהם3. ראשית, מבחני במבחנה לנצל תאים אנושיים היו מבודדים, הסרת רקמות סמוכות או איברים, ולכן הם כבר לא מסוגלים לקיים אינטראקציה עם או להיות מוגן על ידי תאים אחרים3. שנית, מודלים בעלי חיים הם לעתים קרובות אינם לתרגום לבני עקב הבדלים פיזיולוגיה פערים הביוכימי4. כדי למזער את המגבלות האלה, ולא בהקשר של 3Rs (החלפת, עידון, הפחתת) עקרון5, מודלים חלופיים חדשים מתפתחים כל הזמן.
מודלים חלופיים. מרקמות תלת-ממד, כגון PCLS, הן קישור בין מבוסס-אדם במבחנה ומודלים מורכבים בעלי חיים ויוו . PCLS משקפים את הטרוגניות פונקציונלי עם כל סוגי תאים רלוונטיים נוכח ב- במערכת הנשימה6. בנוסף, הטכניקה PCLS יש את היתרון של הכנה לשחזור של מספר פרוסות דקות של עובי מדויק מתורם יחיד ברקמות בעלי חיים או אדם. זה מאפשר פקד פנימי, כמו גם ריכוזים שונים או סמים כדי להיבדק.
מאז כניסתה הראשונה של פרוסות מלא אגר אמבריולוגיה בשנת 1994 על ידי פישר. et al. 7 הטכניקה עבור פריסה וגזירה culturing של רקמת הריאה שופרה משמעותית. כריסטיאן מרטין. et al. שיפור טכניקה זו עבור יישומים כימי, תרופתי נוסף8. הקבוצה שלנו הוצג על טכניקה זו על ידי כריסטיאן מרטין ב- 2007. מאז, היישום של PCLS במחקר התרחבה בדיקות של תפקודי התגובות, כגון דרכי הנשימה9,10 ו- vasoconstriction11, חיסונית, תרופתי12,13, ובדיקות רעילות7 מינים שונים של מספר מעבדות. למשל, Schlepütz. et al. 14 נחקרו דרכי הנשימה תגובות על הבדלים בין המינים, לעומת הפעלת הנוירון היקפיים או על ידי גירוי בשדה חשמלי (EFS) או על ידי קפסאיצין בעכברים, עכברושים, שרקנים, כבשים, מרמוסטיים ואת בני האדם. הם מצאו את המינים השונים שיש דפוסים ברורים, אך שונה של bronchoconstriction בתיווך עצב, הגיע למסקנה כי חיות מעבדה נפוץ (עכברים וחולדות) אינן משקפות תמיד התגובה האנושית. לבדיקת רעילות ריאות וכדי להפחית את מספר בעלי חיים בהקשר זה, הס. et al. 15 תוקף מראש עכברוש PCLS חלופה שמחוץ עבור מחקרי רעילות אינהלציה. מחקר אימות מראש multicentric זה הניב התפתחות שני מודלים של חיזוי באמצעות PCLS עם תוצאות מבטיחות.
יתר על כן, במחקר בסיסי, שימשו PCLS להבהיר סידן איתות16תגובות אלרגיות מוקדם17, זיהום נגיפי תגובות18,19. הטכנולוגית המתמשכת, להיות נידונות להתקדמות נוספת. לדוגמה, השדה היא הגדלת היתרון של רקמה אנושית על ידי אחסון חוזר של רקמות קפוא. . רוזנר ואח תיאר טכניקה של הקפאה והפשרה PCLS מאתר ששומרת את היכולת של דרכי הנשימה חוזה על גירוי של: לכן, הטכניקה מאריך את חלון זמן מוגבל שבתוכו רקמות נשארו קיימא, ולא כל כך רחוק מבחני ניתן ליישם לאורך זמן התורם אותו20. בנוסף ההתפתחויות הללו מחקר, Lauenstein. et al. 21 חקר לאחרונה הערכת סיכונים של כימיקלים שונים עשויים לשמש לרגישות פוטנציאליים לאסתמה תעסוקתית ב PCLS האנושית.
אסטמה תעסוקתית, הסימפטומים שלו הם שיבוש זרימת אוויר hyperresponsiveness דרכי הנשימה, בדומה אסטמה אלרגית, הנגרמת כתוצאה מחשיפה גבוהה משקל מולקולרי (HMW)22 או נמוך משקל מולקולרי (LMW) חומרים23 (למשל , תרכובות פלטינה) בסביבת העבודה. סוכני LMW יש פוטנציאל גבוה רגישות עולה כאשר ויוצרים haptens, לאגד המוביל חלבונים21. רישום של כימיקלים HMW או LMW חדש דורש הערכת סיכונים בתוך חוץ גופית ו ויוו בנוגע שלהם בשם רגישות עולה פוטנציאליים (למשל., ה-OECD מנחה 429)24. המבחנים לקביעת רגישות עולה בשם פוטנציאל, עם זאת, לא נועדו במקור עבור הערכת סיכונים של לרגישות בדרכי הנשימה, אך עבור קשר לרגישות, אבל נראה שיש כמה חפיפה עבור קבוצת משנה קטנה של חומרים25 . העבודה על-ידי. Lauenstein et al. תוכנן במסגרת הפרויקט האיחוד האירופי סנס-it-iv, לפתח אסטרטגיות אלטרנטיביות בדיקה להערכת הסיכון של איש קשר בשם או ריאות לרגישות21. עבור פרויקט זה, התמקדנו בדיקת השימושיות של PCLS האנושי ככלי בדיקה חלופית. לכן, קבוצת הקצה immunomodulatory (למשל, הכדאיות, ציטוקינים הפרשת) נבחר כדי לקבוע את הפוטנציאל מטרד או דלקתיות של חומרים כימיים, כגון תרכובות LMW פלטינה. Lauenstein et al. . מצאו שום דפוס כללי זה יכול לחול על כל לרגישות בדרכי הנשימה; עם זאת, העבודה שלהם סיפקה את היסודות עבור פרוטוקולים שפורסמו לאחרונה26.
לסיכום, פרוטוקול המובאת כאן עבור הכנה וחשיפה עוקבות של האדם PCLS מספק שיטה מועילה עבור הערכת פוטנציאל רעיל ריאות ו/או חומרים immunomodulatory, אשר יכול להיות מעורב בפיתוח של מערכת הנשימה מחלות, כמו אסטמה תעסוקתית.
Protocol
ניסויים עם PCLS האנושי חייב להיות נעשה על-פי קוד האתיקה של ההסתדרות הרפואית העולמית ואושרו על-ידי ועדת האתיקה המקומית (הניסויים PCLS למופת המוצגת כאן אושרו על-ידי ועדת האתיקה המקומית של הנובר הספר לרפואה; מספר 2701-2015). מדעת בכתב על השימוש בחומר אמבריולוגיה נדרש כל המטופלים התורם או למשפחותיהם. הממצאים המתוארים בכתב יד זה התקבלו עם פרוסות רקמות מתורמים בגילאים שונים, המינים, ההיסטוריה הרפואית ואת סיבת כריתה, אם כי מרבית הרקמה התקבל היה מחולים הסובלים מסרטן ריאות. רקמת הגידול ללא רק שימש לניסויים.
1. כללי הכנת PCLS האנושי, עוקבות חשיפה לכימיקלים
הערה: שני אנשים נדרשים למלא ריאה. רשומת החיסונים מעודכנים עבור צהבת A ו- B הוא מומלץ. חולים מוקרנים באופן שגרתי עבור בזכות ו- HIV לפני השתלת ריאה. אם זיהום פעיל עם שחפת Mycobacterium מאובחנים או חשד, יש לדחות את הריאה. למרות זאת, כל רקמת הריאה אנושי טרי ודוגמאות הנגזרים ממנו חייבים להתייחס אליו כמו אמצעי הגנה שעשויות להיות מדבקים ומהווים המתאימים חייב להילקח (מסיכות מסנן חלקיקים (FFP2), במשקפי מגן, כפפות) כדי להבטיח בטיחות תעסוקתית של צוות. התהליך לוקח 60-90 דקות.
- לאשר את intactness של האונה אמבריולוגיה.
הערה: קרע קרום הריאות מונע מילוי הומוגנית של הרקמה. אמבריולוגיה חומר חייב להיות מהיום של כריתה. אחסון תקופות של בערך 2 h בטמפרטורת החדר (RT) לפני למלא. את זה עם agarose על הקרח מתקבלים. הרקמה שאנחנו משתמשים בפרוטוקול זה מתקבל מתוך בחולים שעברו כריתה. . זה לא מחולים המנוח. אם הרקמה אוחסן על קרח, לחמם אותו כדי RT לפני שתמלאו אותה, אחרת agarose פולימריזציה מיד, ללא מילוי הומוגני ניתן יהיה.
התראה: ודא כי כל אדם במגע עם חומר אנושי יליד ללבוש ביגוד מגן המורכב חלוק מעבדה, שני זוגות כפפות, כובע, מסכת פנים, וזוג משקפי. חומר אנושי הוא פוטנציאל זיהומיות. - שוקל 7.5 גר' agarose ג'לי נמוכה ולהוסיף אותו 250 מ ל מים מזוקקים-bi. מרתיחים את agarose במיקרוגל עד agarose היא התפרקה. . תירגע כ 40 מעלות, בהתאם נקודת ההיתוך, ג'לי של agarose...
הערה: מספר מבחנות נדרשים, בהתאם לגודל האונה. - לחמם ולשמור על המדיום תרבות (טבלה של חומרים) ב 37 º C.
הערה: אם agarose חם מדי, ויטמינים במדיום תרבות יאבד את היעילות, בתאים יתבלבל. אם הטמפרטורה של הפתרון בינוני/agarose מתחת 37 ° C, תהליך ג'לי להתחיל ולפגוע מילוי הומוגנית של הריאה. מומלץ רק מגוון בטמפרטורה של 37 ° C עד 39 מעלות. - מניחים את כל החומרים הדרושים בהישג יד לפני שמתחילים: 5-10 כלים לנגרות, קטטר גמיש של 1 מ' אורך, מזרק מתאימים (לדוגמה, 50 מ ל) מתאים לחיבור הקטטר, מקרר מלא קרח.
- נקרר את סמפון קנה הנשימה/המרכזית על-ידי הוספת צינור סיליקון, קיבעון זה עם מלחציים מונחה במקביל הצינור, כך המלחציים צביטת הרקמה ביחד לצד צינור סיליקון ללא לצבוט את זה מחוץ. ודא כי הצינור סיליקון הוא מקובע בתוך וכי לא תוכל להחליק החוצה במהלך ההליך מילוי. סגירת כל הסמפונות אחרים, כלי דם ופגיעות עם מלחציים, כך agarose לא יכולה לדלוף במהלך ההליך מילוי.
- מערבבים אמצעי שוות ערך של 3% נמוך-ג'לי agarose עם תרבות במדיום גביע. להחדיר את התערובת לתוך הריאה באמצעות מזרק 50-mL. לפני מילוי מחדש את המזרק בינונית, קלאמפ שתוק הקטטר עם האצבעות או מלחציים להימנע בועות אוויר, agarose וההולכים. למלא האונה הריאות עד זה מלא מנופח. לגעת בזהירות את קרום הריאות ריאות בצד; קרום הריאות צריך להיות אפילו קשה.
הערה: בהתאם לגודל של האונה ריאות, עד 2 או 3 L של agarose/בינוניים פתרון יכול להידרש. - חזור על הצעדים 1.5-1.6 כל סמפון במקרה של הסמפונות מספר בתוך להצטננות.
- לשים קרח פלמור של agarose כדי ג'ל למשך 20-40 דקות, בהתאם לכמות agarose מושתל הריאה. לגעת בזהירות את קרום הריאות הצדדים מספר כדי לבדוק קשה ומגניב, המציין שאת הפילמור הושלם, אחרת להמשיך להמתין. תן פתולוגים לחתוך את הריאה לפרוסות, לקחת דגימות שלהם, לאחסן את החומר ריאות על הקרח לתחבורה.
- חותכים את הרקמה אמבריולוגיה לוחות 3-5 ס מ עם סכין חדה.
הערה: השתמש להב חדש עבור כל הריאות כדי להבטיח חדות. - למלא בפורס רקמות של ארל קפואים 400 מ ל תמיסת מלח מאוזנת (EBSS). מיד חתך רקמה גלילית הליבות מתוך לוחות ריאות באמצעות מברג חצי אוטומטית עם כלי הקידוח מקוטר המועדפת (למשל8 מ"מ; 10 מ מ).
הערה: קוטר זה חייב להיות שווה לקוטר של בעל רקמות בתוך המחשב. - להתאים את עובי הפרוסות ריאות לערך בעובי הרצוי.
הערה: עובי של מיקרומטר כ-250 הוא נפוץ בניסויים PCLS. היצרן של בפורס רקמות ממליצה שלהם מד עובי הפרוסה רקמות לצורך אימות של עובי הפרוסה. לחלופין, כולה-הר מכתים משולב עם מיקרוסקופיה קונפוקלית יכול לשמש כדי לקבוע את עובי הפרוסה כפי שתואר על ידי. Brismar et al. 27 - העברת רקמות הליבות לתוך רקמות האוחז בפורס רקמות. שימי את המשקל (חלק של בעל רקמות) על גבי רקמות הליבה. הגדר את הזרוע מהירות ומהירות להב 6 על בפורס רקמות. להתחיל לחתוך את ליבת רקמה לתוך PCLS.
- תוספת של 500 מ של Dulbecco זמינים מסחרית ששינה נשר בינוני (DMEM): תערובת מזין F-12 DMEM/F12 (1:1) עם 5 מ של פניצילין (10,000 יחידות/mL), סטרפטומיצין (10,000 µg/mL). חנות המדיום תרבות במשך מספר ימים בתנאים סטריליים במקרר. לחמם רק את אמצעי האחסון הדרושים בינוני.
הערה: פניצילין ניתן להשבית אם שמר ב 37 מעלות צלזיוס למשך פרקי זמן ממושכים. שימוש ללא סרום ונטולת צבע תרבות בינוני, כמו סרום הרכב משתנה האצווה כדי אצווה ו צבענים, כגון פנול אדום, יכול להתערב עם מבחני. - למלא צלחת פטרי (100 x 15 מ מ) בינוני תרבות כקרח 25 מ. בינוני צריך להיות מנוקז מחוץ בפורס רקמה לתוך גביע על-ידי פתיחת את המלחציים של הגליל זכוכית. להעביר את הפרוסות של גביע לתוך הפטרי בינונית-תרבות באמצעות מוליך (למשל, לולאה חיסון). מכניסים את צלחת פטרי אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, 100% לחות). לאפשר המדיום להתחמם לפני שטיפה צעדים.
הערה: כל השלבים נוספות מבוצעות בתנאים סטריליים. - מניחים מסננת תא הפטרי ששוטפים את PCLS. לחלוטין להסיר את המדיום תרבות עם פיפטה סרולוגית 10-mL דרך מסננת התא ולהוסיף 25 מ של 37 ° C בינוני טריים ומחוממת מראש. חזור על שלב 3 - 4 פעמים כל 30 דקות.
הערה: מסננת התא מונעת את הפרוסות שאתה נשאב לתוך הפיפטה למנוע נזק לפרוסות. - להעביר את הפרוסות ריאות בזהירות לתוך צלחת 24-ובכן תרבות עם מינימום של 500 µL תרבות בינונית עבור שתי פרוסות לכל טוב. לחשוף רקמת הריאה לחומרים (ראה שלבים 3.1-3.4), למשל, במשך 24 שעות ביממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
הערה: לצורך העברת, רצוי להשתמש ללולאה חיסון ותנו לבמה פרוסות לתוך הלולאה כדי למנוע נזק לרקמות. אין הפרדה נוספת הפרוסות נדרשת, כמו רק מחסור בינוני טריים מספיק יניעו מוות תאי רקמת פרוסות. פרוסות יכולים לחפוף או ונוגעים אחד בשני הבאר: אין לזה כל השפעה על יכולת הקיום של רקמות. - לשים כל חומר אנושי שיורית לתוך בקבוקון פלסטיק עם מקבע (למשל, 10% buffered פורמלדהיד) לפחות 24 שעות, לשרוף את זה בתהליך סילוק.
התראה: פורמלדהיד הוא רעיל, לבצע שלב זה ברדס.
2. ניתוח היסטולוגית של PCLS
- להכין קלטות ביופסיה עם שני מזרוני הספוג הרגילים טבולים מקבע (למשל., 4% buffered פורמלדהיד). מניחים את PCLS בין הידיות קצף בקלטת ביופסיה, להעביר מיד את הרקמה לתוך פתרון מקבע. תיקון הרקמה לילה ב- 4% buffered פורמלדהיד.
- לעבד את הרקמה עבור פרפין הטבעה על-ידי dehydrating דגימות אתנול (70%-90%, 100%, 100%, 100%, 100%) עבור 1 h כל אחת, ואחריה כביסה קסילן (3 x 1 h), פרפין נוזלי (3 x 1 h) לפי פרוטוקולים סטנדרטיים histopathology.
- להעביר את PCLS לתוך תבנית להטבעה. השתמש ללולאה חיסון. להטביע את הרקמה PCLS שמן פראפין. הקפד למקם את הרקמה באופן שווה העובש בעת השלכת לבלוק פראפין.
- חותכים את גוש הרקמה המכילה את PCLS עם מיקרוטום סיבוביים הוא משטח שטוח ואפילו. לקחת את טורי מקטעי העובי הרצוי (למשל., 4 מיקרומטר), הצבת אותם בנפרד על ממוספרים ברצף מצופה זכוכית שקופיות (בד כ 25-30 חלקים ניתן לקחת) עד PCLS כל עובדה.
- כתם שקופיות זכוכית בודד (כל סעיפים 8-10) עם הכתם hematoxylin ואאוזין (H & E) לאוריינטציה. בחר מקטעים עבור הניסוי המבוסס על השקופיות התמצאות (הסעיפים 8 הראשונים והאחרונים אינם שלמים בדרך כלל).
הערה: (אופציונלי) עבור אחסון ממושך, שקופיות יכול להיות טבול שמן פראפין לשימור.
3. הכנה של פתרונות לחומרים
הערה: להכין עבודה פתרונות ופקדים מיד לפני השימוש.
התראה: להתמודד עם החומרים לפי הוראות בטיחות או אם ידוע, כתוכנית העלולה להזיק ופעל אמצעי זהירות שגרתי.
- להמיס חומרים מסיסים במים ישירות במדיום תרבות. כימיקלים לא מסיסים או מסיסות, תחילה לפזר את החומר ממיסים המתאים בהתאם מסיסות החומר. חומרים עם מסיסות המים מוגבלת (< 0.1 מ"ג/מ"ל) יכולים להיות מומס, לדוגמה, דימתיל סולפוקסיד או אתנול. ריכוז החומר הממיס רעיל צריך להיקבע על ידי טיטור מראש. ודא כי החומרים לא לזרז מתוך פתרון מדולל בינוני.
הערה: HClPt סודיום לאורט סולפט (SLS) פתרונות מוכנים. - הכנת חומר פתרונות מניות ב 100-fold הריכוז הגבוה הרצוי תרבות בינוני או הממס. שוקל 12.5 מ"ג HClPt ו 34.4 מ"ג SLS ולהכין מלאי פתרונות על ידי המסת הכימיקלים במדיום תרבות 1 מ"ל.
הערה: אין ממיס נדרש עבור כימיקלים אלה. - להכין לדילול הסופי בטחונות במדיום ומחוממת מראש. במקרה של שימוש מוקדמת של הממס, גישה זו יוצרת ריכוז הממס הסופית זהה עבור כל חומר ריכוזים.
- השתמש הריכוז הסופי הממס (למשל, 1% כפי שמתואר בשלב 3.3) עבור הפניה לטיפול PCLS. אין שליטה הממס היה צורך הכימיקלים שצוין במקטע תוצאות.
4. הפניות חיוביים ושליליים עבור מבחני Cytotoxicity
- עבור כל מבחני יכולת הקיום, הכן חיוביים ושליליים הפקדים הבאים:
- רקמות שליטה: תקופת דגירה PCLS תרבות בינוני רק כהפניה של PCLS שלא טופלו במשך 24 שעות ביממה-תנאי התרבות התא (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, 100% לחות).
- בקרת הרכב (במקרה הצורך): דגירה PCLS עם ריכוז הממס הסופי כפי הפניה עבור PCLS מטופלים עם הרכב בלבד (ראה שלב 3.4) במשך 24 שעות ביממה-תנאי התרבות התא (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, 100% לחות).
- בקרה חיובית: דגירה PCLS עם חומר ניקוי 1% ב בופר עבור h 1-4 מעלות צלזיוס.
הערה: אם PCLS להיות חסר צבע, הרקמה הוא מת. סה כ L-לקטט דהידרוגנאז (LDH) נקבע ב- תגובת שיקוע, עם בליעת של 1.9-2.3 (ראה שלבים 6.1-6.4). הרקמה משמש וזמינותו WST-1 (ראה שלבים 5.1-5.5), עם בליעת כ 0.
5. מידת בהשפעת כימיקלים Cytotoxicity ב PCLS האנושי על-ידי Assay WST-1
הערה: וזמינותו WST-1 מתבצע בתוך צלחת 24-ובכן עם שני PCLS לכל טוב. רצוי, השתמש כפילויות עבור כל פרמטר, בריכה התוצאות של כפילויות אלה לאחר מדידה.
- הכן את הפתרון עובד על ידי דילול הכימית WST-1 בינוני מיד לפני שמתחילים. הכמות הנדרשת של הפתרון עובד הוא µL 250/טוב של צלחת 24-. טוב. לכן, מערבבים µL 25 מהתרכובת עם 225 µL של המדיום תרבות עבור טוב.
- לאחר דגירה של PCLS מ שלב 1.16, למחוק או להשתמש את תגובת שיקוע ציטוקין מדידות או בדיקות אחרות כגון וזמינותו LDH. הרקמה הנותרת משמש עבור השלב הבא.
- Pipet 250 µL של ריכוז הכימית WST-1 לכל עובד טוב ואני דגירה לצלחת-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עבור ה 1 ודא כי PCLS באופן מלא מכוסים על ידי הכימית WST-1 במהלך הדגירה.
- למקם את הצלחת שייקר מסלולית (200 סל ד) ומנערים היטב עבור 30 s כדי להבטיח ערבוב יסודי מהתרכובת WST-1. לקחת צלחת חדשה של 96-ובכן שטוח התחתונה ו- pipet 100 µL כפילויות תגובת שיקוע של כל טוב של צלחת 24-. טוב.
- למדוד את הספיגה של כל טוב-450 nm (אסמכתא: 630 ננומטר) שימוש בקורא microplate. להפחית את הספיגה-630 ננומטר ועד 450 ננומטר. ערכים אלה ישמש לחישוב בשלב 5.6).
הערה: ניתן לקבל נתונים אמינים להערכת cytotoxicity רק מרקמות קיימא. לכן, אלה קריטריוני קבלה בהוצאת הס. et al. צריך להיות נפגש 15 ניסוי. אם קריטריונים אלה אינם מתקיימים, יש לחזור על הניסוי. - הקליטה של הפקד בינונית ללא טיפול צריך להיות מעל 0.6, אחרת שיש לחזור על הניסוי. אם הנתונים עומדת בתנאי זה, קבע את ערך הקליטה של הפקד רקמות ל 100% ולחשב ההפחתה WST-1 של דגימות שטופלו ביחס הפקד רקמות.
6. LDH Assay
הערה: וזמינותו LDH מתבצע בצלחת 96-ובכן עם התרבות µL 100 supernatant סך הכל לאחר תקופת הדגירה פוסט.
- לאחר דגירה של PCLS עם או בלי הסוכנים מבחן, קח µL 50 של תגובת שיקוע מהשלב 1.16, להעבירו למצב שבו כפילויות צלחת 96-ובכן חדשה. זה יוצר כפילויות מכל יחס טוב של צלחת 24-. טוב.
- להכין את הפתרון עובד של LDH מגיב מיד לפני וזמינותו. הפתרון עובד מורכב הפתרון זרז (lyophilisate מומס במים bidistilled 1 מ"ל) לצבוע את הפתרון שסופק על-ידי היצרן. על לוח אחד 96-ובכן, ביסודיות מערבבים 125 µL של זרז פתרון עם mL 6.25 בפתרון לצבוע.
התראה: אל תחשוף את הפתרון אור ישיר. - Pipet 50 µL של הפתרון עובד לתוך כל טוב כבר המכיל 50 µL של תגובת שיקוע, דגירה את הצלחת. בשביל 20 דקות ב RT בחושך. עוד ערבוב נדרש.
- למדוד את הספיגה של כל טוב-492 nm (אסמכתא: 630 ננומטר) באמצעות קורא microplate. להפחית את הספיגה-630 ננומטר מ 492 ננומטר. ערכים אלה ישמש לחישוב בשלב 6.5.
הערה: ניתן לקבל נתונים אמינים להערכת cytotoxicity רק מרקמות קיימא. הקליטה של הפקד שטופלו דטרגנט צריך להיות מעל 1. - לניתוח, להגדיר את הערך הקליטה של הפקד חיוביים משלב 4.1 כ- 100% ולחשב על שחרור LDH הדגימות שטופלו ביחס הפקד חיובי (כלומר, שחרור LDH המרבי).
7. מיקרוסקופיים Assay הכדאיות עם קונאפוקלית לייזר סורק מיקרוסקופ (cLSM)
הערה: עבור וזמינותו הכדאיות מיקרוסקופיים, שניים PCLS רגילה 250-מיקרומטר-עבה מוכתמים µL 250/היטב של צלחת 24-. טוב. כמו כל פרוסה היא עם תמונה בנפרד, ללא כפילות נוספת נדרשים.
- לאחר דגירה של PCLS עם או בלי פריטי המבחן, למחוק את תגובת שיקוע או להשתמש בו עבור מדידות ציטוקינים או בדיקות אחרות כגון וזמינותו LDH. השתמש הרקמה הנותרת עבור ההליך המתואר כאן.
- להכין עבודה דילול של homodimer calcein-AM, אתידיום 1 (EthD-1) עם ריכוז העבודה של שני נוגדנים של 4 מיקרומטר במדיום תרבות. לענין זה, להוסיף 1 µL של calcein-אם (4 מ מ) ו- 2 µL של EthD-1 (2 מ מ) בינוני 997 של תרבות µL. אמצעי אחסון זה נדרש כתם 4 בארות עם שני PCLS.
הערה: להימנע מחשיפה של ריאגנטים אור ישיר. - Pipet 250 µL של דילול לעבוד בכל טוב ואני דגירה את הצלחת. ובכן 24 למשך 45 דקות ב RT בחושך. מניחים את הצלחת על תפקודי לב / נשימה-150 סל ד בתקופת הדגירה כדי להבטיח חשיפה טובה יותר של רקמת הפתרון מכתימים.
- אחרי 45 דקות, לבטל את הפתרון מכתימים ולשטוף את PCLS עם 1 מ"ל בופר דרך רועדת-150 סל ד למשך 3-5 דקות ב RT בחושך. חזור על שלב זה פעמיים.
- µL 500 של בופר חלות על כל טוב המכיל את PCLS ויטראז'ים להימנע autofluorescence של תרבות בינוני. להערכת מיקרוסקופיים, לבצע לפחות שתי מפוזרות באקראי z-במחסן עם cLSM.
- לחץ על הכרטיסיה עינית לבחור 10 X / 0.3 אובייקטיבית, לחץ על באינטרנט כדי לשמש את cLSM במיקרוסקופ אור רגיל כדי למצוא את פני השטח של PCLS. לחץ על לא מקוון כדי לצאת ההגדרה עינית.
- לחץ על הכרטיסייה רכישה והפעל את הלייזרים המתאים עבור fluorophores.
הערה: השתמשנו ללייזר עם אורך גל של 488 ננומטר עבור calcein לצבוע polyanionic (עירור גל של 495 ננומטר) ו לייזר הנה עם אורך גל של 543 nm לגילוי של המתחם EthD-1/DNA (עירור גל של 533 ננומטר). לייזר ארגון לפעול בדרך כלל 30-50% של הזרם המרבי להפעלת זרם שפופרת של בסביבות 5.7 A, כמו זה מאריך את החיים לייזר באופן משמעותי. - לחץ על נתיב אור תחת הלשונית רכישה ולהקים את הצורך ומסננים מראות לניסוי.
הערה: במחקר הנוכחי, מערכת סינון מבוססת שימש עם מפצל קרן ודיקרואיק זוהר הראשי (למשל., HFT 488/543) הפרדת האור עירור, פליטה. דרך מראה המשקף שהאור הזה מופנה המפצל משני קרן ודיקרואיק זוהר (לדוגמה:NFT 545) כדי נוספת נפרדת האור הנפלט מדגם לתוך שני ערוצים. - הגדרת הלהקה לעבור מסננים (למשל, BP 505-530 לאות calcein ו- BP 560-615 לאות מורכבים EthD-1/DNA) לשדר רק טווח מסוים של אורכי גל, הקצה את אות calcein ערוץ 2 ואת האות מורכבת EthD-1/DNA לערוץ 3.
- סמן את התיבה Z-במחסן כדי להגדיר את הגבולות העליונים והתחתונים עבור אמצעי האחסון מיקרוסקופיים. לחץ על לחצן בשידור חי כדי לראות תצוגה חיה של השכבה המתאימה על המסך. להעביר את המוקד למעלה או למטה כדי למצוא פני השטח של PCLS עם אות חדה.
- לחץ על סעיף קטן ערוצים, סמן את התיבה הצג הכל. . תנעל את הטבלה על ידי לחיצה על הלחצן של הערוץ המקביל מתחת לתמונה חיה ולהפעיל את צבע הערוץ.
הערה: צבע כחול בתמונה בשידור חי יציין כי אין שום אות, ואילו אות גבוה יופיע בלבן, והוא אות overexposed יופיעו באדום. - הגדר את חריר לערוץ EthD-1 אדום 1 יחידה אוורירי עבור החלופה הטובה ביותר בין היעילות של אוסף אור חלוקתה אופטי ולהתאים את ערוץ calcein בהתאם. להגביר את האות שזוהו רווח כזה נראה לבן אבל לא אדום בתמונה בשידור חי עם טבלת הנעילה מופעל ערוץ צבע.
הערה: רווח בסיס לא יעלה 600 יחידות. - הגדל או הקטן את ההיסט דיגיטלי כדי להתאים את הרקע כך שיופיע בכחול בתמונה בשידור חי עם טבלת הנעילה מופעל ערוץ צבע.
- לחץ על הכרטיסיה Z-מחסנית תחת רכישה רב-ממדי ולהשתמש המוקד כדי להעביר z-שכבה של ריבית. לחץ על הגדר הראשונה כדי להציל את עמדה זו עבור רכישת מאוחר יותר. לאט לאט ההתמקדות למעלה או למטה עד טווח של 30 מיקרומטר הגיעה והקש להגדיר האחרון כדי להציל.
- לחץ על חי שוב כדי לבטל את התמונה בשידור חי ולחץ על הפעל ניסוי להתחיל ההדמיה.
הערה: רקמת קיימא מזוהה באמצעות קרינה פלואורסצנטית של calcein לצבוע polyanionic. תאים מתים הם שקופחו על ידי היווצרות מורכבות של EthD-1 ו חומצות גרעין.
8. עיבוד תמונה
הערה: המחשב ההמלצה של תוכנת עיבוד תמונה חייב להילקח בחשבון, כמו תוכנית זו דורש את החומרה המתאימה.
- לטעון את הקובץ LSM שנרכש הכדאיות מיקרוסקופיים כתמים PCLS (ראה סעיף 7) לתוך תוכנת עיבוד תמונה. לשמור אותו כקובץ .ims לפני שתמשיך. להגדיר כל הפרמטרים על הפקד רקמות ולהחיל את כל התמונות האלה. שינויים נוספים מותר.
- השתמש בלחצן עוצמת הקול על פני שיקום רקמת קיימא (צביעת calcein) (איור משלים 1A) ואת לחצן כתמים על גרעין התא מת (איור משלים 1 H). בעת עיבוד ערוץ אחד, כבה את הערוץ השני בחלון התאמת התצוגה.
- התחל על-ידי עיבוד הנפח של רקמות חיוניות: להגדיר את הערוץ של פני השטח, לעבד את התמונה כולה, לקבוע את הגורם חלקה 0.5 מיקרומטר ולהשתמש אינטנסיביות מוחלטת על הסף (איור משלים 1B, ג). לחצו על החץ קדימה כחול.
- התאם את הסף אינטנסיביות מוחלטת של אמצעי האחסון המשוחזרת; עוצמת רעש ורקע צריך להיות מופחתים. כיסוי השטח מוצג באפור ואת הדיוק של כיסוי משטחים צריכה להיות מסומנת (1D איור משלים). לאחר השלמת ההתאמה, לחצו על החץ קדימה כחול. רוב הזמן צעד זה נדרש עבור חישוב של ההגדרות. אם התוכנה אינה מסוגל לחשב את עוצמת הקול, להגדיל את הגורם חלקה.
- בשלב האחרון, בחרו מסנן. השתמש במסנן sphericity (עם 10 מיקרומטר) עבור עיבוד פני השטח כדי לסנן מקרופאגים בחלל מכתשי (איור משלים 1E). לחץ על הלחצן קדימה ירוק.
- שטיחות להתאים את התמונה פלט ולייצא נתונים סטטיסטיים כמו קבצי xls. הנפח הכולל (סכום) ישמש לצורך ניתוח נוסף (איור משלים 1F, G). לשמור את ההגדרות, להשתמש בהם עבור כל ניתוח נוסף של z-במחסן מאוהבת באותו היום אותן הגדרות cLSM (איור משלים 1I).
- לשחזר את הערוץ האדום (כתמים) על גרעין התא מת. באופן אקראי למדוד את גודל נקודה µm גודל בחלון surpass; גודל נקודה כ 5 מיקרומטר מארק הפוך לזמין והגדר את גודל נקודה. בדוק אם כל הנקודות מסומנות כל נקודה נספרת פעם אחת בלבד. לתקן באופן ידני אם יש צורך (איור משלים 1B, H, J). לחצו על החץ קדימה כחול.
- לחץ הכפתור הירוק קדימה לתת התוכנית לחשב/ספירת המספר הכולל של נקודות על פי הפרמטרים להגדיר ולייצא את התוצאה בתור קובץ xls (איור משלים 1 K, L, M). לניתוח גרפי או סטטיסטי של התמונה להגדיר את המספר של גרעין התא מת מחושב ביחס לנפח של רקמות חיוניות.
9. מדידה של ציטוקינים ו נוגדנים ב PCLS אנושי
הערה: התגובה החיסונית של ציטוקינים ו כימוקין ניתן למדוד extracellularly את תגובת שיקוע של התרבות, intracellularly lysates רקמות לאחר זמן הדגירה. אליסה נמדד כפילויות בצלחת 96-ובכן עם µL 100/טוב.
- להכין פתרון דטרגנט 1% על ידי ערבוב 5 מ של דטרגנט 495 מ של בופר. ניתן לאחסן את הפתרון ב RT במשך מספר חודשים.
- מערבבים את הפתרון דטרגנט 1% עם מעכב פרוטאז (PI) ביחס של שבערך. הסכום הנדרש תלוי לוח תרבות; לדוגמה, השתמש µL 500/טוב עבור צלחת 24-. טוב. עבור באר אחת, מערבבים 1 µL של פאי עם 499 µL של פתרון דטרגנט.
- הכן טורפדו עם µL 1 של PI פתרון ולאסוף 500 µL התרבות supernatant צינורות אלה. מיד להחליף המדיום בצלחת 24-ובכן 500 µL הפתרון דטרגנט המכילה פאי מוכן בשלב 9.2. Lyse רקמות מאובטח על-ידי הצבת את הצלחת 24-ובכן ב- 4 מעלות צלזיוס. Pipet הרקמה lysate צינור חדש ולאחסן את הצינורות האלה ב- 80 ° C עד ניתוח נוסף.
שים לב: פרוטוקול אליסה מאוד תלויה היצרן, צריכה להיות מלווה הוראות היצרן. פרוטוקול סטנדרטי של אליסה מתואר במקורות הבאים. - לבצע את אליסה כדי למדוד רמות ציטוקינים supernatant או lysate על פי הוראות היצרן. כדי למדוד את IL-1α ו- TNF-α, מעיל טוב a96 צלחת מאת pipetting 100 µL של הנוגדן לכידת (עבור דילול בצע הוראות היצרן) דגירה ללון ב- RT.
- להכין מאגר הכביסה על ידי המסת לוח מאגר כביסה ב- 1 ליטר מים bidistilled. הסר את לכידת נוגדן ואת pipet 400 µL כביסה מאגר כל טוב. החלף את אמצעי אחסון זה שלוש פעמים. לחסום את הצלחת על-ידי הוספת הפתרון חסימה (למשל, 1% BSA ב בופר, בהתאם להוראות היצרן). תקופת דגירה-RT של 1 h.
הערה: ELISAs זמינים מסחרית רגילה לדרוש 2 x 100 µL של רקמת supernatant או lysate. דוגמאות צריך להיות פעם המופשרים רק לפני השימוש. בהתאם רגישות וזמינותו, על ציטוקין שפורסמו, דוגמאות יש לדלל לפני מדידות. לכן, לדלל את הדגימה ב הכימית שסופקו על-ידי וזמינותו. - להסיר הפתרון חסימה ולהוסיף דוגמאות מדולל על העקומה סטנדרטי (עבור דילול בצע הוראות היצרן), 100 µL של רקמת supernatant או 100 µL של רקמת lysate שבו כפילויות שנאספו בשלב 9.3. תקופת דגירה של 2 h-RT.
- הסר את דגימות ואת pipet 400 µL כביסה מאגר כל טוב. החלף את אמצעי אחסון זה שלוש פעמים. Pipet 100 µL biotinylated זיהוי נוגדנים (עבור דילול בצע הוראות היצרן), תקופת דגירה של 2 h-RT.
- הסר את נוגדן ואת pipet 400 µL כביסה מאגר כל טוב. החלף את אמצעי אחסון זה שלוש פעמים. להוסיף 100 µL/טוב של התווית על-ידי HRP streptavidin (עבור דילול בצע הוראות היצרן), תקופת דגירה של 20 דקות ב- RT (יש לבדוק הוראות היצרן).
- להסיר streptavidin pipet 400 µL כביסה מאגר כל טוב. החלף את אמצעי אחסון זה שלוש פעמים.
- להוסיף 100 µL של המצע (מומלץ על ידי היצרן), תקופת דגירה של 20 דקות בחושך (יש לבדוק הוראות היצרן).
הערה: השלב זה רגישים לאור. הימנע לאור החשיפה של סובסטרט, צלחת. - לעצור את התגובה על-ידי הוספת 50 µL להפסיק פתרון (1 M H2אז4). למדוד את הספיגה של כל טוב-450 nm (אסמכתא: 570 ננומטר) שימוש בקורא microplate. להפחית את הספיגה-570 ננומטר ועד 450 ננומטר.
הערה: לא מטופל ו/או הרכב רקמות פקדים לשמש כפקדי שלילי. כדי ליצור תגובה חיסונית ברקמת הריאה, השתמש גירוי מתאים (למשל, 100 ננוגרם למ"ל ליפופוליסכריד (LPS)) כפקד חיובי. תקופת דגירה של שתי בארות עם שני בקרים מתוכנתים לכל טוב עם 100 ננוגרם למ"ל LPS במדיום התרבות, למשל, של 24 שעות, ולאסוף את תגובת שיקוע ורקמות lysate כפי שמתואר בשלב 9.3.
הערה: התוצאות נמדד מתקבלים, אם הספיגה ברמה הגבוהה ביותר שווה או מעל 1.0; אחרת המידה צריך להיות חוזרות ונשנות. העקומה סטנדרטי פעל על פי ההתאמה עקומת מנה-תגובה sigmoidal. - ריכוזי ציטוקין (עמוד) נקבע על ידי אליסה בשלב 9.11 הם מנורמל ל סה כ החלבון התוכן נקבע ברקמת lysate של כל דגימה (ראה סעיף 10).
10. מדידה של חלבון הכולל תוכן ב- PCLS אנושי
הערה: PCLS צריך להיות lysed כדי למדוד ריכוז החלבון הכולל. Lysates רקמות מהשלב 9.3 משמשים עבור שלב זה. וזמינותו מתבצע על צלחת שטוחה 96-ובכן עם µL 25/טוב של רקמת lysate, pipetted שבו כפילויות.
- להכין תקן BSA 7 נקודות עם BSA ריכוזים של 2,000 µg/mL, 1,500 µg/mL, 1,000 µg/mL, 750 מ ל/µg, µg 500/mL, µg 250/mL, µg 125/mL. החל µL 25 שבו כפילויות עבור כל תקן ולהשתמש µL 25 בופר ריקים על צלחת 96-ובכן (שימוש לצלחת עם כיסוי לצלחת).
- Pipet 25 µL של lysates (ראה שלב 9.3) מכל קידוח שבו כפילויות לתוך צלחת 96-ובכן. בסך הכל, µL 50 מכל טוב נדרש. הכנת עבודה הכימית של BCA פתרון על ידי BCA המדללת ריאגנט B 01:50 לפנות BCA ריאגנט א לצלחת 96-ובכן להשתמש µL 400 של ריאגנט B ו- 20,000 µL של ריאגנט א
- בזהירות pipet 200 µL מהתרכובת לעבוד בכל טוב, הימנעות בועות אוויר. . מקום על הלוחית שייקר מסלולית (150 סל ד) 30 s כדי להבטיח לערבב lysates, ריאגנט לעבוד, ולשים כיסוי לצלחת על הצלחת. דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בחושך. למדוד את הספיגה של כל טוב-540-590 nm באמצעות קורא microplate.
הערה: תוצאות המדידה מתקבלים, אם הספיגה של BSA הגבוה ביותר תקן שווה או מעל 0.8; אחרת המידה צריך להיות חוזרות ונשנות. העקומה סטנדרטי פעל על פי ההתאמה עקומת מנה-תגובה sigmoidal. - לניתוח, לחשב עקומת רגיל באמצעות משוואה Marquardt 4-פרמטר לאחר חיסור של הריק. לחשב את ריכוזי החלבון דגימות לא ידוע באמצעות עקומת תקן מתאים.
Representative Results
בשיטת המחקר הנוכחי, PCLS האנושי היו מוכנים, נחשפים חמש ריכוזים של חומרים תעשייתיים להעריך immunomodulatory כימית המושרה תופעות בחומר אמבריולוגיה. רקמת הריאה נחשף בתנאים המשוקע כמו תרבות קבוע עבור ה 24 רעילות הוערכה על ידי מדידה של LDH שפורסמו, פעילות מיטוכונדריאלי ואת הכדאיות מיקרוסקופיים מכתים. בנוסף, נמדדו תכולת החלבון הכולל נורמליזציה, ציטוקינים פרו-דלקתיים. במידת האפשר, ערכים 75 הריכוז המעכב (IC) חושבו על ידי פריסטלטיות sigmoidal שאינו ליניארי. החומרים התייחסות חיובית, דטרגנט עבור cytotoxicity ו LPS על התגובה ציטוקין מולדת, שימשו עבור אימות של כל הפעלה. IC75 באמצעות לוגריתמים טרנספורמציה [מיקרומטר] ערכים (יומן IC50) שימשו ריכוזים "מגרה" למדידות שחרור ציטוקינים עוקבות.
איור 1 ו- 2 איור להראות את ההליך של מילוי חומר אמבריולוגיה, למופת H & E מכתים של האדם PCLS. הנהלים היגיינה שגרתית חייב להיות אחריו כדי למנוע השפעות שליליות על הבריאות ולהבטיח בטיחות של צוות טיפול בחומר אמבריולוגיה. הטכניקה דורש צוות הדרכה ותרגול. חווה פתולוגים מי להבחין בין אזורים שונים (עליונים/תחתונים אונות ו- subpleural לעומת מרכזי נוסף) וחולים לעומת אזורים בריאים יש צורך להעריך את מצב פתולוגי של החומר אמבריולוגיה. PCLS האנושי שנוצר אמור לשמש הכנה של H & E שהוכתמו מקטעים דק, אשר ניתן להעריך מחדש על ידי פתולוג. הליך זה מסייע למשתמשים לקבל אימון מפלה שונים באזורים נגועים, מיקומים בתוך הריאות.
תרשים 3 מציג את תוצאות מדידת LDH ופעילות WST-1 ב- PCLS אנוש לאחר דגירה 24 שעות עם SLS. שליטה בינונית ללא טיפול ללא SLS, שמוצג ב 0 µg/mL SLS, הוא פקד איכות חשוב. ערכים צריך להיות מתחת ל- 20% עבור LDH לעומת רקמת חומרי ניקוי-lysed ו- > יחידות ספיגת 0.7 וזמינותו WST-1. פקדים איכות אלה לשמש גם אינדיקטורים של רקמות לא מספיקות הכדאיות. ההיענות של הרקמה האנושית לקראת הפתרון דטרגנט, כמו חומר רעיל, יעיל חייב להיות כלול כפקד חיובי. זה יביא לעלייה ב- 300-500% (> יחידות ספיגת 2.0) של LDH בהשוואה עם רקמות ללא טיפול, ערכים < 0.1 יחידות ספיגת וזמינותו WST-1. SLS, גרמו לירידה למינון של התא הכדאיות נמדדת על ידי עלייה LDH, ירידה של פעילות מטבולית וזמינותו WST-1 בריכוזים > µg 87/mL. מודל ריכוז סיגמואיד-תגובה היה מצויד בנתונים, כך שיהיה ניתן לחשב ערכים IC75 או IC50. ערכים אלה לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לבחור ריכוזים של ציטוקין ורמות כימוקין: בריכוזים רעיל מאוד, בדרך כלל לא או רק ציטוקינים מופחתת של נוגדנים יכולים להתגלות. לכן, מומלץ רעיל או רק ריכוזים מעט רעילים (IC75). חשוב לציין כי הגידול הצפוי בפעילות LDH בתרבות תא supernatant מושפעת לעיתים קרובות החומר יישומית21. לעתים קרובות, הפרעות להתרחש בין הפעילות ושתמצאו בו האנזים, שמוביל פירוש מוטעה של תוצאות אם וזמינותו LDH וזמינותו cytotoxicity היחידה בשימוש. לכן חשוב והכרחי לביצוע מבחני מספר cytotoxicity כדי להשיג תוצאות חוקי ואמין. יתר על כן, יש לציין כי הרגישות של מבחני LDH ו- WST-1 הוא מאוד דומה.
איור 4, הכדאיות מיקרוסקופיים תמונות של PCLS להפגין ההיענות של הרקמה האנושית כדי דטרגנט בתור חומר רעיל יעיל. התוצאות הן מאוד שימושי לאשר נתונים הכדאיות אחרים, אבל זה דורש ציוד נוסף. ההשפעות הרעילות הן מבחינה ויזואלית לאומדן הערכה של רקמת calcein-חיוביות לעומת גרעין התא EthD-1-חיוביות. מקטעי נבחר באופן אקראי בתוך parenchyma בדרך כלל לגרום נתונים דומים, בעוד יש להימנע איירווייז או כלי דם, כמו חללים גדולים עלולים להשתנות את התוצאות. מהניסיון שלנו, עם ההגדרות מיקרוסקופיים שתוארו לעיל, נמדד בכמות ממוצעת בין 1.5 x 106 ו- 5 x 106 מיקרומטר3 של הרקמה שליטה. הערכים תלויה באיכות החומר הריאה, PCLS איכות, גם על המחלה של התורם רקמת הריאה. אף-על-פי הכדאיות של רקמת הריאה האדם משתנה בין התורמים, המספר של גרעין התא מת לעומת רקמות קיימא לא יעלה 15% של הפקד רקמות. אם התא מת גרעינים קיימים בעיקר בפקד רקמות, עם זאת, הניסוי אמורה להיות נטושה.
איור 5 מציג נתונים נציג עבור האפקט immunomodulatory של HClPt ו- SLS רקמת הריאה אנושי. ציטוקינים פרו-דלקתיים IL-1α ו- TNF-α הם סמנים של דלקת, המציין את תחילת התהליכים דלקתיים לאחר חשיפה מגרה חומרים. שני ציטוקינים נמדדו על ידי אליסה. IL חוץ-תאית-1α היא בדרך כלל נמוכה PCLS האנושי, בעוד תאיים IL-1α מגיע לרמות של 1,000 pg/mL ומעלה. ירידה ב- IL תאיים-1α מציינת תהליכים ציטוטוקסיות מתמשך -, נצפית בעיקר לאחר חשיפת PCLS האנושי כימיקלים. אם הרקמה מגורה עם התקליטים, מפעיל של מערכת החיסון המולדת, בתור שכזה הטיפול חיובי לשלוט, ואז רוב IL-1α המושרה יכול להתגלות רק intracellularly לאחר 24 שעות. לעומת זאת, TNF-α הפרשת המושרה על ידי גירוי LPS בעיקר ניתן למדוד extracellularly. השימוש בפקד חיובי מתאימים, כגון תקליטונים, מדגים את תוקפו של שיטה. בשיטת המחקר הנוכחי, PCLS האנושי נחשפו שלושה ריכוזים של HClPt (32, 64 ו- 125 µg/mL) או שני ריכוזים של SLS (1 ו- 10 µg/mL) עבור ה 24 ציטוקין הפרשת נקבע כסכום של ציטוקינים חוץ-תאית, תאיים מנורמל ריכוזי החלבון הכולל כפי שהיא מתוארת באיור 5. ראוי לציין כאן כי וזמינותו BCA משמש בדרך כלל עבור קביעת תכולת החלבון הכולל, עם זאת, הוא גם משקף חומר-induced cytotoxicity. לפיכך, רעיל בריכוזים תכולת החלבון הכולל של אינם יכולים לשמש עבור נרמול נתונים ציטוקין. הפרשת IL-1α גדלה באופן משמעותי מ- 263 ± 38 pg/mg 887 ± 216 pg/מ ג ועבור TNF-α מ 263 ± 38 pg/mg 1,160 ± 286 pg/מ ג (איור 5A, B). יתר על כן, הנוצרות על-ידי LPS IL-1α ו- TNF-α הפרשת מוצגת בהשוואה פקד רקמות unstimulated. אינדוקציה של ציטוקינים פרו-דלקתיים על ידי פתוגן-הקשורים דפוסי מולקולרית, כגון תקליטונים, מדגים את תוקפו של שיטה והיא מאוד מומלצת כדי לשמש בעת עבודה עם PCLS האנושי לחקור תופעות immunomodulatory. לפרטים נוספים על נתוני HClPt ו- SLS, נא להפנות המחקר על-ידי. Lauenstein et al. 21
איור 1 : נוהל מילוי חומר אמבריולוגיה. אמבריולוגיה מוכן מיד לאחר כריתה. הריאה לאחסן בטמפרטורת החדר למילוי עקבית עם agarose, כדי להימנע agarose פתאומית הפילמור במהלך מילוי. הריאה ממוקם בצורה אופקית, עם האונות התפרסו עבור תצוגה של האופטימלית סמפון הראשי או הסמפונות (A & B על מבט מקרוב על סמפון). הסמפונות לצינוריות עם צינור סיליקון גמיש, קבוע עם תופסנים (C). לאחר מילוי הליך ו agarose פלמור ברקמה, פתולוגים מיומן לחתוך את הריאה פרוסות על 3-5 ס מ עובי (D). מ פרוסות אלה מוכנים ליבות רקמה גלילית (Ø למשל, 8 מ"מ) עם כלי הקידוח (E). הכורים בהתכה רקמות לחתוך עם מילות הקסם רקמה לתוך PCLS, אשר מועברים באופן מיידי מלא בינוני פטרי עבור הדגירה בתנאים התרבות תאים נורמליים (E). לאחר כביסה בכמה צעדים PCLS מועברים תא לוחות תרבות (למשל, ובכן 24 צלחת עם שני PCLS לכל טוב, 500 µL בינוני) כדי להסיר שאריות תאים שיורית ובוררים תא המשוחררים (F). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : קביעת מצב בריאותו של האדם PCLS על ידי צביעת המטוקסילין - PCLS בתמונה זו, מוכן מתורם עם גידול בריאה, מראה רקמת הריאה ללא פגע עם parenchyma מכתשי, היקפי איירווייז (*), וכלי הדם (חץ) סקירה (A). בהגדלה גבוהה יותר, ניצוח איירווייז עם שלם ciliated אפיתל בדרכי הנשימה (חץ) (B), מבנה מכתשי שלם רצוף pneumocytes קיימא, כולל של נים עם רבים אריתרוציטים (חץ) (ג), מכתשי חללים המכילים מכתשי מקרופאגים (CD68 אימונוהיסטוכימיה) (D), כמו גם כלי הדם עם שלם אנדותל (CD31 אימונוהיסטוכימיה) יכול להיות שנצפו (E). רקמת הגידול ללא רק שימש את PCLS, ולכן אין אזורים נגועים בעין בלתי מזוינת גלויים. בניגוד PCLS מוכן מתורמים עם מחלות ריאה אחרות, כגון אמפיזמה או פיברוזיס, מבנה מכתשי לא מופרת PCLS רק מעט בלויה ב הגבול החיצוני, ככל הנראה עקב ההכנה. ברים סולם עולה 1,000 מיקרומטר (A) ו- 50 מיקרומטר (B–E), בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : קביעת cytotoxicity המושרה על ידי SLS ב PCLS האנושי, נמדדת נזילה של האנזים LDH לתוך תרבות בינוני (א) ואובדן של פעילות אנזים מטבולי העריך עם לצבוע WST-1 (B). PCLS האנושי נחשפו הגדלת ריכוזים של SLS. מודל ריכוז סיגמואיד-תגובה לאחר מכן הורכב על הנתונים כך הערכים IC75 או IC50 (הריכוז המעכב על הפחתת 25% ו- 50% של תאים הכדאיות) יכולה להיות מחושבת (דמויות נכון). הנתונים מוצגים אומר ± SEM, n = 3-5. ספיגת של LDH assay נמדדה ב 492 nm (הפניה-630 ננומטר) ואת וזמינותו WST-1 ב-450 nm (הפניה-630 ננומטר). הנתונים היו הותאם ואת שונה. Lauenstein et al. 21 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : להחליפן בתמונות של תלת מימד מיקרוסקופיים מכתים ותמונה הרינדור של האדם PCLS. רקמה חיה שליטה ההיענות של רקמה דטרגנט, כמו חומר רעיל, יעיל מוצגים לאחר צביעה של האדם PCLS עם calcein AM (צהוב) ו- EthD-1 (אדום). ערימות של 30 מיקרומטר היו לוקחים עם מטרה X 10 (א), שניתנו (B). סרגל קנה מידה מציינת 100 מיקרומטר. עירור אורכי גל 488 ננומטר, 543 ננומטר, פליטה מסננים BP 505-550 ננומטר, LP 560 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : אמוניום hexachloroplatinate (HClPt)-induced הפרשת IL-1α ו- TNF-α ב PCLS האנושי, לאחר 24 שעות חשיפה. PCLS נחשפו שלושה ריכוזים (32 µg/mL, µg 64/mL ו- µg/mL 125 של HClPt), שני ריכוזים שונים (1 µg/mL ו- µg 10/mL) של SLS. חוץ-תאית, תאיים IL-1α (א) ו- TNF-α (B) היו נקבעים על-ידי אליסה, מנורמל לתוכן חלבון הכולל. להראות את תוקפו של השיטה activator חיובית של מערכת החיסון המולדת, תקליטונים, מוצג כהפניה תאיים IL-1α (א) ועל שחרור TNF-α (B) חוץ-תאית, מנורמל לתוכן חלבון הכולל. הנתונים מוצגים אומר ± SEM, *p < 0.05 ו * * *p < 0.001; HClPt ו- SLS: n = 9, IL-1αLPS: n = 5, TNF-αLPS: n = 4 כפילויות טכני (מבחן מאן-ויטני). דמות זו שונתה מ. Lauenstein et al. 21 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלים איור 1: עיבוד חישובית מפורט לתמונות של הכדאיות מיקרוסקופיים מכתים באמצעות תוכנת עיבוד. הליך שלב אחר שלב ההפעלה לניתוח תמונה של התמונות המועלות LSM עבור עיבוד משטח רקמת שהוכתמו calcein קיימא (A–G, אני) וזיהוי ספוט של אתידיום שהוכתמו homodimer תא גרעינים (H, J–מ'). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלים איור 2: סקירה של ניתוח תמונה חישובית של הכדאיות מיקרוסקופיים צביעה של רקמת הריאה אנושי. (צהוב) בת קיימא רקמות נותחה על ידי עיבוד פני השטח (B–אני), תאים מתים גרעינים (אדום) אותרו על ידי זיהוי ספוט (J–P). תמונת מצב שימש כדי לייצא את התמונה (Q). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
טכניקת PCLS האנושית היא מבוססת היטב במעבדה שלנו. המאמר הנוכחי נותן תיאור של טכניקה זו והשימוש בה לבדיקת רעילות של חומרים בתוך הריאות לרקמות שמחוץ. באופן כללי, בכל מעבדה באמצעות שטכניקה זו צריך לחפש כדי להגדיר וזמינותו של הקשורים ההגדרה של טווחים לכימות, הערכה של variabilities, פקדים איכות המבטיח תוקפו של הניסוי. נהלי אפשרי יכול להיות, לדוגמה, לחזור על כל נקודת קצה, למשל, וזמינותו cytotoxicity, במינימום של שלושה תורמים ביולוגיים (הרצפים בודדים) עם מינימום של שלושה טכני משכפל לפי המדגם כולל חיובי, הפניות שלילי. צוות המעבדה בקיצור כדי להגדיל את עקביות assay ולצמצם את השתנות וזמינותו.
נקודות קצה נעשה שימוש תכוף כדי להעריך את ההשפעות immunomodulatory של חומרים על רקמת הריאה כוללים cytotoxicity מדידות באמצעות מבחני שונות (למשל, LDH assay, וזמינותו WST-1, מיקרוסקופיים מכתים assay), שחרור ציטוקינים מבחני, באותה מידה כמו שינוי פרופיל ביטוי ואפיון של שינויים באוכלוסיות התאית על ידי שיטות immunohistopathological6. יתר על כן, קיימות טכניקות המתארת את הפריט החזותי של תאים, כמו ריאות תאים דנדריטים, מאתר PCLS28 ניתן להעביר גם PCLS אנושי, ובכך עשוי לספק מפורט יותר תובנות ההרכב הסלולר לפני, לאחר טיפול עם חומרים ציטוטוקסיות בשם.
זה פרוטוקול בסיסי טכניקה להכנה סעיפים רקמת הריאה האנושי הוא להשוות טכניקות שהיו שמתואר היטב פרסומים29. בקיצור, החומר איבר מתקבל מחולים הסובלים מסכן חיים מחלות כרוניות כגון סרטן ריאות, שיש להם לעבור ניתוח כריתה או השתלת. הלימודים תאושר על ידי ועדת האתיקה המקומית. דרושה הסכמה בכתב מושכלת של המטופלים. הגדרת זרימת עבודה בין הקליניקה והמעבדה הוא נושא קריטי ודורש תקשורת, והגדרת ממשקים ותשתיות בין שני האתרים. אמבריולוגיה חומר יש להיות מעובד באופן ישיר לאחר כריתה כדי לשמר את יכולת הקיום של הרקמה. ראוי להזכיר כי יכול להיות מיושם בטכניקה המתוארת כאן עבור PCLS האנושי הריאות צעירים ומבוגרים כאחד, בריאים וחולים הריאות. בארצות הברית, למשל, זה אפשרי להשיג הריאות של תורמי איברים בריאים שמתו בתאונות או איזה איברים שנדחו על השתלת.
השלב הקריטי הראשון בפרוטוקול הוא אינפלציה של דרכי הנשימה, parenchyma שמסביב עם פתרון agarose. שלב זה יש צורך לחזק את הרקמות מאוד עבור ההליך עם פרוסות עוקבות. איכות החומרים אמבריולוגיה, על רקע מחלה, הוא קריטי כאן. יכול להיות מלא רק אונות עם קרום הריאות תקין. גידולים בשלב הסופי סמפון לפעמים למנוע את תהליך מילוי. לפני ניפוח החומר האנושי, הטמפרטורה של הפתרון agarose יש להיבדק ביסודיות. דם רב מדי (או אחרים נוזלים, exudates) בתוך האדם רקמת הריאה תגרום לדילול רצויה agarose, ישפיע הדבר על תהליך הפילמור. לאחר האינפלציה של רקמת הריאה, ג'לי של agarose על הקרח, הריאות נחתכים למקטעים של 200 עד 300 עובי מיקרומטר. עקביות של הרקמה הוא נושא מאוד קריטי. אם הרקמה רכה מדי, עם פרוסות של חלקים שווים קשה. גם אם אותו מיקרוטום פרמטרים מוגדרים עבור כל תורם, עובי הפרוסות בין תורמים עשויות להשתנות, התנאים אמורים בודדים ושינויים במהלך ניפוח לעבד עבור כל ריאה. מילוי inhomogeneous של הרקמה יביא פרוסה שונים בעוביים. במקום מדידה אחידות בעובי של פרוסות, מדידה של תכולת החלבון הכולל ניתן לפקח באופן עקיף ריאות פרוסה עוביים. כמה מחלות סופנית והריאליות ולהקשות על תהליך חיתוך; למשל, הדם כלי הם מאד מעובה יתר לחץ דם ריאתי, רקמות שהותירה יכול להיות כל כך נוקשות חותך גלילי רקמה אפשרית כמעט וזה הלהב מיקרוטום צריך להחליף לעיתים קרובות.
לאחר הכנת האדם PCLS, אינטנסיבי שוטף צעדים, אשר נחוצים להסיר שאריות תאים, שוחררה אנזימים, רקמות מקטעים יכול לשמש עבור ניסויים29. PCLS האנושי תרבותי בתנאים התרבות תאים נורמליים, חשוף, לדוגמה, כימיקלים, תרופות או lipopolysaccharides. זיהום מזדמן של PCLS עקב זיהומים (לא ידוע) הוא עניין מיוחד בתרבות של חומר אמבריולוגיה. חייב להיות מושלך בתרביות רקמה מציג זיהומים, חייבים להיות נקיים ביסודיות הציוד. הפרדה מרחבית בין מקומות מעבדה המשמש להכנת מצד אחד culturing מצד עשוי לעזור כדי להימנע קרוס-זיהומים. לגבי הציוד, האזמל הקטן עלול לדלוף, ברגים hex רופף עלול להוביל נזק מנוע ולהפסיק תנועת להב. לא כל חלק בפורס עשוי פלדת אל-חלד, אז זה נישחק אם לא יבש מיד לשנות ניקוי. כדי להתגבר על בעיות ציוד, ייתכן צורך התקן גיבוי אחד לפחות.
בפרסומים קודמים, agarose יש כבר דיווחו על מנת להישטף והוציאו במהלך שטיפת צעדים לאחר הכנה אינטנסיבית. למעשה, הדבר אינו אפשרי, לא ניתן להסיר את agarose. הסרה מלאה של agarose, זה צריך להיות מומסת מחדש בטמפרטורות גבוהות, אשר יהרוס את הרקמה. Agarose alveoli ואת דרכי הנשימה אינה מפריעה הקצה המתואר. נקודות הקצה האחרות עלול להיות מושפע הנוכחות של agarose (ראה גם מגבלות). הצורך להכין את מקטעי רקמת טרייה יש להדגיש, כמו רקמות הכדאיות הוא נושא קריטי בתרבות. Bronchoconstriction הוא לא פרמטר חוקי עבור הכדאיות. מומלץ להשתמש לפחות שניים או שלושה מבחני cytotoxicity עצמאית לבדיקת הכדאיות של parenchyma שמסביב; יש להיבדק בכל ניסוי30. פקדים איכות במבחני cytotoxicity לשמש אינדיקטורים של רקמות לא מספיקות הכדאיות. לכן, מומלץ להעריך את יכולת התגובה של הרקמה, לדוגמה, לחומר רעיל יעיל כמו חומר ניקוי של כל מבחני cytotoxicity. בהתבסס על עקומות מנה-תגובה, ערכי המינימום והמקסימום של ספיגת צריכה להיות מוגדרת עבור מבחני cytotoxicity ופגשתי לניסויים הבאים. שינויים ותיקונים נוספים בפרוטוקול תלויים בעיקר כימיקלים יישומית ואת נקודות הקצה של ריבית. תחולתה של כימיקלים לא מסיסים או תגובתי מוגבל. הריכוז הגבוה ביותר של דימתיל סולפוקסיד ממס מוגבל ל- 1%. ריכוז גבוה יכול לשמש אך עלולה במהדורה בולטת של ציטוקינים פרו-דלקתיים, כמו IL-8. מצד שני, הגירוי נעשה שימוש עשויה להיות חלשה יחסית. במקרה זה, ניתן להגדיל את כמות הרקמה בין 2 ל 4 פרוסות לכל טוב. גישה זו מגבילה את הכדאיות ל 24 שעות.
מגבלה עיקרית של PCLS האנושי הוא כך בגרמניה הם יכולים רק להיות מוכן מחומר אמבריולוגיה נגועים. חולים שעברו ניתוח בדרך כלל שגילם 50 שנה, 80% של חולים הסובלים מסרטן ריאות או נהג להיות מעשנים. התרופה של חולים, כגון glucocorticoids, יכול גם להשפיע על התוצאה של הניסויים באמצעות רקמה אנושית. לכן, זה הכרחי: i) לאמת את כל הניסוי על-ידי הפניות החיוביות אימות הכדאיות פונקציונליות, ורגישות של הרקמה בודדים, ולאמת ii) צלב-התוצאות תוך שימוש רקמת ריאה בריאה, שאינם נגועים, בגיל העמידה חיות מעבדה (פרימטים אנושיות כגון cynomolgus ו, במידת האפשר, עכבר, חולדה, קביה). טוב יותר את הציון פתולוגיה של רקמה חולה, יותר התוצאות ניסיוני. רקמות חולות בכבדות. בקושי יכול לשמש, לעתים קרובות הופעות מוגבל הכדאיות, רמות ציטוקינים כראוי נמוך או גבוה מאוד, חיידקי או פטרייתי דלקות bronchoconstriction פחות. וריאציה התורם-כדי-תורם גבוה יותר לעומת התוצאות המתקבל חיות מעבדה, המשקף ההשתנות בודדים של בני אדם. זו אינה, עם זאת, מגבלה באופן כללי; כפי שהוזכר לעיל, במדינות אחרות (למשל, ארה ב) ניתן להשיג בריאות של תורמי איברים המת נדחה על השתלת. ההיענות של הרקמה תואר טוב הראשון עד 48 שעות בניסויים חשיפה אקוטית. הכדאיות והפונקציונליות של הרקמה מופחתת לאחר ימים רבים של תרבות או לאחר אחסון ב- 80 ° c זה אפשרי רקמת הריאה האנושי תרבות עבור עד 14 ימים בערך. הכדאיות ממשיכה בתקופה זו; עם זאת, עלייה השתנות, כמו גם לאובדן פונקציונליות מספר אוכלוסיות תאים, כגון מקרופאגים, בתוך הרקמה הוא ציין, וכתוצאה מכך במהדורה מוגבלת ציטוקין בתגובה mitogens. מגבלה נוספת עבור נקודות קצה מסוימים היא הנוכחות של agarose בתוך הרקמה, הפרעה, לדוגמה, הבידוד של כמויות מספיקות ובאיכות גבוהה של רנ א31 או הכנת המתלים תא בודד עבור cytometry זרימה עוקבות, phenotyping של תאים. אפשרות לקבל תובנות מכניסטית תא בודד תגובות ופונקציונליות ובכך הוא מוגבל.
מודלים של רקמת Organotypic, כגון PCLS האנושי, נחשבים יש השפעה גבוהה על מחקר בסיסי וקליני הלא. אמבריולוגיה חומר יש קומפוזיציה ביולוגי המשקף היטב את הארכיטקטורה איבר נורמלי. הוא מכיל, לדוגמה, מגורים מכתשי ובסימפונות בתאי אפיתל תאי שריר חלק, fibroblasts, תאי אנדותל, סיבי עצב, מקרופאגים. הרקמה ברות ביצוע ולא התאים מגיבים לגירויים מספר. עצבים סיבים, למרות לחתוך, יכול להיות מקומי מופעל, המוביל אל מסוף תגובות רפלקס14. כתוצאה מכך, מודל זה שמחוץ מציעה את האפשרות ללמוד תגובות מערכת החיסון התאית מולדת, תגובות הגנה, ציטוקינים איתות, אינדוקציה של סמני פני שטח התא. מספר שיפורים בטכניקה culturing, אימות של נקודות קצה מאפשרים את השימוש PCLS אנושי במדע translational. דוגמאות של גישות עתידיות הן: i) אימות של חדש מטרות ברקמת אמבריולוגיה, ii) הערכה של תגובות חיסוניות לאחר החשיפה, לדוגמה, כימיקלים, תרופות, חלקיקים, וכדומה, iii) תוספת של רקמת הריאה עם תאים חיסוניים, כזה כמו לימפוציטים, iv) זיהוי ושינוי דפוסים מולקולרית, לדוגמה, לאחר חשיפה לרגישות בדרכי הנשימה, חומרים גרימת המחלה או חומרים פעילים עיכוב מסלולים; יתר על כן, v) שיפוץ דרכי הנשימה ו- vi) העצבית תקנה32. השדה ' מדעי ' מעוניינת הגישות הללו הווה ועתיד, יחד עם PCLS. בנוסף, ישנם מגוון של פיתוחים שונים שיעזרו לשפר את הטכניקה PCLS, כגון שימור הקפאה-20, ורקמות מתיחה33 לחקות את התנועה הטבעית של הרקמה במהלך הנשימה או מכני אוורור.
היתרון העיקרי של האדם PCLS לעומת שאר דגמי תלת-ממד הוא הנוכחות של תאים חיסוניים, סיבי עצב. ניתן גם לבצע ניסויים ב עכבר, חולדה, קופים, המהווים מיני בעלי חיים המשמשים עדיין לרוב וטוקסולוגיה. המורכבות של רקמת הריאה אנושי תומך את התרגום של תוצאות מן החיה האדם ומן במבחנה ויוו. בהקשר של מבחני אלטרנטיביים הקיימים לצורך זיהוי לרגישות בדרכי הנשימה, PCLS אנושיים מורכבים ביותר, ואינם מאפשרים תובנות תגובות תא בודד. ובכל זאת, מיקרוסקופיה וזרימה cytometry עשוי לתת מידע אודות תגובות הסלולר, אם סמן נכון הסלולר משמש בשילוב, לדוגמה, אפופטוזיס, נמק או סמני תאיים. ישנם מבחני שפורסמו אשר היה מאומת לדווח שימשו לצורך זיהוי לרגישות בדרכי הנשימה. עם זאת, ההתקדמות בשימוש של PCLS עם כל היתרונות שלהם על מבחני מתא בודד עושים תרומה משמעותית במובן כך שניתן להשתמש בטכניקה להקרנה תפוקה גבוהה, כפי שתואר על ידי ווטסון. ואח 34 הם פיתחו וזמינותו תפוקה גבוהה ההקרנה לחזות דרכי הנשימה רעילות PCLS מאתר נשמר-הקפאה. עם פורמט PCLS ולמחקר שלהם 96-ובכן, הם גילו המפרט דומה בנוזל שטיפה מאתר, שהופך PCLS assay ריאלי של תפוקה גבוהה.
Disclosures
המחברים אין לחשוף. פראונהופר פריט הוא ארגון מחקר ללא מטרות רווח ציבורי עצמאי עבור מחקר יישומי, ביצוע חוזה מחקר מטעם תעשיות ביוטכנולוגיה, פרמצבטיקה, כימיקלים, קוסמטיקה. המימון של המכון נובע פרויקטים ציבוריים לאומיים ובינלאומיים.
Acknowledgments
ברצוננו להודות Lan Lauenstein על עבודתה מראש לגבי אסטרטגיות אלטרנטיביות בדיקה להערכת הסיכון עם PCLS האנושי. כמה המחקר נתמך על ידי מענק של הנציבות האירופית תוכנית המסגרתה 6 סנס-IT-IV "הרומן אסטרטגיות בדיקה להערכת במבחנה של אלרגנים".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon hose 3.0 x 5.0 mm | A. Hartenstein (Leipzig, Germany) | SS04 | |
| Syringe | Faust Lab Science (Klettgau, Germany) | 9.410 050 | |
| Coring tools | custom-made | custom-made | |
| Trimming Blade Handle (FEATHER) | pfm medical ag (Cologne, Germany) | 205530001 | |
| Trimming Blades (FEATHER) | pfm medical ag (Cologne, Germany) | 205500000 | |
| Microtome: Tissue Slicer | Alabama R&D (Bad Homburg, Germany) | 303400-ADPT | Krumdieck Tissue Slicer (MD6000) |
| Microtome blade | Wilkinson Sword (Solingen, Germany) | ENR-4027800011506 | |
| Tissue culture dishes | Sigma (München, Germany) | Z666246-420EA | |
| Cell strainer filter (100 µm Nylon) | Becton Dickinson (Heidelberg, Germany) | BD352360 | |
| Inoculation loop | Copan Diagnostics (Murrieta, USA) | CD176S01 | |
| TPP Tissue culture plates 24wells | Sigma (München, Germany) | Z707791-126EA | |
| Cassette | Thermo Scientific (Schwerte, Germany) | 1000957 | |
| Nunc MaxiSorp flat-bottom | Fisher Scientific GmbH (Hannover, Germany) | 44-2404-21 | |
| Nunc MicroWell 96-Well | Thermo Scientific (Schwerte, Germany) | 260836 | |
| Confocal Microscope | Zeiss (Jena, Germany) | Confocal LSM Meta 510 | |
| Image rendering software | Bitplane AG (Zürich, Switzerland) | IMARIS 7.6 | |
| LSM Image Browser | Zeiss (Jena, Germany) | ||
| Multiwell-Reader | Tecan Group Ltd. (Männedorf, Switzerland) | Tecan infinite F200Pro | Plate Reader |
| Plate shaker | Edmund Buehler GmbH (Hechingen, Germany) | KM-2 Akku | |
| BenchMark ULTRA | Ventana Medical Systems (Tucson, USA) | Automated IHC/ISH slide staining system | |
| Assays | |||
| Cell Proliferation Reagent WST-1 | Roche (Basel, Switzerland) | 11644807001 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche (Basel, Switzerland) | 11644793001 | |
| Microscopical vitality staining | Invitrogen (Carlsbad, USA) | L-3224 | LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit |
| BCA Protein Assay | Thermo Scientific (Schwerte, Germany) | 23225 | |
| ELISA assay kit | R & D systems | various, e.g. DY210 (TNF-α) or DY200 (IL-1α) | DuoSet |
| Reagents | |||
| Agarose, low gelling temperature | Sigma (München, Germany) | A9414-100G | |
| Balanced Salt Mixtures and Solutions, Cell Culture, Classic Media and Salts, Earle’s Balanced Salts (EBSS) | Sigma (München, Germany) | E2888-500ML | |
| Penicillin and streptomycin | Lonza (Verviers, Belgium) | 17-602E | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM F-12) | Gibco (Darmstadt, Germany) | 11039-047 | Culture medium |
| Dulbecco´s Phosphate with Ca and Mg (DPBS) | Lonza (Verviers, Belgium) | BE17-513F | Buffer solution |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma (München, Germany) | A9647-500G | |
| Detergent | Sigma (Saint Louis, USA) | X100-100ML | Triton X-100 |
| Washing buffer | Merck (Darmstadt Germany) | 524653 | 0.05% Tween 20 in PBS |
References
- D'Amato, G., et al. Climate change, air pollution and extreme events leading to increasing prevalence of allergic respiratory diseases. Multidiscip Respir Med. 8 (1), 12 (2013).
- Pawankar, R., et al. State of world allergy report 2008: allergy and chronic respiratory diseases. World Allergy Organ J. 1 (6), Suppl 4-17 (2008).
- Hartung, T., Daston, G. Are in vitro tests suitable for regulatory use. Toxicol Sci. 111 (2), 233-237 (2009).
- Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460 (7252), 208-212 (2009).
- Balls, M., Straughan, D. W. The three Rs of Russell & Burch and the testing of biological products. Dev Biol Stand. 86, 11-18 (1996).
- Sewald, K., Braun, A. Assessment of immunotoxicity using precision-cut tissue slices. Xenobiotica. 43 (1), 84-97 (2013).
- Fisher, R. L., et al. The use of human lung slices in toxicology. Hum Exp Toxicol. 13 (7), 466-471 (1994).
- Ressmeyer, A. R., et al. Characterisation of guinea pig precision-cut lung slices: comparison with human tissues. Eur Respir J. 28 (3), 603-611 (2006).
- Donovan, C., et al. Rosiglitazone elicits in vitro relaxation in airways and precision cut lung slices from a mouse model of chronic allergic airways disease. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 309 (10), 1219-1228 (2015).
- Koziol-White, C. J., et al. Inhibition of spleen tyrosine kinase attenuates IgE-mediated airway contraction and mediator release in human precision cut lung slices. British journal of pharmacology. 173 (21), 3080-3087 (2016).
- Paddenberg, R., Mermer, P., Goldenberg, A., Kummer, W. Videomorphometric analysis of hypoxic pulmonary vasoconstriction of intra-pulmonary arteries using murine precision cut lung slices. J Vis Exp. (83), e50970 (2014).
- Lamb, D. J., et al. Bl 1002494, a Novel Potent and Selective Oral Spleen Tyrosine Kinase Inhibitor, Displays Differential Potency in Human Basophils and B Cells. J Pharmacol Exp Ther. 357 (3), 554-561 (2016).
- Leus, N. G., et al. HDAC 3-selective inhibitor RGFP966 demonstrates anti-inflammatory properties in RAW 264.7 macrophages and mouse precision-cut lung slices by attenuating NF-kappaB p65 transcriptional activity. Biochem Pharmacol. 108, 58-74 (2016).
- Schleputz, M., et al. Neurally mediated airway constriction in human and other species: a comparative study using precision-cut lung slices (PCLS). PLoS One. 7 (10), 47344 (2012).
- Hess, A., et al. Prevalidation of the ex-vivo model PCLS for prediction of respiratory toxicity. Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 32, 347-361 (2016).
- Bergner, A., Sanderson, M. J. Acetylcholine-induced calcium signaling and contraction of airway smooth muscle cells in lung slices. J Gen Physiol. 119 (2), 187-198 (2002).
- Wohlsen, A., et al. The early allergic response in small airways of human precision-cut lung slices. Eur Respir J. 21 (6), 1024-1032 (2003).
- Wu, W., et al. Innate immune response to H3N2 and H1N1 influenza virus infection in a human lung organ culture model. Virology. 396 (2), 178-188 (2010).
- Zmora, P., et al. Non-human primate orthologues of TMPRSS2 cleave and activate the influenza virus hemagglutinin. PLoS One. 12 (5), 0176597 (2017).
- Rosner, S. R., et al. Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation. Am J Respir Cell Mol Biol. 50 (5), 876-881 (2014).
- Lauenstein, L., et al. Assessment of immunotoxicity induced by chemicals in human precision-cut lung slices (PCLS). Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 28 (4), 588-599 (2014).
- Wild, L. G., Lopez, M. Occupational asthma caused by high-molecular-weight substances. Immunol Allergy Clin North Am. 23 (2), 235-250 (2003).
- Di Stefano, F., et al. Occupational asthma due to low molecular weight agents. Int J Immunopathol Pharmacol. 17 (2), Suppl 77-82 (2004).
- Buonsante, V. A., Muilerman, H., Santos, T., Robinson, C., Tweedale, A. C. Risk assessment's insensitive toxicity testing may cause it to fail. Environ Res. 135, 139-147 (2014).
- Boverhof, D. R., et al. Respiratory sensitization and allergy: current research approaches and needs. Toxicol Appl Pharmacol. 226 (1), 1-13 (2008).
- Johansson, H., Albrekt, A. S., Borrebaeck, C. A., Lindstedt, M. The GARD assay for assessment of chemical skin sensitizers. Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 27 (3), 1163-1169 (2013).
- Brismar, H., Patwardhan, A., Jaremko, G., Nyengaard, J. Thickness estimation of fluorescent sections using a CSLM. Journal of Microscopy. 184 (2), 106-116 (1996).
- Lyons-Cohen, M. R., Thomas, S. Y., Cook, D. N., Nakano, H. Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells. J Vis Exp. (122), (2017).
- Switalla, S., et al. Natural innate cytokine response to immunomodulators and adjuvants in human precision-cut lung slices. Toxicol Appl Pharmacol. 246 (3), 107-115 (2010).
- Henjakovic, M., et al. Ex vivo testing of immune responses in precision-cut lung slices. Toxicol Appl Pharmacol. 231 (1), 68-76 (2008).
- Niehof, M., et al. RNA isolation from precision-cut lung slices (PCLS) from different species. BMC Res Notes. 10 (1), 121 (2017).
- De Proost, I., et al. Purinergic signaling in the pulmonary neuroepithelial body microenvironment unraveled by live cell imaging. FASEB J. 23 (4), 1153-1160 (2009).
- Davidovich, N., Chhour, P., Margulies, S. S. Uses of Remnant Human Lung Tissue for Mechanical Stretch Studies. Cell Mol Bioeng. 6 (2), 175-182 (2013).
- Watson, C. Y., et al. Screening for Chemical Toxicity Using Cryopreserved Precision Cut Lung Slices. Toxicol Sci. 150 (1), 225-233 (2016).
