Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Оценка цитотоксических и иммуномодулирующих эффектов веществ в легкое человека точности cut ломтики

doi: 10.3791/57042 Published: May 9, 2018
* These authors contributed equally

Summary

С учетом принципа 3Rs развиваются дыхания модели как альтернативы исследования на животных. Особенно для оценки риска респираторных веществ является отсутствие соответствующих анализов. Здесь мы описывают использование человеческих легких точности cut ломтики для оценки веществ, переносимых по воздуху.

Abstract

Респираторных заболеваний в их широкого разнообразия нужны соответствующие модели системы для понимания основополагающих механизмов и разработки новых терапии. Кроме того регистрация новых веществ требует оценки соответствующих рисков с надлежащими системами контроля во избежание риска людей, наносится ущерб, например, в рабочей среде. Такие оценки рисков обычно проводится в исследованиях на животных. Учитывая принцип 3Rs и скептицизм общественности против экспериментов на животных человека альтернативных методов, таких как точность надреза легких ломтиками (PCLS), развиваются. В настоящем документе описывается методика ex vivo человека PCLS изучить потенциал иммуномодулирующих низкой молекулярной массой вещества, такие как Гексахлороплатинат аммония (HClPt). Измеряемые параметры включают жизнеспособность и местного воспаления дыхательных, отмечен изменены секрецию цитокинов и chemokines. Провоспалительных цитокинов, фактора некроза опухоли альфа (TNF-α), и интерлейкинов 1 альфа (IL-1α) были значительно увеличены в человека PCLS после воздействия к югу токсические концентрации HClPt. Даже несмотря на то, что за последние десятилетия существенно оптимизирована методика PCLS, ее применимости для тестирования иммуномодуляция находится все еще в разработке. Таким образом результаты, представленные здесь носят предварительный характер, несмотря на то, что они показывают потенциал человеческого PCLS как ценный инструмент в дыхательных исследований.

Introduction

Респираторных заболеваний, таких как аллергической астмы, профессиональной астмы, хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), эмфизема и инфекции верхних и нижних дыхательных путей находятся на подъеме и представляют во всем мире здоровья бремя1,2. Подходящей тестовой системы необходимы, для того чтобы определить некоторые из основных механизмов, лежащих в основе этих заболеваний, помимо разработки и тестирования соответствующих веществ. Фундаментальных исследований, а также развития доклинических наркотиков ориентированы на результаты, полученные в vitro или в vivo анализов. Эти анализы, однако, имеют свои ограничения3. Во-первых в пробирке анализов используют клетки человека, которые были изолированы и удалены из прилегающих тканей или органов и, таким образом, больше не могут взаимодействовать с или защищаться от других клеток3. Во-вторых Животные модели часто не могут быть переведены для людей из-за различий в физиологии и биохимические расхождения4. Чтобы свести к минимуму эти ограничения и в контексте 3Rs (замена, изысканности, сокращение) принцип5, новые альтернативные модели постоянно развивается.

Альтернативные тканей человека 3D модели, такие как PCLS, являются связующим звеном между основанный на человека в пробирке и комплекс животных в естественных условиях модели. PCLS отражать функциональные неоднородность со всеми типами соответствующие клетки в дыхательных путей6. Кроме того метод PCLS имеет то преимущество, воспроизводимые подготовки несколько тонких ломтиков точной толщины от одного человека или животного тканей донора. Это позволяет внутреннего контроля, а также различные концентрации или наркотики испытанию.

После первого введения агар заполнены человеческих легких ломтики в 1994 году Fisher et al. 7 методика для нарезки и культивирования легочной ткани были значительно усовершенствованы. Кристиан Мартин и др. улучшили эту технику для дальнейшей химической и фармакологической приложения8. Наша группа была введена в этой технике Кристиан Мартин в 2007 году. С тех пор применение PCLS в исследованиях расширилась от тестирования функциональных ответов, таких как сократимость9,10 и вазоконстрикция11, иммунологические, фармакологические12,13, и токсикологические7 тестирование различных видов в нескольких лабораториях. К примеру, Schlepütz и др. 14 исследованы реакции дыхательных путей для видов различия и сравнении периферийных нейрон активации либо путем стимуляции электрического поля (EFS) капсаицин мышей, крыс, Гвинея свиньи, овцы, мартышек и людей. Они нашли различные виды иметь собственный, но разные структуры нерва опосредованной бронхоспазма и пришел к выводу, что часто используемых лабораторных животных (мышей и крыс) не всегда отражают реакции человека. Для легких токсичность тестирования и уменьшить количество животных в этом контексте, Гесс и др. 15 предварительно проверяются крыса PCLS как альтернатива ex vivo исследований ингаляционной токсичности. Этот многоцентровые исследования предварительной проверки привели к разработке двух моделей прогнозирования с использованием PCLS с многообещающие результаты.

Кроме того в базовых исследований, PCLS использовались для уточнения кальция, сигнализации16, раньше аллергических реакций17и вирусной инфекции ответы18,19. Технический прогресс продолжается и в настоящее время изучаются дальнейшие успехи. Например поле увеличивается в интересах человеческой ткани на хранение и повторное использование замороженных ткани. Рознер et al. описал метод замораживания и оттаивания мышиных PCLS, который сохраняет способность airways контракта после стимуляции: таким образом, метод продлевает окна ограниченное время, в течение которого ткани остаются жизнеспособными и так далее анализов может применяться со временем же доноров20. Помимо этих достижений исследований, Lauenstein et al. 21 недавно расследовала оценки риска различных химических веществ, которые могут выступать в качестве потенциальных сенсибилизаторов профессиональной астмы в человека PCLS.

Профессиональной астмы, чьи симптомы являются воздуха обструкции и сократимость hyperresponsiveness, похож на аллергическую астму, вызванных воздействием высокой молекулярным весом (HMW)22 или низкой молекулярной массой (LMW) веществ23 (например , смеси платины) в окружающей среде на рабочем месте. LMW агенты имеют высокий потенциал сенсибилизация при формировании гаптенами и привязку к перевозчику белки21. Регистрация новых HMW или LMW химических веществ требует оценки рисков в пробирке и в естественных условиях относительно их предполагаемого информирование потенциальных (например., ОЭСР руководства 429)24. Тесты, используемые для определения предполагаемых информирование потенциальных, однако, изначально не были предназначены для оценки риска респираторных сенсибилизаторов, но для контакта сенсибилизаторов, хотя там, как представляется, некоторые сравнения для небольшого подмножества веществ25 . Работа Lauenstein et al. был разработан в рамках проекта Европейского союза Sens ИТ iv, для разработки альтернативных стратегий тестирования для оценки риска предполагаемого контакта или легких сенсибилизаторов21. Для этого проекта мы сосредоточились на тестирование юзабилити человеческого PCLS качестве альтернативного тестирования инструмента. Таким образом набор иммуномодулирующих конечных точек (например, жизнеспособности и цитокина секреция) был выбран для определения раздражающего или воспалительных потенциал таких химических веществ, как соединения LMW платины. Lauenstein et al. нашли не общий шаблон, который может применяться для всех дыхательных сенсибилизаторов; Однако их работа послужила основой для недавно опубликованные протоколы26.

В резюме протокол, представленные здесь для подготовки и последующего воздействия человеческого PCLS обеспечивает полезный метод для оценки потенциально легких-токсичных или иммуномодулирующих веществ, которые могут быть вовлечены в развитие респираторных заболеваний, таких как профессиональной астмы.

Protocol

Эксперименты с человеческой PCLS должны быть выполнены согласно Кодекс этики Всемирной медицинской ассоциации и утвержден Комитетом местных этики (образцовой PCLS эксперименты, показанный здесь были утверждены Комитетом местных этики Ганновер Медицинская школа; номер 2701-2015). Письменного информированного согласия на использование человеческих легких материалов требуется от всех доноров пациентов или их ближайших родственников. Были получены результаты, описанные в этой рукописи с кусочками ткани от доноров разных возрастов, полов, медицинской истории, и причина резекции, хотя большинство ткани, полученных от пациентов, страдающих от рака легких. Только бесплатно опухоль ткани был использован для экспериментов.

1. Общая подготовка человека PCLS и последующего воздействия химических веществ

Примечание: Два человека требуются для заполнения легких. Рекомендуется использовать запись современных вакцинации для гепатита A и B. Пациентов, регулярно проверяются для ВГС и ВИЧ до трансплантации легких. Если диагноз или подозреваемых активных инфицирование микобактериями туберкулеза легких должно быть отвергнуто. Тем не менее, все свежие человека легочной ткани и образцы, производные от него должны рассматриваться как потенциально инфекционные и соответствующие защитные меры должны быть приняты (частицы фильтра маски (FFP2), защитные очки, перчатки), для обеспечения безопасности труда персонал. Процедура занимает 60-90 мин.

  1. Подтверждения целостности мочку легкое человека.
    Примечание: Разрыв в плевру предотвращает однородное заполнение ткани. Легкое человека материал должен быть от дня резекции. Допускаются периодов хранения около 2 ч при комнатной температуре (RT) до заполнения его с агарозы на льду. Ткани, которые мы используем в этом протоколе получается из пациентов, перенесших резекцию. Это не от умерших больных. Если ткани был сохранен на льду, предварительно нагреть его до RT перед заполнением его, в противном случае агарозы будет полимеризоваться немедленно, и не однородное заполнение будет возможно.
    Предупреждение: Убедитесь, что все лица при контакте с родной человеческого материала положить на защитную одежду, состоящий из лаборатории пальто, две пары, перчатки, шапка, маска и очки безопасности. Материал человека потенциально инфекционными.
  2. Весит 7,5 г гелеобразующего низкой агарозы и добавить его в 250 мл би дистиллированной воды. Отварите агарозы в микроволновую печь, пока растворится агарозы. Остудить до приблизительно 40 ° C, в зависимости от точки плавления и гелеобразующего агарозы.
    Примечание: Несколько Колб, требуются в зависимости от размера доли.
  3. Предварительно нагреть и держать питательной среды (Таблица материалов) при 37 ° C.
    Примечание: Если агарозы слишком жарко, витамины в среде культуры потеряет эффективность и клетки будут повреждены. Если температура раствора средне/агарозы ниже 37 ° C, желирующий процесс начнется и ухудшить однородное заполнение легких. Только в диапазоне температур от 37 ° C до 39 ° C рекомендуется.
  4. Разместите все необходимые материалы в пределах досягаемости до начала: 5-10 зажимов, гибкий катетер примерно 1 м длины, подходящий шприц (например, 50 мл) установку подключения к катетер и Ледяной ящик, наполненный льдом.
  5. Иглу трахея/главного бронха, вставив силиконовые трубки и фиксирующий зажим ориентированной параллельно трубе, так, чтобы зажим сжимает ткани вместе наряду с силиконовой трубки без щипать его покинуть. Убедитесь, что Силиконовая трубка зацикленная внутри и не может выскользнуть во время процедуры наполнения. Закройте все другие бронхов, кровеносных сосудов и травм с зажимами, так что не агарозы могут просочиться во время процедуры наполнения.
  6. Mix эквивалентный объем 3% агарозном низким гелеобразующего с питательной среды в стакан. Внушить смесь в легких, с помощью шприца 50-мл. Перед заправкой шприц с среднего, зажим закрыл катетер с пальцами или зажим, чтобы избежать воздушных пузырей и рефлюкс агарозы. До тех пор, пока он полностью надут, заполните доли легкого. Аккуратно дотроньтесь легких плевры на стороне; плевра должно быть ровным и жесткий.
    Примечание: В зависимости от размера доли легкого, до 2 или 3 Л раствора агарозы/средний может потребоваться.
  7. Повторите шаги 1.5-1.6 для каждого бронха, в случае нескольких бронхов в рамках единого образца.
  8. Положите легких на льду для полимеризации агарозы в гель для 20-40 мин, в зависимости от количества внушал агарозы. Аккуратно дотроньтесь плевры на нескольких сторон, чтобы проверить, является ли это жесткий и прохладный, означающее что полимеризации является полным, в противном случае продолжать ждать. Пусть патологоанатомов легких нарезать ломтиками, взять их образцы и хранить легких материалов на льду для транспортировки.
  9. Вырежьте человека легочной ткани в 3-5 см плит с острым ножом.
    Примечание: Используйте новые лезвия для каждого легкого для обеспечения четкости.
  10. Заполните срез ткани с 400 мл ледяной Эрл сбалансированного солевого раствора (EBSS). Немедленно сократить сердечников цилиндрических ткани из легких слябов, полуавтоматическое отверткой с инструментом керна диаметром предпочтительным (например, 8 мм, 10 мм).
    Примечание: Этот диаметр должна быть эквивалентна диаметр держателя ткани внутри машины.
  11. Отрегулируйте толщину ломтиков легких к значению требуемой толщины.
    Примечание: Толщиной приблизительно 250 мкм обычно используется в PCLS экспериментов. Производитель срез ткани рекомендует толщиномер их кусочек ткани для проверки толщины срез. Кроме того всего гора пятнать в сочетании с confocal микроскопии может использоваться для определения толщины срез, как описано в Brismar et al. 27
  12. Перенесите сердечников ткани в держатель ткани среза ткани. Положите вес (часть держателя ткани) поверх основной ткани. Установите руку скорость и скорость вращения ножей 6 на срез ткани. Начните, нарезка основной ткани в PCLS.
  13. Дополнение к 500 мл из коммерчески доступных Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM): питательной смеси F-12 среде DMEM/F12 (1:1) с 5 мл пенициллин (10 000 единиц/мл) и стрептомицин (10 000 мкг/мл). Храните питательной среды на несколько дней в стерильных условиях в холодильник. Предварительно теплой только необходимый объем среднего.
    Примечание: Пенициллин будет деактивировано, если хранится при 37 ° C для более длительных периодов. Использование сыворотки свободных и без красителя питательной среды, как сыворотка состав меняется от партии к партии и красителей, таких как фенол красный, может мешать анализов.
  14. Заполните чашку Петри (100 x 15 мм) с 25 мл ледяной питательной среды. Средний следует слитого из срез ткани в стакан, открыв фиксатор цилиндра стекла. Перевести ломтики с стакан на Петри блюдо с питательной среды с помощью аппликатора (например, прививка цикла). Положите на Петри блюдо в инкубатор (37 ° C, 5% CO2, 100% влажность). Разрешить среднего разогреть до мытья шаги.
    Примечание: Все дальнейшие шаги выполняются в стерильных условиях.
  15. Поместите стрейнер ячейки в Петри для мытья PCLS. Полностью удалить питательной среды с Серологические Пипетки 10-мл через ячейку сито и добавить 25 мл подогретым свежей среды 37 ° C. Повторите этот шаг 3 - 4 раза каждые 30 мин.
    Примечание: Клетки сетчатый фильтр предотвращает ломтики втягиваться в пипетку, чтобы избежать повреждений на ломтики.
  16. Передача легких ломтики тщательно в 24-ну культуры плиту с минимум 500 мкл питательной среды для два ломтика за хорошо. Разоблачить легочной ткани веществ (см. шаги 3.1-3.4), например, за 24 часа при 37 ° C, 5% CO2.
    Примечание: Для передачи, предпочтительно использование цикла прививок и пусть ломтики плавать на петлю для того, чтобы предотвратить повреждение тканей. Без дальнейшего разъединения ломтики заказ, как только нехватка достаточно свежей среды будет стимулировать клеточную смерть в срезах ткани. Фрагменты можно перекрывать или соприкасаются друг с другом в хорошо: это не влияет на жизнеспособность тканей.
  17. Положите все остаточные человеческого материала в пластиковый флакон с фиксатором (например, 10% буферизуются формальдегида) для по крайней мере 24 часа и записать это в процессе удаления.
    Предупреждение: Формальдегид токсичных, выполнить этот шаг под капотом.

2. гистологический анализ PCLS

  1. Подготовить биопсии кассеты с двух пенопластовых прокладок, пропитанной фиксатором (например., 4% буферизуются формальдегид). Место PCLS между прокладки в кассету биопсии и немедленно передавать ткани в фиксирующие решение. Исправить ткани на ночь в 4% буферизации формальдегида.
  2. Процесс ткани для парафина, встраивание образцов в этаноле (70%, 90%, 100%, 100%, 100%, 100%), за 1 ч, обезвоживает организм после стирки в ксилоле (3 x 1 h) и жидкий парафин (3 x 1 h) согласно стандартным гистопатология протоколы.
  3. Перевод PCLS на встраивание формы. Используйте цикл прививка. Внедрите в PCLS ткани в жидкий парафин. Убедитесь, что место ткани равномерно в плесени при приведении блоком парафина.
  4. Вырежьте блок ткани, содержащий PCLS с микротом роторный до тех пор, пока он имеет плоскую и даже поверхность. Принимать последовательные секции требуемой толщины (например., 4 мкм), помещая их индивидуально на последовательно пронумерованных стекла с покрытием слайды (обычно 25-30 разделов могут быть приняты) до всей PCLS был обработан.
  5. Пятно одно стекло слайды (каждые 8-10 разделов) с гематоксилином и эозином пятно (H & E) для ориентации. Выберите разделы для эксперимент, основанный на ориентацию слайдов (первый и последний 8 секций обычно неполной).
    Примечание: (Необязательно) для длительного хранения, слайды можно окунуться в жидкий парафин для сохранения.

3. Приготовление растворов для веществ

Примечание: Подготовьте рабочие решения и контроля непосредственно перед использованием.

Предупреждение: Обработки веществ согласно инструкции по технике безопасности или, если она неизвестна, как потенциально вредные и следовать обычной предосторожности.

  1. Растворите водорастворимые вещества непосредственно в среде культуры. Нерастворимые или малорастворимых химических веществ сначала растворяют вещества в соответствующие растворители в зависимости от растворимости веществ. Вещества с ограниченной растворимостью в воде (< 0,1 мг/мл) может быть распущен, например, в ДМСО или этанола. Нетоксичные растворителей концентрации должны определяться заранее титрования. Убедитесь, что вещества не осадок из раствора при разбавлении в среду.
    Примечание: Готовятся HClPt и натрия лаурет сульфат (SLS) решения.
  2. Подготовьте вещество фондовых решения в 100 раз желаемого высокие концентрации в питательной среды или растворителя. Взвесить 12,5 мг HClPt и 34,4 мг SLS и подготовить акций решения путем растворять химических веществ в 1 мл питательной среды.
    Примечание: Не растворителя требуется для этих химических веществ.
  3. Подготовьте окончательный разбавления 1: 100 в подогретым среде. В случае предварительного использования растворителя этот подход приводит к же конечная концентрация растворителя для всех концентрации вещества.
  4. Используйте конечная концентрация растворителя (например, 1%, как описано в шаге 3.3) для лечения ссылку PCLS. Без растворителя управления требовалось для химических веществ, перечисленных в разделе результаты.

4. положительные и отрицательные ссылки для анализов цитотоксичности

  1. Для всех жизнеспособность анализов Подготовьте следующие позитивные и негативные элементы управления:
    1. Ткани управления: инкубировать PCLS в среде культуры только в качестве ссылки для без лечения PCLS за 24 ч в условиях культуры клеток (37 ° C, 5% CO2, 100% влажность).
    2. Управления транспортным средством (при необходимости): инкубировать PCLS с конечная концентрация растворителей, как ссылку для PCLS с автомобилем только (см. шаг 3.4) за 24 ч в условиях культуры клеток (37 ° C, 5% CO2, 100% влажность).
    3. Положительный контроль: инкубировать PCLS с 1% моющего средства в буферном растворе 1 ч при 4 ° C.
      Примечание: Если PCLS становится бесцветным, ткани мертв. Общая L-Лактатдегидрогеназа (LDH) определяется в надосадке, с поглощением примерно 1,9-2,3 (см. шаги 6.1-6.4). Ткани используется для assay WST-1 (см. шаги 5.1-5.5), при поглощении около 0.

5. Измерение химически индуцированных цитотоксичность в человека PCLS в Assay WST-1

Примечание: WST-1 генотипирования в 24-ну плиту с двумя PCLS за хорошо. Желательно использовать дубликаты для каждого параметра и обобщить результаты этих дубликатов после измерения.

  1. Приготовьте рабочий раствор путем разбавления WST-1 реагента в среде непосредственно перед началом. Необходимое количество рабочего раствора-250 мкл/хорошо 24-ну плиты. Таким образом Смешайте 25 мкл реагента с 225 мкл питательной среды для одной скважиной.
  2. После инкубации PCLS из шага 1.16 отменить или использовать супернатант для измерения цитокинов или других тестов, таких как assay ЛДГ. Остальные ткани используется для следующего шага.
  3. Накапайте 250 мкл рабочей концентрации реагентов WST-1 за хорошо и инкубировать пластины при 37 ° C и 5% CO2 на 1 ч. Убедитесь, что PCLS полностью охватываются WST-1 реагента во время инкубации.
  4. Место пластину на орбитальный шейкер (200 об/мин) и тщательно встряхнуть для 30 s для обеспечения тщательного перемешивания реагентов WST-1. Возьмите новую квартиру-днище 96-луночных и Накапайте µL 100 в дубликаты из супернатант каждой скважины 24-ну пластины.
  5. Измерение поглощения каждой скважины на 450 Нм (ссылка: 630 Нм) с использованием Считыватель микропланшетов. Вычесть поглощения в 630 Нм от 450 Нм. Эти значения будут использоваться для расчета на шаге 5.6).
    Примечание: Достоверные данные для цитотоксичность оценки могут быть получены только жизнеспособные ткани. Таким образом эти критерии приемлемости, Опубликовано Гесс и др. 15 должны быть выполнены в каждом эксперименте. Если эти условия не выполняются, следует повторить эксперимент.
  6. Поглощение необработанных средних управления должна быть выше 0,6, в противном случае следует повторить эксперимент. Если данные удовлетворяют этому требованию, установите значение поглощения управления ткани 100% и рассчитать WST-1 сокращение обработанных образцов ткани контроля.

6. ЛДГ Assay

Примечание: Уровень ЛДГ генотипирования в 96-луночных плита с 100 мкл культуры супернатант в общей сложности после после инкубационного периода.

  1. После инкубации PCLS с или без агентов тестирования взять 50 мкл супернатант из шага 1.16 и перенести его в дубликаты в новую плиту 96-луночных. Это создает дубликаты от каждого лечение хорошо из 24-ну пластины.
  2. Для приготовления рабочего раствора реагента ЛДГ непосредственно перед assay. Рабочий раствор состоит из решения катализатора (лиофилизата растворяют в 1 мл бидистиллированной воде) и краситель решение, поставляемые производителем. Для одного 96-луночных пластины тщательно перемешайте 125 мкл раствора катализатора с 6.25 мл раствора красителя.
    Предупреждение: Не подвергайте решение прямой свет.
  3. Накапайте 50 мкл рабочего раствора в каждый хорошо уже содержащий 50 мкл супернатант и инкубировать пластину для 20 минут RT в темноте. Никаких дальнейших смешивания требуется.
  4. Измерение поглощения каждой скважины в 492 Нм (ссылка: 630 Нм) с использованием Считыватель микропланшетов. Вычесть поглощения в 630 Нм от 492 Нм. Эти значения будут использоваться для расчета в шаге 6.5.
    Примечание: Достоверные данные для цитотоксичность оценки могут быть получены только жизнеспособные ткани. Поглощение управления моющее средство лечение должно быть более 1.
  5. Для анализа установите значение поглощения позитивного управления от шаг 4.1 как 100% и расчета выпуска ЛДГ в обработанных образцах относительно позитивного управления (т.е., максимальный уровень ЛДГ релиз).

7. микроскопические жизнеспособности Assay с конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (cLSM)

Примечание: Для анализа микроскопических жизнеспособности, два из нормальных PCLS 250-мкм толщиной запятнаны в 250 мкл/хорошо 24-ну плиты. Как каждый ломтик отражаться отдельно, без дальнейшего дубликаты не требуется.

  1. После инкубации PCLS с или без элементов теста удалить супернатант или использовать его для измерения цитокинов или других тестов, таких как assay ЛДГ. Используйте остальные ткани для процедуры, описанной здесь.
  2. Подготовьте рабочие разрежения Флуорексон ам и ethidium Антуану 1 (EthD-1) с рабочей концентрации обоих реагентов 4 мкм в культурной среде. Для этой цели добавьте 1 мкл Флуорексон-ам (4 мм) и 2 мкл EthD-1 (2 мм) 997 мкл питательной среды. Этот объем должен пятно 4 скважины с двумя PCLS.
    Примечание: Избегайте воздействия реагентов для прямой свет.
  3. Накапайте 250 мкл рабочего разведения в каждом хорошо и инкубировать 24-ну пластина для 45 мин на RT в темноте. Во время инкубации для обеспечения лучшего воздействия на ткани окрашивание раствора поместите пластину на орбитальный шейкер на 150 об/мин.
  4. После 45 минут отбросить окрашивание раствора и промыть PCLS с 1 мл буферного раствора путем встряхивания на 150 об/мин для 3-5 мин на RT в темноте. Повторите этот шаг два раза.
  5. Применить 500 мкл раствора буфер для каждой скважины, содержащий окрашенных PCLS избежать аутофлюоресценция от питательной среды. Микроскопические оценки выполните по крайней мере два случайно распределенными z стеки с cLSM.
  6. Нажмите на вкладке глазной выбрать 10 X / 0,3 задачи и нажмите на онлайн использовать cLSM как стандартный световой микроскоп, чтобы найти на поверхности PCLS. Нажмите на Offline для выхода из глазной параметр.
  7. Нажмите на вкладку приобретения и включите соответствующие лазеры для флуорофоров.
    Примечание: Мы использовали Аргоновый лазер с длиной волны 488 нм для окрашивания Флуорексон Полианионная (длина волны возбуждения 495 нм) и HeNe лазер с длиной волны 543 Нм для обнаружения комплекса EthD-1/ДНК (длина волны возбуждения 533 Нм). Аргоновый лазер должен обычно работают на 30-50% от максимального тока для включения трубки тока около 5,7 A, как это значительно продлевает срок жизни лазера.
  8. Нажмите на Пути света в закладке приобретение и установите необходимые фильтры и зеркала для эксперимента.
    Примечание: В настоящем исследовании, на основе фильтра использовалась система с главного луча дихроичных разделитель (например., HFT 488/543) отделение света возбуждения и выбросов. Через отражающее зеркало, этот свет направлен на вторичных дихроичных пучка сплиттер (например, NFT 545) далее отдельные излучаемый свет из образца на два канала.
  9. Настройка группы проходят фильтры (например, BP 505-530 Флуорексон сигнала и BP 560-615 для сложного сигнала EthD-1/ДНК), которые передают только определенного диапазона длин волн и назначить Флуорексон канал 2 и EthD-1/ДНК сложный сигнал канала 3.
  10. Установите флажок Z-стеки для задания верхнего и нижнего пределов для микроскопических тома. Нажмите кнопку Live чтобы увидеть на экране просмотра соответствующего слоя. Переместите фокус вверх или вниз, чтобы найти на поверхности PCLS с острым сигнала.
  11. Нажмите на подраздел каналы и установите флажок Показать все. Блокировка таблицы, нажав на кнопку соответствующего канала под «живой» образ и активировать цвет канала.
    Примечание: Синий цвет в «живой» образ будет указано, что нет сигнала, тогда как высокий сигнал появится в белом и переэкспонированными сигнал будет отображаться красным цветом.
  12. Установите обскуры для красного канала EthD-1 1 Эйри подразделению для лучший компромисс между эффективность света сбора и оптических секционирование и соответственно корректировать Флуорексон канала. Увеличение обнаруженного сигнала прибыль, таким образом, что кажется белым, но не красный в live-образ с активированного канала цвета блокировки таблицы.
    Примечание: Мастер выгоды не должна превышать 600 единиц.
  13. Увеличение или уменьшение цифрового смещение для настройки фона, таким образом, что он отображается синим цветом в live-образ с активированного канала цвета блокировки таблицы.
  14. Нажмите на вкладку Z-стек под многомерные приобретения и использовать фокус переход к z уровень интереса. Нажмите Задать первый сохранить эту позицию для последующего приобретения. Медленно фокуса вверх или вниз до тех пор, пока ряд 30 мкм было достигнуто и нажмите Установить последний спасти.
  15. Нажмите на Live еще раз, чтобы отключить live-образ и нажмите на Начать эксперимент , чтобы начать съемки.
    Примечание: Жизнеспособных тканей обнаруживается через флуоресценции Флуорексон Полианионная краситель. Мертвые клетки подвергаются в комплекс формирования EthD-1 и нуклеиновых кислот.

8. изображения

Примечание: Компьютер рекомендации программного рендеринга изображения должны учитываться, как эта программа требует соответствующего оборудования.

  1. Загрузите файл LSM, приобретенных из микроскопических жизнеспособности окрашивание PCLS (см. раздел 7) в программное обеспечение визуализации изображения. Сохраните его как файл .ims перед продолжением. Задать все параметры управления ткани и применить их ко всем изображениям. Дальнейшие изменения разрешены.
  2. Используйте кнопку громкости для поверхности реконструкции жизнеспособных ткани (Флуорексон окрашивание) (дополнительный Рисунок 1A) и кнопку пятна для мертвых клеточных ядер (дополнительная цифра 1 Ч). При отрисовке один канал, отключите другой канал в окне настройки дисплея.
  3. Начните с рендеринга объём жизненно важных тканей: Установите канал поверхности, обработку всего изображения, равным 0,5 мкм гладкий фактор и использовать абсолютной интенсивности для порога (дополнительный Рисунок 1B, C). Нажмите синюю стрелку вперед.
  4. Настройка порога абсолютной интенсивности реконструированный тома; интенсивность шума и фона должны быть вычтены. Поверхности перекрытия отображается в сером и точность поверхности покрытия должны быть проверены (дополнительная цифра 1 d). После завершения перестройки, нажмите синюю стрелку вперед. Большую часть времени этот шаг необходим для расчета параметров. Если программное обеспечение не сможет вычислить объем, увеличить коэффициент гладкой.
  5. На последнем шаге выберите фильтр. Используйте фильтр сферичности (с приблизительно 10 мкм) для визуализации поверхности для фильтрации макрофагов в альвеолярной пространстве (дополнительная цифра 1E). Нажмите на зеленую кнопку вперед.
  6. Оптически настройки вывода изображения и экспорт статистики в XLS-файлы. Общий объем (сумма) будет использоваться для дальнейшего анализа (дополнительная цифра 1F, G). Сохраните настройки и использовать их для всех дальнейших анализов z стеки, принятых в тот же день с теми же настройками cLSM (дополнительная цифра 1I).
  7. Реконструировать красный канал (пятна) для мертвых клеточных ядер. Случайным образом Измерьте размер точка в мкм, масштабирование в окне surpass; Размер точки около 5 мкм. Mark Enable и задайте размер точки. Проверьте все точки обозначены и каждая точка считается только один раз. Корректировать вручную, если требуется (дополнительный Рисунок 1B, H, J). Нажмите синюю стрелку вперед.
  8. Нажмите зеленую кнопку вперед, чтобы позволить программе расчета/количество общее количество точек в соответствии с параметрами набора и экспортировать результат в виде XLS-файла (Дополнительная цифра 1 K, L, M). Для графического или статистического анализа изображения установить количество вычисляемых мертвых клеточных ядер в соотношении к объему жизненно важных тканей.

9. Измерение Cytokines и Chemokines в человека PCLS

Примечание: Цитокинов и хемокиновых иммунный ответ может быть измерена внеклеточно в надосадке культуры и внутриклеточно лизатов ткани после время инкубации. ELISA измеряется в дубликаты в 96-луночных тарелку с 100 мкл/хорошо.

  1. Подготовка в 1% растворе моющего средства путем смешивания 5 мл моющего средства с 495 мл буферного раствора. Раствор может храниться в РТ на несколько месяцев.
  2. Смешайте 1% раствором моющего средства с ингибитором протеазы (PI) в соотношении 1: 500. Требуемая сумма зависит от культуры плита; Например используйте 500 мкл/хорошо для 24-ну пластины. Для одной скважиной смешайте 1 мкл Пи с 499 мкл моющего раствора.
  3. Подготовка трубки с 1 мкл раствора PI и сбор 500 мкл культуры супернатант в этих труб. Сразу же замените средний в пластине 24-ну 500 мкл стиральный раствор, содержащий PI, подготовленную на этапе 9.2. Лизировать ткани за 1 ч, поместив 24-ну пластины в при 4 ° C. Накапайте lysate в новой трубки ткани и хранить эти трубы-80 ° c до дальнейшего анализа.
    Примечание: В протоколе ELISA весьма зависит от производителя и необходимо следовать инструкциям производителя. Стандартный протокол ELISA описан в следующем.
  4. Выполняют ELISA измерить уровни цитокина в супернатанта или lysate согласно инструкциям производителя. Чтобы измерить IL-1α и ФНО α, пальто a96-ну пластины, дозирования 100 мкл антител захвата (для разбавления следовать инструкциям производителя) и Инкубируйте на ночь на RT.
  5. Подготовьте Отмывающий буфер путем растворения Стиральная буфера таблетки в 1 Л бидистиллированной воды. Удаление захвата антитела и пипетки 400 мкл Отмывающий буфер в каждой скважине. Замените этот объем в три раза. Блокировать пластину, добавляя блокирования решения (например, 1% BSA в буферном растворе, согласно инструкции производителя). Инкубируйте на RT 1 ч.
    Примечание: Стандартные коммерчески доступных ELISAs требуют 2 x 100 мкл ткани супернатанта или lysate. Образцы должны быть талой один раз и только перед использованием. В зависимости от чувствительности анализа и на выпущенных цитокина образцы должны быть разбавлен до измерения. Таким образом разбавляют образец в реагента, предоставляемый assay.
  6. Удаление блокирования решения и добавьте разбавленные образцов для стандартной кривой (для разбавления следовать инструкциям производителя) и 100 мкл ткани супернатанта или 100 мкл lysate в дубликаты, собранных в шаге 9.3 ткани. Проинкубируйте втечение 2 ч на RT.
  7. Удаление образцов и пипетки 400 мкл Отмывающий буфер в каждой скважине. Замените этот объем в три раза. Накапайте 100 мкл биотинилированным обнаружения антител (для разбавления следовать инструкциям производителя) и проинкубируйте втечение 2 ч на RT.
  8. Удаление антитела и пипетки 400 мкл Отмывающий буфер в каждой скважине. Замените этот объем в три раза. Добавить 100 мкл/колодец HRP-меченых стрептавидина (для разбавления следовать инструкциям производителя) и проинкубируйте втечение 20 мин на RT (Проверьте инструкции производителя).
  9. Удаление стрептавидина и пипетки 400 мкл Отмывающий буфер в каждой скважине. Замените этот объем в три раза.
  10. 100 мкл субстрата (рекомендованный производителем) и проинкубируйте втечение 20 мин в темноте (Проверьте инструкции производителя).
    Примечание: Этот шаг светочувствительной. Избегайте воздействия света субстрат и пластины.
  11. Остановить реакции, добавляя 50 мкл стоп раствор (1 М H2т-4). Измерение поглощения каждой скважины на 450 Нм (ссылка: 570 Нм) с использованием Считыватель микропланшетов. Вычесть поглощения в 570 Нм от 450 Нм.
    Примечание: Лечить или автомобиль ткани контроля служат негативный контроль. Чтобы побудить иммунную реакцию в легочной ткани, используйте соответствующие стимуляция (например, 100 нг/мл липополисахарида (LPS)) как позитивный элемент управления. Инкубировать две скважины с двумя ПЛК в колодец с 100 нг/мл LPS в культурной среде, например, за 24 часа и собирать супернатант и lysate, как описано в шаге 9.3 ткани.
    Примечание: Результаты измерений принимаются, если поглощение наивысший стандарт равна или выше 1.0; в противном случае измерение необходимо повторить. Калибровочной кривой должны следовать кривой сигмоид доза ответ.
  12. Концентрации цитокинов (pg) определяется ELISA в шаге 9.11 нормализуются для общего белка содержание определяется в lysate каждого образца ткани (см. раздел 10).

10. Измерение содержание общего белка в человека PCLS

Примечание: PCLS должны анализироваться для измерения концентрации общего белка. Лизатов ткани из шага 9.3 используются для этого шага. Генотипирования в плита плоская 96-луночных с 25 мкл/хорошо ткани lysate, накапаны в дубликаты.

  1. Подготовка стандарта BSA 7-точка с БСА концентрации 2000 мкг/мл, 1500 мкг/мл, 1000 мкг/мл, 750 мкг/мл, 500 мкг/мл, 250 мкг/мл и 125 мкг/мл. Применить 25 мкл в дубликаты каждого стандарта и использовать 25 мкл буфера решение как пропуск на 96-луночных пластине (использование тарелка с крышкой пластины).
  2. Накапайте 25 мкл лизатов (см. шаг 9.3) от каждой скважины дубликаты в 96-луночных плиту. В общей сложности 50 мкл каждого хорошо не требуется. Подготовка рабочего реагента BCA решения путем разбавления BCA реагент Б 1:50 в BCA реагент а. Для 96-луночных пластина использовать 400 мкл Реагента B и 20 000 мкл Реагента а.
  3. Тщательно накапайте 200 мкл рабочего реагента в каждой скважине, избегая пузырьков воздуха. Место пластину на орбитальный шейкер (150 об/мин) для 30 s для обеспечения надлежащего смешивания лизатов и рабочего реагента и положить покрытие на тарелку. Инкубируйте пластины при 37 ° C на 30 мин в темноте. Измерение поглощения каждой скважины на 540-590 нм, используя Считыватель микропланшетов.
    Примечание: Результаты измерений принимаются, если поглощение наивысший стандарт BSA равна или выше 0,8; в противном случае измерение необходимо повторить. Калибровочной кривой должны следовать кривой сигмоид доза ответ.
  4. Для анализа расчет калибровочной кривой с помощью Марквардт уравнение 4-параметр после вычитания заготовки. Рассчитайте концентрацию белка неизвестных образцов с использованием стандартной кривой.

Representative Results

С нынешнего метода исследования человеческие PCLS были подготовлены и воздействию концентраций пяти промышленных веществ оценить химически индуцированных иммуномодулирующие эффекты в человеческих легких материалов. Легочной ткани была разоблачена в подводных условиях как постоянные культуры за 24 ч. токсичность оценивалась путем измерения выпустила ЛДГ, митохондриальной активности и окрашивание микроскопических жизнеспособности. Кроме того содержание общего белка для нормализации и провоспалительных цитокинов были измерены. Всякий раз, когда это возможно, тормозящий концентрации (IC) 75 значения были рассчитаны по нелинейной сигмоид кривой. Положительные эталонные вещества, стиральный порошок для цитотоксичности и LPS врожденной цитокинового ответа, были использованы для проверки каждого прогона. Логарифмически преобразованные IC75 [мкм] значения (журнал IC50) были использованы в качестве «раздражитель» концентрации для последующих cytokine выпуске измерений.

Рисунок 1 и на рисунке 2 показана процедура заполнения человеческих легких материалов и образцовое H & E окрашивание человеческого PCLS. Рутинной гигиенические процедуры должны следовать, чтобы избежать негативных последствий для здоровья и обеспечения безопасности персонала, обработка материала легкое человека. Этот метод требует практика и обучение персонала. Опытный патологоанатомов, которые отличают различных регионов (верхний/нижний лопастями и subpleural против более центральный) и больной против здорового областям необходимо оценить состояние патологического материала, легкое человека. Сгенерированный человека PCLS следует использовать для приготовления H & E-окрашенных тонких секций, которые могут повторно оценивается Патологоанатом. Эта процедура помогает пользователям получить практику дискриминации различных больной областях и местах в легких.

Рисунок 3 представлены результаты измерений для активности ЛДГ и WST-1 в человека PCLS после 24 ч инкубации с SLS. Неочищенные средних без SLS, показано на 0 мкг/мл SLS, является важным качества управления. Значения должны быть ниже 20% для ЛДГ по сравнению с моющим средством лизированы ткани и > 0.7 единиц оптической плотности для assay WST-1. Эти качества управления также служат в качестве индикаторов недостаточно ткани жизнеспособности. Реакции тканей человека к моющим, как эффективного токсичное вещество, должны быть включены в качестве позитивного элемента управления. Это должно привести к увеличению на 300-500% (> 2.0 единиц оптической плотности) из ЛДГ, по сравнению с необработанной ткани и значений < 0,1 единиц оптической плотности для assay WST-1. SLS привело дозозависимое снижение жизнеспособности клеток как измеряется увеличением ЛДГ и снижение метаболической активности в assay WST-1 в концентрациях > 87 мкг/мл. Модель сигмовидной концентрации ответ был установлен в данных, так что это можно рассчитать значения IC75 или IC50. Эти значения могут впоследствии использоваться для выбора концентрации цитокинов и хемокиновых уровней: в высоко токсичных концентрациях, обычно нет или только уменьшилось цитокинов и chemokines могут быть обнаружены. Таким образом рекомендуется нетоксичные или только слегка токсические концентрации (IC75). Важно отметить здесь, что ожидаемое увеличение активности ЛДГ в клеточной культуре супернатанта часто влиянием прикладного вещество21. Часто вмешательства происходят между существа деятельности ферментов, приводит к неправильной интерпретации результатов если ЛДГ assay был единственным цитотоксичность assay используется. Таким образом это важно и необходимо выполнить несколько цитотоксичность анализов для получения надежных и допустимые результаты. Кроме того следует отметить, что чувствительность анализов ЛДГ и WST-1 весьма сопоставима.

На рисунке 4микроскопические жизнеспособности изображения PCLS продемонстрировать реакции тканей человека для моющих средств как эффективной токсичное вещество. Результаты очень полезны для подтверждения данных других жизнеспособность, но это требует дополнительного оборудования. Токсические эффекты визуально оцениваются оценки Флуорексон инфицированных тканей по сравнению с EthD-1-инфицированных клеточных ядер. Случайно выбранных сегментов в паренхиме вообще привести сопоставимых данных, тогда как следует избегать airways или кровеносных сосудов, как большие полости может перенести результаты. Из нашего опыта и микроскопические параметры, описанные выше измеряется средний объем между 1,5 х 106 и 5 x 10-6 мкм3 управления ткани. Значения зависят от качества материала легких, PCLS качества и также болезни легких тканей донора. Даже несмотря на то, что жизнеспособность человека легочной ткани варьируется среди доноров, количество ядер мертвых клеток, по сравнению с жизнеспособным ткани не должна превышать 15% ткани элемента управления. Если мертвые клеточных ядер преимущественно присутствуют в элементе ткани, однако, эксперимент следует отказаться.

Рисунок 5 показывает репрезентативных данных для иммуномодулирующий эффект HClPt и SLS на человека легочной ткани. Провоспалительных цитокинов IL-1α и ФНО α, Биомаркеры воспаления, указывающий начало воспалительных процессов после воздействия стимулирующие вещества. Обе цитокинов были измерены по ELISA. Внеклеточные IL-1α обычно низка в человека PCLS, тогда как внутриклеточных IL-1α достигает уровня 1000 пг/мл и выше. Снижение внутриклеточного IL-1α указывает цитотоксических происходящего - и главным образом наблюдается после воздействия на человека PCLS химических веществ. Если ткань стимулируется с ПЛАСТИНОК, активатор врожденной иммунной системы и таким образом позитивные лечения контроль, то большая часть индуцированных IL-1α могут быть обнаружены только внутриклеточно после 24 ч. В отличие от этого ФНО α секрецию индуцированных LPS стимуляции может быть измерена главным образом внеклеточно. Использование подходящих позитивных элемента управления, например LPS, демонстрирует действенность метода. С нынешнего метода исследования человеческие PCLS были подвержены три концентрации HClPt (32 и 64, 125 мкг/мл) или две концентрации SLS (1 и 10 мкг/мл) для 24 h. цитокина, секрецию был определен как сумма внеклеточные и внутриклеточных цитокинов нормализации концентрации общего белка, как изображено на рисунке 5. Стоит отметить здесь, что BCA assay обычно используется для определения содержания общего белка, однако, он также отражает вещество индуцированной цитотоксичности. Следовательно при высоко токсичных концентрациях содержание общего белка не может использоваться для нормализации цитокинового данных. Секреции IL-1α увеличено значительно от 263 ± 38 ПГ/мг 887 ± 216 ПГ/мг и ФНО α от 263 ± 38 ПГ/мг до 1160 ± 286 ПГ/мг (рис. 5A, B). Кроме того LPS-индуцированной секреции IL-1α и ФНО α представлен по сравнению с элементом управления кератоз ткани. Индукция провоспалительных цитокинов, патоген связанные молекулярные модели, как ЛПС, демонстрирует действенность метода и настоятельно рекомендуется для использования при работе с человеческой PCLS расследовать иммуномодулирующих эффектов. Для более подробной информации о HClPt и SLS данных пожалуйста, обратитесь к исследованию, Lauenstein et al. 21

Figure 1
Рисунок 1 : Процедура для наполнителя легкое человека. Легкое человека готовится сразу же после резекции. Легких должны храниться при комнатной температуре для последовательного заполнения с агарозы и избежать внезапного агарозы полимеризации при наполнении. Легких располагается горизонтально, с лопастями разложить для оптимального представления на главного бронха или бронхов (A & B для крупным планом на бронхов). Бронхи канюлированной с гибкой силиконовые трубки и исправлена зажимы (C). После заполнения процедуры и агарозы полимеризации в ткани подготовленных патологоанатомов нарезать ломтиками в около 3-5 см толщиной (D) легких. Из этих кусочков ядер цилиндрических ткани (Ø например, 8 мм) готовятся с инструментом керна (E). Эти ткани ядер вырезать с срез ткани в PCLS, который сразу же передаются в средне заполнены чашки Петри для инкубации в условиях нормальной клеточной культуры (E). После нескольких шагов Стиральная PCLS передаются в плиты культуры клеток (например, 24-ну пластина с двумя PCLS на хорошо и 500 мкл среднего) для удаления остатков клеток мусора и выпустила клеточных медиаторов (F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Определение состояния здоровья человека PCLS от H & E пятнать. PCLS в этот образ, подготовленных от донора с опухолью легких показывает нетронутыми легочной ткани с альвеолярной паренхимы, периферических airways (*) и кровеносных сосудов (стрелок) в обзоре (A). На увеличение проведение airways с нетронутыми мерцательного дыхательных эпителия (стрелок) (B), нетронутыми альвеолярной структуры, выстроились с жизнеспособным инфицированию, включая капилляр с многочисленными эритроцитов (стрелок) (C), альвеолярный пространств, содержащих альвеолярных макрофагов (CD68 иммуногистохимия) (D), а также кровеносных сосудов с нетронутыми эндотелия (CD31 иммуногистохимии) (E) может наблюдаться. Только бесплатно опухоль ткани был использован для PCLS, поэтому не макроскопически пораженной области являются видимыми. В отличие от PCLS, подготовленных от доноров с другими заболеваниями легких, таких как эмфизема или фиброза, альвеолярной структуры не нарушается и PCLS только немного изношен на внешней границе, скорее всего, из-за действия по подготовке. Шкала индикатора указывают 1000 мкм (A) и 50 мкм (EB), соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Определение цитотоксичности, индуцированных SLS в человека PCLS, измеряется утечки фермента ЛДГ в питательной среды (A) и потеря активности метаболических ферментов, оценены с красителем WST-1 (B). Человеческого PCLS были подвержены повышения концентрации SLS. Модель сигмовидной концентрации ответ впоследствии был установлен к данным, таким образом, чтобы значения IC75 или IC50 (ингибирующее концентрация на 25% и 50% снижение жизнеспособности клеток) может быть вычисляемых (справа цифры). Данные представлены как означает ± SEM, n = 3-5. Абсорбция ЛДГ пробирного измерялась в 492 Нм (ссылка на 630 Нм) и пробирного WST-1 на 450 Нм (ссылка на 630 Нм). Данные были адаптированы и изменены с Lauenstein и др. 21 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Представитель изображений трехмерных микроскопических окрашивание и изображение рендеринга человеческого PCLS. Живой ткани контроля и гибкости ткани с моющим средством, как эффективного токсичное вещество, отображаются после окрашивания человека PCLS с Флуорексон AM (желтый) и EthD-1 (красный). Стеки 30 мкм были приняты с 10 X цели (A) и (B) к просмотру. Линейки шкалы указывает 100 µm. возбуждения волны 488 нм и 543 Нм, выбросов фильтры BP 505-550 Нм и LP 560 Нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5 : Гексахлороплатинат аммония (HClPt)-индуцированной секреции IL-1α и ФНО α в человека PCLS после 24 ч пребывания. PCLS были подвержены три концентрации (32 мкг/мл, 64 мкг/мл и 125 мкг/мл HClPt) и две разные концентрации (1 мкг/мл и 10 мкг/мл) SLS. Внеклеточные и внутриклеточных IL-1α (A), так и ФНО α (B) были определены ELISA и нормализуется содержание общего белка. Чтобы показать действительность метода положительный активатором иммунной системы, LPS, показано, как ссылку для внутриклеточного IL-1α (A) и внеклеточной ФНО α (B) релиз, нормализуется содержание общего белка. Данные представлены как означает ± SEM, *p < 0,05 и ***p < 0,001; HClPt и SLS: n = 9, IL-1αПЛАСТИНОК: n = 5, ФНО αПЛАСТИНОК: n = 4 в технических дубликаты (тест Манна-Уитни). Эта цифра была изменена от Lauenstein и др. 21 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Supplementary Figure 1
Дополнительный рисунок 1: подробные вычислительной обработки изображений микроскопических окрашивание с помощью рендеринга программного обеспечения жизнеспособности. Шаг за шагом процедура для анализа изображений загруженных изображений LSM поверхности отрисовки Флуорексон окрашенных жизнеспособных ткани (AГ, я) и месте обнаружения ethidium Антуану окрашенных клеточных ядер (H, JМ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Supplementary Figure 2
Дополнительный рисунок 2: обзор анализа вычислительных изображений окрашивание микроскопических жизнеспособности человека легочной ткани. Жизнеспособные ткани (желтый) был проанализирован поверхности отрисовки (Bя) и мертвых клеточных ядер (красный) были обнаружены в месте обнаружения (PJ). Режим моментального снимка был использован для экспорта изображения (Q). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Человеческого PCLS техника хорошо известна в нашей лаборатории. В настоящем докладе дается описание этой техники и его использования для проверки токсичности веществ в легких тканей ex vivo. В общем любой лаборатории, используя эту технику следует стремиться создать assay связанные определения количественных квот, оценки изменчивости и контроль качества, гарантирующих обоснованность эксперимента. Возможные стандартные процедуры могут быть, например, чтобы повторить каждой конечной точки, например, цитотоксичность assay, как минимум три биологических доноров (отдельные прогоны) с как минимум два-три технических реплицирует за образец, включая положительные и негативных упоминаний. Персонал лаборатории должны пройти подготовку для повышения согласованности пробирного и свести к минимуму анализа изменчивости.

Конечные точки, часто используется для оценки иммуномодулирующих эффектов веществ на ткани легких включают цитотоксичность измерения с использованием различных анализов (например, ЛДГ пробирного, пробирного WST-1, микроскопические пятнать пробирного), релиз цитокинов assays, а также как изменения в профиле выражение и характеристика изменений в клеточных популяций, immunohistopathological методы6. Кроме того, существуют методы, описывающие визуализации ячеек, например легочной дендритные клетки, в мышиных PCLS28 , который также может быть передан человеческого PCLS и таким образом может обеспечить более подробное понимание клеточного состава до и После лечения с предполагаемым цитотоксических веществ.

Это основной протокол и технику для подготовки разделов ткани легкое человека сопоставима с методами, которые были хорошо описана в публикации29. Короче говоря орган материал получается из пациентов, страдающих от жить угрожая хронических заболеваний, таких как рак легких, которые должны пройти операцию резекции или трансплантации. Исследования должны быть одобрены Комитетом местных этики. Обоснованное письменное согласие пациентов не требуется. Настройка рабочего процесса между клиники и лаборатории является критическим вопросом и требует общения и определения интерфейсов и инфраструктуры между обоих сайтов. Легкое человека материал должен быть обработан непосредственно после резекции для сохранения жизнеспособности тканей. Стоит отметить, что метод, описанный здесь для человека PCLS может применяться для молодых и старых легкие и здоровые и больные легкие. Например, в США, можно получить от доноров здорового органа, который умер в результате несчастных случаев или были отклонены которого органы для трансплантации легких.

Первым важным шагом в протоколе является инфляция airways и окружающие паренхимы раствором агарозы. Этот шаг необходим для закрепления очень мягких тканей для последующей нарезки процедуры. Качество материала легкое человека, основанный на фоне болезни, имеет решающее значение здесь. Можно заполнить только лопастями с нетронутыми плевры. Терминальная стадия опухоли вблизи бронха иногда предотвратить процесс наполнения. Прежде чем надувать человеческого материала, температура раствора агарозы должен быть тщательно проверены. Слишком много крови (или других жидкостей, экссудата) внутри человека легочной ткани приведет к нежелательным разрежения агарозы и будет влиять на процесс полимеризации. После инфляции легочной ткани и гелеобразующего агарозы на льду легкие нарезать секции толщиной 200-300 микрон. Последовательность ткани является очень важным вопросом. Если ткань является слишком мягким, нарезки из равных частей трудно. Даже если же микротом параметры задаются для каждого донора, Толщина ломтика между донорами могут различаться, из-за индивидуальных условий и изменения во время накачивания процесс для каждого легкого. Неоднородное наполнения тканей приведет к толщины различных фрагментов. Вместо измерения и стандартизации Толщина ломтика, измерение содержания общего белка может использоваться косвенно контролировать толщины срез легких. Несколько терминальная стадия заболевания препятствуют процесс нарезки; например, крови, которую судов крайне утолщена в легочной гипертензии и фиброзных тканей может быть настолько жесткой, что нарезка ткани цилиндров вряд ли возможно и ножа микротома необходимо заменить очень часто.

После подготовки человека PCLS и интенсивной стирки шаги, которые необходимы для удаления мусора клеток и выпустили энзимов, ткани, разделы могут быть использованы для экспериментов29. Человеческого PCLS культивировали в условиях нормальной клеточной культуры и воздействию, например, химических веществ, наркотиков или липополисахаридов. Случайные загрязнения PCLS из-за инфекции (неизвестных) является Специальный выпуск в культуре человеческих легких материалов. Должно быть отброшено культур тканей, показаны инфекций и оборудование должны быть тщательно дезинфицируются. С другой стороны пространственное разделение между Лаборатория места, используемые для приготовления, с одной стороны и культивирование может помочь избежать кросс инфекции. Что касается оборудования микротома могут привести к утечке и шестнадцатеричный незатянутых винтов может привести к повреждения двигателя и остановки движения лезвия. Не каждая часть среза изготовлена из нержавеющей стали, и поэтому он будет окисляются если не высушить немедленно изменить очистки. Для преодоления проблем оборудования, это может быть необходимо иметь по крайней мере одно устройство резервного копирования.

В предыдущих публикациях агарозы сообщать быть вымываются и удалены во время интенсивной стирки шаги после подготовки. В самом деле это не возможно, не могут быть удалены агарозы. Для полного удаления агарозы он должен быть повторно расплавленный при высоких температурах, которые бы уничтожить ткани. Агарозы в альвеолы и airways не вмешиваться с описанных конечных точек. Другие конечные точки может быть под влиянием присутствия агарозы (см. также ограничения). Необходимость в подготовке разделов очень свежие ткани должен подчеркнуть, как жизнеспособность тканей является критическим вопросом в культуре. Бронхоспазма не является допустимым параметром для жизнеспособности. Мы рекомендуем использовать по крайней мере два или три независимых цитотоксичность анализов для проверки жизнеспособности окружающей паренхимы; Это должно проверяться каждый эксперимент30. Контроль качества в цитотоксичности анализов служат в качестве индикаторов недостаточно ткани жизнеспособности. Поэтому рекомендуется оценить реакцию ткани, например, для эффективной токсичное вещество как моющее средство в всех анализов цитотоксичности. Основываясь на доза реакция кривых, минимальные и максимальные значения поглощения должны быть определены для анализов цитотоксичности и встретились для последующих экспериментов. Дальнейшие модификации протокола главным образом зависит от применяемых химических веществ и конечные точки интереса. Применимость нерастворимых или высокой реакционной способностью химических веществ является ограниченной. Самая высокая концентрация растворителей для ДМСО ограничивается 1%. Более высокие концентрации могут быть использованы, но может привести к выраженной выпуска провоспалительных цитокинов, таких как ИЛ-8. С другой стороны используемые стимул может быть относительно слабой. В этом случае количество ткани может быть увеличено с двух до 4 ломтика в колодец. Этот подход ограничивает жизнеспособность до 24 ч.

Одним из основных ограничений человека PCLS является, что в Германии они могут только быть подготовлены от больного человека легкого материала. Пациенты проходят операции обычно старше 50 лет и 80% больных, страдающих от рака легких, или использоваться для курильщиков. Лечение пациентов, например, глюкокортикоидов, может также повлиять на исход экспериментов с использованием тканей человека. Таким образом, важно, чтобы: i) положительные отзывы, проверки жизнеспособности, функциональность и чувствительность отдельных тканей для проверки каждого эксперимента и ii) кросс проверить результаты, используя здоровым, не больной, среднего возраста легочной ткани от лабораторных животных (нечеловеческих приматов как cynomolgus и, если возможно, мышь, крысы, морских свинок). Чем лучше оценка патологии пораженной ткани, тем лучше экспериментальных результатов. Сильно пораженные ткани вряд ли могут быть использованы, и очень часто показывает ограниченный жизнеспособности, уровни цитокина неадекватно низкой или очень высокой, бактериальной или грибковой инфекции и меньше бронхоспазма. Доноров и доноров вариации выше по сравнению с результатами, полученными от лабораторных животных, отражающие Индивидуальная изменчивость людей. Это, однако, не является ограничением в целом; Как упоминалось выше, в других странах (например, США), это можно получить Здоровые легкие от умерших доноров отклонил для трансплантации. Реакции ткани была хорошо описана для первого до 48 h в экспериментах острого воздействия. Жизнеспособность и функциональность ткани уменьшается после многих дней культуры или после хранения при температуре-80 ° C. Это позволяет культуры человека легочной ткани для до около 14 дней. Жизнеспособность продолжается в течение этого времени; Однако наблюдается увеличение изменчивости, а также к потере функциональности несколько клеточных популяций, такие как макрофаги, в ткани, что приводит к ограниченной cytokine выпуске в ответ на митогены. Еще одно ограничение для некоторых конечных точек является наличие агарозы в ткани, препятствуя, например, изоляцию высокого качества и достаточного количества РНК31 или подготовка одного клеточной суспензии для последующих проточной цитометрии и фенотипирование клеток. Таким образом ограничена возможность получить механистический понимание ответы одноклеточных и функциональность.

Модели organotypic ткани, такие как человеческого PCLS, считаются иметь большое влияние на основные и доклинических исследований. Легкое человека материал имеет биологические состав, который точно отражает обычный орган архитектуры. Он содержит, например, жилой альвеол и бронхиальной эпителиальных клеток, гладких мышечных клеток, фибробластов, эндотелиальные клетки, нервных волокон и макрофагов. Ткань является жизнеспособным и клетки реагируют на несколько раздражителей. Нервные волокна, хотя вырезать, может быть локально активирован, ведущих к терминал рефлекторные реакции14. Следовательно эта модель ex vivo предлагает возможность учиться сотовой innate иммунных реакций, обороны ответы, цитокин сигнализации и индукции клетки поверхностных маркеров. Некоторые улучшения в технике, культивирования и проверки конечных точек позволяют использовать человека PCLS в поступательного науки. Примеры будущих подходов: i) проверка новых целей в человека легочной ткани, ii) оценки иммунного ответа после воздействия, например, химических веществ, наркотиков, наночастицы, и т.д., iii) добавок легочной ткани с иммунных клеток, такие как Т-лимфоциты, iv) идентификация и изменения молекулярной структуры, например, после воздействия дыхательной сенсибилизаторов, вещества, вызывающие заболевания или активных соединений, ингибирующих путей; Кроме того, v) дыхательных путей реконструкции и vi) нейронов правила32. Области науки заинтересована в этих нынешних и будущих подходах с PCLS. Кроме того существует целый ряд различных событий, которые помогут улучшить технику PCLS, например, крио сохранение20и33 имитировать естественное движение ткани во время дыхания или механического растяжения тканей вентиляции.

Основным преимуществом человеческого PCLS, по сравнению с другими 3D модели является наличие иммунных клеток и нервных волокон. Может также быть эксперименты в мышь и крыса, нечеловеческих приматов, которые являются видов животных, которые по-прежнему чаще всего используются в фармакологии и токсикологии. Сложность человеческого легочной ткани поддерживает перевод результатов от животного к человеку и в пробирке в естественных условиях. В контексте существующих альтернативных анализов для выявления дыхательных сенсибилизаторов человеческие PCLS являются очень сложными и не позволяют взглянуть на одну ячейку ответы. Тем не менее микроскопии и потока цитометрии может дать информацию о клеточных реакций, если право сотовой маркер используется в комбинации, например, апоптоз, некроз или внутриклеточных маркеров. Есть опубликованных анализов, которые были проверены и сообщениям, были использованы для определения дыхательных сенсибилизаторов. Однако прогресс в использовании PCLS со всеми их преимуществами над одной-клеток вносит ценный вклад в том смысле, что этот метод может использоваться для высокопроизводительного скрининга, как описано в Watson et al. 34 они разработали высокопроизводительного скрининга пробирного предсказать сократимость токсичности в мышиных крио сохранить PCLS. С их миниатюрных 96-луночных PCLS формате они обнаружены аналогичные надписи в мышиных промывание жидкости, делая возможным пробирного высок объём PCLS.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать. Fraunhofer элемент является независимая общественная некоммерческая исследовательская организация прикладных исследований, выполнения контрактных исследований имени индустрии биотехнологии, фармацевтической, химической и косметики. Финансирование Института приходит от национальных и международных государственных проектов.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить Lan Lauenstein для ее предварительной работы относительно альтернативных стратегий тестирования для оценки риска с человеческой PCLS. Некоторые из исследований было поддержано гранта от Европейской Комиссии в течение 6й Рамочной программе SENS-IT-IV «Роман тестирование стратегии In Vitro оценки аллергенов».

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon hose 3.0 x 5.0 mm A. Hartenstein (Leipzig, Germany) SS04
Syringe Faust Lab Science (Klettgau, Germany) 9.410 050
Coring tools custom-made custom-made
Trimming Blade Handle (FEATHER) pfm medical ag  (Cologne, Germany) 205530001
Trimming Blades (FEATHER) pfm medical ag  (Cologne, Germany) 205500000
Microtome: Tissue Slicer Alabama R&D (Bad Homburg, Germany) 303400-ADPT Krumdieck Tissue Slicer (MD6000)
Microtome blade Wilkinson Sword (Solingen, Germany) ENR-4027800011506
Tissue culture dishes Sigma (München, Germany) Z666246-420EA
Cell strainer filter (100 µm Nylon) Becton Dickinson (Heidelberg, Germany) BD352360
Inoculation loop Copan Diagnostics (Murrieta, USA)  CD176S01
TPP Tissue culture plates 24wells Sigma (München, Germany) Z707791-126EA
Cassette Thermo Scientific (Schwerte, Germany) 1000957
Nunc MaxiSorp flat-bottom Fisher Scientific GmbH (Hannover, Germany) 44-2404-21
Nunc MicroWell 96-Well  Thermo Scientific (Schwerte, Germany) 260836
Confocal Microscope Zeiss (Jena, Germany) Confocal LSM Meta 510
Image rendering software Bitplane AG (Zürich, Switzerland) IMARIS 7.6
LSM Image Browser Zeiss (Jena, Germany)
Multiwell-Reader Tecan Group Ltd. (Männedorf, Switzerland) Tecan infinite F200Pro Plate Reader
Plate shaker Edmund Buehler GmbH (Hechingen, Germany) KM-2 Akku
BenchMark ULTRA Ventana Medical Systems (Tucson, USA) Automated IHC/ISH slide staining system
Assays
Cell Proliferation Reagent WST-1 Roche (Basel, Switzerland) 11644807001
Cytotoxicity Detection Kit (LDH) Roche (Basel, Switzerland) 11644793001
Microscopical vitality staining  Invitrogen (Carlsbad, USA) L-3224 LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit
BCA Protein Assay Thermo Scientific (Schwerte, Germany) 23225
ELISA assay kit R & D systems various, e.g. DY210 (TNF-α) or DY200 (IL-1α) DuoSet
Reagents
Agarose, low gelling temperature  Sigma (München, Germany) A9414-100G
Balanced Salt Mixtures and Solutions, Cell Culture, Classic Media and Salts, Earle’s Balanced Salts (EBSS) Sigma (München, Germany) E2888-500ML
Penicillin and streptomycin Lonza (Verviers, Belgium) 17-602E
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM F-12) Gibco (Darmstadt, Germany) 11039-047 Culture medium
Dulbecco´s Phosphate with Ca and Mg (DPBS) Lonza (Verviers, Belgium) BE17-513F   Buffer solution
Albumin from bovine serum (BSA) Sigma (München, Germany) A9647-500G
Detergent Sigma (Saint Louis, USA) X100-100ML Triton X-100
Washing buffer Merck (Darmstadt Germany) 524653  0.05% Tween 20 in PBS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. D'Amato, G., et al. Climate change, air pollution and extreme events leading to increasing prevalence of allergic respiratory diseases. Multidiscip Respir Med. 8, (1), 12 (2013).
  2. Pawankar, R., et al. State of world allergy report 2008: allergy and chronic respiratory diseases. World Allergy Organ J. 1, (6), Suppl 4-17 (2008).
  3. Hartung, T., Daston, G. Are in vitro tests suitable for regulatory use. Toxicol Sci. 111, (2), 233-237 (2009).
  4. Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, (7252), 208-212 (2009).
  5. Balls, M., Straughan, D. W. The three Rs of Russell & Burch and the testing of biological products. Dev Biol Stand. 86, 11-18 (1996).
  6. Sewald, K., Braun, A. Assessment of immunotoxicity using precision-cut tissue slices. Xenobiotica. 43, (1), 84-97 (2013).
  7. Fisher, R. L., et al. The use of human lung slices in toxicology. Hum Exp Toxicol. 13, (7), 466-471 (1994).
  8. Ressmeyer, A. R., et al. Characterisation of guinea pig precision-cut lung slices: comparison with human tissues. Eur Respir J. 28, (3), 603-611 (2006).
  9. Donovan, C., et al. Rosiglitazone elicits in vitro relaxation in airways and precision cut lung slices from a mouse model of chronic allergic airways disease. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 309, (10), 1219-1228 (2015).
  10. Koziol-White, C. J., et al. Inhibition of spleen tyrosine kinase attenuates IgE-mediated airway contraction and mediator release in human precision cut lung slices. British journal of pharmacology. 173, (21), 3080-3087 (2016).
  11. Paddenberg, R., Mermer, P., Goldenberg, A., Kummer, W. Videomorphometric analysis of hypoxic pulmonary vasoconstriction of intra-pulmonary arteries using murine precision cut lung slices. J Vis Exp. (83), e50970 (2014).
  12. Lamb, D. J., et al. Bl 1002494, a Novel Potent and Selective Oral Spleen Tyrosine Kinase Inhibitor, Displays Differential Potency in Human Basophils and B Cells. J Pharmacol Exp Ther. 357, (3), 554-561 (2016).
  13. Leus, N. G., et al. HDAC 3-selective inhibitor RGFP966 demonstrates anti-inflammatory properties in RAW 264.7 macrophages and mouse precision-cut lung slices by attenuating NF-kappaB p65 transcriptional activity. Biochem Pharmacol. 108, 58-74 (2016).
  14. Schleputz, M., et al. Neurally mediated airway constriction in human and other species: a comparative study using precision-cut lung slices (PCLS). PLoS One. 7, (10), 47344 (2012).
  15. Hess, A., et al. Prevalidation of the ex-vivo model PCLS for prediction of respiratory toxicity. Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 32, 347-361 (2016).
  16. Bergner, A., Sanderson, M. J. Acetylcholine-induced calcium signaling and contraction of airway smooth muscle cells in lung slices. J Gen Physiol. 119, (2), 187-198 (2002).
  17. Wohlsen, A., et al. The early allergic response in small airways of human precision-cut lung slices. Eur Respir J. 21, (6), 1024-1032 (2003).
  18. Wu, W., et al. Innate immune response to H3N2 and H1N1 influenza virus infection in a human lung organ culture model. Virology. 396, (2), 178-188 (2010).
  19. Zmora, P., et al. Non-human primate orthologues of TMPRSS2 cleave and activate the influenza virus hemagglutinin. PLoS One. 12, (5), 0176597 (2017).
  20. Rosner, S. R., et al. Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation. Am J Respir Cell Mol Biol. 50, (5), 876-881 (2014).
  21. Lauenstein, L., et al. Assessment of immunotoxicity induced by chemicals in human precision-cut lung slices (PCLS). Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 28, (4), 588-599 (2014).
  22. Wild, L. G., Lopez, M. Occupational asthma caused by high-molecular-weight substances. Immunol Allergy Clin North Am. 23, (2), 235-250 (2003).
  23. Di Stefano, F., et al. Occupational asthma due to low molecular weight agents. Int J Immunopathol Pharmacol. 17, (2), Suppl 77-82 (2004).
  24. Buonsante, V. A., Muilerman, H., Santos, T., Robinson, C., Tweedale, A. C. Risk assessment's insensitive toxicity testing may cause it to fail. Environ Res. 135, 139-147 (2014).
  25. Boverhof, D. R., et al. Respiratory sensitization and allergy: current research approaches and needs. Toxicol Appl Pharmacol. 226, (1), 1-13 (2008).
  26. Johansson, H., Albrekt, A. S., Borrebaeck, C. A., Lindstedt, M. The GARD assay for assessment of chemical skin sensitizers. Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 27, (3), 1163-1169 (2013).
  27. Brismar, H., Patwardhan, A., Jaremko, G., Nyengaard, J. Thickness estimation of fluorescent sections using a CSLM. Journal of Microscopy. 184, (2), 106-116 (1996).
  28. Lyons-Cohen, M. R., Thomas, S. Y., Cook, D. N., Nakano, H. Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells. J Vis Exp. (122), (2017).
  29. Switalla, S., et al. Natural innate cytokine response to immunomodulators and adjuvants in human precision-cut lung slices. Toxicol Appl Pharmacol. 246, (3), 107-115 (2010).
  30. Henjakovic, M., et al. Ex vivo testing of immune responses in precision-cut lung slices. Toxicol Appl Pharmacol. 231, (1), 68-76 (2008).
  31. Niehof, M., et al. RNA isolation from precision-cut lung slices (PCLS) from different species. BMC Res Notes. 10, (1), 121 (2017).
  32. De Proost, I., et al. Purinergic signaling in the pulmonary neuroepithelial body microenvironment unraveled by live cell imaging. FASEB J. 23, (4), 1153-1160 (2009).
  33. Davidovich, N., Chhour, P., Margulies, S. S. Uses of Remnant Human Lung Tissue for Mechanical Stretch Studies. Cell Mol Bioeng. 6, (2), 175-182 (2013).
  34. Watson, C. Y., et al. Screening for Chemical Toxicity Using Cryopreserved Precision Cut Lung Slices. Toxicol Sci. 150, (1), 225-233 (2016).
Оценка цитотоксических и иммуномодулирующих эффектов веществ в легкое человека точности cut ломтики
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Neuhaus, V., Danov, O., Konzok, S., Obernolte, H., Dehmel, S., Braubach, P., Jonigk, D., Fieguth, H. G., Zardo, P., Warnecke, G., Martin, C., Braun, A., Sewald, K. Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices. J. Vis. Exp. (135), e57042, doi:10.3791/57042 (2018).More

Neuhaus, V., Danov, O., Konzok, S., Obernolte, H., Dehmel, S., Braubach, P., Jonigk, D., Fieguth, H. G., Zardo, P., Warnecke, G., Martin, C., Braun, A., Sewald, K. Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices. J. Vis. Exp. (135), e57042, doi:10.3791/57042 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter