Bedömning av den cytotoxiska och immunmodulerande effekter av ämnen i Human Precision-cut Lung skivor

Summary

Med tanke på 3R-principen utvecklas respiratorisk modeller som alternativ till djurförsök. Särskilt för riskbedömning av respiratoriska ämnen finns det en brist på lämpliga analyser. Här, beskriver vi användning av mänsklig precision-cut lung skivor för bedömningen av luftburna ämnen.

Abstract

Sjukdomar i andningsorganen i sin bred mångfald behöver lämplig modellsystem att förstå bakomliggande mekanismer och möjliggöra utveckling av nya läkemedel. Registrering av nya ämnen kräver dessutom lämplig riskbedömning med tillräcklig testning system för att undvika risken för individer som skadas, till exempel i arbetsmiljön. Sådana riskbedömningar utförs vanligtvis i djurstudier. Med tanke på 3R-principen och allmänna skepsis mot djurförsök, har mänskliga alternativa metoder, såsom precision-cut lung skivor (avgiften), utvecklats. Detta dokument beskriver ex vivo tekniken av mänskliga avgiften att studera immunmodulerande potential av låg molekylär vikt ämnen, såsom ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Uppmätta slutpunkter inkluderar livskraft och lokala respiratorisk inflammation, märkt av förändrad utsöndring av cytokiner och chemokiner. Pro-inflammatoriska cytokiner, tumör nekros faktor alfa (TNF-α) och interleukin 1 alpha (IL-1α) ökade betydligt i mänskliga avgiften efter exponering för en sub toxisk koncentration av HClPt. Även om tekniken att avgiften har optimerats väsentligt under de senaste decennierna, är dess tillämplighet för testning av immunmodulering fortfarande under utveckling. Därför är de resultat som presenteras här preliminära, även om de visar potentialen för mänskliga avgiften som ett värdefullt verktyg i respiratorisk forskning.

Introduction

Respiratoriska sjukdomar såsom allergisk astma, astma, kronisk obstruktiv lungsjukdom (kol), emfysem och infektioner i de övre och nedre luftvägarna är på uppgång och representerar en världsomspännande hälsa börda^1,2. Lämplig testsystem krävs för att identifiera några av de grundläggande mekanismerna bakom dessa sjukdomar, förutom utveckling och testning av lämpliga ämnen. Såväl grundforskning som preklinisk läkemedelsutveckling är inriktade på resultat som uppnås i in vitro- eller in-vivo analyser. Dessa analyser, har dock sina begränsningar³. För det första, in vitro- analyser utnyttja mänskliga celler som var isolerade och bort från angränsande vävnad eller organ och är således inte längre kunna interagera med eller skyddas av andra celler³. För det andra är djurmodeller ofta inte översättningsbara till människor på grund av skillnader i fysiologi och biokemiska skillnader⁴. För att minimera dessa begränsningar och inom ramen för 3R (replacement, förfining, minskning) princip⁵, nya alternativa modeller utvecklas hela tiden.

Alternativa mänsklig 3D vävnad modeller, såsom avgiften, är en länk mellan mänskliga-baserade in vitro- och komplexa djur i vivo modeller. AVGIFTEN speglar den funktionella heterogeniteten med alla relevanta celltyper som finns i luftvägarna⁶. Dessutom har avgiften tekniken fördelen av reproducerbar förberedelse av flera tunna skivor av exakt tjocklek från en enstaka djurs eller människors vävnadsgivare. Detta gör en intern kontroll samt olika koncentrationer eller droger för att testas.

Sedan det första införandet av agar-fyllda mänskliga lung skivor 1994 av Fisher et al. ⁷ tekniken för skivning och odling av lungvävnad har förbättrats avsevärt. Christian Martin o.a. har förbättrat denna teknik för ytterligare kemiska och farmakologiska program⁸. Vår grupp introducerades till denna teknik av Christian Martin 2007. Sedan dess har breddats tillämpningen av avgiften i forskningen från testning av funktionella svaren, såsom luftvägarna^9,10 och vasokonstriktion¹¹, till immunologiska, farmakologiska^12,13, och toxikologiska⁷ provning i olika arter i flera laboratorier. Exempelvis Schlepütz o.a. ¹⁴ undersökte luftvägarna Svaren för arter skillnader och jämfört perifera neuron aktivering av elektriskt fält stimulering (EFS) eller av kapsaicin hos möss, råttor, marsvin, fåren, silkesapor och människor. De Funna arterna ha distinkta men olika mönster av nerv-medierad bronkkonstriktion och drog slutsatsen att de vanliga försöksdjur (möss och råttor) inte alltid återspeglar den mänskliga reaktionen. För lungcancer toxicitetstestning och att minska antalet djur i detta sammanhang Hess o.a. ¹⁵ verifieras före råtta avgiften som ex vivo alternativ för inandning toxicitetsstudier. Denna multicentric Förvalidering studie resulterade i utvecklingen av två prediktionsmodeller med avgiften med lovande resultat.

Dessutom i grundforskning använts avgiften för att belysa calcium signalering¹⁶, tidiga allergiska reaktioner¹⁷och virusinfektion Svaren^18,19. Tekniska utvecklingen pågår och ytterligare framsteg utforskas. Exempelvis ökar fältet nyttan av mänsklig vävnad med lagring och återanvändning av fryst vävnad. Rosner et al. beskrivs en teknik av frysning och upptining murina avgiften som bevarar möjligheten för luftvägarna att kontraktet vid stimulering: därför tekniken förlänger begränsade tidsramen inom vilken vävnader förbli livskraftig, och så vidare analyser kan appliceras över tid till samma givare²⁰. Utöver dessa forskningsframsteg, Lauenstein o.a. ²¹ undersökte nyligen riskbedömning av olika kemikalier som kan fungera som potentiellt sensibiliserande för yrkesrelaterad astma i mänskliga avgiften.

Yrkesrelaterad astma, vars symtom är luftvägsobstruktion och luftvägarna hyperreaktivitet, liknande till allergisk astma, framkallas av exponering för hög molekylvikt (HMW)²² eller låg molekylär vikt (LMW) ämnen²³ (t.ex. , platina föreningar) i arbetsmiljö. LMW agenter har en hög sensibilisering potentiella när bildar haptener och binda till transportören proteiner²¹. Registrering av nya HMW eller LMW kemikalier krävs in vitro och i vivo riskbedömning avseende deras förmodade sensibilisering potentiella (t.ex., OECD: S riktlinje 429)²⁴. De tester som används för att bestämma den förmodade sensibilisering potentiella, men utformades ursprungligen inte för riskbedömning av luftvägarna sensibiliserande, men för kontakt sensibiliserande, även om det verkade finnas vissa kongruens för en liten delmängd av ämnen²⁵ . Arbetet av Lauenstein et al. utformades som en del av projektet Europeiska unionen Sens-it-iv, att utveckla alternativa teststrategier för riskbedömning av förmodad kontakt eller lung Sensibilisatorer²¹. För detta projekt fokuserade vi på testning användbarheten av mänskliga avgiften som en alternativ testverktyg. En uppsättning immunmodulerande endpoints (t.ex., viabilitet och cytokin sekretion) valdes därför att bestämma den irriterande eller inflammatorisk potentialen av kemikalier, såsom LMW platina föreningar. Lauenstein et al. fann inga allmänna mönster som skulle kunna tillämpas på alla luftvägarna sensibiliserande; deras arbete gav dock grunden för nyligen publicerade protokoll²⁶.

Sammanfattningsvis ger det protokoll som presenteras här för förberedelser och efterföljande exponering av mänskliga avgiften en bra metod för utvärdering av potentiellt lung-toxiska och/eller immunmodulerande ämnen som kan vara inblandade i utvecklingen av andningsorganen sjukdomar, såsom astma.

Protocol

Experiment med mänskliga avgiften måste utföras enligt The Code of Ethics av World Medical Association och godkänts av den lokala etiska kommittén (de exemplariska avgiften experiment visas här godkändes av den lokala etiska kommittén Hannover Medical School; nummer 2701-2015). Skriftligt informerat samtycke till användningen av mänskliga lungan material krävs från alla givare patienter eller deras anhöriga. Resultaten beskrivs i detta manuskript erhölls med vävnad skivor från givare av olika åldrar, kön, sjukdomshistoria, och orsaken till resektion, även om de flesta av vävnaden fick var från patienter som lider av lungcancer. Endast tumör-fri vävnad användes för experiment.

1. allmänna beredning av mänskliga avgiften och efterföljande exponering för kemikalier

Obs: Två personer måste fylla en lunga. En aktuell vaccinationsintyg för hepatit A och B rekommenderas. Patienter är rutinmässigt screenas för HCV och HIV före lungtransplantation. Om en aktiv infektion med Mycobacterium tuberculosis är diagnostiserad eller misstänkt, bör lungan avvisas. Dock alla färska mänsklig lungvävnad och prover som härrör från det måste behandlas som potentiellt smittsamma och motsvarande skyddande åtgärder vidtas (partikel filtermasker (FFP2), skyddsglasögon, handskar) för att säkerställa arbetssäkerheten av den Personalen. Proceduren tar 60-90 min.

1. Bekräfta obrutna av den mänskliga lunglob.
   Obs: En tår i lungsäcken förhindrar homogen fyllning av vävnaden. Mänsklig lunga material måste vara från dagen för resektion. Lagringsperioder med cirka 2 timmar i rumstemperatur (RT) före fylla det med agarosgelelektrofores på is tolereras. Den vävnad som vi använder i detta protokoll erhålls från patienter som genomgår resektion. Det är inte från avlidna patienter. Om vävnaden har förvarats på is, före värma det till RT innan du fyller den, annars Agarens kommer att polymerisera omedelbart och ingen homogen fyllning blir möjligt.
   Varning: Se till att alla personer i kontakt med infödda humant material på skyddskläder som består av en labbrock, två par handskar, mössa, ansiktsmask och ett par skyddsglasögon. Humant material är potentiellt smittsam.
2. Väga 7,5 g låg gelbildande agaros och lägga till 250 mL bi-destillerat vatten. Koka Agarens i mikrovågsugn tills Agarens är upplöst. Kyl det till ca 40 ° C, beroende på den smältande och gelbildande punkten Agarens.
   Obs: Flera kolvar krävs, beroende på storleken på LOB.
3. Pre värma och hålla odlingssubstratet (Tabell för material) vid 37 ° C.
   Obs: Om Agarens är för varmt, vitaminer i odlingsmediet förlorar effektivitet och celler skadas. Om temperaturen av medium/agaros lösningen är under 37 ° C, gelbildande processen startar och försämra homogen fyllning av lungan. Endast ett temperaturintervall på 37 ° C till 39 ° C rekommenderas.
4. Placera alla nödvändiga material inom räckhåll innan du börjar: 5-10 klämmor, flexibel kateter ca 1 m lång, en lämplig spruta (t.ex., 50 mL) passande anslutningen till katetern och en ice box fylld med is.
5. Hål i luftstrupen am main luftrör genom att infoga silikon röret och fixera den med en klämma orienterad parallellt med röret, så att klämman kramar vävnaden tillsammans tillsammans med silikon röret utan nyper det. Kontrollera att silikon röret är fixerade inuti och inte glida ut under förfarandet för fyllning. Stäng alla andra luftrören, blodkärlen och skador med klämmor, så att ingen agaros kan läcka ut under förfarandet för fyllning.
6. Blanda en motsvarande volym av 3% låg gelbildande agaros med odlingsmedium i en bägare. Ingjuta blandningen in i lungen med en 50 mL spruta. Före påfyllning av sprutan med medium, Stäng klämman katetern med fingrar eller en klämma för att undvika luftbubblor och agaros reflux. Fyll lunglob tills det är helt uppblåst. Försiktigt tryck lung lungsäcken på sidan; Lungsäcken skall vara jämn och hård.
   Obs: Beroende på storleken på lunglob, upp till 2 eller 3 L agaros/medium lösning kan krävas.
7. Upprepa steg 1.5-1.6 för varje luftrör vid flera bronkerna inom ett enda exemplar.
8. Pålagda is för polymerisation Agarens till gel för 20-40 min, beroende på mängden ingjuten agaros lungan. Försiktigt trycka lungsäcken på flera sidor för att kontrollera om det är hårt och cool, som anger att polymerisation är klar, annars fortsätter att vänta. Låt patologer kommer skär lungan i skivor, ta deras prover och lagra lung materialet på is för transport.
9. Skär den mänsklig lungvävnaden i 3-5 cm plattor med en vass kniv.
   Obs: Använd ett nytt blad för varje lunga för att garantera skärpa.
10. Fyll utsnittet vävnad med 400 mL iskallt Earles balanserad saltlösning (EBSS). Omedelbart minska cylindriska vävnad kärnor ur lungan plattor med en halvautomatisk skruvmejsel med ett coring verktyg av rekommenderad diameter (t.ex., 8 mm, 10 mm).
    Obs: Denna diameter måste vara motsvarande diametern på vävnad innehavaren inuti maskinen.
11. Justera tjockleken av lung skivor till önskad tjocklek värde.
    Obs: En tjocklek av ca 250 µm används ofta i avgiften experiment. Tillverkaren av utsnittet vävnad rekommenderar deras vävnad Slice tjocklek mätare för kontroll av slice tjocklek. Alternativt kan hela-mount färgning kombinerade med konfokalmikroskopi användas för att bestämma tjockleken slice som beskrivs av Brismar et al. ²⁷
12. Överföra vävnad kärnar ur in i vävnad innehavaren av utsnittet vävnad. Lägga vikt (del av vävnad innehavaren) ovanpå vävnad kärnan. Ange den arm och blad hastighet till 6 på utsnittet vävnad. Starta skivning vävnad kärnan i avgiften.
13. Komplettera 500 mL av kommersiellt tillgängliga Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM): näringsämne blandning F-12 DMEM/F12 (1:1) med 5 mL av penicillin (10.000 enheter/mL) och streptomycin (10 000 µg/mL). Lagra odlingssubstratet i flera dagar under sterila förhållanden i kylskåp. Pre varma bara volymen som krävs av medium.
    Obs: Penicillin kommer att inaktiveras om hålls vid 37 ° C under längre perioder. Använd serum-fri och färgämne odlingsmedium, som serum sammansättning varierar från sats till sats och färgämnen, till exempel fenol-röd, kan störa analyser.
14. Fyll en petriskål (100 x 15 mm) med 25 mL iskallt odlingsmedium. Medium bör tömmas ur utsnittet vävnad till en bägare genom att öppna klämman av glas cylindern. Överföra skivor från en bägare i petriskål med odlingsmedium med hjälp av en applikator (t.ex., Inympning loop). Sätta petriskål i en inkubator (37 ° C, 5% CO₂, 100% luftfuktighet). Låt medlet att värma upp före tvätt steg.
    Obs: Alla ytterligare åtgärder utförs under sterila förhållanden.
15. Placera en cell SIL i petriskål för att tvätta avgiften. Helt ta bort odlingssubstratet med serologiska pipett 10 mL genom den cell sil och tillsätt 25 mL 37 ° C före värmde färskt medium. Upprepa detta steg 3 - 4 gånger varje 30 min.
    Obs: Cell silen hindrar skivor från att sugas in i pipetten, att undvika skada på skivor.
16. Över lung skivor försiktigt till en 24-väl kultur tallrik med ett minimum av 500 µL odlingsmedium för två skivor per brunn. Exponera lungvävnad ämnen (se steg 3.1-3.4), t.ex., för 24 h vid 37 ° C, 5% CO₂.
    Obs: För överföring, företrädesvis Använd en inympning loop och låt skivor flottören på slingan för att förhindra vävnadsskada. Ingen ytterligare uppdelning av skivor behövs, eftersom endast brist på tillräckligt färskt medium kommer inducera celldöd i vävnad skivor. Skivor kan överlappa eller vidrör varandra i brunnen: detta har ingen påverkan på vävnad livskraft.
17. Sätta alla kvarvarande humant material i en plast kolv med ett fixativ (t.ex., 10% buffrat formaldehyd) under minst 24 h och bränna detta i processen förfogande.
    Försiktighet: Formaldehyd är giftigt, utföra detta steg under en huv.

2. histologisk analys av avgiften

1. Förbereda biopsi kassetter med två foam pads dränkta i fixativ (t.ex., 4% buffrad formaldehyd). Placera avgiften mellan skum kuddar i biopsi kassett och omedelbart överföra vävnaden till fixativ lösning. Korrigera vävnaden övernattning i 4% buffrad formaldehyd.
2. Bearbeta vävnaden för paraffin inbäddning av uttorkande prover i etanol (70%, 90%, 100%, 100%, 100%, 100%) för 1 h varje, följt av tvättning i xylen (3 x 1 h) och flytande paraffin (3 x 1 h) enligt standard histopatologi protokoll.
3. Över avgiften till en inbäddning mögel. Använd en inympning loop. Bädda in avgiften vävnaden i flytande paraffin. Se till att placera vävnaden jämnt i formen när du castar paraffin blocket.
4. Skär blocket vävnad som innehåller avgiften med en roterande mikrotom tills den har en plan och jämn yta. Ta seriell avsnitt av önskad tjocklek (t.ex., 4 µm), placera dem individuellt på konsekutivt numrerade belagt glas diabilder (vanligtvis sektioner kan tas 25-30) tills det hela avgiften har bearbetats.
5. Fläcken enda objektglas (varje 8-10 avsnitt) med hematoxylin och eosin fläcken (H & E) för orientering. Välj avsnitt för experimentet baserat på orientering bilderna (de första och sista 8 sektioner är oftast ofullständig).
   Obs: (Valfritt) för långvarig lagring, diabilder kan doppas i flytande paraffin för bevarande.

3. beredning av lösningar för ämnen

Obs: Förbereda fungerande lösningar och kontroller omedelbart före användning.

Försiktighet: Hantera ämnen enligt säkerhetsföreskrifter eller, om okänd, som potentiellt skadliga och följ rutinmässiga säkerhetsföreskrifter.

1. Lös upp vattenlösliga ämnen direkt i odlingsmedium. För olösliga eller svårlösliga kemikalier, först lös ämnet i de lämpliga lösningsmedel beroende på ämne som löslighet. Ämnen med begränsad vattenlöslighet (< 0,1 mg/mL) kan lösas, till exempel i DMSO eller etanol. Koncentrationen av icke-giftiga lösningsmedel bör bestämmas genom titrering i förväg. Kontrollera att ämnen som inte fällning ur lösningen utspädd till medium.
   Obs: HClPt och natrium laureth sulfat (SLS) lösningar är beredda.
2. Förbereda ämnet stamlösningar på 100-fold av önskad högsta koncentration i odlingsmedium eller lösningsmedel. Väger 12,5 mg HClPt och 34,4 mg SLS och förbereda stamlösningar av upplösning kemikalier i 1 mL odlingsmedium.
   Obs: Inget lösningsmedel krävs för dessa kemikalier.
3. Förbereda en slutspädning av 1: 100 i förväg värmde medium. Vid tidigare användning av lösningsmedel resulterar detta synsätt i samma slutliga lösningsmedel koncentration för alla testämnets koncentration.
4. Använda slutliga lösningsmedel koncentration (t.ex., 1% som beskrivs i steg 3.3) för referens behandling av avgiften. Inga lösningsmedel kontroll krävdes för de kemikalier som nämns i resultatavsnittet.

4. positiva och negativa referenser för cytotoxicitet analyser

1. För alla livskraft analyser, förbereda följande positiva och negativa kontroller:
   1. Vävnadskontroll: Inkubera avgiften i odlingsmedium endast som referens i obehandlad avgiften för 24 h vid cell odlingsbetingelser (37 ° C, 5% CO₂, 100% luftfuktighet).
   2. Fordonskontroll (om nödvändigt): Inkubera avgiften med slutliga lösningsmedel koncentration som en referens för avgiften som behandlas med fordonet endast (se steg 3,4) för 24 h vid cell odlingsbetingelser (37 ° C, 5% CO₂, 100% luftfuktighet).
   3. Positiv kontroll: Inkubera avgiften med 1% rengöringsmedel i buffertlösning för 1 h vid 4 ° C.
      Obs: Om avgiften blir färglös, vävnaden är död. Totala L-laktatdehydrogenas (LDH) bestäms i supernatanten, med ett upptag av ca 1,9-2,3 (se steg 6.1-6.4). Vävnaden används för WST-1 analysen (se steg 5.1-5.5), med ett upptag av ca 0.

5. mätning av kemiskt inducerad cytotoxicitet i mänskliga avgiften med WST-1 Assay

Obs: WST-1 analysen utförs i en 24-well platta med två avgiften per brunn. Helst, Använd dubbletter för varje parameter och pool resultaten av dessa dubbletter efter mätning.

1. Förbereda arbetslösning genom spädning WST-1 reagens i medium omedelbart innan du börjar. Den erforderliga mängden av fungerande lösning är 250 µL per brunn 24-bra platta. Därför blanda 25 µL av reagens med 225 µL odlingssubstrat för en brunn.
2. Efter inkubation av avgiften från steg 1.16, kasta eller använda supernatanten för cytokin mätningar eller andra tester såsom LDH analysen. Den återstående vävnaden används för nästa steg.
3. Pipettera 250 µL av arbetande koncentrationen av WST-1 reagens per väl och inkubera plattan vid 37 ° C och 5% CO₂ för 1 h. se till att avgiften täcks helt av WST-1 reagens under inkubation.
4. Placera plattan i orbitalskak (200 rpm) och skaka försiktigt i 30 s att säkerställa omsorgsfull blandning av WST-1 reagens. Ta en ny platt-bottenplatta med 96 brunnar och Pipettera 100 µL i dubbletter från supernatanten i varje brunn Skyltens 24 brunnar.
5. Mäta upptaget av varje brunn vid 450 nm (referens: 630 nm) med en microplate reader. Subtrahera absorptionen vid 630 nm från 450 nm. Dessa värden kommer att användas för beräkningen i steg 5,6).
   Obs: Tillförlitliga uppgifter för cytotoxicitet bedömning kan erhållas endast från livskraftiga vävnad. Därför dessa godkännandekriterier som publiceras av Hess o.a. ¹⁵ bör uppfyllas i varje experiment. Om dessa kriterier inte uppfylls, bör försöket upprepas.
6. Absorptionen av de medelstora kontrollgrupp bör vara över 0,6, annars experimentet bör upprepas. Om data uppfyller detta krav, absorption värdet i kontrollen vävnad till 100% och beräkna WST-1 minskning av behandlade prover i samband med kontrollen vävnad.

6. LDH Assay

Obs: LDH analysen utförs i en plattan med 96 brunnar med 100 µL kultur supernatant totalt efter efter inkubationstiden.

1. Efter inkubation av avgiften med eller utan test agenter, ta 50 μl av supernatanten från steg 1.16 och överför det i dubbletter till en nya plattan med 96 brunnar. Detta genererar dubbletter från varje behandlas väl av en 24-bra platta.
2. Förbereda den fungerande lösningen av LDH reagens omedelbart före analysen. Arbetslösning består av katalysator lösningen (frystorkat pulver löses i 1 mL bidistilled vatten) och färga lösning som tillhandahålls av tillverkaren. För en plattan med 96 brunnar, grundligt blanda 125 µL katalysator lösning med 6,25 mL färgämne.
   Försiktighet: Utsätt inte lösningen för direkt ljus.
3. Överför med pipett 50 µL av den fungerande lösningen till varje brunn redan innehållande 50 μl av supernatanten och inkubera plattan för 20 min på RT i mörkret. Ingen ytterligare blandning krävs.
4. Mäta upptaget av varje brunn på 492 nm (referens: 630 nm) med en microplate reader. Subtrahera absorptionen vid 630 nm från 492 nm. Dessa värden ska användas för beräkningen i steg 6,5.
   Obs: Tillförlitliga uppgifter för cytotoxicitet bedömning kan erhållas endast från livskraftiga vävnad. Absorptionen av tvättmedel-behandlade kontrollen bör vara över 1.
5. För analys, absorption värdet av den positiva kontrollen från steg 4.1 som 100% och beräkna LDH utgivningen i behandlade prover i förhållande till den positiva kontrollen (dvs, maximal LDH release).

7. mikroskopiska livskraft Assay med Confocal Laser Scanning Mikroskop (cLSM)

Obs: För mikroskopiska lönsamhet analysen, är två av de normala 250-µm tjock avgiften färgade i 250 µL per brunn 24-bra platta. Eftersom varje skiva är avbildas separat, krävs ingen ytterligare dubbletter.

1. Efter inkubation av avgiften med eller utan testartiklar, Kassera supernatanten eller använda det för cytokin mätningar eller andra tester såsom LDH analysen. Använd den återstående vävnaden för proceduren som beskrivs här.
2. Bered arbetsutspädningen av calcein-AM och etidiumbromid homodimer 1 (EthD-1) med en arbetande koncentration av båda reagenser 4 µm i odlingsmedium. För detta ändamål, att lägga till 1 µL av calcein-AM (4 mM) och 2 µL av EthD-1 (2 mM) till 997 µL odlingsmedium. Denna volym krävs för att färga 4 brunnar med två avgiften varje.
   Obs: Undvik exponering av reagenser för direkt ljus.
3. Pipettera 250 µL arbetsutspädningen i varje väl och inkubera 24-väl plattan för 45 min på RT i mörkret. Placera plattan i orbitalskak på 150 rpm under ruvningen att säkerställa bättre exponering av vävnaden till färglösningen.
4. Efter 45 min, kassera färgningslösningen och tvätta avgiften med 1 mL buffertlösning genom skakning på 150 rpm för 3-5 min vid RT i mörkret. Upprepa detta steg två gånger.
5. Tillämpa 500 µL buffertlösning till varje brunn innehållande de färgade avgiften för att undvika autofluorescens från odlingssubstratet. Utför minst två slumpmässigt distribuerade z-stackar med en cLSM för mikroskopisk bedömning.
6. Klicka på fliken okulär att välja en 10 X / 0.3 mål och klicka på Online för att använda cLSM som en standard ljusmikroskop för att hitta ytan av avgiften. Klicka på Offline för att avsluta inställningen okulär.
7. Klicka på fliken förvärv och slå på de lämpliga lasrarna för fluorophores.
   Obs: Vi använde en argon laser med en våglängd av 488 nm för den polyanjonisk dye calcein (excitation våglängd av 495 nm) och en HeNe laser med en våglängd på 543 nm för detektion av EthD-1/DNA komplexet (excitation våglängd av 533 nm). Argon laser bör generellt köra på 30-50% av den maximala strömmen att aktivera en tube ström på cirka 5,7 A, som detta förlänger laser livslängd avsevärt.
8. Klicka på Ljus väg under fliken förvärv och ställa nödvändiga filter och speglar för experimentet.
   Obs: I den aktuella studien, användes ett filter-baserat system med en huvudsakliga dikroisk stråldelare (t.ex., HFT 488/543) separera det excitation och utsläpp ljuset. Genom en reflekterande spegel detta ljus är riktad till den sekundära dikroisk stråldelare (t.ex., NFT 545) till ytterligare separat ljuset som avges från provet till två kanaler.
9. Ställ in band pass filter (t.ex., BP 505-530 för calcein signalen och BP 560-615 för EthD-1/DNA complex signalen) som överför endast ett visst antal våglängder och tilldela calcein signalen till kanal 2 och EthD-1/DNA complex signalen till kanal 3.
10. Markera rutan Z-stackar för att ställa in de övre och nedre gränserna för mikroskopiska. Tryck på knappen levande att se en levande bild av det motsvarande lagret på skärmen. Flytta fokus upp eller ner hitta ytan av avgiften med en skarp signal.
11. Klicka på underavsnittet kanaler och markera kryssrutan Visa alla. Låsa upp tabellen genom att trycka på knappen för motsvarande kanal under live-avbilden och aktivera kanal färg.
    Obs: En blå färg i live-avbilden indikerar att det finns ingen signal, medan en hög signal visas i vitt och en överexponerad signal visas i rött.
12. Ange pinhole för röda EthD-1 kanal 1 luftiga enhet för bästa avvägningen mellan effektiviteten i ljus insamling och optisk snittning och justera calcein kanalen. Öka den upptäckta signalen av vinsten så att det visas vitt men inte rött i live-avbilden med aktiverad kanal färgtabellen fängsel.
    Obs: Master vinsten bör inte överstiga 600 enheter.
13. Öka eller minska digital offset för att justera bakgrunden så att den visas i blått i live-avbilden med aktiverad kanal färgtabellen fängsel.
14. Klicka på fliken Z-Stack under flerdimensionella förvärv och använda fokus för att skifta till en z-skikt av intresse. Tryck på Ange första Spara denna position för senare förvärv. Långsamt flytta fokus uppåt eller nedåt tills en rad 30 µm har nåtts och tryck på Ange sista att spara.
15. Klicka på Live en gång till inaktivera live-avbilden och tryck på Starta experimentet att starta bildtagning.
    Obs: Livskraftig vävnad upptäcks genom fluorescens de polyanjonisk dye calcein. Döda celler diskrimineras av komplexa bildandet av EthD-1 och nukleinsyror.

8. bildåtergivning

Obs: Dator rekommendation av rendering bildbehandlingsprogram måste beaktas, eftersom detta program kräver lämplig maskinvara.

1. Läsa in LSM filen förvärvats från mikroskopiska livskraft färgning av avgiften (se avsnitt 7) i bilden rendering programvara. Spara det som .ims filen innan du fortsätter. Ställa in alla parametrar på kontrollen vävnad och tillämpa dessa på alla bilder. Inga ytterligare ändringar är tillåtna.
2. Använd volymknappen för surface återuppbyggnad av livskraftiga vävnad (calcein färgning) (kompletterande figur 1A) och knappen ställen för döda cellkärna (kompletterande figur 1 H). Vid återgivning av en kanal, Stäng av den andra kanalen i fönstret bildskärm justering.
3. Börja med att återge volymen av vital vävnad: Ställ in channel av ytan, bearbeta hela bilden, ställa den släta faktorn till 0,5 µm och använda absolut intensitet för tröskelvärde (kompletterande figur 1B, C). Tryck på den blå framtida pilen.
4. Justera tröskelvärdet absolut intensitet på rekonstruerade volymen; buller och bakgrunden intensitet bör dras. Yta överlägg visas i grått och riktigheten av yttäckning bör kontrolleras (kompletterande figur 1 d). När du har slutfört justeringen, tryck blå framåtpilen. För mesta krävs det här steget för beräkning av inställningarna. Om programvaran inte är kunna beräkna volymen, öka den släta faktorn.
5. I det sista steget, Välj ett filter. Använda filtret sfärisk (med ca 10 µm) för surface rendering för att filtrera bort makrofager i alveolära utrymmet (kompletterande figur 1E). Tryck på den gröna knappen framåt.
6. Optiskt Justera bild och exportera statistik som .xls-filer. Den totala volymen (summan) kommer att användas för vidare analys (kompletterande bild 1F, G). Spara inställningarna och använda dem för alla ytterligare analyser av z-stackar tagna samma dag med samma cLSM inställningar (kompletterande bild 1I).
7. Rekonstruera den röda kanalen (fläckar) för döda cellkärnor. Slumpmässigt mäta dot storlek i µm skalning i fönstret överstiga; dot storlek är cirka 5 µm. Markera Enable och ställa in storleken dot. Kontrollera om alla prickar är markerade och varje punkt räknas endast en gång. Korrigera manuellt om det behövs (kompletterande figur 1B, H, J). Tryck på den blå framtida pilen.
8. Tryck på knappen för gröna framåt för att låta programmet beräkna/räkna det totala antalet ställen enligt parametrar in och exportera resultatet som .xls-fil (Kompletterande figur 1 K, L, M). Anger antalet beräknade döda cellkärnor i förhållande till volymen av vital vävnad för grafiska eller statistisk analys av bilden.

9. mätning av cytokiner och chemokiner i mänskliga avgiften

Obs: Det cytokin och chemokine immunsvaret kan mätas extracellularly i kultur supernatanten och intracellulärt i vävnad lysates efter inkubationstiden. ELISA mäts i dubbletter i en plattan med 96 brunnar med 100 µL per brunn.

1. Förbered en 1% lösning genom att blanda 5 mL diskmedel med 495 mL buffertlösning. Lösningen kan förvaras vid RT i flera månader.
2. Blanda i 1% rengöringslösning med proteashämmare (PI) i ett förhållande av 1: 500. Mängd som behövs beror på kultur plattan; exempelvis använda 500 µL per brunn för en 24-bra platta. För en brunn, blanda 1 µL PI med 499 µL av rengöringslösning.
3. Förbereda rör med 1 µL PI lösning och samla 500 µL av kultur supernatanten i dessa rör. Omedelbart ersätta mediet i 24-väl plattan av 500 µL rengöringslösning som innehåller PI som bereddes i steg 9,2. Lysera vävnad för 1 h genom att placera 24-väl plattan i vid 4 ° C. Pipettera vävnaden lysate i en ny tub och lagra dessa rör vid-80 ° C tills vidare analys.
   Obs: ELISA protokollet beror på tillverkaren och tillverkarens anvisningar ska följas. Ett standardprotokoll för ELISA beskrivs i följande.
4. Utföra de ELISA-test för att mäta cytokin nivåer i supernatanten eller lysate enligt tillverkarens anvisningar. För att mäta IL-1α och TNF-α, coat a96-väl plattan av pipettering 100 µL av capture antikropp (för utspädning följ tillverkarens instruktioner) och inkubera över natten vid RT.
5. Förbereda tvätt buffert genom att lösa upp en tvätt buffert tablett i 1 L bidistilled vatten. Ta bort fånga antikropp och Pipettera 400 µL tvätt buffert i varje brunn. Ersätta denna volym tre gånger. Blockera plattan genom att lägga till blockerande lösningen (t.ex., 1% BSA i buffertlösning, enligt tillverkarens instruktioner). Inkubera vid RT i 1 h.
   Obs: Standard kommersiellt tillgängliga ELISAs kräver 2 x 100 µL av vävnad supernatant eller lysate. Prov bör vara tinade en gång och bara före användning. Beroende på känslighet för analys och på de släppta cytokin, måste prover spädas före mätningar. Därför, späd provet i reagensen tillhandahålls av analysen.
6. Ta bort blockering lösningen och lägga till utspädda prover för standardkurvan (för utspädning följer tillverkarens instruktioner) och 100 µL av vävnad supernatant eller 100 µL av vävnad lysate i dubbletter i steget 9,3. Inkubera i 2 h på RT.
7. Ta prover och Pipettera 400 µL tvätt buffert i varje brunn. Ersätta denna volym tre gånger. Pipettera 100 µL biotinylerade detektionsantikropp (för utspädning följ tillverkarens instruktioner) och inkubera i 2 h på RT.
8. Ta bort antikropp och Pipettera 400 µL tvätt buffert i varje brunn. Ersätta denna volym tre gånger. Tillsätt 100 µL per brunn av HRP-märkt streptividin (för utspädning följ tillverkarens instruktioner) och inkubera i 20 min på RT (Kontrollera tillverkarens anvisningar).
9. Ta bort streptividin och Pipettera 400 µL tvätt buffert i varje brunn. Ersätta denna volym tre gånger.
10. Tillsätt 100 µL av substratet (rekommenderas av tillverkaren) och inkubera i 20 min i mörker (Kontrollera tillverkarens anvisningar).
    Obs: Detta steg är ljuskänsliga. Undvika ljus exponering av substrat och plattan.
11. Stoppa reaktionen genom att lägga till 50 µL stopplösning (1 M H₂SO₄). Mäta upptaget av varje brunn vid 450 nm (referens: 570 nm) med en microplate reader. Subtrahera absorptionen vid 570 nm från 450 nm.
    Obs: Obehandlad eller fordonets vävnad reglage fungerar som negativa kontroller. För att inducera ett immunsvar i lungvävnad, Använd lämpliga stimulering (t.ex., 100 ng/mL lipopolysackarid (LPS)) som positiv kontroll. Inkubera två brunnar med två PLC per brunn med 100 ng/mL LPS i odlingsmedium, exempelvis i 24 h, och samla supernatanten och vävnad lysat som beskrivs i steg 9,3.
    Obs: De uppmätta resultaten accepteras, om absorptionen av högsta standard är lika med eller högre än 1,0; Annars måste mätningen upprepas. Standardkurvan bör följa sigmoidal dos-respons kurva montering.
12. Cytokin koncentrationer (pg) bestäms av ELISA i steg 9.11 är normaliserad till den totala proteinhalten bestäms i vävnad lysate av varje prov (se avsnitt 10).

10. mätning av totala proteinhalten i mänskliga avgiften

Obs: Avgiften måste vara lyserat för att mäta total proteinkoncentration. De vävnad lysates från steg 9,3 används för det här steget. Analysen utförs i en platt 96 brunnar tallrik med 25 µL per brunn vävnad lysate, pipetteras i dubbletter.

1. Förbereda en 7-punkts BSA standard med BSA koncentrationer av 2 000 µg/mL, 1 500 µg/mL, 1000 µg/mL, 750 µg/mL, 500 µg/mL, 250 µg/mL och 125 µg/mL. Tillsätt 25 µL i dubbletter för varje standard och använda 25 µL buffertlösning som en tom på en plattan med 96 brunnar (Använd en tallrik med en plate cover).
2. Pipettera 25 µL av den lysates (se steg 9,3) från varje brunn i dubbletter i en plattan med 96 brunnar. Totalt krävs 50 µL av varje väl. Förbereda arbetande reagensen BCA lösning genom att späda BCA reagens B 1:50 i BCA reagens A. Använd 400 µL av reagens B och 20.000 för en plattan med 96 brunnar µL av reagens A.
3. Noggrant Pipettera 200 µL av arbetande reagens i varje brunn, att undvika luftbubblor. Placera plattan i orbitalskak (150 rpm) för 30 s för att säkerställa korrekt blandning av lysates och fungerande-reagens, och sätta en plate cover på plattan. Inkubera plattan vid 37 ° C i 30 min i mörker. Mäta upptaget av varje brunn vid 540-590 nm med en microplate reader.
   Obs: Mätresultaten accepteras, om absorptionen av högsta BSA standard är lika med eller högre än 0,8; Annars måste mätningen upprepas. Standardkurvan bör följa sigmoidal dos-respons kurva montering.
4. För analys, beräkna standardkurvan med hjälp av en 4-parameter Marquardt ekvation efter subtraktion av tom. Beräkna protein koncentrationerna av okända prover med standardkurvan passar.

Representative Results

Med denna forskningsmetod, var mänskliga avgiften beredd och utsätts för fem koncentrationer av industriella ämnen att bedöma kemiskt inducerad immunmodulerande effekter i mänskliga lungan material. Lungvävnad utsattes nedsänkt villkor som permanent kultur för 24 h. toxicitet bedömdes genom mätning av utsläppt LDH, mitokondriell aktivitet och mikroskopiska livskraft färgning. Dessutom mättes totalt proteininnehåll för normalisering och pro-inflammatoriska cytokiner. Om möjligt, beräknades hämmande koncentration (IC) 75 värden av icke-linjära sigmoidal kurva montering. De positiva referensämnena, tvättmedel för cytotoxicitet och LPS för medfödda cytokin svar, användes för validering av varje körning. Det logaritmiskt omvandlade IC75 [µM] värden (log IC50) användes som ”irriterande” koncentrationer för efterföljande cytokin release mätningar.

Figur 1 och figur 2 visar tillvägagångssättet av fyllning mänskliga lungan material och exemplarisk H & E-färgning av mänskliga avgiften. Hygienisk rutinförfaranden måste följas för att undvika negativa effekter på hälsa och garantera säkerheten för den personal som hanterar mänskliga lungan materialet. Tekniken kräver personalens utbildning och praktik. Erfarna patologer som skilja olika regioner (övre/nedre loberna och subpleural kontra mer central) och sjuka jämfört med friska områden behövs för att bedöma patologiskt status av mänskliga lungan materialet. Den genererade mänskliga avgiften bör användas för beredning av H & E-färgade tunnslip, som åter kan utvärderas av en patolog. Denna procedur hjälper användarna att få övning i diskriminera olika sjuka områden och platser i lungorna.

Figur 3 presenterar mätresultaten för LDH och WST-1 aktivitet i mänskliga avgiften efter 24 h inkubation med SLS. Den medelstora kontrollgrupp utan SLS, visat på 0 µg/mL SLS, är en viktig kvalitet kontroll. Värdena bör vara under 20% för LDH jämfört med tvättmedel-lyserat vävnad och > 0.7 absorbansen enheter för WST-1 analysen. Dessa kvalitetskontroller också fungera som indikatorer på otillräcklig vävnaden livskraft. Lyhördhet av den mänskliga vävnaden mot rengöringsmedel lösning, som en effektiv giftigt ämne, måste inkluderas som positiv kontroll. Det bör leda till en ökning av 300-500% (> 2,0 absorbansen enheter) av LDH jämfört med obehandlat vävnad och i värden < 0,1 absorbansen enheter för WST-1 analysen. SLS resulterade i en dosberoende minskning av cellernas viabilitet mätt som en ökning av LDH och en minskning av metabolisk aktivitet i WST-1 analysen vid koncentrationer > 87 µg/mL. En sigmoideum koncentration-respons-modellen var utrustad till data, så att det är möjligt att beräkna IC75 eller IC50 värden. Dessa värden kan därefter användas för att markera koncentrationer för cytokin och chemokine nivåer: vid mycket giftiga koncentrationer, vanligtvis nr eller bara minskat cytokiner och chemokiner kan upptäckas. Därför rekommenderas inte giftig eller bara något toxiska koncentrationer (IC75). Det är viktigt att notera här att den förväntade ökningen av LDH aktivitet i cellkultur supernatant påverkas ofta av tillämpad ämne²¹. Störningar uppstår ofta, mellan substans och enzym aktivitet, vilket leder till misstolkningar av resultat om LDH analysen var den enda cytotoxicitet analys används. Därför är det viktigt och nödvändigt att utföra flera cytotoxicitet analyser för att få tillförlitliga och giltiga resultat. Det bör vidare nämnas att känsligheten av LDH och WST-1 analyserna är mycket jämförbara.

I figur 4visar mikroskopiska livskraft bilder av avgiften lyhördhet av mänsklig vävnad att rengöringsmedel som effektivt giftigt ämne. Resultaten är mycket användbar för att bekräfta andra livskraft data, men detta kräver ytterligare utrustning. Toxiska effekter bedöms visuellt av utvärdering av calcein-positiv vävnad jämfört med EthD-1-positiva cellkärnor. Slumpvis utvalda segment inom parenkymet resulterar allmänt i jämförbara uppgifter, luftvägarna eller blodkärl bör undvikas, eftersom större hålrum kan flytta resultaten. Från vår erfarenhet och med mikroskopiska inställningarna som beskrivs ovan, mäts en genomsnittliga volymen mellan 1,5 x 10⁶ och 5 x 10⁶ µm³ av kontroll vävnad. Värdena beror på lung materialkvalitet, avgiften kvalitet, och även på sjukdomen av lunga vävnad givaren. Trots att lönsamheten för mänsklig lungvävnad varierar mellan givare, bör antalet döda cellkärna jämfört med livskraftiga vävnad inte överstiga 15% av kontrollen vävnad. Om döda cellkärnorna finns huvudsakligen i kontrollen vävnad, dock bör experimentet överges.

Figur 5 visar representativa uppgifter för den immunmodulerande effekten av HClPt och SLS på mänsklig lungvävnad. De pro-inflammatoriska cytokiner som IL-1α och TNF-α är biomarkörer för inflammation, som anger början av de inflammatoriska processerna efter exponering för stimulerande ämnen. Båda cytokiner mättes med ELISA. Extracellulära IL-1α är vanligtvis låg i mänskliga avgiften, medan intracellulära IL-1α når nivåer av 1000 pg/mL och ovan. En minskning av intracellulära IL-1α indikerar pågående cytotoxiska processer - och observeras mestadels efter exponering av mänskliga avgiften för kemikalier. Om vävnad stimuleras med LPS, en aktivator av det medfödda immunsystemet och som sådan positiv behandling styra, då de flesta av de inducerade IL-1α kan bara påvisas intracellulärt efter 24 h. TNF-α sekretion induceras av LPS stimulering kan däremot främst mätas extracellularly. Användning av lämplig positiv kontroll, såsom LPS, visar giltigheten av en metod. Med denna forskningsmetod utsattes mänskliga avgiften för tre koncentrationer av HClPt (32, 64, 125 µg/mL) eller två koncentrationer av SLS (1 – 10 µg/mL) för 24 h. cytokin sekretion fastställdes som en summa av den extracellulära och intracellulära cytokiner normaliserade totalprotein koncentrationer som avbildas i figur 5. Det är värt att nämna här att BCA analysen används i allmänhet för bestämning av totalt proteininnehåll, men det återspeglar också ämne-inducerad cytotoxicitet. Därför vid mycket giftiga koncentrationer kan inte totala proteinhalten användas för normalisering av cytokin data. Utsöndring av IL-1α ökade betydligt från 263 ± 38 pg/mg till 887 ± 216 pg/mg och för TNF-α från 263 ± 38 pg/mg till 1 160 ± 286 pg/mg (figur 5A, B). Dessutom presenteras LPS-inducerad IL-1α och TNF-α sekretion i jämförelse med en ostimulerade vävnadskontroll. Induktion av pro-inflammatoriska cytokiner av patogen-associerade molekylära mönster, såsom LPS, visar giltigheten av en metod och rekommenderas att användas när du arbetar med mänskliga avgiften för att undersöka immunmodulerande effekter. För mer information om HClPt och SLS data, hänvisas till studien av Lauenstein o.a. ²¹

Figur 1 : Förfarande för mänskliga lungan fyllnadsmaterial. Mänskliga lungan bereds omedelbart efter resektion. Lungan ska förvaras vid rumstemperatur för konsekvent fyllning med agarosgelelektrofores och undvika plötsliga agaros polymerisation under fyllning. Lungan är placerad horisontellt, med loberna sprida ut för en optimal syn på den huvudsakliga luftrör eller bronkerna (A & B för närbild på luftrör). Bronkerna är kanylerade med en flexibel silikon tub och fast med klämmor (C). Efter fyllning förfarandet och agaros polymerisation i vävnaden skär utbildade patologer lungan i skivor om 3-5 cm tjocklek (D). Från dessa skivor tillagas cylindriska vävnad kärnor (Ø t.ex., 8 mm) med en coring verktyget (E). Dessa vävnad kärnor skärs med en vävnad slicer in avgiften, som överförs omedelbart till medium-fyllda petriskålar för inkubering under normal cell kultur förhållanden (E). Efter flera tvätt steg avgiften överförs i cell kultur plattor (t.ex., 24-well platta med två avgiften per brunn och 500 µL medium) för att avlägsna kvarvarande cellfragment och släppt cell medlare (F). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2 : Bestämning av mänskliga avgiften av H & E färgning hälsostatus. AVGIFTEN i denna bild, beredd från en donator med en lung tumör, visar intakt lungvävnad med alveolära parenkymet, perifera luftvägarna (*), och blodkärl (pilspetsar) i översikten (A). Vid högre förstoring, bedriva airways med intakt cilierade respiratoriskt epitel (pilspetsar) (B), en intakt alveolära struktur fodrad med livskraftiga pneumocytes, inklusive en kapillär med talrika erytrocyter (pilspetsar) (C), alveolära utrymmen som innehåller alveolära makrofager (CD68 immunohistokemi) (D), samt blodkärl med intakt endotel (CD31 immunohistokemi) (E) kan observeras. Endast tumör-fri vävnad användes för den avgiften, varför inga makroskopiskt sjuka områden är synliga. I motsats till avgiften beredda från givare med andra lungsjukdomar, såsom emfysem eller fibros, alveolära strukturen störs inte och avgiften är bara något nött vid den yttre gränsen, troligen på grund av förberedelser. Skala fält anger 1000 µm (A) och 50 µm (B–E), respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3 : Bestämning av cytotoxicitet induceras av SLS i mänskliga avgiften, mätt med läckage av enzymet LDH i odlingsmedium (A) och förlust av metabola enzymaktivitet utvärderas med färgämnet WST-1 (B). Mänskliga avgiften exponerades för ökande koncentrationer av SLS. En sigmoideum koncentration-respons modell försågs senare till data, så att IC75 eller IC50 värdena (hämmande koncentration på 25% och 50% minskning av cellernas viabilitet) kan beräknas (höger figur). Data presenteras som menar ± SEM, n = 3-5. Absorbansen av LDH assay mättes på 492 nm (referens vid 630 nm) och WST-1 analys vid 450 nm (referens på 630 nm). Data var anpassas och ändras från Lauenstein o.a. ²¹ Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4 : Representativa bilder av tredimensionella mikroskopiska färgning och bilden rendering av mänskliga avgiften. Levande vävnadskontroll och lyhördhet vävnad till tvättmedel, som en effektiv giftigt ämne, visas efter färgning av mänskliga avgiften med calcein AM (gul) och EthD-1 (röd). Travar av 30 µm togs med ett 10 X-objektiv (A) och återges (B). Skalstapeln anger 100 µm. magnetisering våglängder 488 nm och 543 nm, emission filter BP 505-550 nm och LP 560 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5 : Ammonium hexachloroplatinate (HClPt)-inducerad IL-1α och TNF-α sekretion i mänskliga avgiften efter 24 h exponering. AVGIFTEN var utsatta för tre koncentrationer (32 µg/mL, 64 µg/mL och 125 µg/mL HClPt) och två olika koncentrationer (1 µg/mL och 10 µg/mL) av SLS. Extracellulära och intracellulära IL-1α (A) och TNF-α (B) fastställdes av ELISA och normaliserade till det totala proteininnehållet. För att visa giltigheten av metoden visas en positiv aktivator av det medfödda immunsystemet, LPS, som en referens för intracellulära IL-1α (A) och extracellulära TNF-α (B) release, normaliserade till totalt proteininnehåll. Data presenteras som menar ± SEM, *p < 0,05 och ***p < 0,001; HClPt och SLS: n = 9, IL-1α_LP: n = 5, TNF-α_LP: n = 4 i tekniska dubbletter (Mann-Whitney test). Denna siffra har ändrats från Lauenstein o.a. ²¹ Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande Figur1: detaljerad beräkningsmässig bearbetning för bilder av mikroskopiska livskraft färgning använda renderingsprogram. Stegvisa operativa förfarandet för bildanalys av uppladdade LSM bilder för surface rendering av calcein-färgade livskraftig vävnad (A–G, jag) och spot detektion av etidiumbromid homodimer-färgade cellkärna (H, J–M). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande figur 2: översikt över computational bildanalys av mikroskopiska livskraft färgning av mänsklig lungvävnad. Livskraftig vävnad (gul) analyserades av surface rendering (B–jag) och döda cellkärna (röd) upptäcktes av spot detection (J–P). Det snapshot-läget användes för att exportera bilden (Q). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Den mänskliga avgiften-tekniken är väl etablerad i vårt laboratorium. Detta dokument ger en beskrivning av denna teknik och dess användning för toxicitetstester av ämnen i lunga vävnad ex vivo. I allmänhet med något laboratorium med hjälp av denna teknik bör sträva efter att ställa in ett test definition av kvantifierbara spänner, uppskattning av variabilitet och kvalitetskontroller garanterar giltigheten av experimentet. Möjliga standardförfaranden kan vara, till exempel att upprepa varje slutpunkt, t.ex., cytotoxicitet analysen, i minst tre biologiska givare (individuella körningar) med ett minimum av två till tre tekniska replikat per prov, inklusive positiva och negativa referenser. Laboratoriepersonal ska vara tränad att öka analysens konsekvens och minimera assay variabilitet.

Slutpunkter som ofta används för att bedöma immunmodulerande effekter av substanser på lungvävnad inkluderar cytotoxicitet mätningar med olika analyser (t.ex., LDH assay, WST-1 analys, mikroskopiska färgning assay), cytokinfrisättning analyser, såväl som förändringar i uttryck profil och karakterisering av förändringar i cellulära populationer av immunohistopathological metoder⁶. Dessutom finns det tekniker som beskriver visualisering av celler, såsom pulmonell dendritiska celler, i murina avgiften²⁸ som kan också överföras till mänskliga avgiften och kan därmed ge mer detaljerad inblick i den cellulära sammansättningen före och efter behandling med förmodad cytotoxiska substanser.

Denna grundläggande protokoll och teknik för beredning av mänskliga lungan vävnadssnitt är jämförbar med tekniker som har varit väl beskrivet i publikationer²⁹. Kort sagt, erhålls orgel materialet från patienter som lider av live-hotande kroniska sjukdomar såsom lungcancer, som måste genomgå kirurgi för resektion eller transplantation. Studierna måste godkännas av den lokala etiska kommittén. Patientens informerade samtycke krävs. Ställa in ett arbetsflöde mellan klinik och laboratorium är en kritisk fråga och kräver kommunikation och definitionen av gränssnitt och infrastruktur mellan båda platserna. Mänskliga lungan material måste behandlas direkt efter resektion att bevara livskraften i vävnaden. Det är värt att nämna att den teknik som beskrivs här för mänskliga avgiften kan användas till både unga och gamla lungor och friska och sjuka lungor. I USA, till exempel är det möjligt att få lungorna från friska organdonatorer som dött i olyckor eller vars organ har förkastats för transplantation.

Ett första viktigt steg i protokollet är inflationen av luftvägarna och omgivande parenkymet med agarosgelelektrofores lösning. Detta steg är nödvändigt att stelna mycket mjukdelar för efterföljande skivning förfarandet. Kvaliteten på mänskliga lungan material, baserat på sjukdom bakgrund, är avgörande här. Endast lober med intakt lungsäcken kan fyllas. Slutstadiet tumörer nära luftrör hindra ibland påfyllningen. Innan blåsa mänskligt material, har temperaturen av agaros lösningen kontrolleras noggrant. För mycket blod (eller andra vätskor, exudat) inuti människan lungvävnad oönskad utspädning av agaros och kommer att påverka de polymerisation processen. Efter inflation av lungvävnad och gelbildande av agaros på is, är lungorna skuren i sektioner med 200 till 300 µm tjocklek. Konsekvens av vävnad är en mycket viktig fråga. Om vävnaden är för mjuk, är skivning av lika delar svårt. Även om samma mikrotomen parametrar ställs in för varje givare, tjockleken på skivorna mellan givarna kan variera, på grund av enskilda villkor och förändringar under den blåsa bearbeta för varje lunga. Inhomogena fyllning av vävnaden kommer att resultera i olika segment tjocklekar. Istället för mätning och standardisera tjockleken på skivor, kan mätning av totala proteinhalten användas för att indirekt övervaka lung segment tjocklekar. Flera slutstadiet sjukdomar hindra skivning processen; t.ex.blod fartyg är extremt förtjockad i pulmonell hypertension och fibrotisk vävnad kan vara så stel att skivning av vävnad cylindrar är knappast möjligt och mikrotomen bladet behöver bytas ofta.

Efter beredning av mänskliga avgiften och intensiv tvättning steg, som är nödvändigt att ta bort cellfragment och släppt enzymer, vävnad sektioner kan användas för experiment²⁹. Mänskliga avgiften är odlade under normal cell kultur förhållanden och utsatta, exempelvis kemikalier, läkemedel eller lipopolysackarider. Tillfällig kontamination av avgiften på grund av (okänd) infektioner är ett specialnummer i kultur av mänskliga lungan material. Vävnadskulturer som visar infektioner måste kasseras och utrustningen desinficeras grundligt. Rumsliga avskiljandet mellan laboratorium platser används för beredning å ena och odling kan däremot bidra till att undvika cross-infektioner. Mikrotomen kan läcka när det gäller utrustningen, och lös hex skruvarna kan leda till motoriska skador och stopp av bladets rörelse. Inte varje del av utsnittet är gjord av rostfritt stål och så det oxiderar om inte torkas omedelbart ändra rengöring. För att övervinna utrustning problem, kan det vara nödvändigt att ha minst en backup-enhet.

I tidigare publikationer, har agaros rapporterat att tvättas och tas bort under intensiv tvättning steg efter beredning. I själva verket är detta inte möjligt, Agarens kan inte tas bort. För fullständig borttagning Agarens måste det vara åter smält vid höga temperaturer, vilket skulle förstöra vävnaden. Agarens i alveolerna och luftvägarna stör inte beskrivs slutpunkterna. Andra effektmått kan påverkas av närvaron av agaros (se även begränsningar). Behovet av att förbereda mycket fräsch vävnadssnitt har betonas, eftersom vävnad bärkraft är en kritisk fråga i kultur. Bronkokonstriktion är inte en giltig parameter för livskraft. Vi rekommenderar att du använder minst två eller tre oberoende cytotoxicitet analyser för att kontrollera livskraft omgivande parenkymet; Detta måste kontrolleras i varje experiment³⁰. Kvalitetskontroller i cytotoxicitet analyser fungera som indikatorer på otillräcklig vävnaden livskraft. Därför är det rekommenderat att bedöma lyhördheten av vävnad, till exempel i en effektiv giftigt ämne såsom ett rengöringsmedel i alla cytotoxicitet analyser. Baserat på dos-responskurvor, lägsta och högsta värden av absorption måste definieras för cytotoxicitet analyser och träffades för efterföljande experiment. Ytterligare ändringar av protokollet beror främst på de tillämpa kemikalierna och ändpunkterna av intresse. Tillämpligheten av olöslig eller mycket reaktiva kemikalier är begränsad. Den högsta lösningsmedel koncentrationen för DMSO är begränsad till 1%. Högre koncentrationer kan användas men kan leda till uttalad frisättning av proinflammatoriska cytokiner, såsom IL-8. Däremot, kan den stimulans som används vara relativt svag. I detta fall kan mängden vävnad ökas från två till fyra skivor per brunn. Detta synsätt begränsar livskraft till 24 h.

En stor begränsning av mänskliga avgiften är att i Tyskland de kan endast framställas från sjuka människors lung material. Patienter som opereras är normalt äldre än 50 år och 80% av patienter som lider av lungcancer är eller brukade vara rökare. Medicinering av patienter, såsom glukokortikoider, kan också påverka resultatet av experiment med mänsklig vävnad. Därför är det viktigt att: (i) validera varje experiment av positiva referenser att kontrollera livskraft, funktionalitet och känsligheten hos de enskilda vävnaden, och ii) kors-validera resultaten med friska, icke-sjuka, medelålders lungvävnad från försöksdjur (icke-mänskliga primater såsom cynomolgus och, om möjligt, mus, råtta, marsvin). Ju bättre de patologi poängen av sjuka vävnad, desto bättre de experimentella resultaten. Kraftigt sjuk vävnad kan knappast användas och mycket ofta visar begränsad bärkraft, cytokin som otillräckligt låga eller mycket höga nivåer, bakterie-eller svampinfektioner och mindre bronkokonstriktion. Givare-till-givare variation är högre jämfört med resultat från försöksdjur, återspeglar den individuella variationen av människor. Detta är dock inte en begränsning i allmänhet. som nämnts ovan, i andra länder (t.ex., USA) är det möjligt att få friska lungor från avlidna organdonatorer Förkastat för transplantation. Lyhördhet av vävnad har beskrivits väl för första upp till 48 h i akut exponering experiment. Livskraft och funktionalitet av vävnad reduceras efter många dagar av kultur eller efter lagring vid-80 ° C. Det är möjligt att kultur mänsklig lungvävnad för upp till ca 14 dagar. Lönsamheten fortsätter under denna tid; dock observeras en ökad variabilitet, samt en förlust av funktioner av flera cellpopulationer, såsom makrofager, i vävnaden, vilket leder till begränsad cytokinfrisättning svar på mitogena substanser. En annan begränsning för vissa endpoints är förekomsten av agaros i vävnaden, hinder, till exempel isolering av hög kvalitet och tillräckliga mängder RNA³¹ eller utarbetandet av encelliga suspensioner för efterföljande flödescytometri och fenotypning av celler. Möjligheten att få mekanistiska insikter i enskild cell svaren och funktionalitet är således begränsad.

Organotypic vävnad modeller, såsom mänskliga avgiften, anses ha en hög inverkan på grundläggande och icke-klinisk forskning. Mänsklig lunga material har en biologisk sammansättning som nära återspeglar den normala orgel-arkitekturen. Det innehåller exempelvis bostäder alveolära och bronkial epitelceller, glatta muskelceller, fibroblaster, endotelceller, nervtrådar och makrofager. Vävnaden är livskraftig och celler svarar på flera stimuli. Nervskada fibrer, även om skär, kan aktiveras lokalt, vilket leder till terminal reflex svar¹⁴. Följaktligen, ex vivo modellen erbjuder möjligheten att studera cellulära medfödda immunsvar, försvar svaren, cytokin signalering och induktion av cell yta markörer. Flera förbättringar i teknik, odling och validering av slutpunkter tillåta användning av mänskliga avgiften i translationell forskning. Exempel på framtida strategier är: i) validering av nya mål i mänsklig lungvävnad, ii) bedömning av immunsvar efter exponering, exempelvis kemikalier, läkemedel, nanopartiklar, etc., iii) tillskott av lungvävnad med immunceller, sådana som T-lymfocyter, iv) identifiering och ändring av molekylära mönster, till exempel efter exponering för luftvägarna sensibiliserande, sjukdomsframkallande ämnen eller aktiva föreningar att hämma utbildningsvägar. Dessutom v) luftvägarna remodeling och vi) neuronala förordning³². Det vetenskapliga fältet är intresserad dessa nuvarande och framtida strategier med avgiften. Dessutom finns det en mängd olika utvecklingar som hjälper till att förbättra den avgiften tekniken, såsom cryo-bevarande²⁰och vävnad stretching³³ för att efterlikna den naturliga rörelsen av vävnad under andning eller mekaniska ventilation.

Den stora fördelen med mänskliga avgiften jämfört med andra 3D-modeller är förekomsten av immunceller och nervfibrer. Experiment kan också utföras i mus, råtta och icke-mänskliga primater, som är de djurarter som fortfarande används oftast i farmakologi och toxikologi. Komplexiteten i mänsklig lungvävnad stöder översättning av resultat från djur till människa och från in vitro- in vivo. Inom ramen för befintliga alternativa analyser för identifiering av luftvägarna sensibiliserande, mänskliga avgiften är mycket komplexa och Tillåt inte insikter i enskild cell svaren. Ännu, mikroskopi och flöde flödescytometri kan ge information om cellulära svar, om just cellulära markören används i kombination, till exempel med apoptos, nekros eller intracellulära markörer. Det finns publicerade analyser som har validerats och rapporteras till har använts för identifiering av luftvägarna sensibiliserande. Dock gör framsteg inom användning av avgiften med alla sina fördelar över enskild cell analyser ett värdefullt bidrag i den meningen att tekniken kan användas för high-throughput screening, som beskrivs av Watson et al. ³⁴ de utvecklat en high-throughput screening test för att förutsäga luftvägarna toxicitet i murina cryo-bevarade avgiften. Med deras miniatyriserade 96 brunnar avgiften format upptäckt de liknande utläsningar i murina lavage vätska, att göra avgiften en genomförbar hög genomströmning-analysen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silicon hose 3.0 x 5.0 mm	A. Hartenstein (Leipzig, Germany)	SS04
Syringe	Faust Lab Science (Klettgau, Germany)	9.410 050
Coring tools	custom-made	custom-made
Trimming Blade Handle (FEATHER)	pfm medical ag  (Cologne, Germany)	205530001
Trimming Blades (FEATHER)	pfm medical ag  (Cologne, Germany)	205500000
Microtome: Tissue Slicer	Alabama R&D (Bad Homburg, Germany)	303400-ADPT	Krumdieck Tissue Slicer (MD6000)
Microtome blade	Wilkinson Sword (Solingen, Germany)	ENR-4027800011506
Tissue culture dishes	Sigma (München, Germany)	Z666246-420EA
Cell strainer filter (100 µm Nylon)	Becton Dickinson (Heidelberg, Germany)	BD352360
Inoculation loop	Copan Diagnostics (Murrieta, USA)	CD176S01
TPP Tissue culture plates 24wells	Sigma (München, Germany)	Z707791-126EA
Cassette	Thermo Scientific (Schwerte, Germany)	1000957
Nunc MaxiSorp flat-bottom	Fisher Scientific GmbH (Hannover, Germany)	44-2404-21
Nunc MicroWell 96-Well	Thermo Scientific (Schwerte, Germany)	260836
Confocal Microscope	Zeiss (Jena, Germany)		Confocal LSM Meta 510
Image rendering software	Bitplane AG (Zürich, Switzerland)		IMARIS 7.6
LSM Image Browser	Zeiss (Jena, Germany)
Multiwell-Reader	Tecan Group Ltd. (Männedorf, Switzerland)	Tecan infinite F200Pro	Plate Reader
Plate shaker	Edmund Buehler GmbH (Hechingen, Germany)	KM-2 Akku
BenchMark ULTRA	Ventana Medical Systems (Tucson, USA)		Automated IHC/ISH slide staining system
Assays
Cell Proliferation Reagent WST-1	Roche (Basel, Switzerland)	11644807001
Cytotoxicity Detection Kit (LDH)	Roche (Basel, Switzerland)	11644793001
Microscopical vitality staining	Invitrogen (Carlsbad, USA)	L-3224	LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit
BCA Protein Assay	Thermo Scientific (Schwerte, Germany)	23225
ELISA assay kit	R & D systems	various, e.g. DY210 (TNF-α) or DY200 (IL-1α)	DuoSet
Reagents
Agarose, low gelling temperature	Sigma (München, Germany)	A9414-100G
Balanced Salt Mixtures and Solutions, Cell Culture, Classic Media and Salts, Earle’s Balanced Salts (EBSS)	Sigma (München, Germany)	E2888-500ML
Penicillin and streptomycin	Lonza (Verviers, Belgium)	17-602E
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM F-12)	Gibco (Darmstadt, Germany)	11039-047	Culture medium
Dulbecco´s Phosphate with Ca and Mg (DPBS)	Lonza (Verviers, Belgium)	BE17-513F	Buffer solution
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma (München, Germany)	A9647-500G
Detergent	Sigma (Saint Louis, USA)	X100-100ML	Triton X-100
Washing buffer	Merck (Darmstadt Germany)	524653	0.05% Tween 20 in PBS