Summary
هنا، نقدم بروتوكول للتصوير بمرور الزمن والمرحلة تحليل فاسكولوجينيسيس في المختبر باستخدام مجهر التباين مقترنا مع برمجيات المصدر المفتوح، "تحليل فاسكولوجينيسيس الحركية". يمكن تطبيق هذا البروتوكول على كمي تقييم إمكانات فاسكولوجينيك من العديد من أنواع الخلايا أو الظروف التجريبية النموذجية أمراض الأوعية الدموية.
Abstract
فاسكولوجينيسيس هو عملية معقدة بموجبه الخضوع غشائي الخلايا الجذعية والسلف تشكيل السفينة حيثياته . أصبح التقييم الكمي فاسكولوجينيسيس قراءات مركزية من السلف غشائي خلية وظيفة، وذلك، بذلت محاولات عدة لتحسين نماذج فاسكولوجينيسيس في المختبر و في فيفو . ومع ذلك، محدودة النطاق، الأساليب القياسية مع قياسات ثابتة الفشل في القبض على العديد من جوانب هذه العملية ديناميكية للغاية. ولذلك، كان الهدف من وضع هذا البروتوكول الرواية لتقييم الحركية في المختبر فاسكولوجينيسيس كي كوانتيتاتي معدلات تكوين الشبكة وتثبيت الاستقرار، فضلا عن توفير نظرة ثاقبة الآليات المحتملة الكامنة وراء الأوعية الدموية خلل وظيفي. ويظهر تطبيق هذا البروتوكول استخدام الجنين مستعمرة غشائي تشكيل خلايا (اكفكس) يتعرضون لآلام السكري. اكفكس الجنينية المستمدة من دم الحبل السري بعد الولادة، ومثقف، ومطلي في الشرائح يحتوي على مصفوفة غشاء الطابق السفلي، حيث أنها خضعت فاسكولوجينيسيس. صور الآبار الشريحة بأكملها التي تم الحصول عليها باستخدام الوقت الفاصل بين الطوري أكثر من 15 ساعة. وجرى تحليل الصور لاشتقاق البيانات الكمية باستخدام برنامج تحليل يسمى تحليل الحركية من فاسكولوجينيسيس (كف). كف يستخدم تجزئة الصورة متبوعاً سكيليتونيزاتيون لتحليل مكونات شبكة الاتصال من أكوام من نقطة الوقت متعدد المرحلة تباين الصور لاشتقاق المعلمات عشر (قياس 9، 1 حساب) لهيكل الشبكة بما في ذلك: الشبكات، الشبكة المناطق المغلقة العقد وفروع وفرع مجموع طول، فرع متوسط الطول، تشعبت ثلاثية العقد، العقد تشعبت رباعية، هياكل شبكة والفرع إلى نسبة العقدة. تطبيق هذا البروتوكول، وحدد تغيير معدلات فاسكولوجينيسيس في اكفكس التي تم الحصول عليها من الحمل معقدة بمرض البول السكري. ومع ذلك، هذا الأسلوب له آثار واسعة النطاق تتجاوز نطاق ذكرت هنا. تنفيذ هذا النهج سيعزز آليا إلى تقييم وتحسين قراءات وظيفية فاسكولوجينيسيس والعمليات الأخرى المتفرعة بيولوجيا هاما في العديد من أنواع الخلايا أو الحالات المرضية.
Introduction
قدرة الخلايا السلف بطانية للخضوع فاسكولوجينيسيس، أو تشكيل السفينة حيثياته ، أمر بالغ الأهمية في إقامة المفرج الجنينية أثناء التنمية1. بالإضافة إلى ذلك، مواصلة تشكيل السفينة ونضوج الأوعية الموجودة من قبل، والذي يعرف باسم "الانجيوجينسس"، أيضا عملية رئيسية في التنمية وفي الحياة بعد الولادة للحفاظ على تدفق الدم والتوازن في جميع أنحاء الجسم2. كل عضو في الجسم فيعتمد على نظام الأوعية الدموية لإيصال الأوكسجين والمواد المغذية، وإزالة النفايات3. إذا كان لا يتم الاحتفاظ التوازن الأوعية الدموية، مثل أن تشكيل الأوعية الدموية وإصلاح أما غير كافية أو في الزائدة، يمكن أن تؤدي أمراض الأوعية الدموية4. ولذلك، تشكيل الأوعية الدموية والتكيف هي عادة دراسة، كما أنها ضرورية للحفاظ على صحة الجهاز ومتورطة في تنمية العديد من الدول باثولوجي.
نظراً لزيادة فهم مشاركة الأوعية الدموية في التنمية، فضلا عن مظاهر المرض والتقدم، وضعت فحوصات لنموذج فاسكولوجينيسيس والأوعية في المختبر و في فيفو5 ،،من67. النمذجة تشكيل السفينة ينطوي تصفيح خلايا الأوعية الدموية، مثل خلايا بطانية، في مصفوفة الغشاء يعزز تنظيم الخلية وتشكيل السفينة شبكات8،،من910. عادة ما يلي بين عشية وضحاها الحضانة، صوراً لخلية الشبكات التي تم التقاطها في نقطة مرة واحدة، مما أدى إلى عدد صغير من الصور لتحليل11،،من1213. ولذلك النهج التحليلي إلى حد كبير تم تطويرها والأمثل لمرة واحدة نقطة تقييمات10،14. بيد أن تحليلات ثابتة هي ببساطة غير كافية في التقاط دينامية عملية تشكيل السفينة والتبصير محدودة الآليات المحتملة التي تشارك. على الرغم من تزايد وتيرة التصوير سوف المحتمل أن توفر البيانات اللازمة لتحديد تشكيل حركية، سيكون تطبيق التحليلات المتقدمة سابقا إلى نقطة متعددة وقت التصوير نهج الكفاءة والعمل المكثف14. بالإضافة إلى ذلك، على الرغم من تطور تحليلات المتاحة تجارياً، رسوم الدفع كل صورة يجعل هذا الخيار التكلفة الباهظة للدراسات الحركية بآلاف صور التي تم إنشاؤها15. ولذلك، هناك حاجة في الميدان لنهج مبسط وفعال لالتقاط وتحديد فاسكولوجينيسيس في المختبر، بما في ذلك القدرة على تحليل مجموعات الصور الكبيرة المتولدة عن الوقت الفاصل بين الخلية حية مجهرية.
للتغلب على هذه القيود، تم تطوير نهج جديد هدف توسيع نقطة مرة واحدة تصوير للتمكن من تقييم ديناميكي من فاسكولوجينيسيس مع الصور المكتسبة كل 15 دقيقة16. بواسطة التقاط النقاط الزمنية متعددة على مدى عدة ساعات، يوفر هذا النهج تصوير أكثر تفصيلاً لعملية فاسكولوجينيسيس، فضلا عن التبصر في الآليات الممكنة التي تساهم في تكوين وصيانة شبكات السفينة. بالإضافة إلى تحسين نوعية للحصول على الصور والتردد، يتضمن هذا النهج البرمجيات الرواية في شكل مفتوح المصدر المكونات في17. البرمجيات، ويشار إليها بوصفها الحركية التحليل من فاسكولوجينيسيس (كف)، هو تطبيق مبسطة تتضمن معالجة الصور وتحليلها خصيصا لمجموعات الصور الكبيرة المتولدة من امتلاك الوقت متعدد نقطة. ويحلل كف المرحلة تباين الصور من خلال تجزئة الصورة متبوعاً سكيليتونيزيشن18. معلمات العشرة لهيكل الشبكة كمياً بكف بما في ذلك: فروع وشبكات مغلقة والعقد، شبكة المناطق، هياكل شبكة، تشعبت ثلاثية العقد، العقد تشعبت رباعية، فرع مجموع طول، فرع متوسط طول والفرع إلى العقدة نسبة (انظر 16من تخطيطي في الشكل 1). ويشمل تطبيق النهج كف النمط الظاهري رواية، المحسوب من فاسكولوجينيسيس في المختبر ، يشار إليه كالفرع لنسبة العقدة. عملنا مؤخرا أظهر أن هذه النسبة يدل على الاتصال بالشبكة، وقد يكون مرتبطاً بالعمليات الخلوية الأخرى المشاركة في تكوين شبكة الاتصال، مثل حركية16.
على الرغم من أن تم تقييم الجنين مستعمرة غشائي تشكيل الخلية (أكفك) فاسكولوجينيسيس في هذه الدراسات، يمكن تطبيق هذا النهج اقتناء وتحليل الصورة سهولة لتقييم أي أنواع الخلايا التي يخضع لها فاسكولوجينيسيس أو الأوعية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا النهج لتحديد تغيير وظيفة الأوعية الدموية الناجمة عن مجموعة متنوعة من الدول باثولوجي، مثل السكري الحملي، كما هو مبين في هذه الدراسات. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييف هذا الأسلوب لتقييم تكوين الشبكة والتفريع، التي تعتبر هامة للعمليات الأخرى ذات الصلة بيولوجيا. وهكذا، لا يزال يحدد الأثر المحتمل لتطبيق هذا النهج المبتكر للنظم البيولوجية الفريدة.
Protocol
1-الأعمال التحضيرية
-
ثقافة مستعمرة غشائي تشكيل خلايا (اكفكس)
ملاحظة: أكفك الجنين العينات المستخدمة في هذه التجارب كانت معزولة من دم الحبل السري البشري ومثقف قبل بيوكوري Angio (ABC) في "كلية الطب جامعة إنديانا" كما هو موضح سابقا6. وقد أجرى phenotyping الروتينية مراقبة الجودة داخل أي بي سي لتأكيد التعبير عن المستضدات غشائي كما هو موضح سابقا19،،من2021. العينات المستخدمة في التجارب كانت باساجيد الحد الأدنى (2-3 مرات). جميع زراعة الأنسجة العمل قد أنجز في غطاء زراعة الأنسجة. الكواشف كافة، بما في ذلك لوحات زراعة الأنسجة والحلول، كانت عقيمة.- يومين قبل التجربة، معطف 100 ملم جولة لوحات زراعة الأنسجة مع 6 مل الكولاجين من النوع 1 0.05 مغ/مل، واحتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
ملاحظة: الكولاجين النوع الأول هو المخفف في الماء المقطر المزدوجة التي تحتوي على 20 حمض الخليك في شمال البحر الأبيض المتوسط إلى تركيز عامل 0.05 مغ/مل. - في اليوم السابق للتجربة، تريبسينيزي وريبلاتي اكفكس على لوحات الكولاجين 1 مغلف نوع في 1.1.1. (انظر الملاحظة تحت 1.1).
- تريبسينيزي اكفكس، نضح وسائل الإعلام من الخلايا مطلي وتغسل مع مل 7 من برنامج تلفزيوني. نضح برنامج تلفزيوني، ثم أضف 2-3 مل من 0.5% التربسين واحتضان خلايا لمدة 2-5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- مباشرة بعد الحضانة مع التربسين، أضف 3 مل من EGM2 وبيبيت صعودا وهبوطاً لإزاحة كافة الخلايا ملتصقة. نقل تعليق خلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
- الطرد المركزي جميع العينات في ز x 500 لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- نضح المادة طافية وإعادة تعليق خلية الكريات في 1-2 مل EGM2. مزيج تعليق خلية جيدا وإزالة قاسمة صغيرة (20-40 ميكروليتر) لفرز الأصوات.
- إضافة أجزاء متساوية تريبان الأزرق إلى الخلية الكوة و "الماصة؛" 10 ميليلتر على هيموسيتوميتير. حساب عدد الخلايا في الأرباع الأولى الأربعة من هيموسيتوميتير.
ملاحظة: استخدم كلا الجانبين من هيموسيتوميتير لكل عينة التهم لزيادة الدقة. - أغسل لوحات زراعة الأنسجة المغلفة بالكولاجين، والتي تم إعدادها في الخطوة 1.1.1، مرتين مع مل 7 من برنامج تلفزيوني. بعد يسفط الغسيل PBS الثاني، أضف 10 مل متوسط نمو غشائي 2 (EGM2) الثقافة الإعلامية تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين إلى اللوحات.
- استخدام حساب الخلية التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.1.7، حساب حجم تعليق الخلية المطلوبة إلى لوحة 4 × 105 خلايا. لوحة 4 × 105 اكفكس على لوحات زراعة الأنسجة أعد الخطوة 1.1.8، واحتضان في غاز ثاني أكسيد الكربون (CO2) 37 درجة مئوية و 5% بين عشية وضحاها.
- يومين قبل التجربة، معطف 100 ملم جولة لوحات زراعة الأنسجة مع 6 مل الكولاجين من النوع 1 0.05 مغ/مل، واحتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
-
° قبل التجربة، تخزين اللوازم في 4 ج بين عشية وضحاها
- تخزين لوحة معدنية 3 "2"، الشريحة (الاحتفاظ في الحزمة حتى فتح في هود)، مربع العقيمة 20 ميكروليتير (ميكروليتر) نصائح والغشاء مصفوفة (مصفوفة).
ملاحظة: يتم الاحتفاظ المصفوفة في-80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل؛ دائماً الذوبان في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها أو لعدة ساعات قبل استخدامها.
- تخزين لوحة معدنية 3 "2"، الشريحة (الاحتفاظ في الحزمة حتى فتح في هود)، مربع العقيمة 20 ميكروليتير (ميكروليتر) نصائح والغشاء مصفوفة (مصفوفة).
- تأكد من توفر مساحة كافية للصور الموجودة على محركات الأقراص الثابتة للكمبيوتر.
ملاحظة: باستخدام التكوين المبينة في هذا البروتوكول، كانت حوالي 60 غيغابايت (GB) من المساحة المطلوبة كل تجربة (4 غيغابايت في البئر). بيد أن تقديرات المساحة تقوم على تكوين الأجهزة وسوف تحتاج إلى أن تكون مصممة لكل نظام.
2-البروتوكول 1: الإعداد التجريبية: إعداد الشريحة
-
جمع وإعداد اللوازم
- اليوم من هذه التجربة، جمع اللوازم لطلاء الخلايا على الشريحة، بما في ذلك دلو من الجليد ووعاء صغير من الثلج الجاف ومقص وماصة 20 ميكروليتر. رش جميع البنود مع الإيثانول 70% والقضاء على الجفاف مع مناشف ورقية ووضع العناصر في غطاء زراعة الأنسجة عقيمة.
- جمع جميع اللوازم المخزنة في 4 درجات مئوية (راجع الخطوة 1، 2) بما في ذلك لوحة معدنية، مربع من نصائح، والشرائح، ومصفوفة. رش مربع النصائح مع الإيثانول 70% ووضع المربع في حاوية الثلج الجاف.
ملاحظة: إزالة مصفوفة من الثلاجة 4 درجات مئوية فقط عندما تكون جاهزاً لاستخدام والحفاظ دائماً على المصفوفة على الجليد. - رش اللوحة المعدنية مع الإيثانول 70% وتضمين ذلك في الجليد في دلو الجليد. فتح حزمة تحتوي على الشريحة، ومكان الشريحة على اللوحة المعدنية للحفاظ على البارد.
-
تحميل مصفوفة على شريحة
- تعيين الماصة 10 ميكروليتر وإزالة التلميح من المربع تلميح الباردة مع الماصة. قص 1 سم تقريبا قبالة نهاية الحافة مع المقص.
ملاحظة: قطع متعامد على تلميح للحد من فقاعات في المصفوفة. يمكن تعيين الماصة إلى حجم أكبر قليلاً من 10 ميكروليتر لحساب مصفوفة الشائكة إلى داخل الطرف. - رسم المصفوفة ببطء إلى نصيحة ماصة. فورا بوضع طرف الماصة في وسط البئر. اللمس بلطف طرف الماصة إلى أسفل البئر ودفع المصفوفة ببطء للخارج.
ملاحظة: لا عبر ماصة، كهذا سوف يسبب فقاعات للنموذج. إذا كان أشكال فقاعة، البوب فورا باستخدام تلميح صغير. - تحتوي الشريحة على 15 بئرا الفردية. كرر الخطوة السابقة لكل بئر. استخدام تلميح ماصة جديدة لكل بئر للحفاظ على الاتساق والحد من ترسيخ مصفوفة داخل الحافة.
- حالما يتم تحميل الشريحة مع جميع الآبار التي تحتوي على مصفوفة، دفع الغطاء طوال الطريق على الشريحة، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة حتى يتصلب المصفوفة.
ملاحظة: لا تدع المصفوفة تجف. إضافة وحدة تخزين صغيرة (2-3 مل) من برنامج تلفزيوني في الحد الأقصى من أنبوب مخروطي 50 مل قرب الشريحة في الحاضنة الحد من مخاطر تجفيف المصفوفة.
- تعيين الماصة 10 ميكروليتر وإزالة التلميح من المربع تلميح الباردة مع الماصة. قص 1 سم تقريبا قبالة نهاية الحافة مع المقص.
3-بروتوكول 2: الطلاء اكفكس في المصفوفة
-
إزالة تمسكا اكفكس من لوحات زراعة الأنسجة، وجمع في تعليق
- الحصول على زراعة الأنسجة مطلي لوحات تحتوي على اكفكس في اليوم السابق (انظر الفرع 1-1-9). نضح EGM2 وسائل الإعلام وتغسل تمسكا اكفكس مرة واحدة مع مل 7 من برنامج تلفزيوني.
- نضح برنامج تلفزيوني، وإضافة 2-3 مل التربسين، واحتضان خلايا ملتصقة لمدة 2-5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- فور انتهاء الحضانة، أضف 3 مل من EGM2 وبيبيت صعودا وهبوطاً لإزاحة كافة الخلايا ملتصقة. نقل تعليق خلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
- كرر الخطوات 3.1.1-3.1.3 للعينات أكفك الثلاثة المتبقية إلى كل خلية أربع عينات جمعت في تعليق.
-
إعداد يمزج الرئيسي
- الطرد المركزي جميع العينات في ز x 500 لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- نضح المادة طافية وإعادة تعليق خلية الكريات في 1-2 مل EGM2.
- مزيج تعليق خلية جيدا وإزالة قاسمة صغيرة (20-40 ميكروليتر) لفرز الأصوات.
- إضافة أجزاء متساوية تريبان الأزرق إلى الخلية الكوة و "الماصة؛" 10 ميكروليتر إلى هيموسيتوميتير. حساب عدد الخلايا في الأرباع الأولى الأربعة من هيموسيتوميتير.
ملاحظة: استخدم كلا الجانبين من هيموسيتوميتير لكل عينة التهم لزيادة الدقة. - استخدام الخلية التهم من أعلى، وحساب حجم كل عينة خلية تحتوي على 1.4x104 خلايا. خلط كل خلية تعليق شامل والكوة 1.4 × 104 خلايا في أنبوب جديد لإعداد مزيج رئيسي لكل حالة تجريبية. إضافة وسائط EGM2 حيث يكون الحجم النهائي لكل مزيج الرئيسي 175 ميكروليتر.
- خلط كل مزيج الرئيسي قبل ميكروليتر 50 بلطف بيبيتينج واليكووت من المزيج الرئيسي إلى الآبار الفردية على الشريحة.
ملاحظة: جميع العينات هي مطلي في ثلاث نسخ، مع سيد يمزج المحسوبة لآبار 3.5 لضمان حجم كاف لآبار 3.
-
احتضان الشريحة
- احتضان الشريحة عند 37 درجة مئوية حتى يمكن نقلها إلى قاعة المجهر للتصوير.
ملاحظة: يجب أن يكون الوقت بين الطلاء وتصوير موجزة بقدر الإمكان الحد من فقدان البيانات أثناء المراحل المبكرة من فاسكولوجينيسيس.
- احتضان الشريحة عند 37 درجة مئوية حتى يمكن نقلها إلى قاعة المجهر للتصوير.
4-البروتوكول 3: إعداد المجهر والحصول على الصور
ملاحظة: لدراساتنا، البروتوكولات 2 و 3 وأجريت في الوقت نفسه الأفراد منفصلة. إذا كان يجب إتمام البروتوكولات 2 و 3 من نفس الشخص، ينبغي استكمال البروتوكول 3 خطوات 4.1 و 4.2 أدناه قبل البدء بالبروتوكول 2 أعلاه.
-
قم بتشغيل المجهر والكمبيوتر
- تشغيل واحد إلى اثنين في ساعة تقريبا قبل البدء بالتجربة، ويسخن حاضنة المرحلة الأعلى إلى 37 درجة مئوية وتعيين CO2 إلى 5%، وتعيين نسبة الرطوبة إلى 85%. ملء الخزان الرطوبة في الحاضنة، إذا كان فارغاً.
- ضع شريحة غرف فارغة في واحد من هذين الموقفين مفتوحة، وملء مع الماء المقطر. تأمين الحرارة التغذية المرتدة للتحكم في درجة الحرارة الدائرة، إذا كانت متوفرة.
ملاحظة: في حالة توفر الحرارة ردود الفعل، استخدام هذه "درجة حرارة الحاضنة" للتحقق من أن الدائرة قد اكويليبراتيد. - قم بتشغيل منفاخ ثانوي تعيين إلى 39-42 درجة مئوية الحرارة الشرائح من أسفل وتقليل التكثيف.
- إضافة شريحة ثانية فارغة حتى يمكن إضافة الشريحة التجريبية. هذه الشريحة بمثابة عنصر نائب موقع لتكوين إعدادات اقتناء صورة للآبار الفردية أثناء الإعداد.
- إضافة المياه إلى الخزان المحيطة بابار على الشريحة الثانية لتحاكي الظروف خلال التجربة بالتصوير. المياه المحيطة الآبار يتيح تقييم للرطوبة أثناء إعداد المجهر والتدفئة.
ملاحظة: الموازنة ما قبل المرحلة الأعلى حاضنة ومنفاخ الثانوية أمر حاسم للحفاظ على بيئة مستقرة تثقيف. خلية يعيش معظم غرفة تحكم إعطاء التغذية المرتدة في الوقت الحقيقي لدرجة الحرارة وأول أكسيد الكربون2، والرطوبة لتقييم مدى استعداد النظام. قبل المتابعة، تحقق تراكم الرطوبة على الشريحة، وتجفيف المفرطة للخزان كما شغل في 4.1.5. الرطوبة قد تحتاج إلى تعديل إذا كان هناك تجفيف المفرطة أو التكثيف في الدائرة. لزيادة نسبة الرطوبة، بإضافة مناديل تبلل بماء مقطر. لتقليل التكثيف، أما إنقاص إعداد الرطوبة بصيغته المعدلة في 4.1.1 أو التكثيف يمكن أن تكون علامة على درجة حرارة منخفضة، تحقق من إعدادات درجة حرارة الغرفة وتحديد المواقع من منفاخ الثانوية.
-
تكوين إعدادات اقتناء الصورة الأساسية خلال الموازنة.
يتم تكوين الحصول على ملاحظة: الصور من خلال البرنامج الذي يتحكم في المرحلة ومصراع الكاميرا. أداة إعداد المتعددة الأبعاد هو أسهل طريقة لتكوين البرنامج. وعلاوة على ذلك، سوف تحتاج البرمجيات إجراءات ضبط تلقائي لضمان مراقبة التركيز طوال فترة التجربة.- استخدم البرنامج لتعيين مواقف المرحلة متعددة لكل بئر. لهذا البروتوكول، حدد مركز الآبار.
- قم بتكوين الحصول على الصورة مثل في كل موقف المرحلة، كلها جيدا يتم تصويرها. على سبيل المثال، استخدام تيليسكان مع تداخل الصورة 10-20% والحقول حوالي 5 × 5، اعتماداً على الكاميرا والتكبير النهائي.
- تكوين الفاصل الزمني للتصوير كل 15 دقيقة.
ملاحظة: باستخدام التكوين المبينة في هذا البروتوكول، كل 15 بئرا للشريحة يتم تصويرها ضمن فاصل زمني لمدة 15 دقيقة.
-
تحميل الشريحة التجريبية
- وبعد الموازنة للدائرة الحاضنة، استبدال الشريحة فارغة مع الشريحة التجريبية.
ملاحظة: سوف يكون دائرة متوازن لدرجة الحرارة مستقرة وأول أكسيد الكربون2والرطوبة لمدة 20 دقيقة على الأقل. مجرد الشريحة التجريبية جاهزة، يتحتم أن يتم إكمال الخطوات بسرعة إلى أدنى حد "الوقت الميت" بين الطلاء والنقطة الأولى وقت التقاطها بالمجهر. وعلاوة على ذلك، تيسيرا للمقارنة بين تجارب التصوير، هذه المرة ينبغي أن تكون متسقة. في هذه التجارب، يلزم جميع الخطوات المبينة في البروتوكول 3 قسم 4.3 حوالي 30 دقيقة لإتمام. - إزالة غطاء الشريحة وإضافة المياه إلى الخزان المحيطة بابار على الشريحة.
ملاحظة: يتم إزالة الغطاء لمدة تجربة التصوير.
- وبعد الموازنة للدائرة الحاضنة، استبدال الشريحة فارغة مع الشريحة التجريبية.
-
تكوين إعدادات اقتناء الصورة النهائية
- وضع هدف "خطة CFI فلور دل" 10 X في المكان وحدد الحلبة المرحلة Ph1 على المكثف. مع أول بئر في التركيز، ضبط مسار الضوء دياسكوبيك لإنارة كوهلر وتكوين البصريات مرحلة التحقق من المحاذاة لحلقة المرحلة في المكثف مع قناع المرحلة الموضوعية.
- تكوين وقت التعرض وضبط كثافة المصباح لمرحلة التباين، وعادة أقل من 500 مللي.
- التنقل خلال كل مرحلة موقف مجموعة في 4.2.1 وتأكيد أن مركز البئر محدداً، وضبطه، إذا لزم الأمر.
- في كل موقف المرحلة، التركيز على الخلايا مطلي في البئر، وتعيين الموضع z الموقف المرحلة الذي يستخدم للتصوير في البرنامج.
- اختبار إليه ضبط تلقائي للصورة للمجهر. إذا كانت الأجهزة القائمة على ضبط تلقائي للصورة، ضمان على وتم وضعه بشكل صحيح لكل مرحلة المواقف.
ملاحظة: العينة والمرحلة قد الانجراف عمودياً من خلال التجربة، من المهم أن البرنامج الاختيار ضبط تلقائي للصورة في كل موقف المرحلة وكل مرة نقطة لضمان تصوير موثوق بها خلال الوقت الدورة. إذا كان ذلك ممكناً، ينبغي استخدام موقع ضبط تلقائي للعزم في النقطة الزمنية السابقة كنقطة انطلاق لروتين اوتوفوكس اللاحقة. وبهذه الطريقة، الانجراف الجارية يمكن تعديلها بسهولة. - تقليل أو إطفاء الأنوار في الغرفة مجهر والبدء في تجربة التصوير.
5-البروتوكول 4: صورة تحليل فاسكولوجينيسيس (كف) تجهيز والحركية
-
حفظ الصور من النقاط الزمنية الفردية رصة صور لكل بئر
ملاحظة: يمكن تصدير معظم البرامج لالتقاط الصور المشاجرات متعدد الصفحات (مداخن) السلاسل الزمنية. كف يهدف إلى العمل في مجموعات البيانات التي يمكن أن تشمل نقاط زمنية متعددة. وهكذا، يحدث تحليل على المكدس الصورة بأكملها لموقف مرحلة معينة. إذا لزم الأمر، يمكن استيراد الصورة برامج معالجة الصور واحدة من كل نقطة الوقت لإعادة بناء رصة صور. - فتح الصورة تجهيز البرمجيات على جهاز الكمبيوتر
-
إضافة كف لبرامج معالجة الصور
- اسحب الملف كف من مجلد إلى شريط رمادي في الجزء السفلي من نافذة البرنامج. انقر فوق 'حفظ' لإضافة البرنامج إلى القائمة.
-
افتح المكدس الصورة يتم تحليلها
- انقر فوق 'ملف' ثم 'فتح' من خلال القائمة المنسدلة في برامج معالجة الصور، أو سحب ملف الصورة في شريط رمادي كما في الخطوة 5.3.1.
- تحويل الصور إلى 8 بت بواسطة النقر فوق 'صورة'، 'اكتب'، '8 بت'.
-
إنشاء منطقة للفائدة (ROI)
- فتح إدارة العائد على الاستثمار عن طريق النقر على 'تحليل' في شريط الأدوات. ثم حدد 'أدوات' يتبع بعائد الاستثمار مدير ''.
- إنشاء عائد جديد بواسطة النقر فوق أدوات التحديد دائرة أو مستطيل في شريط أدوات الرسم في مجال التحديد المطلوب في الصورة. انقر فوق 'إضافة' في إطار إدارة العائد على الاستثمار لحفظ هذا الشكل.
ملاحظة: يمكن فتح عائد تم إنشاؤها مسبقاً بواسطة سحب حفظ رويس (مجلد مضغوط) في شريط 'سحب وإسقاط' لفتح في إدارة. - انقر فوق التسمية عائد الاستثمار المدرجة في إدارة العائد على الاستثمار لعرضها على الصورة.
ملاحظة: إذا كان العائد على الاستثمار ولن يظهر في الصورة، إنشاء عائد ثانية (أي الحجم/الشكل) وإضافته إلى المدير. مرة واحدة كل رويس تظهر في القائمة، انقر فوق ذهابا وإيابا بين الاثنين وعائد الاستثمار المطلوب سوف تظهر في الصورة. - قم بمحاذاة دوروا إذا لزم الأمر. مرة واحدة العائد على الاستثمار في مكان على الصورة في الموقع المطلوب، اذهب إلى القائمة وانقر فوق 'تحرير' ثم '"واضحة خارج"'. سيؤدي هذا إلى حذف بيانات الصورة خارج دوروا (مفيدة للأشكال غير مستطيل) لكل صورة في المكدس.
ملاحظة: يمكنك أيضا النقر على 'صورة' و 'المحاصيل' إذا كنت تستخدم عائد على شكل ريكتانجولارلي.
-
قم بتشغيل برنامج كف
- انقر فوق 'المكونات' في شريط القوائم.
- حدد شبكة تحليل المكونات الإضافية. هذا وسوف تفتح نافذة تحتوي على خيارات لتغيير الإعدادات الموجودة في الأداة الإضافية.
- تغيير أسلوب العتبة باستخدام السهم المنسدل.
- حالما يتم تحديد كافة الإعدادات المناسبة، انقر فوق 'موافق' لبدء معالجة البرمجيات.
ملاحظة: الإعدادات المناسبة تتحدد من خلال تصور الهيكل العظمى وقناع النسخ التي تم إنشاؤها بواسطة كف، التي تدل على أككوراري البرنامج لتحديد وتمييز الخلايا والشبكات من الخلفية في الصورة التباين المرحلة.
-
حفظ البيانات المولدة بكف
- وبمجرد انتهاء المكونات في التحليل، سوف اثنين من النوافذ المنبثقة على الشاشة بما في ذلك جدول بيانات مع القيم العددية وكومة من الصور تنصهر تصور التراجم هيكل عظمى وقناع.
- حفظ القيم العددية بالتنقل إلى الركن الأيمن العلوي من جدول البيانات والنقر فوق 'تحرير' ثم 'نسخ' أو 'قطع' للصق القيم في جدول بيانات excel.
- انقر فوق صورة الهيكل العظمى وقناع تنصهر فيها. حفظ المكدس تنصهر فيها هيكل عظمى/قناع الصورة كملف تنسيق ملف صورة ذات علامات (TIFF) بواسطة النقر فوق 'الملف،' '"حفظ باسم"،' 'TIFF'.
- حفظ على النقيض من المرحلة اقتصاص الصورة المكدس (تم إنشاؤها باستخدام العائد على الاستثمار) بواسطة النقر فوق 'ملف'، '"حفظ باسم"،' 'TIFF.'
- انقر فوق في إطار إدارة العائد على الاستثمار، وتحديد العائد على الاستثمار المستخدمة لاقتصاص الصور. انقر فوق 'المزيد' تليها 'حفظ' لحفظ دوروا لاستخدامها في المستقبل.
ملاحظة: استخدام نفس العائد على الاستثمار سيساعد على الحفاظ على الاتساق عبر التحاليل.
Representative Results
كف ينتج تمثيلات مرئية لهيكل الشبكة
التباين بين اكفكس وخلفية المصفوفة في الصور التباين المرحلة تمكن كف تحديد الهياكل الخاصة بالخلية. يتم تمثيل شبكات أكفك حددها كف التصوير كالتراجم هيكل عظمى وقناع لتوضيح الهياكل المستخدمة بواسطة البرنامج للقياس الكمي (الشكل 2أ). الأهم من ذلك، يمكن تقييم نوعي للنسخ هيكل عظمى وقناع التعرف السريع على كف حساسية ودقة، والتي يمكن أن تكون مفيدة في تحديد إعدادات العتبة المثلى وتفسير نتائج التحليل. عندما نوعية الصور التباين في المرحلة العالية وتباين كافي ويتحقق، كف يحدد بدقة شبكات أكفك كما يتبين من التشابه بين الصورة التباين المرحلة والمولدة بكف هيكل عظمى وقناع النسخ (الشكل 2 A و الفيديو 1).
وبدلاً من ذلك، إذا لم يكن لديك مرحلة التباين الصور عالية التباين و/أو التحف الفنية للتصوير مثل تحدث gridding، يتم تقليل دقة الكشف عن شبكة وتصبح نتائج ملتبسة (الشكل 2ب). بالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا يحجب تشكيل فقاعات الهواء داخل الخلية وسائل الإعلام الكشف عن دقة (الشكل 2). ومع ذلك، غالباً ما تكون التغلب على المشاكل مع جودة الصورة من خلال اختيار أساليب مختلفة العتبة المدرجة في البرنامج كف. على سبيل المثال، وقد تم تحليل الصورة مرحلة التباين في الشكل 2ب استخدام إعدادات تجهيز الصورة متطابقة باستثناء الأسلوب العتبة. من النسخ هيكل عظمى والقناع، فمن الواضح أن العتبة أوتسو أسفرت عن كشف أكثر دقة من الشبكات أكفك التي تظهر في الصورة على النقيض المرحلة (الشكل 2ب). ولذلك، جودة الصورة أمر حاسم في تحقيق نتائج دقيقة وذات مغزى في هذا التحليل. ومع ذلك، تسمح أساليب العتبة مختلفة المدرجة في واجهة المستخدم كف التكيف لتحليل الصور استناداً إلى نوعية الصور الإدخال.
الوقت الفاصل بين الفحص المجهري يحدد الاختلافات النوعية والكمية في أكفك فاسكولوجينيسيس عقب التعرض لمرض السكري الحملي داخل الرحم
في الآونة الأخيرة، تم تطبيق النهج التحليلي الذي كف لتقييم دالة أكفك الجنين عقب التعرض للأمهات نوع 2 السكري (T2DM) في الرحم16. استخدام كف، حددت حركية غيرت من فاسكولوجينيسيس في اكفكس الجنين يتعرض إلى T2DM. ومع ذلك، بالإضافة إلى T2DM أيضا التعرض، والذي يحدث في جميع أنحاء أكمله من الحمل أو السكري الحملي (GDM) تنمية تعصب الجلوكوز عادة في الربع الثالث من الحمل، يضعف أكفك الدالة13. ولذلك، تم تطبيق كف لتحديد إذا تعرض غدم اكفكس أيضا عرض حركية تغيير تكوين الشبكة أكفك. المرحلة 1 (0-5 ح) وتم تقييم المرحلة 2 (5 + ح) استخدام الوقت الفاصل مجهرية مقترنة بكف تحليل (الشكل 3). المرحلة الممثل تباين الصور المكتسبة في بداية الحصول على الصور (0.50 ح) وطوال الوقت (ح 5.00 و 10.00) تصور تشكيل شبكة أكفك في أربع عينات اختبار من يوم واحد تجريبية (الشكل 3 و 1 فيديو ). رغم ما يعادل خلية تحميل، كما هو ملاحظ في الصور مرحلة التباين في ساعات 0.50، تتجلى الاختلافات النوعية في بنية الشبكة في نقاط الساعة 5.00 وساعة 10.00. اكفكس من الحمل غير معقدة (UC) تشكل شبكة معقدة وصعبة 5 ساعات ما بعد الطلاء، مشابهة ل البيانات المنشورة سابقا لدينا16. على العكس من ذلك، اكفكس من غدم عينة 1 نموذج (GDM1) قليلة جداً شبكة الهياكل غير مترابطة. ومع ذلك، لا ينعكس هذا النمط في جميع أكفك العينات التي تم الحصول عليها من الحمل غدم، يدل على عدم التجانس بين العينات. عينات GDM2 و GDM3 عرض تشكيل شبكة أكبر مقارنة ب GDM1، على الرغم من ظهور أنماط الاتصال تغيير مقارنة بتفرد العينة. الأهم من ذلك، تدابير كف العديد من المكونات الهيكلية شبكات أكفك لتحديد تعمل واضحة وخفية على حد سواء.
وبالإضافة إلى توليد التراجم هيكل عظمى وقناع لهيكل الشبكة، كوانتيتاتيس كف المقاييس العشرة لهيكل الشبكة، بما في ذلك العدد من هياكل الشبكات الفردية، العقد، العقد تشعبت الثلاثي، تشعبت رباعية العقد، والفروع، ومجموع طول الفرع وفرع متوسط الطول وفرع لنسبة العقدة، مجموع إغلاق الشبكات وشبكة المنطقة16. كف تقوم بتجميع البيانات الخاصة بكل نموذج في جدول واحد من القيم لكافة الصور من خلال الوقت. ويتضمن الجدول 1 تمثيلية البيانات الخام من دراسة التصوير واحد لواحد أكفك عينة. معلمات لهيكل شبكة تقاس بكف يتم تنظيمها في الأعمدة، ويتم تنظيم البيانات الخاصة بصور متسلسلة المكتسبة على مر الزمن في الصفوف. مثلاً، في دراساتنا، الصورة 1 تم الحصول عليها الطلاء بعد 30 دقيقة مع الصور اللاحقة التي يجري جمعها كل 15 دقيقة القيم الأولية التي تم إنشاؤها بواسطة كف يمكن ثم رسوم بيانية أو مواصلة تحليلها باستخدام أكثر تعقيداً الإحصائية النهج16.
تظهر الرسوم البيانية الخمسة التي تصور قيم المتوسط الحسابي لهيكل الشبكة من ثلاث تجارب منفصلة عينة واحدة غير معقدة (UC) وثلاث عينات غدم (الشكل 4). تحليل العينة تفرد في هذه التجارب المنجزة وبالمثل لسبق UC عينات16. سابقا، حددت فيه أن أكفك فاسكولوجينيسيس في المختبر ثنائية طورية، تتألف من المرحلة 1 (0-5 ح) والمرحلة 2 (5-10 ح)16. ويتسق هذا النمط في الدراسات الحالية، كما يتضح من الرسم البياني تصور بيانات الشبكة المغلقة (الشكل 4). وشكلت العينة UC عدد أكبر من الشبكات المغلقة بالمقارنة مع كل ثلاثة من هذه العينات غدم. من المثير للاهتمام، ثلاث من العينات الأربع التي يبدو أن وقت مماثل إلى أقصى حد عدد من الشبكات المغلقة، التي تحدث بين 2.5 و 3 ساعة. ومع ذلك، كانت العينة GDM2 أبطأ للوصول إلى الشبكات المغلقة القصوى، التي وقعت 5 ساعات ما بعد الطلاء. و، على الرغم من تشكيل شبكات القصوى أقل مقارنة بتفرد العينة العينة GDM2، الشبكات التي تشكل المثل إلى عينة UC على مر الزمن. على العكس من ذلك، GDM1 و GDM3، التي شكلت شبكات أقل مقارنة بتفرد العينة، كما أظهرت انخفاض عام في عدد الشبكة على مر الزمن. عموما، من الرسم البياني يصور رقم الشبكة المغلقة، الواضح أن جميع العينات التي أكفك عرض نمط ثنائي طورية من تكوين شبكة الاتصال، ولكن تختلف معدل تكوين وأقصى حد عدد من الشبكات التي تحققت عبر العينات.
منطقة الشبكة يمثل متوسط المساحة داخل الشبكات المغلقة التي شكلتها في اكفكس. ولذلك، أكبر شبكة مغلقة رقم أصغر مجالات شبكة الاتصال. وينعكس هذا النمط في مجال شبكة الرسوم البيانية حيث كانت العينة جامعة كاليفورنيا، التي شكلت عدد أكبر من الشبكات المغلقة، أصغر شبكة المناطق على مر الزمن مقارنة بالعينات غدم الثلاثة (الشكل 4). GDM2، الذي بلغ أقصى الشبكات المغلقة ببطء أكثر، معارضها مجال شبكة عالية في البداية، ولكن استقرار المنطقة على مر الزمن، وهذا كان آخر يشبه نموذج جامعة كاليفورنيا في 15 ساعة. مع مرور الوقت، زادت منطقة الشبكة متوسط في جميع العينات بسبب استقرار شبكة دي. ومع ذلك، أظهرت بعض العينات، مثل GDM1 و GDM3، زيادة سريعة أكثر في مجال شبكة، التي من المحتمل تشير إلى استقرار انخفاض مقارنة بالعينات الأخرى العارضة زيادة تدريجية أكثر.
معرض اكفكس غدم يتعرض استقرار شبكة تخفيض
نسبة الفروع إلى العقد النمط الظاهري رواية حسبت بكف والمحددة في دراساتنا السابقة، وهذا يدل على شبكة اتصال16. في الدراسة الحالية، وقد عينة UC نسبة منخفضة، مما يمثل مستوى عال من الاتصال بالشبكة التي تم الاحتفاظ بها على مر الزمن (الشكل 4). على العكس من ذلك، كان ثلاث عينات غدم نسبة أعلى من فروع للعقد، لا سيما في المرحلة 2 من تكوين شبكة الاتصال. وهذه الملاحظة يوضح الاتصال انخفاض واستقرار هياكل شبكة دي.
وعموما، شكلت GDM1 أقل من العقد والفروع مقارنة بالعينات الأخرى، مع تخفيض الإبقاء على مدى التجربة. GDM2 و GDM3 والإبقاء على أكبر عدد من الفروع مقارنة بتفرد العينة، لا سيما بين 5-15 ح. وكانت إعداد العقد اكتشف في شبكات GDM2 و GDM3 أكثر مماثلة لعدد العقد في عينة جامعة كاليفورنيا، لا سيما بين ح 10-15. أكبر عدد من الفروع، ولكن عدد مماثل من العقد، يمكن أن تمثل الفرع زيادة بنسبة العقدة واضحا في نقاط زمنية لاحقة في عينات غدم. الأهم من ذلك، يمكن أن تكون التغيرات المتزامنة في فرع والعقدة رقم يصعب تفسيره في رسومات منفصلة. ومع ذلك، فرع الرواية إلى نسبة عقده يوفر وسيلة لتقييم كيف تؤدي التغييرات، بما في ذلك التغييرات الطفيفة التي يصعب اكتشافها في الرسوم البيانية الفردية، في عدد كل من فرع وعقده، في تغيير شبكة الاتصال.
الشكل 1 : التخطيطي تبين 10 معلمات كمياً بالحركية التحليل من فاسكولوجينيسيس (كف)- كف كوانتيتاتيس عشر معلمات متميزة لهيكل الشبكة. كافة المعلمات هي مرمزة والمبينة في التخطيطي عددياً (1-10). تتضمن معلمات عدد الفروع (أخضر، 1)، إغلاق الشبكات (الأزرق، 2)، والعقد (الأحمر، 3)، متوسط مجال شبكة (أورانج، 4)، العدد من هياكل الشبكات (أسود، 5) والعقد تشعبت الثلاثي (أصفر، 6)، والعقد تشعبت رباعية (الأرجواني، 7)، كذلك المجموع (9) ومتوسط طول الفرع (10)، وأن نسبة عدد الفروع إلى عدد العقد (10). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : تحليل الحركية من فاسكولوجينيسيس (كف) كوانتيتاتيس هيكل الشبكة. (أ) التراجم هيكل عظمى وقناع شبكة الهياكل المحددة باستخدام مرحلة التباين الصور توفير تمثيل مرئي لشبكة الهياكل المحددة وقياسها كمياً بكف كف. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. (ب) صورة تباين مرحلة ممثل أكفك شبكات 10 ح الطلاء بعد أن التباين المنخفض وشبكة من علامات من خياطة الصور الفردية معا. يمكن تحديد أساليب العتبة مختلفة، مثل الوسط أو أوتسو، في كف المكون الإضافي لتحسين دقة كوانتيتاتيون، وإذا كانت مرحلة التباين الصور لها على النقيض منخفضة أو في حالة حدوث gridding. تظهر الترجمات هيكل عظمى وقناع للصورة التباين المرحلة لأساليب العتبة يعني واوتسو. مرحلة التباين صور تم التقاطها باستخدام هدفا X 10. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : التعرض "غدم داخل الرحم" يغير تشكيل شبكة أكفك. تم القبض على الصور لتشكيل شبكة أكفك عند فواصل زمنية 15 دقيقة ح 15 من الطوري. صور التباين المرحلة الممثل في زيادات ح 5، بدءاً من وقت التصفيحات (0.5 ح)، ترد تفرد وثلاثة غدم عينات. مرحلة التباين صور تم التقاطها باستخدام هدفا X 10. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : اكفكس يتعرض إلى داخل الرحم غدم معرض غيرت شبكة تشكيل حركية. وتم الحصول على اكفكس من حمل غير معقدة (UC) أسود وثلاث حالات حمل تعقدت السكري الحملي (GDM 1-3، الأحمر). تم القبض على مرحلة التباين الصور في الشبكات الفواصل ل h. 15 برنامج التحليل الحركي من فاسكولوجينيسيس (كف) quantitated مغلقة 15 دقيقة وشبكة المناطق وفروع، والعقد ونسبة الفروع إلى العقد. وتمثل البيانات يتضح ± يعني الخطأ القياسي لمتوسط ثلاث تجارب منفصلة لكل عينة (SEM). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الفيديو 1: التعرض "غدم داخل الرحم" يغير الحركية لتشكيل شبكة أكفك. تم القبض على الصور لتشكيل شبكة أكفك عند فواصل زمنية 15 دقيقة ح 15 من الطوري. مرحلة التباين الصور تظهر تفرد وثلاث عينات غدم ما يزيد على 15 ح بدءاً من ح 0.5. شريط مقياس يمثل 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
| الصورة | فرع مجموع الشبكات | العقد | مثلثات | الرباعيات | الفروع | فرع مجموع طول * | فرع متوسط الطول * | فرع لنسبة العقدة | الشبكات المغلقة | شبكة مجال * * |
| 1 | 382 | 290 | 278 | 11 | 943 | 47210 | 124 | 3.25 | 9 | 480214 |
| 2 | 284 | 345 | 337 | 8 | 940 | 50699 | 179 | 2.72 | 16 | 264469 |
| 3 | 205 | 376 | 366 | 9 | 910 | 55728 | 272 | 2.42 | 27 | 150621 |
| 4 | 162 | 422 | 407 | 15 | 947 | 59692 | 368 | 2.24 | 40 | 98713 |
| 5 | 132 | 454 | 441 | 12 | 967 | 61923 | 469 | 2.13 | 53 | 72951 |
| 6 | 122 | 435 | 419 | 14 | 907 | 62587 | 513 | 2.09 | 68 | 56948 |
| 7 | 88 | 429 | 411 | 17 | 852 | 63983 | 727 | 1.99 | 74 | 51429 |
| 8 | 68 | 451 | 437 | 13 | 874 | 63960 | 941 | 1.94 | 74 | 51780 |
| 9 | 93 | 437 | 417 | 18 | 905 | 60901 | 655 | 2.07 | 49 | 82919 |
| 10 | 126 | 511 | 487 | 24 | 1075 | 61981 | 492 | 2.1 | 37 | 116857 |
| 11 | 49 | 397 | 384 | 12 | 737 | 61823 | 1262 | 1.86 | 79 | 48805 |
| 12 | 81 | 376 | 364 | 10 | 751 | 56817 | 701 | 2 | 63 | 64431 |
| 13 | 98 | 509 | 482 | 26 | 1028 | 60799 | 620 | 2.02 | 44 | 98056 |
| 14 | 93 | 449 | 416 | 31 | 909 | 58282 | 627 | 2.02 | 45 | 94081 |
| * مقربا إلى أقرب ميكرون، * * مقربا إلى أقرب ميكرون ^ 2 | ||||||||||
الجدول 1: ممثلة من البيانات الخام من تصوير واحد لواحد أكفك عينة الدراسة-
Discussion
كف يتيح تقييم مجموعات البيانات الكبيرة مع نقاط زمنية متعددة
تقليديا، وكوانتيتيشن من فاسكولوجينيسيس في المختبر تمثلت واحدة أو بضع الوقت نقطة القياسات. هذا النهج الثابت ببساطة غير كافية لالتقاط والتحديد الكمي لعملية دينامية ومعقدة. ولذلك، هذا الأسلوب الرواية قد وضعت لتمكين تحليل كفاءة حركية تشكيل شبكة التبصر في الآليات الجزيئية المحتملة التي تشارك في عملية دينامية فاسكولوجينيسيس. الكفاءة والتشغيل الآلي للمكاتب، عناصر هامة في تطوير تقنيات مبتكرة لتوليد وتحليل كميات كبيرة من البيانات التصوير. ووضعت كف على وجه التحديد لتحليل رصات الصور كبيرة تتألف من مئات الصور لتقليل الوقت والعمالة اللازمة لاستخلاص استنتاجات ذات معنى بيولوجيا من الوقت الفاصل بين مجموعات البيانات. الأهم من ذلك، كف تجري معالجة الصور وتوليد البيانات في غضون ثانية للصغيرة (أقل من 100 صور) صورة المداخن ودقيقة لأكبر (أكثر من 100 صورة) صورة المكدسات، أسفر عن كفاءة لا مثيل لها. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تنظيم البيانات في جداول البيانات بالزمن ومعلمات قياس الجيل السريع للعرض البياني والتحليل الإحصائي.
التحديات في التطبيق الناجح لهذا النهج
على الرغم من أن هذا الفحص يتضمن تحسينات للحصول على الصور وتحليلها، قد تعوق بعض تحديات التنفيذ الناجح. وتشمل العقبات الرئيسية الأربعة الرطوبة الاستقرار ودقة توقيتها من الطلاء للحصول على الصور وموثوقية الأجهزة والبرامج وإدارة مجموعات كبيرة من البيانات التي تم إنشاؤها لكل تجربة. تصوير الخلايا الحية مستقرة على مدى عدة ساعات يمكن أن يكون تحديا. على وجه التحديد، مطلوب الترطيب المناسبة ومتسقة للدوائر التصوير. شرائح الأوعية المستخدمة في هذا التحليل، التي صممت لفحوصات الأوعية المستندة إلى مصفوفة parallelizing. يجعل حجمها منخفضة، ما يقرب من 50 ميليلتر، التبخر والتكثيف اعتبارات هامة لشروط الثقافة الموسعة. ولمكافحة هذه المشكلة التجريبية، من الضروري استخدام حاضنة الذي ينظم الرطوبة. ومع ذلك، قد يكون أيضا المطلوبة لزيادة هذه اللائحة إذا تجفيف المفرطة في دائرة التصوير يحدث على مر الزمن. وجدنا أن أبسط نهج زيادة الرطوبة لزيادة مساحة سطح المياه في الدائرة. ولتحقيق هذا الهدف، تقترح لدينا بروتوكول مصادر المياه الثلاثة التالية: شريحة ثانية غرف مملوءة بالماء، وأيضا حيث يتم قياس درجة حرارة الحاضنة، المياه في المنطقة المحيطة بابار على الشرائح، وورق الترشيح ترطب أو مناديل. على العكس من ذلك، يحدث التكثف عند درجة حرارة الهواء في الغرفة يبرد الجزء السفلي من الشريحة والرطوبة داخل قاعة يتكثف على الشرائح والآبار. هذا التعقيد يمكن أن يؤدي إلى إضعاف وسائل الإعلام الخلية وتأثير لينسينج الذي يتداخل مع التباين المرحلة. وفي هذه الدراسات، تم تصغير التكثيف من خلال التطبيق للهواء الساخن (39-42 درجة مئوية) على الجزء السفلي من الشريحة.
هو أحد الاعتبارات رئيسية لأية دراسة الوقت الفاصل بين الاتساق بين بدء التجربة والتصوير. توقيت عندما يبدأ تصوير أمر بالغ الأهمية لتفسير الأحداث المتلقين للمعلومات. لضمان دقة التوقيت لهذا التحليل، ينبغي أن تتم مراقبة مشددة الوقت بين الطلاء الأولى والنقطة الزمنية المصورة الأولى. في الممارسة العملية، يمكن التقليل من هذا "الوقت الميت"، ولكن الأهم من ذلك، فإنه يجب أن يكون متسقا للسماح بتجارب في أيام مختلفة بالمقارنة. على سبيل المثال، نحن نتوقع في هذا البروتوكول وقت ميت لما يقرب من 30 دقيقة. ويمكن تيسير هذا بالقرب من إعداد تجريبية والتصوير المرافق.
ما قد يبدو وكأنه التفاصيل الدنيوية للوهلة الأولى هامة للبرمجيات واستقرار الأجهزة، وإدارة البيانات. البرمجيات وبرامج تشغيل الأجهزة المقترنة وبيئة الشبكة والبرامج الآلية التحديثات كل يؤثر على استقرار البرنامج. أنها تستحق اختبار هذا البروتوكول في "تشغيل الجاف" تحديد الاختناقات والمصادر المحتملة للمشاكل في الحصول على الصورة؛ على سبيل المثال، تحقق من إعداد الخلية الحية لا يمكن الاعتماد عليها، وموثوقية المرحلة ومصراع الكاميرا، وسياسات تكنولوجيا المعلومات المؤسسية في نظام التشغيل، وتحديثات البرامج.
إدارة البيانات هي شغلا شاغلا لأي تجربة التصوير الذي يولد مئات الآلاف من الصور. لحسن الحظ، البرمجيات التجارية غالباً ما يتحقق من المساحة المتوفرة قبل البدء بتجربة تصوير. بيد أن هذا التحليل يشمل أيضا معالجة ما بعد التقاط الصور والتحليل التي يمكن إضافة إلى عبء مساحة محرك الأقراص الثابتة وتتداخل مع تصوير التجارب، إذا كانت المساحة المتوفرة محدودة. علاوة على ذلك، الأمن والاستقرار للكمبيوتر لا يمكن ضمانة، حتى مع حلول الأجهزة مثل صفيف مكرر من الأقراص متطابقة. وهكذا، استراتيجية لإدارة بيانات التأكد من الفضاء على محركات الأقراص الثابتة للكمبيوتر للتجارب الجارية وأرشفة البعيد قوية، على سبيل المثال مع مورد محفوظات مؤسسية، أمر ضروري.
استراتيجيات تحقيق أقصى قدر من جودة الصورة
على الرغم من قدرة كف دقة التعرف اكفكس من خلفية ماتريكس قوية، حساسية المقايسة فيعتمد على جودة الصورة. على سبيل المثال، إذا كانت الصورة على النقيض منخفضة، سيكشف البرنامج شبكات الخليوي بأقل دقة (الشكل 2ب). نوعية على النقيض من المرحلة تتأثر بعوامل عدة، بما في ذلك إعدادات المجهر المستخدمة للحصول على الصور، تحميل المصفوفة ووسائط الإعلام تعليق الخلية أثناء إعداد المقايسة، والحفاظ على مستويات الإعلام داخل الآبار طوال التصوير. لتحسين تباين المرحلة لهذه الاختبارات، قدمت تعديلات طفيفة لمحاذاة الدائري المرحلة في المجهر لتحسين التباين. بالإضافة إلى ذلك، تم اختبار إعداد عينة صارم لضمان تحميل الوسائط متساوية ومتسقة. إذا كان المبلغ من المصفوفة و/أو وسائل الإعلام التي تم تحميلها في الآبار أما تحت أو فوق النطاق الأمثل، يمكن أن تشكل غضروف مما يؤدي إلى تباين مرحلة تغيير. وأخيراً، نظراً لصغر حجم السائل في الآبار، أنها حاسمة للحفاظ على مستويات الإعلام بالتقليل من التبخر والتكثيف، كما ذكر أعلاه. عموما، الأمثل المقايسة الحاسمة لإنشاء صور ذات جودة عالية التباين للتحليل.
بالإضافة إلى مرحلة نوعية على النقيض، يمكن أيضا أن تؤثر عوامل أخرى نتائج الفحص بما في ذلك التلوث بوسائل الإعلام، عيوب في المصفوفة، وجسيمات أو الحطام في مصفوفة أو وسائل الإعلام. التلوث يشكل خطرا من هذا التحليل نظراً لأنه ينطوي على تصوير الخلايا الحية على مدى عدة ساعات في غرفة الفحص المجهري. للحد من خطر التلوث، يتم تحميل المعلقات مصفوفة وخلية على الشريحة في غطاء عقيمة. وبالإضافة إلى ذلك، هو عادة مطلي كل عينة في تكرار أو ثلاث نسخ لتجربة للتقليل من خطر فقدان البيانات بسبب المسائل غير المتوقعة مثل الحطام أو الخلط التحليل الجزيئات.
عينة التغايرية محركات الأقراص تحتاج للمقايسة زيادة حساسية
لاحظ عدم التجانس وقدمت تقريرا في دراسات سابقة من اكفكس يتعرض إلى غدم13. مستوى عال من عدم التجانس في وظيفة الخلية التي لوحظت في هذه العينات هناك تكهنات بأن ذلك يعزى إلى عدة عوامل منها شدة الأم المرض، ومدة المرض، وأسلوب الإدارة المستخدمة لتنظيم مستويات السكر في الدم. الأهم من ذلك، أن هذا النهج التحليلي يلتقط فاسكولوجينيسيس مجموعة ديناميكية من أكفك، مما يجعل من إمكانية تحديد الاختلافات المظهرية نظراً لعدم تجانس الوظيفية في عينات من الحمل غدم. عموما، يمكن الأخذ باستخدام عينات المريض الأولية، مثل تلك المستخدمة في هذه الدراسات، وتقلب أكبر مقارنة بخط خلية. كما ينصب تركيز أكبر على متعدية دراسات شملت العينات الحيوانية أو البشرية الأولية متعددة مع التقلبات الوظيفية، حساسية الفحص ضروري للكشف والاشتقاق من قياسات ذات مغزى بيولوجيا والاستنتاجات. ولذلك، وضع نهج مثل كف سيؤدي إلى تحسين كمية ونوعية البيانات التي تولدها فاسكولوجينيسيس في المختبر والأوعية فحوصات لتمكين أكثر قوة من الملاحظات والاستنتاجات. وعلاوة على ذلك، سوف تيسر هذه البيانات التحقيق في المستقبل للآليات الجزيئية الكامنة التي تسهم في تغيير أكفك فاسكولوجينيسيس عقب التعرض غدم داخل الرحم.
التطبيقات المستقبلية لهذا النهج
على الرغم من أن تم تطبيق هذا الأسلوب لتقييم الجنين أكفك فاسكولوجينيسيس في المختبر في هذه الدراسات، تتعدد التطبيقات المحتملة لهذا النهج. ويمكن تنفيذ هذا الأسلوب سهولة لدراسة أي سكان الخلية التي تشارك في عمليات فاسكولوجينيسيس أو الأوعية. على وجه التحديد، فإنه يمكن استخدامها لدراسة السكان الخلايا الفردية، كما تجلى في هذه الدراسة، ولكن يمكن تطبيقه أيضا على نظم الثقافة المشتركة. في المستقبل، سيكون من المفيد لتوسيع هذا النهج بعد الفحص ثنائي الأبعاد في المختبر لتقييم نماذج ثلاثية الأبعاد (3D). على الرغم من أن الإصدار الحالي من كف لن تكون كافية كوانتيتاتينج 3D تصوير البيانات، نهجاً تحليلية متعددة حدودي، والوقت الفاصل بين مصممة بالمثل خصيصا لنماذج 3D أو في فيفو ستبلغ في حالة إبداء الملاحظات في أبعاد اثنين في المختبر هي الممثل للدالة cell في أجواء أكثر بيولوجيا ذات صلة.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
يعترف الكتاب لوسي ميلر، ليني هرنانديز، الدكتور ديفيد هاس، بريتاني Yeley (إنديانا مدرسة الطب في جامعة)، والدكتور كارين بولوك، Mund جولي، ماثيو ريباس واميلي سيمز (Angio بيوكوري في مركز السرطان سيمون جامعة إنديانا) تقديم المساعدة التقنية الممتازة في اشتقاق عينات أكفك. الكتاب أيضا أن نقر الدكتور مورين هارينغتون ألف، إدوارد ف. سرور، ريتشارد أ. يوم، ميرفن جيم يودر وكلاوس أ ماتياس (إنديانا مدرسة الطب في جامعة) للمناقشة العلمية، فضلا عن "الجدران جانيس" (إنديانا مدرسة الطب في جامعة) الدعم الإداري. وأجرى تصوير كافة في مركز إنديانا "الفحص المجهري البيولوجية"، كلية الطب بجامعة إنديانا. أيد هذا العمل مؤسسة "الطفولة رايلي" والمعاهد الوطنية للصحة (R01 HL094725 و P30 CA82709 U10 HD063094). بالإضافة إلى ذلك، هذا المنشور كان ممكناً بفضل دعم جزئي من الوطني للقلب والرئة، والدم المعهد من المعاهد الوطنية للصحة تحت جائزة # T32 HL007910.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Tissue Culture Plates | Fisher | 353003 | |
| 15 mL conical tubes | Fisher | 1495949B | |
| Angiogenesis 15-well micro-slides | Ibidi | 81506 | |
| Matrigel | Fisher (Corning) | 354234 | |
| EGM2 Medium | Lonza | CC3162 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| PSA Antimyocytic, Antibiotic | Fisher | MT30004C1 | Added 5 mL per 500 mL bottle of EGM2 medium. |
| 0.5% Trypsin/0.53 nM EDTA in HBSS | Fisher (Corning) | MT25052CI | |
| Type 1 Collagen | Fisher (Corning) | 354226 | 100 mg of liquid, concentration range 3-4 mg/mL. Dilute in 20 nM acetic acid in ddH2O to use at a final concentration of 0.05 mg/mL. |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-212 | Used in Type 1 Collagen solution at a final concentration of 20 nM. |
| Kim Wipes | Fisher | 06-666 | |
| Chambered slide | Ibidi | 80296 | This slide can be filled with distilled water to maintain humidity in the imaging chamber. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher (Gibco) | 20012027 | 1x solution, pH 7.2 |
| Microscope | Nikon Instruments | MEA53100 and MEF55030 | Motorized TiE including Ph1 phase ring for phase contrast with objective |
| Stage | Prior Instruments | ProScan II | Other OKOlab and Nikon Elements AR compatible stage may be used |
| Objective | Nikon Instruments | 93178 | CFI Plan Fluor DL 10X |
| Camera | Hamamatsu | C11440-42U | ORCA Flash 4.0LT |
| Stage Blower | Precision Controls | N/A | This item has been discontinued, alternatives include Smart Air-Therm Heater(AIRTHERM-SMT-1W) from World Precision Instruments |
| Stage-top Incubator | OKOLabs | H301 | BoldLine including a two position slide holder |
| Computer | Hewlett-Packard | Z620 or equivalent | 4 core Intel Xeon processor, >32 GB RAM, >2 TB RAID 10, nVidia Quadro graphics card |
| Nikon Elements Software | Nikon Instruments | AR v 4.20 | ND Acquisition is a multidimensional setup tool used to configure Elements software. |
| FIJI (ImageJ) Software | N/A | N/A | Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://imagej.net/Fiji/Downloads |
| KAV Plug-In | N/A | N/A | Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://github.com/icbm-iupui/kinetic-analysis-vasculogenesis |
References
- Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
- Tung, J. J., Tattersall, I. W., Kitajewski, J. Tips, stalks, tubes: notch-mediated cell fate determination and mechanisms of tubulogenesis during angiogenesis. CSH Med. 2 (2), 006601 (2012).
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473 (7347), 298 (2011).
- Carmeliet, P. Angiogenesis in health and disease. Nat Med. 9 (6), 653-660 (2003).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat Protoc. 5 (4), 628-635 (2010).
- Prasain, N., Meador, J. L., Yoder, M. C. Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood. J Vis Exp. (62), (2012).
- Simons, M., et al. State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularization: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circ Res. 116 (11), 99-132 (2015).
- Crabtree, B., Subramanian, V. Behavior of endothelial cells on Matrigel and development of a method for a rapid and reproducible in vitro angiogenesis assay. In Vitro Cell Dev-An. 43 (2), 87-94 (2007).
- Khoo, C. P., Micklem, K., Watt, S. M. A comparison of methods for quantifying angiogenesis in the Matrigel assay in vitro. Tissue Eng Part C-Me. 17 (9), 895-906 (2011).
- Allier, C. P., et al. Video lensfree microscopy of 2D and 3D culture of cells. SPIE BiOS. 8947, 89471 (2014).
- Wang, Y., Chen, Q., Zhang, Z., Jiang, F., Meng, X., Yan, H. Interleukin-10 overexpression improves the function of endothelial progenitor cells stimulated with TNF-α through the activation of the STAT3 signaling pathway. Int J Mol Med. 35 (2), 471-477 (2015).
- Ingram, D. A., et al. In vitro hyperglycemia or a diabetic intrauterine environment reduces neonatal endothelial colony-forming cell numbers and function. Diabetes. 57 (3), 724-731 (2008).
- Blue, E. K., et al. Gestational diabetes induces alterations in the function of neonatal endothelial colony-forming cells. Pediatr Res. 75 (2), 266-272 (2014).
- Carpentier, G. ImageJ contribution: Angiogenesis Analyzer. , (2012).
- WimTube. , Available from: https://www.wimasis.com/en/products/13/WinTube (2012).
- Varberg, K. M., et al. Kinetic analyses of vasculogenesis inform mechanistic studies. Am J Physiol-Cell Ph. , (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Met. 9 (7), 676-682 (2012).
- Arganda-Carreras, I., Fernández-González, R., Muñoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. 3D reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue. Microsc Res Techniq. 73 (11), 1019-1029 (2010).
- Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
- Mead, L. E., Prater, D., Yoder, M. C., Ingram, D. A. Isolation and characterization of endothelial progenitor cells from human blood. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 2, Unit 2C.1 (2008).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
