Kinetic analys av Vasculogenesis kvantifierar dynamiken i Vasculogenesis och angiogenes In Vitro

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för time-lapse imaging och analys av vasculogenesis in vitro- använda fas kontrast mikroskopi tillsammans med öppen källkod, Kinetic analys av Vasculogenesis. Detta protokoll kan tillämpas för att bedöma kvantitativt vasculogenic potentialen i många celltyper eller experimentella förhållanden som modellerar vaskulär sjukdom.

Abstract

Vasculogenesis är en komplex process som endotelceller stamceller och stamceller genomgå bildandet av blodkärl de novo . Kvantitativ bedömning av vasculogenesis har blivit en central avläsning av endothelial progenitor cell funktionalitet, och därför har det gjorts flera försök att förbättra både in vitro- och in-vivo vasculogenesis modeller. Dock är standardmetoder begränsad, med statiska mätningar misslyckas att fånga många aspekter av denna mycket dynamisk process. Mål att utveckla detta nya protokoll var därför att bedöma kineticsen av in vitro- vasculogenesis för att kvantifiera andelen nätverk bildas och stabilisering, samt ge insikt i potentiella mekanismerna bakom vaskulär dysfunktion. Tillämpningen av detta protokoll demonstreras med fostrets endothelial kolonibildande celler (ECFCs) utsätts för moderns diabetes mellitus. Fostrets ECFCs var härrör från navelsträngsblod efter födseln, odlade och klädd i bilder som innehåller basalmembranet matris, där de genomgick vasculogenesis. Bilder av hela bilden brunnarna förvärvades med time-lapse fas kontrast mikroskopi över 15 timmar. Bilder analyserades för härledning av kvantitativa data med hjälp av en analys programvara som kallas kinetisk analys av Vasculogenesis (KAV). KAV använder bild segmentering följt av skeletonization för att analysera nätverkskomponenter från högar av flera tid punkt fas kontrast bilder att härleda tio parametrar (9 mätt, 1 beräknas) av nätverket struktur inklusive: stängt nätverk, nätområden noder, grenar, totala grenlängd, genomsnittliga grenlängd, triple-Grenade noder, quad-Grenade noder, nätstrukturer och vägskälet till nod baserat. Tillämpningen av detta protokoll identifierade förändrade priser av vasculogenesis i ECFCs erhålls från graviditeter kompliceras av diabetes mellitus. Denna teknik har dock bred konsekvenser utöver redovisas här. Genomförandet av denna strategi kommer att förbättra mekanistiska bedömning och förbättra funktionsavläsningar vasculogenesis och andra biologiskt viktiga förgrenade processer i många celltyper eller sjukdomstillstånd.

Introduction

Förmågan av endothelial stamceller genomgå vasculogenesis eller bildandet av blodkärl de novo , är kritisk i upprättandet av embryonala vaskulatur under utveckling¹. Dessutom är ytterligare bildandet av blodkärl och mognaden av redan existerande fartyg, som kallas angiogenes, också en viktig process i utvecklingen och i postnatal liv att upprätthålla blodflödet och homeostas i hela kroppen². Varje organ i kroppen är beroende av det vaskulära systemet för leveransen av syre och näringsämnen, och avlägsnande av avfall³. Om kärl homeostas inte upprätthålls, sådana att blodkärlsbildning och reparation är otillräcklig eller i överskott, kan vaskulära sjukdomar leda⁴. Därför, vaskulär bildandet och anpassning ofta studeras, eftersom de är nödvändiga för underhållet av organ hälsa och är inblandade i utvecklingen av ett flertal patologiska stater.

På grund av en ökad förståelse för medverkan av kärlsystemet i utveckling, liksom i sjukdom manifestation och progression, har analyser utvecklats till modell vasculogenesis och angiogenes in vitro och i vivo^{5 ,6,7}. Modeling bildandet av blodkärl involverar plätering vaskulära celler, såsom endotelceller, i basalmembranet matris som främjar cell organisation och bildandet av fartyget nätverk^8,9,10. Normalt följande natten inkubation, bilder av cellen nätverk fångas vid en enda tidpunkt, vilket resulterar i ett litet antal bilder för analys^11,12,13. Analytiska metoder har därför till stor del utvecklats och optimerad för enkel tid punkt bedömningar^10,14. Dock statiska analyser är helt enkelt otillräckliga på att fånga den dynamiska processen för bildandet av blodkärl och ger begränsad insikt om potentiella mekanismer som är involverade. Trots ökande imaging frekvens skulle sannolikt ge nödvändiga uppgifter för att identifiera bildandet kinetik, skulle tillämpningen av tidigare utvecklade analytics till en multi tid punkt imaging strategi vara ineffektivt och labor intensiv¹⁴. Dessutom, trots utveckling av kommersiellt tillgängliga analyser återger en pay-per-image avgift detta alternativ kostnad oöverkomliga för kinetiska studier där tusentals bilder är genererade¹⁵. Därför finns det ett behov i området för ett rationellt och effektivt förhållningssätt till fånga och kvantifiera vasculogenesis in vitro-, inklusive förmågan att analysera stora bild-apparater som genereras av time-lapse levande cell mikroskopi.

För att övervinna dessa begränsningar, utvecklades en ny strategi med syfte att utöka enda tidpunkt imaging möjliggör dynamisk bedömning vasculogenesis med bilder förvärvade varje 15 min¹⁶. Genom att fånga flera tidpunkter under flera timmar, ger detta tillvägagångssätt en mer detaljerad skildring av processen av vasculogenesis, samt insikt i potentiella mekanismer bidrar till bildandet och underhållet av fartyget nät. Förutom att förbättra frekvens och kvalitet av bild förvärvandet, innehåller detta tillvägagångssätt roman programvara i form av en öppen källkod plug-in¹⁷. Programvaran, avses som Kinetic analys av Vasculogenesis (KAV), är en strömlinjeformad program som innefattar bildbehandling och analys speciellt för stora bild-apparater som genereras från flera tid punkt förvärv. KAV analyserar fas kontrast bilder genom bild segmentering följt av skeletonization¹⁸. Tio parametrar av nätverksstrukturen kvantifieras av KAV inklusive: grenar, slutna nätverk, noder, nätverksareor, nätstrukturer, triple-Grenade noder, quad-Grenade noder, totala grenlängd, genomsnittliga grenlängd och vägskälet till nod baserat (se schematiskt i figur 1)¹⁶. Tillämpningen av KAV-metoden innehåller en roman, beräknade fenotyp av in vitro- vasculogenesis, kallad grenen nod-förhållande. Vårt senaste arbete visade att detta förhållande är vägledande för nätverksanslutning och kan vara associerad med andra cellulära processer som är involverade i bildandet av nätverk, såsom motilitet¹⁶.

Även om fostrets endothelial kolonibildande cell (ECFC) vasculogenesis bedömdes i dessa studier, kan denna bild förvärv och analys lätt tillämpas för att utvärdera alla celltyper som genomgår vasculogenesis eller angiogenes. Detta tillvägagångssätt kan dessutom användas för att identifiera förändrad vaskulär funktion följd en mängd patologiska stater, såsom graviditetsdiabetes diabetes mellitus, som visas i dessa studier. Denna metod kan dessutom anpassas för att bedöma nätverk bildas och förgreningar, som är viktiga för andra biologiskt relevanta processer. Den potentiella effekten av att tillämpa detta nya tillvägagångssätt att unika biologiska system alltså ännu skall fastställas.

Protocol

1. förberedelser

1. Kultur endothelial kolonibildande celler (ECFCs)
   Obs: Fostrets ECFC prover som används i dessa experiment var isolerade från mänskliga navelsträngsblod och odlade av Angio BioCore (ABC) vid Indiana University School of Medicine som tidigare beskrivits⁶. Rutinmässiga kvalitetskontroll fenotypning genomfördes inom ABC att bekräfta uttryck av endothelial antigener som tidigare beskrivits^19,20,21. Prover som används i experiment var överförda minimalt (2 - 3 gånger). Alla vävnadsodling arbetet utförs i en vävnadskultur huva. Alla reagenser, inklusive vävnadsodling plattor och lösningar, var steril.
   1. Två dagar före experimentet, coat 100 mm runda vävnadsodling plattor med 6 mL 0,05 mg/mL typ 1 kollagen och inkubera vid 37 ° C över natten.
      Obs: Typ 1 kollagen är utspätt i dubbeldestillerat vatten innehållande 20 nM ättiksyra till en fungerande koncentration på 0,05 mg/mL.
   2. Dagen innan experimentet, trypsinize och replate ECFCs på typ 1 kollagen belagda plåtar i 1.1.1. (Se anmärkning enligt 1.1).
   3. För att trypsinize ECFCs, sug ut media från guldpläterade celler och tvätta med 7 mL PBS. Aspirera PBS, och tillsätt sedan 2-3 mL 0,5% trypsin och inkubera cellerna under 2-5 minuter vid 37 ° C.
   4. Omedelbart efter inkubation med trypsin, tillsätt 3 mL EGM2 och Pipettera upp och ner för att få bort alla vidhäftande celler. Överföra cellsuspension till en 15 mL koniska rör.
   5. Centrifugera alla prover vid 500 x g under 5 minuter i rumstemperatur.
   6. Aspirera supernatanten och slamma cell pellets i 1-2 mL av EGM2. Blanda cellsuspensionen noggrant och ta bort en liten alikvot (20-40 μl) för inventering.
   7. Lägg till lika delar trypan blå till cellen alikvotens och Pipettera 10 µL till en hemocytometer. Räkna antalet celler i de fyra primära kvadranterna av hemocytometer.
      Obs: Använd båda sidor av hemocytometer för alla prov räknas för att öka träffsäkerheten.
   8. Tvätta de kollagen-belagd vävnadsodling plåtar, som utarbetades i steg 1.1.1, två gånger med 7 mL PBS. Kultur media kompletteras med 10% fetalt bovint serum till plattorna efter aspirera andra PBS tvätten, tillsätt 10 mL av endothelial odlingsmedium 2 (EGM2).
   9. Använder de blodkroppar som erhölls i steg 1.1.7, beräkna volymen av cellsuspensionen krävs att plattan 4 x 10⁵ celler. Plåt 4 x 10⁵ ECFCs på vävnadsodling plattorna bereddes i steg 1.1.8 och inkubera vid 37 ° C och 5% koldioxid (CO₂) över natten.
2. Innan experimentet, lagra förnödenheter vid 4 °C över natten
   1. Lagra en 3 ”x 2” metallplatta, slide (håll i paketet tills i huva), en låda med steril 20 mikroliter (μl) tips och basalmembranet matris (matrix).
      Obs: Matrisen hålls vid-80 ° C för långsiktig lagring; alltid Tina det vid 4 ° C över natten eller i flera timmar före användning.
3. Bekräfta tillgängligheten av tillräckligt med utrymme för bilderna på datorns hårddiskar.
   Obs: Använder den konfigurationen som beskrivs i detta protokoll, krävdes cirka 60 gigabyte (GB) utrymme per experiment (4 GB per brunn). Dock utrymme uppskattningar baseras på maskinvarukonfiguration och kommer att behöva bestämmas för varje system.

2. protokoll 1: Experimentell Setup: förbereda bilden

1. Samla och förbereda leveranser
   1. Dagen av experimentet, samla leveranser för plätering celler i bilden, inklusive en hink med is, en liten behållare med torris, ett par sax och 20 μL pipett. Spraya alla objekt med 70% etanol, torka torrt med hushållspapper och placera objekt i en steril vävnadsodling huva.
   2. Samla alla leveranser lagras vid 4 ° C (se steg 1.2) inklusive metallplattan, låda med tips, bild och matrix. Spray rutan tips med 70% etanol och Placera lådan i behållaren på torris.
      Obs: ta bort matris från 4 ° C kylen bara när du är klar att använda och alltid hålla matrisen på is.
   3. Spray metallplattan med 70% etanol och bädda in det i isen i en ishink. Öppna förpackningen som innehåller bilden och placera bilden på metallplattan att hålla det kallt.
2. Load matris in i bilden
   1. Ställ pipetten till 10 μL och ta bort spetsen från kalla tip låda med pipetten. Skär ca 1 cm utanför slutet av spetsen med saxen.
      Obs: skär vinkelrätt mot spetsen att minska bubblor i matrisen. Pipetten kan anges till en volym som är något större än 10 μL för matris som fastnar på insidan av spetsen.
   2. Långsamt dra matrisen i pipettspetsen. Placera omedelbart pipettspetsen på mitten av brunnen. Försiktigt tryck pipettspetsen längst ned i brunnen och tryck långsamt matrisen.
      Obs: inte över pipett, eftersom detta kommer att orsaka bubblor bildas. Om en bubbla former, pop det omedelbart med ett litet tips.
   3. Bilden innehåller 15 enskilda brunnar. Upprepa föregående steg för varje brunn. Använda en ny pipettspetsen för varje brunn för att upprätthålla konsistens och minska matrix stelnar inuti spetsen.
   4. När bilden är laddad med alla brunnar innehållande matris, Skjut locket hela vägen in i bilden och inkubera vid 37 ° C i 30-60 min tills matrisen stelnar.
      Obs: Låt inte matrisen torka ut. Lägga till en liten volym (2-3 mL) av PBS i hatten för en 50 mL konisk slang nära bilden i inkubatorn att minska risken för matrix torkning.

3. protokoll 2: Plätering ECFCs på matrisen

1. Ta bort anhängare ECFCs från vävnadsodling plattor och samla i suspension
   1. Erhålla vävnadsodling plattor som innehåller ECFCs pläterade föregående dag (se avsnitt 1.1.9). Aspirera EGM2 media och tvätta anhängare ECFCs en gång med 7 mL PBS.
   2. Aspirera PBS, tillsätt 2-3 mL av trypsin och inkubera vidhäftande celler för 2-5 min vid 37 ° C.
   3. Omedelbart efter inkubering tillsätts 3 mL EGM2 och Pipettera upp och ner för att få bort alla vidhäftande celler. Överföra cellsuspension till en 15 mL koniska rör.
   4. Upprepa steg 3.1.1-3.1.3 för de återstående tre ECFC proverna tills alla fyra cellprover samlas i suspension.
2. Förbereda master mixar
   1. Centrifugera alla prover vid 500 x g under 5 minuter i rumstemperatur.
   2. Aspirera supernatanten och slamma cell pellets i 1-2 mL av EGM2.
   3. Blanda cellsuspensionen noggrant och ta bort en liten alikvot (20-40 μl) för inventering.
   4. Lägg till lika delar trypan blå till cellen alikvotens och tillsätt 10 μL på en hemocytometer. Räkna antalet celler i de fyra primära kvadranterna av hemocytometer.
      Obs: Använd båda sidor av hemocytometer för alla prov räknas för att öka träffsäkerheten.
   5. Med hjälp av cellen räknas från ovan, beräkna volymen av varje cell prov som innehåller 1.4x10⁴ celler. Blanda alla cellsuspensioner och alikvotens 1,4 x 10⁴ celler i ett färskt rör att förbereda en master mix för varje experimentella villkor. Lägg till EGM2 media så att den slutliga volymen av varje master mix är 175 μl.
   6. Blanda varje master mix av försiktigt pipettering och alikvotens 50 μL av master mix i enskilda brunnar i bilden.
      Obs: alla prover är klädd i tre exemplar med master mixar beräknas för 3,5 wells att säkerställa tillräcklig volym för 3 brunnar.
3. Inkubera i bilden
   1. Inkubera i bilden vid 37 ° C tills det kan flyttas in i mikroskopet kammaren för avbildning.
      Obs: Tiden mellan plätering och imaging bör vara så kort som möjligt för att begränsa dataförlust under de tidiga stadierna av vasculogenesis.

4. protokoll 3: Mikroskop Setup och bild förvärv

Obs: För våra studier, protokoll 2 och 3 genomfördes samtidigt av separata individer. Om protokoll 2 och 3 måste utföras av samma individ, bör protokoll 3 steg 4.1 och 4.2 nedan slutföras innan protokoll 2 ovan.

1. Slå på mikroskopet och dator
   1. Cirka en till två timmar före start experimentet, aktivera och förvärma scenen övre inkubatorn till 37 ° C, ange den CO₂ till 5%, och ange luftfuktigheten till 85%. Fyll inkubatorns luftfuktighet reservoar, om den är tom.
   2. Placera en tom kamrar bild i en av två öppna positioner och fyll på med destillerat vatten. Säkra feedback termometern för kammaren temperaturkontroll, om tillgängligt.
      Obs: Om feedback termometern är tillgängliga använder denna ”inkubator temperatur” verifiera att kammaren har jämviktas.
   3. Slå på en sekundär fläkten inställd på 39-42 ° C att värma bilderna underifrån och minimera kondens.
   4. Lägga till en andra bild som en tom tills den experimentella bilden kan läggas. Denna bild fungerar som en läge platshållare för konfiguration av förvärvet bildinställningarna för enskilda brunnar under installationen.
   5. Tillsätt vatten reservoaren kring brunnarna på den andra bilden till efterliknar villkoren under imaging experimentet. Vattnet kring brunnarna möjliggör bedömning av luftfuktighet under mikroskopet installationen och förvärmning.
      Obs: Jämviktade scenen-top inkubator och sekundär fläkten är kritiska för att upprätthålla en stabil culturing miljö. De flesta levande cell kammare styrenheter ger återkoppling i realtid av temperatur, CO₂, och luftfuktighet för att bedöma systemet. Innan du fortsätter, kontrollera ansamling av fukt i bilden och stark uttorkning av behållaren som fylls i 4.1.5. Luftfuktighet kan behöva justeras om det är överdriven torkning eller kondens i kammaren. För att öka luftfuktigheten, lägga till våtservetter fuktad med destillerat vatten. För att minska kondens, antingen minska luftfuktighet inställningen justeras i 4.1.1 eller som kondens kunde vara ett tecken på låg temperatur, kontrollera de kammaren temperaturinställningar och placering av sekundär fläkten.
2. Konfigurera grundläggande bildinställningar förvärv under Jämviktstiden.
   Obs: bilden förvärv konfigureras via programvara som styr den scenen, slutaren och kamera. En flerdimensionell installationsverktyget är det enklaste sättet att konfigurera programvaran. Dessutom måste programvaran ha autofokus rutiner att säkerställa fokuskontroll över varaktigheten av experimentet.
   1. Använda programvaran för att ställa in flera scenen positioner för varje brunn. Välj centrera av brunnarna för detta protokoll.
   2. Konfigurera bild förvärv så att vid varje skede position, hela väl är avbildade. Exempelvis använda en tilescan med 10-20% bild överlappning och cirka 5 x 5 fält, beroende på kamera och slutliga förstoringen.
   3. Konfigurera tidsfördröjning för imaging varje 15 min.
      Obs: Använder den konfigurationen som beskrivs i detta protokoll, är alla 15 brunnar i bilden avbildade inom ett intervall på 15 min.
3. Ladda experimentella bilden
   1. Efter Jämviktstiden inkubator avdelning, ersätta den tom bilden med experimentella bilden.
      Obs: en skakad kammare kommer att ha stabil temperatur, CO₂och fukt i minst 20 min. När den experimentella bilden är klar, är det viktigt att stegen är klara snabbt för att minimera ”döda-tiden” mellan plätering och den ursprungliga tidpunkten som fångas av mikroskopet. Dessutom för att underlätta jämförelse mellan imaging experiment, bör denna gång vara konsekvent. I dessa experiment krävs alla stegen i protokoll 3 avsnitt 4.3 cirka 30 minuter att slutföra.
   2. Skjut locket och tillsätt vatten till reservoaren kring brunnarna i bilden.
      Obs: Locket tas bort för varaktigheten av imaging experimentet.
4. Konfigurera inställningar för slutliga bilden förvärv
   1. Placera syftet CFI planera Fluor DL 10 X i position och välj Ph1 fas ringen på kondensorn. Med den första brunnen i fokus, justera diascopic ljusbanan för Köhler belysning och konfigurera fas optik genom att kontrollera justeringen av fas ring i kondensorn med objektiva fas masken.
   2. Konfigurera exponeringstiden och justera lampans intensitet för faskontrast, som normalt är mindre än 500 ms.
   3. Bläddra igenom varje position scenografi i 4.2.1 och bekräfta att mitten av brunnen är markerad, och justera det, om det behövs.
   4. Vid varje skede position, fokus på cellerna klädd i brunnen och Ställ in scenen positionens z position används för imaging i programvaran.
   5. Testa autofokus mekanism för mikroskopet. Om autofokus är maskinvarubaserad, att den är på och rätt placerad för alla skede positioner.
      Obs: som förlagan och scenen kan glida vertikalt under experimentet, det är viktigt att programvaran kontrollerar autofokus vid varje skede position och varje tidpunkt att säkerställa tillförlitlig imaging under tiden-kursen. En autofokus position bestäms i den tidigare tidpunkten bör om möjligt användas som utgångspunkt för efterföljande autofokus rutin. Detta sätt, pågående drift kan justeras för enkelt.
   6. Minska eller släcka lamporna i mikroskopet rummet och starta imaging experimentet.

5. protokoll 4: Bild bearbetning och kinetiska analys av Vasculogenesis (KAV)

1. Spara bilder från enskilda tidpunkter som en bildstapel för varje brunn
   Obs: de flesta programvara för Bildinsamling kan exportera flersidiga TIFF (staplar) av tidsserier. KAV är utformad för att fungera på datamängder som kan omfatta flera tidpunkter. Således uppstår analys på hela bilden stacken för ett visst Stadium ställning. Om så krävs, kan de bildbehandlingsprogram importera enstaka bilder från varje tidpunkt att rekonstruera en bildstapel.
2. Öppna den bildbehandlingsprogram på datorn
3. Lägga till KAV bildbehandling programvara
   1. Dra KAV filen från en mapp i det grå fältet längst ned i fönstret programvara. Klicka 'Spara' för att lägga till programmet i listan.
4. Öppna bild stacken ska analyseras
   1. Klicka på 'Arkiv' och sedan 'Öppna' genom menyn i bildbehandling programvara eller dra bildfilen i det grå fältet som i steg 5.3.1.
   2. Konvertera bilder till 8 bitar genom att klicka på 'Bild', 'Typ', '8 bit'.
5. Skapa en region av intresse (ROI)
   1. Öppna den ROI Manager genom att klicka på 'Analysera' i verktygsfältet. Välj 'Verktyg' följt av ' ROI Manager.
   2. Skapa en ny ROI genom att klicka på de cirkel eller rektangel markeringsverktyg i verktygsfältet och dra önskat markeringsområde på bilden. Klicka på 'Add' i fönstret ROI manager om du vill spara som formar.
      Obs: En tidigare skapad ROI kan öppnas genom att dra Sparad ROIs (zippad mapp) i fältet 'Dra och släpp' att öppna i Manager.
   3. Klicka på ROI etiketten anges i ROI Manager att visa det på bild.
      Obs: Om ROI inte visas på bilden, skapa en andra ROI (någon storlek/form) och lägga till chefen. När båda ROIs visas i listan, klicka fram och tillbaka mellan två och önskad ROI visas på bilden.
   4. Justera ROI om det behövs. När ROI är på plats på bilden i önskad plats, gå till menyn och klicka på 'Redigera' sedan 'Klart utanför'. Detta tar bort bilddata utanför ROI (användbart för icke-rektangulära former) för varje bild i stacken.
      Obs: Du kan också klicka på 'Image' och 'Beskär' om du använder en sig rektangulärt formade ROI.
6. Köra programvaran KAV
   1. Klicka på 'Plug-ins' i menyraden.
   2. Välj den 'analysera nätverket' Plug-in. Detta kommer att öppna upp ett fönster med alternativ för att ändra inställningar i plugin-programmet.
   3. Ändra metoden tröskelvärde använder pilen.
   4. När alla lämpliga inställningar är markerat, klicka på 'OK' för att initiera programbehandling.
      Obs: Lämpliga inställningar bestäms genom visualisering av skelett och mask återgivningar som genereras av KAV, som är vägledande för noggrannhetsklass av programvaran att identifiera och urskilja celler och nätverk från bakgrunden i bilden fas kontrast.
7. Spara KAV-genererade data
   1. När plugin-programmet har slutförts analysen, kommer två windows popup-fönster på skärmen inklusive en datatabell med numeriska värden och en bunt med smält bilder föreställande skelett och mask återgivningar.
   2. Spara de numeriska värdena genom att navigera till det övre vänstra hörnet av tabellen och klicka på 'Redigera' sedan 'kopia' eller 'Klippa' för att klistra in värden i ett excel-kalkylblad.
   3. Klicka på bilden för smält skelett och mask. Spara den smält skelett/mask bildstapel som en taggade Image File Format (TIFF)-fil genom att klicka på 'Arkiv,' 'Spara som,' 'TIFF.'
   4. Spara den beskurna faskontrast image stack (skapad med ROI) genom att klicka på 'Fil,' 'Spara som,' 'TIFF.'
   5. Klicka på fönstret ROI Manager och välj ROI används för att beskära bilder. Klicka 'Mer' följt av 'Spara' för att spara ROI för framtida bruk.
      Obs: Använda samma ROI hjälper upprätthålla enhetlighet över analyser.

Representative Results

KAV producerar visuella representationer av nätverksstrukturen
Kontrasten mellan ECFCs och matrix bakgrunden i fas kontrast bilderna gör KAV att identifiera cell-specifika strukturer. ECFC nätverk identifieras av KAV representeras bildmässig som skelett och mask återgivningar att illustrera strukturer som används av programvara för kvantifiering (figur 2A). Ännu viktigare, möjliggör kvalitativ bedömning av skelett och mask återgivningar snabb identifiering av KAV känslighet och noggrannhet, vilket kan vara användbart att fastställa optimala tröskel inställningar och tolka analys resultat. När kvaliteten på fas kontrast bilderna är hög och tillräcklig kontrast uppnås, identifierar KAV korrekt ECFC nätverk som indikeras av likheten mellan fas kontrast bilden och KAV-genererade skelett och mask återgivningar (figur 2 A och Video 1).

Alternativt om fas kontrast bilder inte har hög kontrast eller artefakter av imaging såsom gridding uppstå, nätverk upptäckt noggrannhet reduceras och resultat blir tvetydig (figur 2B). Dessutom kan bildas luftbubblor inom cellen media också dölja upptäckt noggrannhet (figur 2). Problem med bildkvaliteten kan dock ofta övervinnas genom val av olika tröskelvärde metoder ingår i programvaran KAV. Till exempel analyserades fas kontrast bilden i figur 2B med identisk bild Bearbetningsinställningar utom metoden tröskelvärde. Från skelett och Mask återgivningar är det uppenbart att den Otsu tröskelvärde resulterade i en mer korrekt upptäckt av ECFC nätverken fas kontrast bilden (bild 2B). Bildkvaliteten är därför avgörande för att uppnå korrekt och meningsfull resultat i denna analys. Dock tillåta olika tröskelvärde metoder ingår i användargränssnittet för KAV justering av bildanalys baserat på kvaliteten på de ingående bilderna.

Time-lapse mikroskopi identifierar kvalitativa och kvantitativa skillnader i ECFC vasculogenesis efter intrauterin graviditetsdiabetes diabetes mellitus exponering
Nyligen, det KAV analytiska tillvägagångssättet tillämpades för att bedöma fostrets ECFC funktion efter exponering för moderns typ 2 diabetes mellitus (T2DM) i livmodern¹⁶. Med hjälp av KAV, förändrad kinetik av vasculogenesis identifierades i fostrets ECFCs utsätts för T2DM. Men förutom T2DM försämrar exponering, vilket sker i hela den hela dräktigheten, graviditetsdiabetes diabetes mellitus (GDM) eller utvecklingen av glukosintolerans vanligen under graviditetens tredje trimester, också ECFC funktion¹³. Därför tillämpades KAV för att avgöra om GDM-exponerade ECFCs också Visa förändrad kinetik ECFC nätverk bildas. Fas 1 (0-5 h) och fas2 (5 + h) bedömdes med hjälp av time lapse mikroskopi tillsammans med KAV analys (figur 3). Representativa fas kontrast bilder förvärvade i början av bild förvärvandet (0.50 h) och under hela tiden (5.00 och 10.00 h) skildrar ECFC nätverk bildas i de fyra prov från en experimentell dag (figur 3 och Video 1 ). Trots motsvarande cell lastning, som observerades i fas kontrast bilderna vid 0,50 timmar, är kvalitativa skillnader i nätverkets struktur uppenbara på 5.00 och 10.00-timmars tidpunkter. ECFCs från okomplicerad graviditet (UC) bildar ett komplexa och intrikata nätverk 5 timmar efter plätering, liknar våra tidigare publicerade data¹⁶. Omvänt, prova ECFCs från GDM 1 (GDM1) form mycket få nätverk strukturer som inte är sammankopplade. Dock återspeglas detta mönster inte i alla ECFC produktproverna GDM graviditeter, vägledande heterogenitet mellan prover. Prover GDM2 och GDM3 visar större nätverk bildandet jämfört med GDM1, även om mönster av anslutning visas förändrad jämfört med UC provet. Ännu viktigare, mäter KAV flera strukturella komponenter i ECFC nätverk att identifiera både uppenbara och subtila fenotyper.

Förutom att generera skelett och mask återgivningar av nätverksstruktur, quantitates KAV tio mått av nätverkets struktur, inklusive antalet noder, fyrbäddsrum-Grenade noder, triple-Grenade noder, enskilda nätstrukturer, grenar, totalt grenlängd, genomsnittliga grenlängd, gren nod förhållande, totalt stängt nätverk och nätverk område¹⁶. KAV sammanställer data för varje prov i en enda tabell med värden för alla bilder av tidsförloppet. Tabell 1 innehåller representativa rådata från en tänkbar studie för ett ECFC prov. Parametrarna för nätverkets struktur mäts av KAV är ordnade i kolumner och data för sekventiell bilder förvärvade med tiden är ordnade i rader. För exempel, i våra studier, bild 1 erhölls 30 min efter plätering med efterföljande bilder som samlas in varje 15 min. rå värden som genereras av KAV kan sedan visas i diagram eller ytterligare analyseras med hjälp av mer komplexa statistiska metoder¹⁶.

Fem grafer som skildrar medelvärdena för nätverkets struktur från tre separata experiment visas för ett okomplicerat prov (UC) och de tre GDM proverna (figur 4). UC provet i dessa experiment som utförs på samma sätt till tidigare analyserade UC prover¹⁶. Tidigare identifierades att ECFC vasculogenesis in vitro är bi-phasic, bestående av fas 1 (0 - 5 h) och fas 2 (5-10 h)¹⁶. Detta mönster är konsekvent i de aktuella studierna, vilket framgår av figuren föreställande stängt nätverksdata (figur 4). UC provet bildade ett större antal slutna nätverk jämfört med alla tre av GDM proverna. Intressant, tycks tre av de fyra proverna ha en liknande tid till maximal antal slutna nätverk, som uppstår mellan 2,5 och 3 timmar. GDM2 provet var dock långsammare att nå maximal slutna nätverk, som inträffade 5 timmar efter plätering. Och, trots GDM2 provet bildar färre maximal nätverk jämfört med UC provet, bibehölls de nätverk som bildar det likaså till UC-prov över tid. Omvänt, GDM1 och GDM3, som bildade färre nätverk jämfört med UC provet, även ställt ut en generell minskning av nätverksnummer över tid. Sammantaget från figuren föreställande stängda nätverksnummer, är det uppenbart att alla ECFC prover visas ett bi-phasic mönster av nätverk bildas, men graden av bildandet och maximala antalet nätverk som uppnåtts varierar mellan olika prover.

Nätområde representerar den genomsnittliga arean inom de slutna nätverk som bildas av ECFCs. Därför, desto större slutna nätverket nummer, ju mindre områdena nätverk. Detta mönster återspeglas i nätverket området grafer där UC provet, som bildade ett större antal slutna nätverk, hade mindre nätverksområden över tiden jämfört med de tre GDM proverna (figur 4). GDM2, som nådde maximal slutna nätverk långsammare, uppvisade hög nätområde initialt, men området stabiliserad över tid, och detta var mest liknar UC provet på 15 timmar. Över tid ökade genomsnittliga nätverk området i alla prover på grund av nätverk avinstallation stabilisering. Vissa prover, som GDM1 och GDM3, uppvisade dock en snabbare ökning i nätverksområde, vilket sannolikt tyder på minskad stabilitet jämfört med andra prover som uppvisar en mer gradvis ökning.

GDM-exponerade ECFCs uppvisar minskad nätverkets stabilitet
Förhållandet mellan grenar till noder är en roman fenotyp beräknas av KAV och identifieras i våra tidigare studier, och detta är vägledande nätverk anslutning¹⁶. I den aktuella studien hade UC provet en låg, som föreställde en hög nivå av nätverksanslutningen som upprätthölls över tiden (figur 4). Omvänt, tre GDM proverna hade en högre andel av filialer till noder, särskilt i fas2 av nätverk bildas. Denna observation visar minskad connectivity och avinstallation stabilisering av nätverksstrukturer.

GDM1 bildade sammantaget färre noder och grenar jämfört andra prov med den sänkning som underhålls under loppet av experimentet. GDM2 och GDM3 bildas och underhålls ett större antal grenar jämfört med UC provet, särskilt mellan 5-15 h. Antalet noder som upptäckts i GDM2- och GDM3 liknade mer antalet noder i UC provet, särskilt mellan 10-15 h. Ett större antal grenar, men ett liknande antal noder, kan stå för ökad vägskälet till nod baserat uppenbar vid senare tidpunkter i GDM proven. Ännu viktigare, kan samtidiga ändringar i grenen och nod vara svårt att tolka i separata grafer. Men erbjuder romanen vägskälet till nod baserat ett sätt att bedöma hur förändringar, inklusive lätta förändringar som är svåra att upptäcka i de enskilda diagrammen, i både gren och nod nummer, resultera i ändrade nätverksanslutningen.

Figur 1 : Schematisk disposition 10 parametrar kvantifieras av kinetiska analys av Vasculogenesis (KAV). KAV quantitates tio olika parametrar av nätverksstrukturen. Alla parametrar är färgkodade och beskrivs i schematiskt numeriskt (1-10). Parametrar inkluderar antalet grenar (grön, 1), stängt nätverk (blå, 2), och noder (rött, 3), i genomsnitt nätområde (orange, 4), antalet nätverksstrukturer (svart, 5), trippel-Grenade noder (gul, 6) och quad-Grenade noder (lila, 7), samt totalen (9) och genomsnittliga (10) grenlängd och förhållandet mellan antalet filialer till antalet noder (10). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2 : Kinetic analys av Vasculogenesis (KAV) quantitates nätverksstruktur. (A) skelett och mask återgivningar av nätverksstrukturer som identifierats av KAV använder fas kontrast bilder ger visuell representation av nätverksstrukturer identifieras och kvantifieras enligt KAV. Skalstapeln = 500 µm. (B) en representativ fas kontrast bild av ECFC nätverk 10 h efter plätering som har låg kontrast och rutnät markerar från sammanfoga enskilda bilder. Olika tröskelvärde metoder, såsom medelvärde eller Otsu, kan väljas i KAV plug-in att förbättra kvantitering noggrannhet, om fas kontrast bilder har låg kontrast eller om gridding uppstår. Skelett och mask återgivningar av fas kontrast bilden visas för både medelvärde och Otsu tröskelvärde metoder. Fas kontrast bilder fångades med en 10 X-objektiv. Skalstapeln = 500 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figur 3 : Intrauterin GDM exponering förändrar ECFC nätverk bildandet. Bilder av ECFC nätverk bildas fångades med 15 min mellanrum för 15 h av fas kontrast mikroskopi. Representativa fas kontrast bilder på 5 h steg, start vid tidpunkten för plätering (0,5 h), visas för UC och tre GDM prover. Fas kontrast bilder fångades med en 10 X-objektiv. Skalstapeln = 500 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figur 4 : ECFCs utsätts för intrauterin GDM utställning ändras nätverk bildas kinetik. ECFCs erhölls från en okomplicerad graviditet (UC, svart) och tre graviditeter kompliceras av graviditetsdiabetes diabetes mellitus (GDM 1-3, röd). Fas kontrast bilder fångades på 15 min intervall för 15 h. Kinetic analys av Vasculogenesis (KAV) programvara quantitated stängt nätverk, nätverksområden, grenar, noder och förhållandet mellan grenar till noder. Uppgifterna illustrerad representerar medelvärde ± standardavvikelsen för medelvärdet (SEM) av tre separata experiment för varje prov. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Video 1: Intrauterin GDM exponering förändrar kinetik ECFC nätverk bildas. Bilder av ECFC nätverk bildas fångades med 15 min mellanrum för 15 h av fas kontrast mikroskopi. Fas kontrast bilder visas för UC och tre GDM prover över 15 h börjar på 0,5 h. Skalstapeln representerar 500 µm. vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)

Bild	Totala kontorsnät	Noder	Tripplar	Fyrbäddsrum	Grenar	Totala gren längd *	AVG gren längd *	Gren-nod-förhållande	Slutna nätverk	Network område **
1	382	290	278	11	943	47210	124	3,25	9	480214
2	284	345	337	8	940	50699	179	2.72	16	264469
3	205	376	366	9	910	55728	272	2,42	27	150621
4	162	422	407	15	947	59692	368	2.24	40	98713
5	132	454	441	12	967	61923	469	2.13	53	72951
6	122	435	419	14	907	62587	513	2.09	68	56948
7	88	429	411	17	852	63983	727	1,99	74	51429
8	68	451	437	13	874	63960	941	1,94	74	51780
9	93	437	417	18	905	60901	655	2,07	49	82919
10	126	511	487	24	1075	61981	492	2.1	37	116857
11	49	397	384	12	737	61823	1262	1,86	79	48805
12	81	376	364	10	751	56817	701	2	63	64431
13	98	509	482	26	1028	60799	620	2,02	44	98056
14	93	449	416	31	909	58282	627	2,02	45	94081
* avrundat till närmaste micron, ** avrundat till närmaste micron ^ 2

Tabell 1: Representativa rådata från en tänkbar studie för ett ECFC prov.

Discussion

KAV möjliggör utvärdering av stora datamängder med flera tidpunkter
Traditionellt har kvantitering av vasculogenesis in vitro- bestod av en enda eller några tid punkt mätningar. Denna statiska strategi är helt enkelt otillräckliga för att fånga och kvantifiera en dynamisk och komplex process. Därför utvecklades denna nya metod för att möjliggöra effektiva analyser av nätverket bildandet kinetik att få insikt i potentiella molekylära mekanismer som är involverade i den dynamiska processen för vasculogenesis. Effektivitet och automatisering är viktiga komponenter i utvecklingen av nya tekniker för att generera och analysera stora mängder imaging data. KAV utvecklades speciellt för att analysera stora bildstaplar bestående av hundratals bilder att minska tid och arbetskraft som krävs för att härleda biologiskt meningsfulla slutsatser från time-lapse datauppsättningar. Ännu viktigare, KAV bedriver bildbehandling och data generation i några sekunder för små (mindre än 100 bilder) bild stackar och minuter för större (mer än 100 bilder) bildstaplar, vilket resulterar i oöverträffad effektivitet. Data organisationen in i kalkylblad av tid och uppmätta parametrar kan dessutom snabb generering av grafisk presentation och statistisk analys.

Utmaningar i framgångsrik tillämpning av denna metod
Även om denna analys innehåller förbättringar både bild förvärv och analys, kan några utmaningar hindra framgångsrikt genomförande. De fyra viktigaste hindren inkluderar luftfuktighet stabilitet, timing precision från bordläggningen till bild förvärvandet, programvara och maskinvara tillförlitlighet och hantering av stora datamängder som genereras för varje experiment. Stabil levande cell imaging under flera timmar kan vara utmanande. Särskilt krävs lämpliga och konsekventa befuktning för imaging kamrarna. Angiogenes bilder används i denna analys, som är avsedda för parallelizing matrix-baserade angiogenes analyser. Deras låg volym, ca 50 µL, gör avdunstning och kondensation betydande överväganden för utökade odlingsbetingelser. För att bekämpa problemet experimentellt, är det nödvändigt att använda en inkubator som reglerar luftfuktighet. Dock kan det också krävas att öka denna förordning om stark uttorkning av imaging kammaren inträffar över tiden. Vi hittade att det enklaste sättet att öka luftfuktigheten är att öka vatten yta i kammaren. För att uppnå detta mål, våra protokoll föreslår följande tre vattenkällor: en andra kamrar bild fylld med vatten, som är också där inkubator temperaturen mäts, vatten i området kring brunnarna på diabilder och fuktade filterpapper eller våtservetter. Däremot uppstår kondens när lufttemperaturen i rummet kyler botten av bilden och luftfuktigheten inne i kammaren kondenserar på bilderna och brunnarna. Denna komplikation kan leda till en utspädning av cell media och en lensing effekt som stör faskontrast. I dessa studier var kondens minimeras genom tillämpning av uppvärmd luft (39-42 ° C) på undersidan av bilden.

En nyckelfråga för någon time-lapse studie är överensstämmelsen mellan experiment initiering och imaging. Tidpunkten för när imaging startar är avgörande för tolkningen av efterföljande händelser. För att säkerställa timing precisionen i denna analys, ska tiden mellan första plätering och den första avbildade tidpunkten kontrolleras noggrant. I praktiken detta ”dödtid” kan minimeras, men ännu viktigare, det måste vara konsekvent att tillåta experiment på olika dagar kan jämföras. Exempelvis i detta protokoll förväntar vi oss en döda tid av cirka 30 min. Detta kan underlättas av närheten av experimentella förberedelse och imaging faciliteter.

Vad kan tyckas vara vardagliga detaljer vid första anblicken är viktiga för programvara, maskinvara stabilitet och datahantering. Programvaran och tillhörande maskinvarudrivrutiner, nätverksmiljö och automatiserad programvara uppdaterar alla påverkar stabiliteten i programvaran. Det är värt att testa detta protokoll i en ”torr kör” att identifiera flaskhalsar och potentiella felkällor i bild förvärv; till exempel kontrollera för opålitliga levande cell setup, scenen, slutaren och kamera tillförlitlighet och institutionella informationshanteringsprinciperna teknik för automatiserad operativsystem och programuppdateringar.

Datahantering är en pågående oro av någon tänkbar experiment som genererar hundratals till tusentals bilder. Lyckligtvis, kommersiell programvara ofta kontrollerar för tillgängligt utrymme före start ett imaging experiment. Denna assay innehåller emellertid också post-Capture bildbehandling och analys som kan lägga till hårddisk utrymme bördan och störa imaging experiment, om utrymmet är begränsat. Ytterligare, säkerheten och stabiliteten i datorn kan inte garanteras, även med maskinvarulösningar som en redundant array av identiska diskar. Således, en data management strategi att säkerställa utrymme på datorns hårddiskar för pågående experiment och en robust remote arkivering, exempelvis med en institutionell arkivering resurs, är nödvändigt.

Strategier för att maximera bildkvaliteten
Även om KAV förmåga att urskilja exakt ECFCs från matrix bakgrunden är robust, är analysens känslighet beroende av bildkvalitet. Till exempel om bilden har låg kontrast, kommer att mjukvaran upptäcka mobilnätverk med mindre noggrannhet (figur 2B). Kvaliteten på fas kontrasten påverkas av flera faktorer, inklusive inställningarna för mikroskopet används för bild förvärv, lastning av matrisen och cell suspension media under assay förberedelser, och underhåll av media nivåer inom brunnarna hela imaging. För att optimera fas kontrasten för dessa analyser, gjordes mindre justeringar till fas ring justering i mikroskopet att förbättra kontrast. Dessutom var provberedning noggrant testade för att säkerställa lika och konsekvent media lastning. Om mängden matris eller media laddas i brunnar är antingen nedanför eller ovanför spektrometerns optimala mätområde, kan en menisk bilda leder till förändrad faskontrast. Slutligen, på grund av den lilla volymen av vätska i brunnarna, det är viktigt att upprätthålla media nivåer genom att minimera avdunstning och kondensation, som nämnts ovan. Sammantaget är assay optimering avgörande för att skapa högkvalitativa bilder med kontrast för analys.

Utöver fas kontrast kvalitet, kan andra faktorer också påverka analysens resultat inklusive media kontaminering, brister i matrisen, och partiklar eller skräp i matrisen eller media. Kontaminering är en fara för denna analys eftersom det innebär levande cell imaging under flera timmar i en mikroskopi kammare. För att minska risken för kontamination, lastas matrix och cell upphängningarna på bilden i en steril huva. Varje prov är dessutom vanligtvis klädd i två eller tre exemplar för ett experiment för att minimera risken för dataförlust på grund av oförutsedda problem som skräp eller partiklar confounding analysen.

Prov heterogenitet enheter behöver för ökad analysens känslighet
Heterogenitet har observerats och rapporterats i tidigare studier av ECFCs som exponeras för GDM¹³. En hög nivå av heterogenitet i cell-funktion som observerats i dessa prover är spekulera till vara hänförligt till flera faktorer, inklusive svårighetsgraden av moderns sjukdom, sjukdom, och ledarstil som används för att reglera blodsockernivåerna. Allt fångar detta analytiska tillvägagångssätt den dynamiska sortiment av ECFC vasculogenesis, vilket gör det möjligt att identifiera fenotypiska skillnader på grund av funktionella heterogenitet i prover från GDM graviditeter. Användning av primära patientprover, såsom de som används i dessa studier kan sammantaget införa större variabilitet jämfört med en cellinje. Större betoning på translationella studier på djur eller människa flera delprov med funktionella variabilitet, är analysens känslighet viktigt för att upptäcka och härledning av biologiskt meningsfull mätningar och slutsatser. Därför, utveckling av strategier som KAV kommer att förbättra kvantiteten och kvaliteten på data som genereras av in vitro- vasculogenesis och angiogenes analyser för att möjliggöra mer robust observationer och slutsatser. Dessa data kommer dessutom att underlätta framtida utredning av underliggande molekylära mekanismer som bidrar till förändrad ECFC vasculogenesis efter intrauterin GDM exponering.

Framtida tillämpningar av denna strategi
Även om denna metod användes för att bedöma fostrets ECFC vasculogenesis in vitro- i dessa studier, är de potentiella tillämpningarna av detta tillvägagångssätt många. Denna teknik kan lätt genomföras för att studera någon cell befolkningen som deltar i processerna av vasculogenesis eller angiogenes. Specifikt, det kan användas för att studera enskilda cellpopulationer, vilket visades i denna studie, men det skulle också kunna tillämpas på samtidig kultur system. I framtiden, skulle det vara fördelaktigt att expandera denna strategi bortom den tvådimensionella i vitro assay att bedöma tredimensionella (3D) modeller. Även om den aktuella versionen av KAV skulle vara otillräcklig för quantitating 3D-avbildning data, skulle en Likaså utformade time-lapse, multi parametriska analytisk metod speciellt för 3D eller i vivo modeller informera om observationer gjorda i två dimensioner in vitro- är representativa för cellens funktion i en mer biologiskt relevant miljö.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Tissue Culture Plates	Fisher	353003
15 mL conical tubes	Fisher	1495949B
Angiogenesis 15-well micro-slides	Ibidi	81506
Matrigel	Fisher (Corning)	354234
EGM2 Medium	Lonza	CC3162
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11550
PSA Antimyocytic, Antibiotic	Fisher	MT30004C1	Added 5 mL per 500 mL bottle of EGM2 medium.
0.5% Trypsin/0.53 nM EDTA in HBSS	Fisher (Corning)	MT25052CI
Type 1 Collagen	Fisher (Corning)	354226	100 mg of liquid, concentration range 3-4 mg/mL. Dilute in 20 nM acetic acid in ddH2O to use at a final concentration of 0.05 mg/mL.
Glacial Acetic Acid	Fisher	A38-212	Used in Type 1 Collagen solution at a final concentration of 20 nM.
Kim Wipes	Fisher	06-666
Chambered slide	Ibidi	80296	This slide can be filled with distilled water to maintain humidity in the imaging chamber.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher (Gibco)	20012027	1x solution, pH 7.2
Microscope	Nikon Instruments	MEA53100 and MEF55030	Motorized TiE including Ph1 phase ring for phase contrast with objective
Stage	Prior Instruments	ProScan II	Other OKOlab and Nikon Elements AR compatible stage may be used
Objective	Nikon Instruments	93178	CFI Plan Fluor DL 10X
Camera	Hamamatsu	C11440-42U	ORCA Flash 4.0LT
Stage Blower	Precision Controls	N/A	This item has been discontinued, alternatives include Smart Air-Therm Heater(AIRTHERM-SMT-1W) from World Precision Instruments
Stage-top Incubator	OKOLabs	H301	BoldLine including a two position slide holder
Computer	Hewlett-Packard	Z620 or equivalent	4 core Intel Xeon processor, >32 GB RAM, >2 TB RAID 10, nVidia Quadro graphics card
Nikon Elements Software	Nikon Instruments	AR v 4.20	ND Acquisition is a multidimensional setup tool used to configure Elements software.
FIJI (ImageJ) Software	N/A	N/A	Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://imagej.net/Fiji/Downloads
KAV Plug-In	N/A	N/A	Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://github.com/icbm-iupui/kinetic-analysis-vasculogenesis