Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Kinetische analyse van vasculogenese kwantificeert dynamiek van Vasculogenese en angiogenese In Vitro

Published: January 31, 2018 doi: 10.3791/57044

Summary

Hier presenteren we een protocol voor time-lapse beeldvorming en analyse van het vasculogenese in vitro gebruik van fase contrast microscopie in combinatie met de open source-software, kinetische analyse van vasculogenese. Dit protocol kan worden toegepast om het kwantitatief het beoordelen van het potentieel van de vasculogenic van vele celtypes of experimentele omstandigheden dat model vasculaire ziekte.

Abstract

Vasculogenese is een complex proces waarbij endotheliale cellen van de stam en voorlopercellen ondergaan DOVO vaartuig vorming. Kwantitatieve beoordeling van vasculogenese uitgegroeid tot een centrale uitlezing van endothelial progenitor cel functionaliteit, en dus verschillende pogingen zijn gedaan om zowel in vitro als in vivo vasculogenese modellen. Standaardmethoden zijn echter beperkt in omvang, met statische metingen niet te vangen van de vele aspecten van dit zeer dynamisch proces. Dus, het doel van de ontwikkeling van dit nieuwe protocol moest beoordelen de kinetiek van in vitro vasculogenese om te kwantificeren tarieven van netwerk vorming en stabilisatie, evenals het bieden van inzicht in mogelijke mechanismen die ten grondslag liggen aan vasculaire dysfunctie. Toepassing van dit protocol is aangetoond door middel van foetale endothelial kolonievormende cellen (ECFCs) blootgesteld aan moeders diabetes mellitus. Foetale ECFCs werden afgeleid van navelstrengbloed na geboorte, gekweekt en verguld in dia's met kelder membraan matrix, waar ze onderging vasculogenese. Beelden van de hele dia putten werden verkregen met behulp van time-lapse fase contrast microscopie meer dan 15 uur. Beelden werden geanalyseerd voor afleiding van kwantitatieve gegevens met behulp van een analysesoftware genaamd kinetische analyse van vasculogenese (KAV). KAV beeldsegmentatie, gevolgd door skeletonization gebruikt voor het analyseren van de netwerkonderdelen van stapels van multi tijd punt fase contrast beelden voor het afleiden van tien parameters (9 gemeten, 1 berekend) van het netwerk structuur met inbegrip: gesloten netwerken, netwerkgebieden, knooppunten, takken, totale lengte, gemiddelde lengte, triple-vertakt knooppunten, quad-vertakt knooppunten, netwerkstructuren en de aftakking naar knooppunt verhouding. Toepassing van dit protocol geïdentificeerd gewijzigd tarieven van vasculogenese in ECFCs verkregen zwangerschappen bemoeilijkt door diabetes mellitus. Deze techniek heeft brede implicaties echter buiten de reikwijdte hier gemeld. Uitvoering van deze aanpak zal verbeteren mechanistische beoordeling en verbetering van de functionele uitlezingen Vasculogenese en andere biologisch belangrijke vertakkende processen in vele celtypes of ziekte staten.

Introduction

De mogelijkheid van endotheliale voorlopercellen ondergaan vasculogenese, of de vorming van het vaartuig van de DOVO , is van cruciaal belang bij het vaststellen van embryonale therapieën tijdens ontwikkeling1. Daarnaast is verdere vaartuig vorming en rijping van reeds bestaande vaartuigen, die bekend als angiogenese staat, ook een belangrijke proces in ontwikkeling en postnatale leven om bloedstroom en homeostase in het lichaam2. Elk orgaan in het lichaam is afhankelijk van het vasculaire systeem voor de levering van zuurstof en voedingsstoffen, en voor de verwijdering van afgewerkte3. Als vasculaire homeostase niet wordt gehandhaafd, zodat het bloedvat vorming en reparatie onvoldoende of in overmaat zijn, de vasculaire ziekten kunnen leiden tot4worden weergegeven. Daarom, vasculaire vorming en aanpassing worden vaak bestudeerd, zoals ze essentieel voor het behoud van de gezondheid orgel zijn en zijn betrokken bij de ontwikkeling van vele pathologische staten.

Als gevolg van een toegenomen inzicht in de betrokkenheid van het vaatstelsel in ontwikkeling, maar ook in de manifestatie van de ziekte en de progressie, zijn tests ontwikkeld om model Vasculogenese en angiogenese in vitro en in vivo5 ,6,7. Modelleren van schip vorming omvat plating vasculaire cellen, zoals endotheliale cellen, in de kelder membraan-matrix die bevordert de organisatie van de cel en de vorming van schip netwerken8,9,10. Meestal de volgende overnachting incubatie, beelden van mobiele netwerken worden vastgelegd op een enkel tijdstip, wat resulteert in een klein aantal beelden voor analyse11,12,13. Daarom, analytische benaderingen zijn grotendeels ontwikkeld en geoptimaliseerd voor het keer punt evaluaties10,14. Echter, statische analyses zijn simpelweg onvoldoende bij het vastleggen van het dynamische proces van de vorming van het vaartuig en beperkt inzicht geven in mogelijke mechanismen die betrokken zijn. Hoewel steeds vaker imaging waarschijnlijk de nodige gegevens bieden zou ter identificatie van de formatie kinetiek, zou toepassing van eerder ontwikkelde analytics op een multi tijd punt imaging aanpak inefficiënt en arbeid intensieve14. Bovendien, ondanks de ontwikkeling van commercieel beschikbare analyses maakt een pay-per-beeld vergoeding deze optie kosten-verbiedend voor kinetische studies waarin duizenden beelden gegenereerde15 zijn. Er is dus een noodzaak op het gebied van een gestroomlijnde en efficiënte aanpak te vangen en te kwantificeren vasculogenese in vitro, inclusief de mogelijkheid om het analyseren van grote afbeelding sets gegenereerd door time-lapse levende cel microscopie.

Deze beperkingen wilt opheffen, werd een nieuwe aanpak ontwikkeld met als doel het uitbreiden van enige tijd punt imaging zodat dynamische evaluatie van vasculogenese met beelden verkregen elke 15 min16. Door het vastleggen van meerdere tijdstippen gedurende enkele uren, biedt deze aanpak een meer gedetailleerde beschrijving van het proces van vasculogenese, alsmede inzicht in mogelijke mechanismen bij te dragen aan de vorming en het onderhoud van netwerken van het vaartuig. Deze aanpak omvat naast het verbeteren van de frequentie en de kwaliteit van Beeldacquisitie, nieuwe types software in de vorm van een open-source plug-in17. De software, wordt genoemd als kinetische analyse van vasculogenese (KAV), is een gestroomlijnde toepassing waarin beeldverwerking en de analyse speciaal voor grote afbeelding sets gegenereerd op basis van multi tijd punt acquisities. KAV analyseert fase contrast beelden via beeldsegmentatie, gevolgd door skeletonization18. Tien parameters van netwerkstructuur zijn gekwantificeerd door KAV inclusief: takken, gesloten netwerken, knooppunten, netwerkgebieden, netwerkstructuren, triple-vertakt knooppunten, quad-vertakt knooppunten, totale lengte, gemiddelde lengte en de aftakking naar knooppunt verhouding (Zie schema in Figuur 1),16. Toepassing van de KAV aanpak omvat een roman, berekende fenotype van in vitro vasculogenese, hierna aangeduid als de aftakking naar knooppunt verhouding. Ons recente werk aangetoond dat deze verhouding kenmerkend voor de verbinding met het netwerk is en kan gepaard gaan met andere cellulaire processen die betrokken zijn bij de vorming van het netwerk, zoals motiliteit16.

Hoewel foetale endothelial kolonievormende cel (ECFC) vasculogenese werd beoordeeld in deze studies, kan deze afbeelding verwerving en analyse aanpak gemakkelijk worden toegepast om te evalueren van alle celtypes die ondergaan vasculogenese of angiogenese. Bovendien kan deze aanpak worden gebruikt voor identificatie van gewijzigde vasculaire functie die voortvloeien uit een verscheidenheid van pathologische toestanden, zoals zwangerschapsduur diabetes mellitus, zoals in deze studies. Bovendien, deze methode zou kunnen worden aangepast om de vorming van het netwerk en vertakking, die belangrijk voor andere biologisch relevante processen zijn te beoordelen. Dus, de mogelijke gevolgen van de toepassing van deze nieuwe aanpak met unieke biologische systemen nog te bepalen.

Protocol

1. voorbereiding

  1. Cultuur endothelial kolonievormende cellen (ECFCs)
    Opmerking: Foetale ECFC monsters gebruikt in deze experimenten werden geïsoleerd van menselijke navelstrengbloed en gekweekt door de Angio BioCore (ABC) op de Indiana University School of Medicine als eerder beschreven6. Routine kwaliteitscontrole fenotypering werd uitgevoerd binnen het ABC te bevestigen uitdrukking van endothelial antigenen als eerder beschreven19,20,21. Monsters gebruikt in experimenten minimaal waren gepasseerd (2 - 3 keer). Alle weefselkweek werk werd uitgevoerd in de kap van een weefselkweek. Alle reagentia, inclusief weefselkweek platen en oplossingen, zijn steriel.
    1. Twee dagen voorafgaand aan het experiment 100 mm ronde weefselkweek platen met 6 mL 0,05 mg/mL type 1 collageen jas en Incubeer bij 37 ° C's nachts.
      Opmerking: Type 1 collageen wordt in tweemaal gedestilleerd water met 20 nM azijnzuur tot een concentratie van de werken van 0,05 mg/mL verdund.
    2. De dag voorafgaand aan het experiment, trypsinize en replate ECFCs op de type 1 collageen gecoate platen in 1.1.1. (Zie opmerking in punt 1.1).
    3. Om te trypsinize ECFCs, media uit vergulde cellen gecombineerd en wassen met 7 mL PBS. Gecombineerd PBS, dan voeg 2-3 mL 0,5% trypsine en Incubeer de cellen gedurende 2-5 minuten bij 37 ° C.
    4. Onmiddellijk na incubatie met trypsine, voeg 3 mL EGM2 en Pipetteer omhoog en omlaag te verjagen alle aanhangend cellen. Celsuspensie overbrengen in een conische buis 15 mL.
    5. Centrifugeer alle monsters bij 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    6. Gecombineerd supernatant en resuspendeer cel pellets in 1-2 mL EGM2. Meng de celsuspensie en verwijderen van een kleine hoeveelheid (20-40 μL) om te tellen.
    7. Gelijke delen trypan blauwe toevoegen aan de cel aliquoot en Pipetteer 10 µL op een hemocytometer. Het aantal cellen in de vier primaire kwadranten van de hemocytometer.
      Opmerking: Gebruik beide zijden van de hemocytometer voor alle monster tellingen te verhogen van de nauwkeurigheid.
    8. Wassen van de weefselkweek collageen beklede platen, die werden opgesteld in stap 1.1.1, tweemaal met 7 mL PBS. Cultuur media aangevuld met 10% foetale runderserum aan de platen na aspirating de tweede PBS wash, voeg toe 10 mL endothelial groeimedium 2 (EGM2).
    9. Met behulp van de graven van de cel in stap 1.1.7 verkregen, het volume van de celsuspensie plaat 4 x 105 cellen moeten berekenen. 4 x 10 bord5 ECFCs op de platen van weefselkweek in stap 1.1.8 voorbereid, en na een nacht bebroeden bij 37 ° C en 5% kooldioxide (CO2).
  2. Voorafgaand aan het experiment, slaan voorraden bij 4 °C's nachts
    1. Het slaan van een 3 "x 2" metalen plaat, dia (Houd in pakket tot open in kap), een doos van steriele 20 microliter (μL) tips en kelder membraan matrix (matrix).
      Opmerking: De matrijs wordt gehouden bij-80 ° C voor langdurige opslag; Ontdooi het altijd bij 4 ° C's nachts of gedurende enkele uren voorafgaand aan het gebruiken.
  3. Controleer of de beschikbaarheid van voldoende ruimte voor de afbeeldingen op van de computer harde-schijven.
    Opmerking: Met de configuratie geschetst in dit protocol, moesten ongeveer 60 gigabytes (GB) ruimte per experiment (4 GB per putje). Echter ruimte schattingen zijn gebaseerd op de hardwareconfiguratie en zal moeten worden bepaald voor elk systeem.

2. protocol 1: Experimentele opstelling: voorbereiding van de dia

  1. Verzamelen en voorbereiden van de leveringen
    1. De dag van het experiment, verzamelen supplies voor cellen op de dia, met inbegrip van een emmer ijs, een kleine container van droogijs, een paar van schaar en een 20 μL pipet plating. Spuiten van alle items met 70% ethanol, veeg droog met keukenpapier en plaats van de items in een steriele weefselkweek kap.
    2. Verzamelen van alle leveringen opgeslagen bij 4 ° C (zie stap 1.2) met inbegrip van de metalen plaat, vak van tips, dia en matrix. Het vak van tips spray met 70% ethanol en plaats van het vak in de container van droogijs.
      Opmerking: verwijderen matrix uit de koelkast 4 ° C alleen als u klaar bent om te gebruiken en houd altijd de matrix op ijs.
    3. Spray de metalen plaat met 70% ethanol en insluiten in het ijs in de ijsemmer. Open de verpakking met de dia, en plaats van de dia op de metalen plaat te houden koude.
  2. Belasting matrix op de dia.
    1. De pipet ingesteld op 10 μL en verwijder de tip van koude tip doos met de pipet. Snijd ongeveer 1 cm van het einde van het uiteinde met de schaar.
      Opmerking: Cut loodrecht op de tip om de bubbels in de matrix. De pipet kan worden ingesteld op een volume iets groter dan 10 μL ter verantwoording voor matrix vasthouden aan de binnenkant van de tip.
    2. Langzaam trekken de matrix in het uiteinde van de pipet. Onmiddellijk plaats het uiteinde van de pipet in het midden van de put. Zachtjes raak het uiteinde van de pipet om de bodem van de put en langzaam de matrix uitduwen.
      Opmerking: niet over Pipet, als dit zal leiden tot bubbels te vormen. Als een zeepbel vormen, pop onmiddellijk met behulp van een kleine tip.
    3. De dia bevat 15 afzonderlijke wells. Herhaal de vorige stap voor elk putje. Gebruik een nieuwe Pipet-tip voor elk putje consistentie te verminderen matrix stollen in de tip.
    4. Zodra de dia wordt geladen met alle putjes met matrix, duwen de deksel helemaal op de dia, en Incubeer bij 37 ° C gedurende 30-60 minuten totdat de matrix stolt.
      Opmerking: Laat niet de matrix uitdrogen. Het toevoegen van een klein volume (2-3 mL) van PBS in de dop van een conische buis van 50 mL in de buurt van de dia in de incubator om het risico voor het drogen van de matrix.

3. protocol 2: Plating ECFCs op de Matrix

  1. Aanhanger ECFCs verwijderen uit weefselkweek platen en verzamelen in suspensie
    1. Weefselkweek platen met de ECFCs bekleed de vorige dag (zie punt 1.1.9) te verkrijgen. Gecombineerd EGM2 media en wassen van de aanhanger ECFCs eens met 7 mL PBS.
    2. Gecombineerd PBS, voeg 2-3 mL trypsine en incubeer Adherente cellen gedurende 2-5 minuten bij 37 ° C.
    3. Onmiddellijk na incubatie, voeg 3 mL EGM2 en Pipetteer omhoog en omlaag te verjagen alle aanhangend cellen. Celsuspensie overbrengen in een conische buis 15 mL.
    4. Herhaal de stappen 3.1.1-3.1.3 voor de resterende drie monsters van het ECFC alle vier celsteekproeven worden verzameld in suspensie.
  2. Master mixen voor te bereiden
    1. Centrifugeer alle monsters bij 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Gecombineerd supernatant en resuspendeer cel pellets in 1-2 mL EGM2.
    3. Meng de celsuspensie en verwijderen van een kleine hoeveelheid (20-40 μL) om te tellen.
    4. Gelijke delen trypan blauwe toevoegen aan de cel aliquoot en Pipetteer 10 μL op een hemocytometer. Het aantal cellen in de vier primaire kwadranten van de hemocytometer.
      Opmerking: Gebruik beide zijden van de hemocytometer voor alle monster tellingen te verhogen van de nauwkeurigheid.
    5. Met behulp van de cel telt van bovenaf, berekenen van het volume van elk monster cel met 1.4x104 cellen. Meng alle cel schorsingen en aliquoot 1.4 x 104 cellen in een verse buis voor te bereiden op een master mix elke experimentele voorwaarde. EGM2 media toevoegen zodat het eindvolume voor elke master mix 175 μL is.
    6. Elke master mix Meng door zachtjes pipetting en aliquoot 50 μl van master mix in individuele putjes op de dia.
      Opmerking: alle monsters zijn verguld in drievoud, met master mixen berekend voor 3,5 putten om voldoende volume voor 3 wells.
  3. Incubeer de dia
    1. Incubeer de dia bij 37 ° C, totdat het kan worden verplaatst naar de Microscoop kamer voor imaging.
      Opmerking: De tijd tussen de beplating en imaging moet zo kort mogelijk verlies van gegevens tijdens de vroege stadia van vasculogenese beperken.

4. protocol 3: Microscoop Setup en beeldacquisitie

Opmerking: Voor onze studies, protocollen 2 en 3 werden uitgevoerd gelijktijdig door afzonderlijke individuen. Als protocollen 2 en 3 moet worden ingevuld door dezelfde persoon, moet Protocol 3 stappen 4.1 en 4.2 hieronder zijn voltooid alvorens aan te vangen van Protocol 2 hierboven.

  1. Schakel de Microscoop en computer
    1. Ongeveer één tot twee uur vóór het opstarten van het experiment, inschakelen en verwarm de incubator fase top tot 37 ° C ingesteld, de CO-2 tot 5%, en de luchtvochtigheid tot 85%. Vul de incubator van vochtigheid reservoir, indien leeg.
    2. Plaats een lege chambered dia in een van de twee open posities en vullen met gedestilleerd water. Beveilig de feedback thermometer voor zaal-temperatuurregeling, indien beschikbaar.
      Opmerking: Als de thermometer feedback beschikbaar is, gebruik deze "incubator temperatuur" om te verifiëren dat de kamer heeft geëquilibreerd.
    3. Inschakelen van een secundaire blower ingesteld op 39-42 ° C te verwarmen van de dia's uit de onderstaande lijst en condensatie te minimaliseren.
    4. Voeg een tweede dia als een leeg totdat de experimentele dia kan worden toegevoegd. Deze dia dient als een aanduiding van de locatie voor de configuratie van de overname-instellingen voor afzonderlijke putten tijdens setup.
    5. Voeg water toe tot het reservoir rondom de putjes op de tweede dia op de omstandigheden tijdens het imaging experiment nabootsen. Het water rondom de putten kan evaluatie van vochtigheid bij Microscoop setup en voorverwarmen.
      Opmerking: Pre evenwichtsinstelling van de fase-top incubator en secundaire aanjager is van cruciaal belang voor het handhaven van een stabiel klimaat voor kweken. De meeste levende cellen kamer controllers geven real-time feedback van temperatuur, CO2en vochtigheid te beoordelen van de bereidheid van het systeem. Controleer voorafgaand aan verder te gaan, op de accumulatie van vochtigheid op de dia en overmatig drogen van het reservoir als 4.1.5 ingevuld. Luchtvochtigheid moet mogelijk worden aangepast als er overmatig drogen of condensatie in de zaal. Toevoegen om te verhogen van de luchtvochtigheid, veegt bevochtigd met gedestilleerd water. Als u wilt verkleinen condensatie, afnemen van de luchtvochtigheid instelling aangepast in 4.1.1 of zoals condensatie zou een teken zijn van lage temperatuur, check de kamer temperatuurinstellingen en de positionering van de secundaire Blazer.
  2. Basisinstallatiekopie overname-instellingen configureren tijdens evenwichtsinstelling.
    Opmerking: Beeldacquisitie wordt geconfigureerd via de software die de fase, de sluitertijd en de camera regelt. Een multidimensionale setup tool is de makkelijkste manier voor het configureren van de software. Bovendien moet de software hebben autofocus routines om focus controle gedurende de looptijd van het experiment.
    1. De software gebruiken voor het instellen van meerdere podium posities voor elk putje. Bij dit protocol, selecteert u het midden van de putten.
    2. Configureer de Beeldacquisitie zodanig dat bij elke fase positie, de hele goed is beeld. Bijvoorbeeld, gebruik een tilescan met 10-20% beeld overlapping en ongeveer 5 x 5 velden, afhankelijk van de camera en definitieve vergroting.
    3. Configureer de time-lapse voor imaging-elke 15 min.
      Opmerking: Met de configuratie geschetst in dit protocol, zijn alle 15 putjes van de dia beeld binnen een interval van 15 min.
  3. De experimentele dia laden
    1. Na evenwichtsinstelling van de incubator kamer, door de lege dia te vervangen door de experimentele dia.
      Opmerking: een equilibrated kamer zal beschikken over stabiele temperatuur, CO2en vochtigheid gedurende ten minste 20 minuten. Zodra de experimentele dia klaar is, is het noodzakelijk dat stappen snel worden voltooid om te minimaliseren van de "dode tijd" tussen de beplating en het punt van de eerste tijd gevangen genomen door de Microscoop. Bovendien, om de vergelijking tussen imaging experimenten, ditmaal moet worden consistent. In deze experimenten vereist alle stappen in Protocol 3 sectie 4.3 ongeveer 30 minuten om te voltooien.
    2. Verwijderen van de dia deksel en voeg water naar het reservoir rondom de putjes op de dia.
      Opmerking: Deksel is verwijderd voor de duur van de beeldvorming experiment.
  4. Eindbeeld overname-instellingen configureren
    1. Plaats van de doelstelling van de CFI Plan Fluor DL 10 X in positie en selecteer de Ph1 fase ring op de condensor. Met de eerste put in focus, het pad diascopic licht voor Köhler belichting aanpassen en configureren van fase optica door het controleren van de aanpassing van de ring van de fase in de condensor met het masker van de objectieve fase.
    2. De belichtingstijd configureren en aanpassen van de intensiteit van de lamp voor fase contrast, die meestal minder dan 500 ms is.
    3. Elke fase positie set in 4.2.1 doorlopen en bevestigen dat het midden van de put is geselecteerd, en pas, indien nodig.
    4. Bij elke fase positie, focus op de cellen vergulde in de put en de fase positie van z positie gebruikt voor beeldvorming in de software instellen.
    5. Test de autofocus-mechanisme voor de Microscoop. Als de autofocus hardware gebaseerd is, controleert het brandt en correct geplaatst voor alle podium posities.
      Opmerking: zoals het model en de fase verticaal tijdens het experiment drift kunnen, is het belangrijk dat de software de autofocus op de positie van elke fase en elk tijdstip controleert om betrouwbare beeldvorming in de tijd-loop. Indien mogelijk, is een autofocus positie bepaald in het vorige punt van de tijd dient als uitgangspunt voor de latere autofocus routine. Op deze manier aan de gang zijnde drift kan worden aangepast voor gemakkelijk.
    6. Verminderen of doven van de lichten in de kamer van de Microscoop en de beeldvorming experiment starten.

5. Protocol nr. 4: Beeld verwerking en kinetische analyse van vasculogenese (KAV)

  1. Sparen beelden van individuele tijdstippen als een afbeeldingsstapel voor elk putje
    Opmerking: de meeste software voor Fotolader kunt exporteren multipage TIFF-bestanden (stacks) van tijdreeksen. KAV is ontworpen voor gebruik op datasets die meerdere tijdstippen kunnen bevatten. Dus, analyse op de hele afbeelding stack voor de positie van een bepaald stadium plaatsvindt. Indien nodig kunt de beeldverwerkingssoftware enkele beelden importeren vanuit elk punt van de tijd aan het reconstrueren van een afbeeldingsstapel.
  2. Het beeld processing software op de computer openen
  3. KAV toevoegen aan het beeld processing software
    1. Sleep de KAV-bestand vanuit een map in de grijze balk aan de onderkant van het venster software. Klik op 'Opslaan' om de software toevoegen aan de lijst.
  4. Open de afbeeldingsstapel te analyseren
    1. Klik op 'bestand' dan 'Open' via het dropdown menu in de software van de beeldverwerking, of sleep het afbeeldingsbestand in de grijze balk zoals in stap 5.3.1.
    2. De beelden omzetten in 8 bits door te klikken op 'Beeld', 'Type', '8 bit'.
  5. Maken van een regio van belang (ROI)
    1. Open de ROI-Manager door te klikken op 'Analyseren' in de werkbalk. Selecteer 'Tools' gevolgd door ' ROI Manager'.
    2. Maak een nieuwe ROI door op de cirkel of rechthoek selectiegereedschappen op de werkbalk te klikken en de gewenste selectiegebied puttend uit de afbeelding. Klik op 'Toevoegen' in het venster van de manager ROI als die shape wilt opslaan.
      Opmerking: Een eerder gemaakte ROI kan worden geopend door te slepen ROIs (gezipte map) opgeslagen in de bar van het 'Drag and Drop' in de Manager te openen.
    3. Klik op het label van de ROI vermeld in de ROI-Manager om het te bekijken op de afbeelding.
      Opmerking: Als de ROI zal niet op de afbeelding verschijnen, maak een tweede ROI (een willekeurige grootte/vorm) en toe te voegen aan de manager. Zodra beide ROIs weergegeven in de lijst, klikt u op heen en weer tussen de twee en de gewenste ROI op de afbeelding verschijnen zal.
    4. Uitlijnen de ROI indien nodig. Zodra de ROI op zijn plaats op het beeld op de gewenste locatie is, ga naar het Menu en klik op 'Bewerken' dan 'Duidelijk buiten'. Dit zal de afbeeldingsgegevens buiten de ROI (nuttig voor niet-rechthoekige vormen) voor elke afbeelding in de stapel verwijderen.
      Opmerking: Kunt u ook klikken op 'Afbeelding' en 'Bijsnijden' als u van een rectangularly gevormde ROI gebruikmaakt.
  6. Stormloop naar de KAV software
    1. Klik op 'Plug-ins' in de menubalk.
    2. Selecteer de 'analyseren netwerk' Plug-in. Dit opent een venster met opties voor het wijzigen van de instellingen in de Plug-in.
    3. De methode van de drempelmethode met behulp van de drop-down pijl te wijzigen.
    4. Zodra alle van de juiste instellingen zijn geselecteerd, klikt u op 'OK' om te starten softwareverwerking.
      Opmerking: Passende instellingen worden bepaald door visualisatie van het skelet en masker uitleveringen gegenereerd door KAV, die een aanwijzing van de accurary van de software te identificeren en te onderscheiden van de cellen en netwerken van de achtergrond van de fase contrast foto.
  7. De KAV gegenereerde gegevens opslaan
    1. Zodra de plug-in klaar is met de analyse, zal twee vensters pop-up op het scherm, met inbegrip van een gegevenstabel met numerieke waarden en een stapel van gesmolten beelden beeltenis skelet en masker uitleveringen.
    2. Sla de numerieke waarden door te navigeren naar de linkerbovenhoek van de tabel en te klikken op 'Edit' 'Kopieer' of 'Cut' om waarden in een excel-werkblad plakken.
    3. Klik op de gesmolten skelet en mask-afbeelding. De gesmolten skelet/mask afbeeldingsstapel opslaan als een bestand Tagged Image File Format (TIFF) door te klikken op 'File,' 'Opslaan als' 'TIFF.'
    4. Opslaan van de bijgesneden fase contrast stack (gemaakt met behulp van de ROI) van het beeld door te klikken op 'Bestand,' 'Opslaan als' 'TIFF.'
    5. Klik op de ROI Manager-venster en selecteer de ROI gebruikt voor het bijsnijden van de beelden. Klik op 'Meer' gevolgd door 'Opslaan' om de ROI voor toekomstig gebruik.
      Opmerking: Met behulp van de dezelfde ROI zal helpen consistentie over de analyses.

Representative Results

KAV produceert visuele representaties van netwerkstructuur
Het contrast tussen de ECFCs en de achtergrond van de matrix in de fase contrast beelden kunt KAV te identificeren van cel-specifieke structuren. ECFC netwerken geïdentificeerd door KAV zijn pittoreske als skelet en masker uitleveringen vertegenwoordigd om te illustreren structuren gebruikt door de software voor kwantificering(Figuur 2). Bovenal maakt kwalitatieve beoordeling van het skelet en masker uitleveringen snelle identificatie van KAV gevoeligheid en nauwkeurigheid, waarin nog kan nuttig zijn bij het bepalen van de optimale instellingen en interpreteren van resultaten van de analyse. Wanneer de kwaliteit van de afbeeldingen met fase contrast hoog is en voldoende contrast is bereikt, identificeert KAV nauwkeurig ECFC netwerken, zoals aangegeven door de gelijkenis tussen de fase contrast-afbeelding en de KAV gegenereerde skelet en masker uitleveringen (Figuur 2 A en Video 1).

U hebt fase contrast beelden geen hoog contrast en/of artefacten van imaging zoals gridding plaatsvinden, netwerk detectie nauwkeurigheid wordt verminderd en resultaten worden dubbelzinnig (Figuur 2B). Vorming van luchtbellen binnen de cel media kan bovendien ook onzichtbaar maakt detectie nauwkeurigheid (Figuur 2). Problemen met de beeldkwaliteit kunnen echter vaak worden overwonnen door selectie van verschillende drempelmethode methoden opgenomen in de software van KAV. Bijvoorbeeld, werd de fase contrast afbeelding in Figuur 2B geanalyseerd met identiek beeld processing instellingen met uitzondering van de drempelmethode-methode. Van het skelet en masker uitleveringen is het duidelijk dat de Otsu drempelmethode in een meer nauwkeurige detectie van de netwerken van de ECFC weergegeven in de fase contrast afbeelding (Figuur 2B resulteerde). Beeldkwaliteit is daarom essentieel voor het bereiken van nauwkeurige en zinvolle resultaten in deze test. Evenwel toestaan dat verschillende drempelmethode methoden opgenomen in de gebruikersinterface van KAV aanpassing van beeldanalyse op basis van de kwaliteit van de invoerafbeeldingen.

Time-lapse microscopie identificeert kwalitatieve en kwantitatieve verschillen in ECFC vasculogenese na blootstelling van de uteriene zwangerschapsduur diabetes mellitus
Onlangs, de KAV analytische aanpak werd gebruikt om te beoordelen van foetale ECFC functie, na blootstelling aan moeders type 2 diabetes mellitus (T2DM) in utero16. Met behulp van KAV, veranderde kinetiek van vasculogenese werden geïdentificeerd in de foetale ECFCs blootgesteld aan T2DM. Echter, naast T2DM blootstelling, dat door de hele draagtijd, zwangerschapsduur diabetes mellitus (GDM) of de ontwikkeling van glucose-intolerantie gewoonlijk in het derde trimester van de zwangerschap komt, schaadt ook ECFC functie13. Daarom, KAV werd toegepast om te bepalen als de GDM-blootgesteld ECFCs veranderde kinetiek van de ECFC netwerk vorming ook weergegeven. Fase 1 (0-5 h) en fase 2 (5 + h) werden beoordeeld met behulp van tijd vervallen microscopie in combinatie met KAV analyse (Figuur 3). Representatieve fase contrast beelden verworven aan het begin van Beeldacquisitie (0,50 h) en in de tijdsverloop (5.00 en 10.00 h) verbeelden ECFC netwerk vorming in de vier monsters getest van een experimentele dag (Figuur 3 en Video 1 ). Ondanks de equivalente cel laden, zoals waargenomen in de fase contrast beelden op 0,50 uren, zijn kwalitatieve verschillen in netwerkstructuur duidelijk op de 5,00 en 10,00 uur tijd punten. ECFCs van de ongecompliceerde zwangerschap (UC) vormen een complex en ingewikkeld netwerk 5 uur na plating, vergelijkbaar met onze eerder gepubliceerde gegevens16. Omgekeerd, ECFCs van GDM voorbeeldformulier 1 (GDM1) zeer weinig structuren niet onderling verbonden netwerk. Dit patroon komt echter niet tot uiting in alle ECFC monsters verkregen uit GDM zwangerschappen, indicatieve van heterogeniteit tussen de monsters. Monsters GDM2 en GDM3 weer groter netwerk vorming in vergelijking met GDM1, hoewel de patronen van connectiviteit veranderd in vergelijking met de UC-monster lijken. Bovenal meet KAV verschillende constructiedelen van ECFC netwerken te identificeren zowel subtiele als duidelijke fenotypen.

Naast het genereren van skelet en masker uitleveringen van netwerkstructuur, kwantificeert KAV tien statistieken van de structuur van het netwerk, met inbegrip van het aantal individuele netwerkstructuren, knooppunten, triple-vertakt knooppunten, quadruple-vertakt knooppunten, takken, totale bijkantoor van de lengte, gemiddelde lengte, aftakking naar knooppunt verhouding, totale gesloten netwerken, en netwerk gebied16. KAV verzamelt de gegevens voor elk monster in een enkele tabel van waarden voor alle foto's van het tijdsverloop. Tabel 1 bevat representatieve ruwe gegevens uit één beeldvorming studie voor één ECFC monster. Parameters van de netwerkstructuur gemeten door KAV zijn geordend in kolommen, en de gegevens voor opeenvolgende beelden verworven na verloop van tijd zijn onderverdeeld in rijen. Voor bijvoorbeeld in onze studies, afbeelding 1 werd verkregen 30 min na beplating met latere beelden worden verzameld elke 15 min. Raw waarden die zijn gegenereerd door KAV kan vervolgens worden opgenomen in een grafiek of16verder geanalyseerd met behulp van meer complexe statistische benaderingen.

Vijf grafieken beeltenis van gemiddelde waarden van de structuur van het netwerk uit drie aparte experimenten worden weergegeven voor een enkele ongecompliceerde monster (UC) en de drie monsters voor GDM (Figuur 4). Het monster van UC in deze experimenten uitgevoerd op dezelfde manier eerder geanalyseerd UC monsters16. Eerder, was het ontdekt dat ECFC vasculogenese in vitro is bi-phasic, bestaande uit fase 1 (0 - 5 h) en fase 2 (5-10 h)16. Dit patroon is consistent in de huidige studies, zoals blijkt uit de grafiek afgebeeld gesloten netwerkgegevens (Figuur 4). De UC-steekproef vormden een groter aantal gesloten netwerken ten opzichte van alle drie van de GDM-monsters. Interessant is dat lijken drie van de vier monsters te hebben een soortgelijke tijd om maximale aantal gesloten netwerken, die tussen 2,5 tot 3 uur plaatsvindt. Het GDM2 monster was echter langzamer te bereiken maximale gesloten netwerken, die zich hebben voorgedaan 5 uur na plating. En, ondanks het GDM2 monster vormen minder maximale netwerken in vergelijking met de UC-monster, de netwerken vormt werden onderhouden ook aan het UC monster na verloop van tijd. Omgekeerd, GDM1 en GDM3, die gevormd minder netwerken in vergelijking met de UC-monster, ook tentoongesteld een algehele vermindering in netwerknummer na verloop van tijd. Over het algemeen uit de grafiek afgebeeld gesloten netwerknummer, is het duidelijk dat alle ECFC monsters een bi-phasic patroon van de vorming van het netwerk weergegeven, maar het tempo van de vorming en het maximale aantal netwerken bereikt in verschillende steekproeven variëren.

Netwerkgebied vertegenwoordigt het gemiddelde gebied binnen de gesloten netwerken gevormd door de ECFCs. Dus, hoe groter de gesloten netwerk nummer, hoe kleiner de netwerkgebieden. Dit patroon blijkt uit de grafieken van de netwerk-gebied waar de UC monster, dat een groter aantal gesloten netwerken gevormd, had kleinere netwerkgebieden na verloop van tijd in vergelijking met de drie monsters voor GDM (Figuur 4). GDM2, die maximale gesloten netwerken langzamer bereikt, tentoongesteld hoge netwerkgebied in eerste instantie, echter de ruimte gestabiliseerd in de tijd, en dit was meest vergelijkbaar met het UC monster om 15 uur. Na verloop van tijd de gemiddelde netwerkgebied in alle monsters stegen als gevolg van de stabilisatie van het netwerk. Echter, tentoongesteld enkele monsters, zoals GDM1 en GDM3, een snellere toename van de netwerkgebied, die is waarschijnlijk kenmerkend voor verminderde stabiliteit t.o.v. andere monsters vertonen een meer geleidelijke verhoging.

GDM-blootgesteld ECFCs vertonen gereduceerde netwerk stabiliteit
De verhouding van takken met knooppunten is een roman fenotype door KAV berekend en vastgesteld in onze eerdere studies, en dit is een indicatie van netwerk connectiviteit16. In de huidige studie had het UC monster een lage ratio, die vertegenwoordigd een hoge mate van connectiviteit van het netwerk dat werd gehandhaafd na verloop van tijd (Figuur 4). Omgekeerd, de drie monsters van de GDM had een hogere ratio van takken met knooppunten, met name in fase 2 van de formatie van het netwerk. Deze observatie toont verminderde connectiviteit en de stabilisatie van de netwerkstructuren.

Over het algemeen gevormd GDM1 minder knooppunten en takken in vergelijking met de andere monsters, met de vermindering gehandhaafd in de loop van het experiment. GDM2 en GDM3 gevormd en onderhouden van een groter aantal takken in vergelijking met de UC-voorbeeld, met name tussen 5-15 h. Het aantal knooppunten in de GDM2 en GDM3-netwerken gedetecteerd waren meer gelijk aan het aantal knooppunten in de UC-steekproef, met name tussen 10-15 h. Een groter aantal takken, maar een soortgelijk aantal knooppunten, zou goed zijn voor de toegenomen aftakking naar knooppunt verhouding duidelijk op de latere tijdstippen in de GDM-monsters. Nog belangrijker is, kunnen gelijktijdige wijzigingen in branch en node nummer moeilijk te interpreteren in afzonderlijke grafieken. De nieuwe aftakking naar knooppunt verhouding biedt echter een manier om te beoordelen hoe wijzigingen, met inbegrip van lichte wijzigingen moeilijk op te sporen in de afzonderlijke grafieken, in zowel de tak en de node nummer, resulteren in een gewijzigde netwerkverbinding.

Figure 1
Figuur 1 : Schematisch overzicht 10 parameters gekwantificeerd door kinetische analyse van vasculogenese (KAV). KAV kwantificeert tien verschillende parameters van de netwerkstructuur. Alle parameters zijn vergelijkende en schetste in het schema genummerd (1-10). Parameters omvatten het aantal takken (groen, 1), gesloten netwerken (blauw, 2), en de knooppunten (rood, 3), gemiddelde netwerkgebied (orange, 4), het aantal netwerkstructuren (zwarte, 5), triple-vertakt knooppunten (geel, 6) en quad-vertakt knooppunten (paarse, 7), alsmede het totaal (9) en gemiddelde lengte van (10) tak, en de verhouding van het aantal takken met het aantal knooppunten (10). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Kinetische analyse van vasculogenese (KAV) kwantificeert netwerkstructuur. (A) skelet en masker uitleveringen van netwerkstructuren geïdentificeerd door KAV met fase contrast-afbeeldingen geven visuele representatie van netwerkstructuren geïdentificeerd en gekwantificeerd door KAV. Schaal bar = 500 µm. (B) een representatieve fase contrast beeld van ECFC netwerken 10u na beplating met laag contrast en raster markeringen van afzonderlijke beelden samen te naaien. Verschillende drempelmethode methoden, zoals het gemiddelde of Otsu, kunnen worden geselecteerd in de KAV plug-in om kwantificatie nauwkeurigheid, als fase contrast beelden lage contrast hebben of als gridding optreedt. Skelet en masker uitleveringen van de fase contrast-afbeelding worden weergegeven voor zowel de gemiddelde en de Otsu drempelmethode methoden. Fase contrast beelden werden gemaakt met behulp van een 10 X doelstelling. Schaal bar = 500 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Intra GDM blootstelling verandert ECFC netwerk vorming. Beelden van de ECFC netwerk vorming werden gevangen voor 15u tussenpozen 15 min door fase contrast microscopie. Representatieve fase contrast beelden in stappen van 5 h, starten op het moment van plating (0.5 h), worden weergegeven voor de UC en drie GDM monsters. Fase contrast beelden werden gemaakt met behulp van een 10 X doelstelling. Schaal bar = 500 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : ECFCs blootgesteld aan anticonceptie GDM tentoonstelling gewijzigd netwerk vorming kinetiek. ECFCs werden verkregen uit een ongecompliceerde zwangerschap (UC, zwart) en drie zwangerschappen bemoeilijkt door zwangerschapsduur diabetes mellitus (GDM 1-3, rood). Fase contrast beelden werden gemaakt op 15 min. intervallen voor 15 h. kinetische analyse van vasculogenese (KAV) software quantitated gesloten netwerken, netwerkgebieden takken, knooppunten en de verhouding van takken met knooppunten. De gegevens geïllustreerd vertegenwoordigen de gemiddelde ± standaardafwijking van het gemiddelde (SEM) van drie aparte experimenten voor elk monster. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Video 1
Video 1: Anticonceptie GDM blootstelling wijzigt de kinetiek van de ECFC netwerk vorming. Beelden van de ECFC netwerk vorming werden gevangen voor 15u tussenpozen 15 min door fase contrast microscopie. Fase contrast beelden worden getoond voor de UC en drie GDM monsters meer dan 15 h basisgewicht van 0.5 h. De schaal staaf vertegenwoordigt 500 µm. gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)

Afbeelding Totale tak netwerken Knooppunten Triples Verviervoudigt Takken Tak totale lengte * AVG tak lengte * Aftakking naar knooppunt verhouding Gesloten netwerken Netwerk gebied **
1 382 290 278 11 943 47210 124 3,25 9 480214
2 284 345 337 8 940 50699 179 2.72 16 264469
3 205 376 366 9 910 55728 272 2.42 27 150621
4 162 422 407 15 947 59692 368 2.24 40 98713
5 132 454 441 12 967 61923 469 2.13 53 72951
6 122 435 419 14 907 62587 513 2.09 68 56948
7 88 429 411 17 852 63983 727 1.99 74 51429
8 68 451 437 13 874 63960 941 1.94 74 51780
9 93 437 417 18 905 60901 655 2.07 49 82919
10 126 511 487 24 1075 61981 492 2.1 37 116857
11 49 397 384 12 737 61823 1262 1,86 79 48805
12 81 376 364 10 751 56817 701 2 63 64431
13 98 509 482 26 1028 60799 620 2.02 44 98056
14 93 449 416 31 909 58282 627 2.02 45 94081
* afgerond op de dichtstbijzijnde micron, ** afgerond op de dichtstbijzijnde micron ^ 2

Tabel 1: Vertegenwoordiger onbewerkte gegevens van één beeldvorming studie voor één ECFC monster.

Discussion

KAV kunt evaluatie van grote gegevenssets met meerdere tijdstippen
Traditioneel, bestond kwantificatie van vasculogenese in vitro uit één of een paar tijdmetingen punt. Deze statische aanpak volstaat gewoon voor het vastleggen en kwantificeren van een dynamische en complexe proces. Daarom was deze nieuwe methode ontwikkeld om efficiënte analyses van netwerk vorming kinetiek inzicht te krijgen in mogelijke moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij het dynamische proces van vasculogenese. Efficiëntie en automatisering zijn belangrijke componenten in de ontwikkeling van nieuwe technieken te genereren en analyseren van grote hoeveelheden imaging data. KAV werd ontwikkeld specifiek voor het analyseren van grote afbeeldingsstapels, bestaande uit honderden beelden om de tijd en arbeid vereist voor het afleiden van biologisch zinvolle conclusies van time-lapse datasets te verlagen. Bovenal KAV voert beeldverwerking en generatie van de gegevens in een kwestie van seconden voor kleine (minder dan 100 afbeeldingen) image stapels en minuten voor grotere (groter dan 100 afbeeldingen) afbeeldingsstapels, wat resulteert in een ongeëvenaarde efficiëntie. Daarnaast maakt de organisatie van de gegevens in spreadsheets door tijd en gemeten parameters snelle generatie grafische presentatie en statistische analyse.

Uitdagingen in de succesvolle toepassing van deze benadering
Hoewel deze bepaling verbeteringen in zowel Beeldacquisitie en analyse bevat, kunnen sommige uitdagingen succesvolle implementatie belemmeren. De vier belangrijkste obstakels behoren vochtigheid stabiliteit, precisie van de timing van de beplating Beeldacquisitie, software en hardware betrouwbaarheid en beheer van grote datasets die zijn gegenereerd voor elk experiment. Stabiele levende cel beeldvorming over enkele uren kan worden uitdagende. Specifiek, is juiste en consequente bevochtiging vereist voor de beeldvorming kamers. Angiogenese dia's worden gebruikt in deze test, die zijn ontworpen voor parallelizing matrix gebaseerde angiogenese testen. Hun laag volume, ongeveer 50 µL, maakt verdamping en condensatie belangrijke overwegingen voor uitgebreide cultuuromstandigheden. Ter bestrijding van deze experimentele kwestie, is het noodzakelijk te gebruiken van een incubator die regelt de vochtigheid. Het kan ook wel moeten uitbreiden van deze verordening als overmatig drogen van de beeldvorming kamer na verloop van tijd optreedt. We vonden dat de eenvoudigste aanpak te verhogen van de luchtvochtigheid te verhogen van de oppervlakte van het water in de kamer is. Om dit doel te bereiken, ons protocol stelt de volgende drie waterbronnen: een tweede chambered dia gevuld met water, dat ook waar de incubator temperatuur wordt gemeten is, water in de omgeving van de putjes op de dia's, en het wordt bevochtigd filterpapier of veegt af. Omgekeerd, condensatie optreedt wanneer de temperatuur van de lucht in de kamer de onderkant van de dia koelt en de vochtigheid in de kamer op de dia's en de putten condenseert. Deze complicatie kan leiden tot een verwatering van de cel media en een lensing effect dat met de fase contrast interfereert. In deze studies, werd condensatie geminimaliseerd door toepassing van de verwarmde lucht (39-42 ° C) op de bodem van de dia.

Een belangrijke overweging voor elke time-lapse studie is consistentie tussen experiment initiatie en beeldvorming. De timing van wanneer imaging begint is essentieel voor de interpretatie van downstream gebeurtenissen. Om ervoor te zorgen de precisie van de timing van deze bepaling, moet de tijd tussen eerste beplating en het eerste punt van de verbeelde tijd streng worden gecontroleerd. In de praktijk deze "dode tijd" kan worden geminimaliseerd, maar wat nog belangrijker is, het moet consistent te staan experimenten op verschillende dagen worden vergeleken. We verwachten bijvoorbeeld in dit protocol een dode tijd ongeveer 30 min. Dit kan worden vergemakkelijkt door de nabijheid van de experimentele opstelling en imaging faciliteiten.

Wat lijkt misschien als alledaagse details op het eerste gezicht belangrijk voor software, hardware stabiliteit en gegevensbeheer zijn. De software en de bijbehorende hardwarestuurprogramma's, de netwerkomgeving en de geautomatiseerde software updates alle invloed op de stabiliteit van de software. Het is de moeite waard het testen van dit protocol in een "dry run" om te identificeren van knelpunten en potentiële bronnen van problemen in de Beeldacquisitie; bijvoorbeeld, check voor onbetrouwbare levende cel setup, toneel, sluitertijd en camera betrouwbaarheid en het institutionele informatie technologiebeleid inzake geautomatiseerde besturingssysteem en software-updates.

Gegevensbeheer is een reden tot voortdurende bezorgdheid van elke imaging experiment dat honderden tot duizenden beelden genereert. Gelukkig, commerciële software vaak controles voor beschikbare ruimte vóór het opstarten van een imaging experiment. Deze bepaling bevat echter ook na opname beeldverwerking en de analyse die kunt toevoegen aan de last van de harde schijf ruimte en interfereren met imaging experimenten, als de beschikbare ruimte beperkt is. Worden verder, de veiligheid en de stabiliteit van de computer kunnen niet gegarandeerd, zelfs met hardwareoplossingen zoals een redundant array of identieke schijven. Een data-managementstrategie om ruimte op de harde schijven van de computer voor lopende experimenten en een robuuste externe archivering, bijvoorbeeld met een institutionele archivering resource, is dus noodzakelijk.

Strategieën voor het optimaliseren van de beeldkwaliteit
Hoewel de mogelijkheid van KAV om de ECFCs nauwkeurig te onderscheiden van de achtergrond van de matrix robuust is, is de gevoeligheid van de test afhankelijk van de beeldkwaliteit. Bijvoorbeeld, als de afbeelding laag contrast is, detecteert de software cel netwerken met minder nauwkeurigheid (Figuur 2B). De kwaliteit van de fase contrast wordt beïnvloed door verschillende factoren, waaronder de instellingen van de Microscoop gebruikt voor Beeldacquisitie, laden van de matrix en de cel schorsing media tijdens assay voorbereiding en onderhoud van media niveaus binnen de putten in de gehele imaging. Voor het optimaliseren van de fase contrast voor deze tests, werden kleine aanpassingen aan de uitlijning van de ring van de fase in de Microscoop gedaan om het contrast te verbeteren. Bereiding van de monsters was bovendien aan strenge tests onderworpen om te zorgen voor gelijke en consistente media laden. Als de hoeveelheid matrix en/of in de putjes geladen media onder of boven het optimale meetbereik is, kan een meniscus leidt tot gewijzigde fase contrast vormen. Tot slot, als gevolg van de kleine hoeveelheid vloeistof in de putten is het essentieel media om niveaus te handhaven door het minimaliseren van verdamping en condensatie, zoals hierboven vermeld. Over het geheel genomen is assay optimalisatie cruciaal voor het genereren van hoge kwaliteit contrastrijke opnamen voor analyse.

Naast fase contrast kwaliteit, kunnen andere factoren ook van invloed zijn assay resultaten met inbegrip van media besmetting, onvolkomenheden in de matrix, en deeltjes of puin in de matrix of de media. Verontreiniging is een gevaar van deze bepaling, omdat het gaat om levende cellen beeldvorming over enkele uren in een zaal van microscopie. Om het risico van verontreiniging, worden de matrix en cel schorsingen geladen op de dia die in een steriele kap. Elk monster is bovendien meestal verzinkt in dubbele of drievoud voor een experiment om te minimaliseren van het risico van gegevensverlies als gevolg van onvoorziene problemen zoals puin of deeltjes verstorende de analyse.

Voorbeeld heterogeniteit stations behoefte aan verhoogde assay gevoeligheid
Heterogeniteit is waargenomen en gerapporteerd in eerdere studies van ECFCs blootgesteld aan GDM13. Een hoge mate van heterogeniteit in functie van de cel waargenomen in deze voorbeelden wordt gespeculeerd te wijten aan verschillende factoren, met inbegrip van de ernst van maternale ziekte, de duur van de ziekte, en managementstijl gebruikt voor het regelen van de niveaus van de glucose van het bloed. Nog belangrijker is, vangt deze analytische aanpak het dynamische bereik van ECFC vasculogenese, waardoor het haalbaar is om het identificeren van fenotypische verschillen als gevolg van functionele heterogeniteit in monsters van GDM zwangerschappen. Globaal, kan het gebruik van primaire patiënt monsters, zoals degene die gebruikt zijn in deze studies, grotere variabiliteit in vergelijking met een cellijn introduceren. Zoals meer nadruk wordt gelegd op translationeel studies waarbij meerdere primaire dierlijke of menselijke monsters met functionele variabiliteit, is assay gevoeligheid essentieel voor de detectie en afleiding van biologisch zinvolle metingen en conclusies. Daarom, ontwikkeling van benaderingen zoals KAV zal het verbeteren van de kwantiteit en kwaliteit van gegevens gegenereerd door in vitro Vasculogenese en angiogenese testen zodat meer robuuste opmerkingen en conclusies. Bovendien zal deze gegevens toekomstige onderzoek van moleculaire mechanismen die bijdragen aan de veranderde ECFC vasculogenese na uteriene GDM blootstelling vergemakkelijken.

Toekomstige toepassingen van deze aanpak
Hoewel deze methode werd toegepast voor de beoordeling van foetale ECFC vasculogenese in vitro in deze studies, zijn de mogelijke toepassingen van deze aanpak talrijk. Deze techniek kan gemakkelijk worden geïmplementeerd om te bestuderen van een celpopulatie die deel uitmaakt van de processen van vasculogenese of angiogenese. Specifiek, het kan worden gebruikt voor het bestuderen van individuele cel populaties, zoals werd aangetoond in deze studie, maar het kan ook worden toegepast op co cultuur systemen. In de toekomst zou het zinvol zijn om uit te breiden deze aanpak dan de tweedimensionale in vitro assay voor het beoordelen van driedimensionale (3D) modellen. Hoewel de huidige versie van KAV zou voor quantitating van 3D-imaging gegevens ontoereikend zijn, zou een ook ontworpen time-lapse, multi parametrische analytische aanpak specifiek voor 3D of in vivo modellen informeren als in twee dimensies opmerkingen in vitro zijn representatief voor de functie van de cel in een meer biologisch relevante instelling.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs erkennen Lucy Miller, Leanne Hernandez, Dr. David Haas, Brittany Yeley (Indiana University School of Medicine), Dr. Karen Pollok, Julie Mund, Matthew Repass en Emily Sims (Angio BioCore aan de Indiana University Simon Cancer Center) voor uitstekende technische bijstand bij de afleiding van de ECFC monsters. De auteurs erkennen ook Drs. Maureen A. d. j. Harrington, Edward F. Srour, Richard N. Day, Mervin C. Yoder, Matthias A. Clauss (Indiana University School of Medicine) voor zowel de wetenschappelijke discussie als de Janice muren (Indiana University School of Medicine) voor administratieve ondersteuning. Alle imaging werd uitgevoerd in het midden van de Indiana voor biologische microscopie, Indiana University School of Medicine. Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health (R01 HL094725 P30 CA82709 en U10 HD063094) en de Riley Children's Foundation. Bovendien, werd deze publicatie mogelijk gemaakt met gedeeltelijke steun van de nationale hart-, Long- en bloed Instituut van het National Institutes of Health onder Award # T32 HL007910.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm Tissue Culture Plates Fisher 353003
15 mL conical tubes Fisher 1495949B
Angiogenesis 15-well micro-slides Ibidi 81506
Matrigel Fisher (Corning) 354234
EGM2 Medium Lonza CC3162
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11550
PSA Antimyocytic, Antibiotic Fisher MT30004C1 Added 5 mL per 500 mL bottle of EGM2 medium.
0.5% Trypsin/0.53 nM EDTA in HBSS Fisher (Corning) MT25052CI
Type 1 Collagen Fisher (Corning) 354226 100 mg of liquid, concentration range 3-4 mg/mL. Dilute in 20 nM acetic acid in ddH2O to use at a final concentration of 0.05 mg/mL.
Glacial Acetic Acid Fisher A38-212 Used in Type 1 Collagen solution at a final concentration of 20 nM.
Kim Wipes Fisher 06-666
Chambered slide Ibidi 80296 This slide can be filled with distilled water to maintain humidity in the imaging chamber.
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher (Gibco) 20012027 1x solution, pH 7.2
Microscope Nikon Instruments MEA53100 and MEF55030 Motorized TiE including Ph1 phase ring for phase contrast with objective
Stage Prior Instruments ProScan II Other OKOlab and Nikon Elements AR compatible stage may be used
Objective Nikon Instruments 93178 CFI Plan Fluor DL 10X
Camera Hamamatsu C11440-42U ORCA Flash 4.0LT
Stage Blower Precision Controls N/A This item has been discontinued, alternatives include Smart Air-Therm Heater(AIRTHERM-SMT-1W) from World Precision Instruments
Stage-top Incubator  OKOLabs H301 BoldLine including a two position slide holder
Computer Hewlett-Packard Z620 or equivalent 4 core Intel Xeon processor, >32 GB RAM, >2 TB RAID 10, nVidia Quadro graphics card 
Nikon Elements Software Nikon Instruments AR v 4.20 ND Acquisition is a multidimensional setup tool used to configure Elements software.
FIJI (ImageJ) Software N/A N/A Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://imagej.net/Fiji/Downloads
KAV Plug-In N/A N/A Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://github.com/icbm-iupui/kinetic-analysis-vasculogenesis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386, (6626), 671-674 (1997).
  2. Tung, J. J., Tattersall, I. W., Kitajewski, J. Tips, stalks, tubes: notch-mediated cell fate determination and mechanisms of tubulogenesis during angiogenesis. CSH Med. 2, (2), 006601 (2012).
  3. Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, (7347), 298 (2011).
  4. Carmeliet, P. Angiogenesis in health and disease. Nat Med. 9, (6), 653-660 (2003).
  5. Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat Protoc. 5, (4), 628-635 (2010).
  6. Prasain, N., Meador, J. L., Yoder, M. C. Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood. J Vis Exp. (62), (2012).
  7. Simons, M., et al. State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularization: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circ Res. 116, (11), 99-132 (2015).
  8. Crabtree, B., Subramanian, V. Behavior of endothelial cells on Matrigel and development of a method for a rapid and reproducible in vitro angiogenesis assay. In Vitro Cell Dev-An. 43, (2), 87-94 (2007).
  9. Khoo, C. P., Micklem, K., Watt, S. M. A comparison of methods for quantifying angiogenesis in the Matrigel assay in vitro. Tissue Eng Part C-Me. 17, (9), 895-906 (2011).
  10. Allier, C. P., et al. Video lensfree microscopy of 2D and 3D culture of cells. SPIE BiOS. 8947, 89471 (2014).
  11. Wang, Y., Chen, Q., Zhang, Z., Jiang, F., Meng, X., Yan, H. Interleukin-10 overexpression improves the function of endothelial progenitor cells stimulated with TNF-α through the activation of the STAT3 signaling pathway. Int J Mol Med. 35, (2), 471-477 (2015).
  12. Ingram, D. A., et al. In vitro hyperglycemia or a diabetic intrauterine environment reduces neonatal endothelial colony-forming cell numbers and function. Diabetes. 57, (3), 724-731 (2008).
  13. Blue, E. K., et al. Gestational diabetes induces alterations in the function of neonatal endothelial colony-forming cells. Pediatr Res. 75, (2), 266-272 (2014).
  14. Carpentier, G. ImageJ contribution: Angiogenesis Analyzer. (2012).
  15. WimTube. Available from: https://www.wimasis.com/en/products/13/WinTube (2012).
  16. Varberg, K. M., et al. Kinetic analyses of vasculogenesis inform mechanistic studies. Am J Physiol-Cell Ph. (2017).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Met. 9, (7), 676-682 (2012).
  18. Arganda-Carreras, I., Fernández-González, R., Muñoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. 3D reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue. Microsc Res Techniq. 73, (11), 1019-1029 (2010).
  19. Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104, (9), 2752-2760 (2004).
  20. Mead, L. E., Prater, D., Yoder, M. C., Ingram, D. A. Isolation and characterization of endothelial progenitor cells from human blood. Current Protocols in Stem Cell Biology. Chapter 2, Unit 2C.1 (2008).
  21. Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, (5), 1801-1809 (2007).
Kinetische analyse van vasculogenese kwantificeert dynamiek van Vasculogenese en angiogenese <em>In Vitro</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Varberg, K. M., Winfree, S., Dunn, K. W., Haneline, L. S. Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro. J. Vis. Exp. (131), e57044, doi:10.3791/57044 (2018).More

Varberg, K. M., Winfree, S., Dunn, K. W., Haneline, L. S. Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro. J. Vis. Exp. (131), e57044, doi:10.3791/57044 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter