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Developmental Biology

Vasculogenesis और Angiogenesis की Vasculogenesis Quantifies गतिशीलता के काइनेटिक विश्लेषण इन विट्रो

Published: January 31, 2018 doi: 10.3791/57044
Automatic Translation
1,2, 3,4, 3,4, 1,2,5,6,7
1Department of Cellular and Integrative Physiology, Indiana University School of Medicine, 2Herman B Wells Center for Pediatric Research, Indiana University School of Medicine, 3Indiana Center for Biological Microscopy, Indiana University School of Medicine, 4Department of Medicine, Indiana University School of Medicine, 5Department of Pediatrics, Indiana University School of Medicine, 6Department of Microbiology and Immunology, Indiana University School of Medicine, 7Indiana University Simon Cancer Center, Indiana University School of Medicine

Summary

यहां, हम समय चूक इमेजिंग और vasculogenesis के विश्लेषण के लिए इन विट्रो चरण इसके विपरीत खुला स्रोत सॉफ्टवेयर के साथ मिलकर माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद, vasculogenesis के काइनेटिक विश्लेषण । इस प्रोटोकॉल को मात्रात्मक कई कोशिका प्रकार या प्रयोगात्मक शर्तों कि मॉडल संवहनी रोग की vasculogenic क्षमता का आकलन करने के लिए लागू किया जा सकता है ।

Abstract

Vasculogenesis एक जटिल प्रक्रिया है जिसके द्वारा endothelial स्टेम और जनक कोशिकाओं को डी नोवो पोत गठन से गुजरना पड़ता है. vasculogenesis का मात्रात्मक मूल्यांकन endothelial जनक सेल की कार्यक्षमता का एक केंद्रीय readout बन गया है, और इसलिए, दोनों में इन विट्रो और vivo vasculogenesis मॉडल में सुधार करने के लिए कई प्रयास किए गए हैं । हालांकि, मानक तरीकों स्थिर माप इस अत्यधिक गतिशील प्रक्रिया के कई पहलुओं पर कब्जा करने में विफल रहने के साथ, दायरे में सीमित कर रहे हैं । इसलिए, इस उपंयास प्रोटोकॉल के विकास के लक्ष्य के लिए इन विट्रो vasculogenesis में कैनेटीक्स का आकलन करने के क्रम में नेटवर्क के गठन और स्थिरीकरण की दर quantitate, साथ ही साथ संभावित तंत्र अंतर्निहित नाड़ी में अंतर्दृष्टि प्रदान करना था रोग. इस प्रोटोकॉल के आवेदन भ्रूण endothelial कॉलोनी बनाने कोशिकाओं (ECFCs) मातृ मधुमेह के लिए उजागर का उपयोग कर प्रदर्शन किया है । भ्रूण ECFCs गर्भनाल रक्त निंनलिखित जंम के बाद से व्युत्पंन थे, संस्कृति, और तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स, जिसमें वे vasculogenesis से गुजरती स्लाइड में चढ़ाया । पूरे स्लाइड कुओं की छवियां 15 घंटे से अधिक समय चूक चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर अधिग्रहीत किया गया । छवियां मात्रात्मक डेटा के व्युत्पत्ति के लिए विश्लेषण किया गया एक विश्लेषण Vasculogenesis (KAV) के काइनेटिक विश्लेषण नामक सॉफ्टवेयर का उपयोग । KAV skeletonization द्वारा पीछा छवि विभाजन का उपयोग करता है बहु समय बिंदु चरण कंट्रास्ट छवियों के ढेर से नेटवर्क घटकों का विश्लेषण करने के लिए दस मापदंडों प्राप्त करने के लिए (9 मापा, सहित नेटवर्क संरचना के 1 गणना): बंद नेटवर्क, नेटवर्क क्षेत्रों, नोड्स, शाखाओं, कुल शाखा की लंबाई, औसत शाखा की लंबाई, ट्रिपल-शाखाओं वाले नोड्स, क्वाड-ब्रांच्ड नोड्स, नेटवर्क संरचनाएं, और शाखा के लिए नोड अनुपात । इस प्रोटोकॉल के अनुप्रयोग मधुमेह से जटिल गर्भधारण से प्राप्त ECFCs में vasculogenesis की बदल दरों की पहचान की. हालांकि, इस तकनीक के दायरे से परे व्यापक प्रभाव है यहां की सूचना दी । इस दृष्टिकोण के कार्यांवयन यंत्रवत मूल्यांकन बढ़ाने के लिए और vasculogenesis और अंय कई कोशिका प्रकार या रोग राज्यों में जैविक रूप से महत्वपूर्ण शाखाकरण प्रक्रियाओं के कार्यात्मक readouts में सुधार होगा ।

Introduction

endothelial जनक कोशिकाओं की क्षमता vasculogenesis से गुजरना करने के लिए, या डी नोवो पोत गठन, विकास के दौरान भ्रूण vasculature की स्थापना में महत्वपूर्ण है1. इसके अतिरिक्त, और पोत गठन और पूर्व मौजूदा जहाजों, जो angiogenesis के रूप में जाना जाता है की परिपक्वता भी विकास में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है और प्रसव जीवन में रक्त प्रवाह और homeostasis बनाए रखने के लिए पूरे शरीर में2। शरीर में हर अंग ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की डिलीवरी के लिए संवहनी प्रणाली पर निर्भर है, और अपशिष्ट के हटाने के लिए3। संवहनी homeostasis बनाए रखा नहीं है, तो ऐसी है कि रक्त वाहिका गठन और मरम्मत या तो अपर्याप्त हैं या अधिक में, संवहनी रोगों के परिणाम कर सकते हैं4. इसलिए, संवहनी गठन और अनुकूलन सामांयतः अध्ययन कर रहे हैं, के रूप में वे अंग स्वास्थ्य के रखरखाव में आवश्यक है और कई रोग राज्यों के विकास में फंसा रहे हैं ।

विकास में संवहनी प्रणाली की भागीदारी के एक वृद्धि की समझ के कारण, के रूप में अच्छी तरह के रूप में रोग अभिव्यक्ति और प्रगति में, परख मॉडल vasculogenesis और angiogenesis इन विट्रो में विकसित किया गया है और vivo में5 ,6,7. मॉडलिंग पोत गठन ऐसे endothelial कोशिकाओं के रूप में संवहनी कोशिकाओं चढ़ाना शामिल है, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में है कि सेल संगठन और पोत नेटवर्क के गठन को बढ़ावा देता है8,9,10। आम तौर पर, रात की गर्मी के बाद, सेल नेटवर्क की छवियों को एक ही समय बिंदु पर कब्जा कर लिया, विश्लेषण के लिए छवियों की एक छोटी संख्या में जिसके परिणामस्वरूप11,12,13। इसलिए, विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण मोटे तौर पर विकसित किया गया है और एकल समय बिंदु आकलन के लिए अनुकूलित10,14। हालांकि, स्थैतिक विश्लेषण पोत गठन की गतिशील प्रक्रिया पर कब्जा करने और शामिल संभावित तंत्र में सीमित जानकारी प्रदान करने में बस अपर्याप्त हैं । हालांकि बढ़ती इमेजिंग आवृत्ति की संभावना आवश्यक डेटा प्रदान करने के लिए गठन कैनेटीक्स की पहचान करेगा, पहले से विकसित विश्लेषिकी के आवेदन एक बहु समय बिंदु इमेजिंग दृष्टिकोण अक्षम और श्रम गहन14होगा । इसके अतिरिक्त, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विश्लेषण के विकास के बावजूद, एक भुगतान प्रति छवि शुल्क इस विकल्प की लागत-काइनेटिक अध्ययन है जिसमें छवियों के हजारों15उत्पंन कर रहे है के लिए निषेध प्रदान करता है । इसलिए, एक सुव्यवस्थित और कुशल दृष्टिकोण को पकड़ने के लिए क्षेत्र में एक की जरूरत है और इन विट्रो मेंvasculogenesis मात्रा, बड़ी छवि का विश्लेषण करने की क्षमता सहित समय चूक रहते सेल माइक्रोस्कोपी द्वारा उत्पंन सेट ।

इन सीमाओं को दूर करने के लिए, एक नया दृष्टिकोण एकल टाइम पॉइंट इमेजिंग के विस्तार के उद्देश्य के साथ विकसित किया गया था छवियों के साथ vasculogenesis के गतिशील मूल्यांकन सक्षम करने के लिए हर 15 मिनट16अधिग्रहीत । कई घंटे से अधिक समय अंक पर कब्जा करके, इस दृष्टिकोण vasculogenesis की प्रक्रिया का एक अधिक विस्तृत चित्रण प्रदान करता है, के रूप में अच्छी तरह के रूप में संभावित गठन और पोत नेटवर्क के रखरखाव के लिए योगदान तंत्र में अंतर्दृष्टि । आवृत्ति और छवि अधिग्रहण की गुणवत्ता में सुधार के अलावा, इस दृष्टिकोण एक खुला स्रोत प्लग के रूप में उपंयास सॉफ्टवेयर शामिल है-17में । सॉफ्टवेयर, Vasculogenesis (KAV) के काइनेटिक विश्लेषण के रूप में भेजा, एक सुव्यवस्थित आवेदन है कि छवि प्रसंस्करण और विश्लेषण विशेष रूप से बड़ी छवि बहु समय बिंदु अधिग्रहण से उत्पंन सेट के लिए शामिल है । KAV छवि विभाजन के माध्यम से चरण कंट्रास्ट छवियों का विश्लेषण करती है skeletonization द्वारा पीछा किया18। नेटवर्क संरचना के दस मापदंडों सहित KAV द्वारा मात्रा हैं: शाखाओं, बंद नेटवर्क, नोड्स, नेटवर्क क्षेत्रों, नेटवर्क संरचनाओं, ट्रिपल शाखाओं में बंटी नोड्स, quad-शाखाओं में बंटी नोड्स, कुल शाखा की लंबाई, औसत शाखा की लंबाई, और शाखा के लिए नोड अनुपात (देखें चित्रा 1)16में योजनाबद्ध । KAV दृष्टिकोण के आवेदन एक उपंयास भी शामिल है, इन विट्रो vasculogenesis में की गणना की phenotype, नोड अनुपात को शाखा के रूप में जाना जाता है । हमारे हाल के काम का प्रदर्शन किया है कि इस अनुपात नेटवर्क कनेक्टिविटी का संकेत है और अंय सेलुलर नेटवर्क के गठन में शामिल प्रक्रियाओं, जैसे गतिशीलता16के साथ जुड़ा हो सकता है ।

हालांकि भ्रूण endothelial कॉलोनी बनाने सेल (ECFC) vasculogenesis इन अध्ययनों में मूल्यांकन किया गया था, इस छवि अधिग्रहण और विश्लेषण दृष्टिकोण आसानी से किसी भी सेल प्रकार है कि vasculogenesis या angiogenesis से गुजरना मूल्यांकन करने के लिए लागू किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, इस दृष्टिकोण को बदल नाड़ी रोग राज्यों, जैसे गर्भावधि मधुमेह हो सकता है, के रूप में इन अध्ययनों में दिखाया गया है की एक किस्म से जिसके परिणामस्वरूप समारोह की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा कर सकते हैं । इसके अलावा, इस विधि के लिए नेटवर्क के गठन और शाखाओं का आकलन है, जो अंय जैविक रूप से प्रासंगिक प्रक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण है अनुकूलित किया जा सकता है । इस प्रकार, अद्वितीय जैविक प्रणालियों के लिए इस उपंयास दृष्टिकोण लागू करने के संभावित प्रभाव अभी तक निर्धारित किया जाना है ।

Protocol

1. तैयारी

  1. संस्कृति endothelial कॉलोनी बनाने कोशिकाएं (ECFCs)
    नोट: भ्रूण ECFC इन प्रयोगों में इस्तेमाल नमूनों मानव गर्भनाल रक्त से अलग और इंडियाना विश्वविद्यालय के स्कूल ऑफ मेडिसिन में एंजियो (एबीसी) द्वारा संस्कृति के रूप में पहले से ही6वर्णित थे । नियमित गुणवत्ता नियंत्रण phenotyping एबीसी के भीतर आयोजित किया गया था endothelial एंटीजन की अभिव्यक्ति की पुष्टि करने के लिए पहले वर्णित के रूप में19,20,21। प्रयोगों में प्रयुक्त नमूनों को न्यूनतम (2-3 बार) पारित किया गया. सभी ऊतक संस्कृति का काम एक ऊतक संस्कृति हुड में प्रदर्शन किया गया था । टिशू कल्चर प्लेट्स और सॉल्यूशन सहित सभी रिएजेंट बाँझ थे ।
    1. प्रयोग करने से पहले दो दिन, कोट १०० मिमी दौर ऊतक संस्कृति प्लेटें ०.०५ मिलीग्राम/एमएल प्रकार 1 कोलेजन के 6 मिलीलीटर के साथ, और ३७ डिग्री सेल्सियस रात भर में गर्मी ।
      नोट: प्रकार 1 कोलेजन में पतला है 20 एनएम एसिटिक एसिड से युक्त डबल आसुत जल ०.०५ मिलीग्राम/एमएल के एक काम एकाग्रता के लिए ।
    2. प्रयोग करने से पहले दिन, trypsinize और प्रकार 1 पर ECFCs प्लेट 1.1.1 में कोलेजन लेपित प्लेटें । (१.१ के तहत नोट देखें) ।
    3. ECFCs trypsinize करने के लिए, मढ़वाया कोशिकाओं से महाप्राण मीडिया और पंजाब के 7 मिलीलीटर से धो लें । महाप्राण पंजाब, फिर ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2-5 मिनट के लिए ०.५% trypsin और गर्मी कोशिकाओं के 2-3 मिलीलीटर जोड़ें ।
    4. तुरंत trypsin के साथ मशीन के बाद, EGM2 और प्लास्टिक के 3 मिलीलीटर जोड़ने के ऊपर और नीचे सभी अनुयाई कोशिकाओं को उखाड़ देना । एक 15 एमएल शंकु ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण सेल सस्पेंशन ।
    5. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ५०० x g पर सभी नमूनों के केंद्रापसारक ।
    6. महाप्राण supernatant और EGM2 के 1-2 मिलीलीटर में पुनः निलंबित सेल छर्रों । सेल सस्पेंशन को अच्छी तरह से मिक्स करें और काउंटिंग के लिए एक छोटा aliquot (20-40 μL) निकाल लें ।
    7. एक hemocytometer पर सेल aliquot और पिपेट 10 µ एल के लिए नीले trypan बराबर भागों जोड़ें । hemocytometer के चार प्राथमिक चक्रों में कोशिकाओं की संख्या की गणना ।
      नोट: शुद्धता बढ़ाने के लिए सभी नमूना गणना के लिए hemocytometer के दोनों पक्षों का उपयोग करें ।
    8. कोलेजन-लेपित ऊतक संस्कृति प्लेटें, जो 1.1.1 कदम में तैयार थे, दो बार पंजाब के 7 मिलीलीटर के साथ धो लो । दूसरा पंजाब aspirating धोने के बाद, 10 मिलीलीटर endothelial विकास मध्यम 2 (EGM2) संस्कृति मीडिया प्लेटों के लिए 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक जोड़ें ।
    9. चरण 1.1.7 में प्राप्त सेल गणना का उपयोग करना, प्लेट 4 एक्स 105 कोशिकाओं के लिए आवश्यक सेल निलंबन की मात्रा की गणना । प्लेट 4 एक्स 105 ECFCs ऊतक संस्कृति चरण 1.1.8 में तैयार प्लेटों पर, और ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड (2CO) पर रात भर में मशीन ।
  2. प्रयोग करने से पहले, 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान की आपूर्ति रातोंरात
    1. एक 3 "x 2" धातु प्लेट, स्लाइड स्टोर (हूड में खुला जब तक पैकेज में रखने के लिए), बाँझ 20 microliter (μL) सुझावों का एक बॉक्स, और तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (मैट्रिक्स) ।
      नोट: मैट्रिक्स में रखा जाता है-८० ° c लंबी अवधि के भंडारण के लिए; हमेशा यह 4 ° c रात भर में या कई घंटे के लिए पहले का उपयोग करने के लिए गल ।
  3. कंप्यूटर की हार्ड ड्राइव पर छवियों के लिए पर्याप्त स्थान की उपलब्धता की पुष्टि करें ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित कॉन्फ़िगरेशन का उपयोग करते हुए, लगभग ६० गीगाबाइट (gb) स्थान की आवश्यकता थी प्रति प्रयोग (4 gb/ हालांकि, रिक्ति अनुमान हार्डवेयर कॉंफ़िगरेशन पर आधारित होते है और प्रत्येक सिस्टम के लिए निर्धारित करने की आवश्यकता होगी ।

2. प्रोटोकॉल 1: प्रायोगिक सेटअप: स्लाइड तैयार करना

  1. इकट्ठा और आपूर्ति तैयार
    1. प्रयोग के दिन, स्लाइड पर कोशिकाओं को चढ़ाना के लिए आपूर्ति इकट्ठा, बर्फ की एक बाल्टी, सूखी बर्फ के एक छोटे कंटेनर, कैंची की एक जोड़ी सहित, और एक 20 μL पिपेट । स्प्रे ७०% इथेनॉल के साथ सभी मदों, कागज तौलिए से सूखी पोंछ, और एक बाँझ ऊतक संस्कृति हुड में जगह आइटम ।
    2. इकट्ठा सभी आपूर्ति 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत (१.२ कदम देखें) धातु प्लेट, सुझावों, स्लाइड, और मैट्रिक्स के बॉक्स सहित । ७०% इथेनॉल के साथ सुझावों के बॉक्स स्प्रे और सूखी बर्फ के कंटेनर में बॉक्स जगह है ।
      नोट: का उपयोग करने के लिए तैयार है और हमेशा बर्फ पर मैट्रिक्स रखने के लिए जब 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज से मैट्रिक्स निकालें.
    3. ७०% इथेनॉल के साथ धातु की थाली स्प्रे और बर्फ बाल्टी में बर्फ में एंबेड । स्लाइड वाले पैकेज को खोलें, और इसे ठंडा रखने के लिए स्लाइड को मेटल प्लेट पर रखें ।
  2. स्लाइड पर लोड मैट्रिक्स
    1. पिपेट को 10 μL पर सेट करें और पिपेट के साथ कोल्ड टिप बॉक्स से टिप निकालें । कैंची के साथ टिप के अंत में लगभग 1 सेमी काट ।
      नोट: कटौती करने के लिए टिप को सीधा मैट्रिक्स में बुलबुले को कम करने के लिए । पिपेट एक मात्रा के लिए सेट किया जा सकता है थोड़ा 10 से अधिक μL के लिए खाते में मैट्रिक्स टिप के अंदर से चिपके हुए ।
    2. धीरे पिपेट टिप में मैट्रिक्स ड्रा । तुरंत पिपेट टिप के केंद्र पर अच्छी तरह से जगह है । धीरे अच्छी तरह से नीचे करने के लिए पिपेट टिप को छूने और धीरे मैट्रिक्स बाहर धक्का ।
      नोट: पिपेट पर नहीं है, के रूप में इस बुलबुले के रूप में पैदा होगा । यदि एक बुलबुला रूपों, यह पॉप तुरंत एक छोटे से टिप का उपयोग कर ।
    3. स्लाइड में 15 तास के कुएं हैं । प्रत्येक कुआं के लिए पिछला चरण दोहराएं । एक नए पिपेट टिप का उपयोग करने के लिए एक अच्छी तरह से निरंतरता बनाए रखने और मैट्रिक्स टिप अंदर जमना कम ।
    4. एक बार स्लाइड सभी मैट्रिक्स युक्त कुओं के साथ भरी हुई है, ढक्कन स्लाइड पर सभी तरह से धक्का, और 30-60 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन जब तक मैट्रिक्स जम ।
      नोट: मैट्रिक्स बाहर सूखी मत देना । मैट्रिक्स सुखाने के जोखिम को कम करने के लिए मशीन में स्लाइड के पास एक ५०-एमएल शंकु ट्यूब की टोपी में पंजाबियों की एक छोटी मात्रा (2-3 एमएल) जोड़ें ।

3. प्रोटोकॉल 2: मैट्रिक्स पर चढ़ाना ECFCs

  1. टिशू कल्चर प्लेट्स से अनुयाई ECFCs निकालें और सस्पेंशन में जमा करें
    1. पिछले दिन मढ़वाया ECFCs युक्त ऊतक संस्कृति प्लेट प्राप्त करें (धारा 1.1.9 देखें). महाप्राण EGM2 मीडिया और धो अनुयाई ECFCs एक बार पंजाब के 7 मिलीलीटर के साथ ।
    2. महाप्राण पंजाबियों, trypsin के 2-3 मिलीलीटर जोड़ें, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2-5 मिनट के लिए अनुयाई कोशिकाओं मशीन ।
    3. तुरंत मशीन के बाद, EGM2 के 3 मिलीलीटर जोड़ने और प्लास्टिक ऊपर और नीचे सभी अनुयाई कोशिकाओं को उखाड़ देना । एक 15 एमएल शंकु ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण सेल सस्पेंशन ।
    4. दोहराएँ चरण 3.1.1-3.1.3 शेष तीन ECFC नमूने के लिए जब तक कि सभी चार कक्ष नमूने निलंबन में संग्रहीत किए जाते हैं ।
  2. तैयार मास्टर घोला जा सकता है
    1. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ५०० x g पर सभी नमूनों के केंद्रापसारक ।
    2. महाप्राण supernatant और EGM2 के 1-2 मिलीलीटर में पुनः निलंबित सेल छर्रों ।
    3. सेल सस्पेंशन को अच्छी तरह से मिक्स करें और काउंटिंग के लिए एक छोटा aliquot (20-40 μL) निकाल लें ।
    4. सेल aliquot और पिपेट 10 μL पर एक hemocytometer के लिए नीले trypan बराबर भागों जोड़ें । hemocytometer के चार प्राथमिक चक्रों में कोशिकाओं की संख्या की गणना ।
      नोट: शुद्धता बढ़ाने के लिए सभी नमूना गणना के लिए hemocytometer के दोनों पक्षों का उपयोग करें ।
    5. ऊपर से कक्ष की गणना का उपयोग करके, प्रत्येक कक्ष नमूने के वॉल्यूम की गणना करें जिसमें 1.4 x104 कक्ष हैं । सभी सेल सस्पेंशन अच्छी तरह से मिलाएं और aliquot १.४ x 104 कोशिकाओं एक ताजा ट्यूब में प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के लिए एक मास्टर मिश्रण तैयार करने के लिए । EGM2 मीडिया जोड़ें ताकि प्रत्येक मास्टर मिश्रण का अंतिम खंड १७५ μL है ।
    6. प्रत्येक मास्टर मिश्रण को धीरे से pipetting और aliquot ५० μL की स्लाइड पर व्यक्तिगत कुओं में मास् क मिश्रण से मिलाएं ।
      नोट: सभी नमूनों 3 कुओं के लिए पर्याप्त मात्रा सुनिश्चित करने के लिए ३.५ कुओं के लिए गणना मास्टर घोला जा सकता है के साथ, तपसिल में चढ़ाया जाता है ।
  3. स्लाइड की मशीन
    1. ३७ डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड मशीन जब तक यह इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप चैंबर में ले जाया जा सकता है ।
      नोट: चढ़ाना और इमेजिंग के बीच का समय vasculogenesis के प्रारंभिक दौर के दौरान डेटा हानि को सीमित करने के लिए संभव के रूप में के रूप में संक्षिप्त होना चाहिए ।

4. प्रोटोकॉल 3: माइक्रोस्कोप सेटअप और छवि अधिग्रहण

नोट: हमारे अध्ययन के लिए, प्रोटोकॉल 2 और 3 अलग व्यक्तियों द्वारा एक साथ आयोजित किया गया । प्रोटोकॉल 2 और 3 एक ही व्यक्ति द्वारा पूरा किया जाना चाहिए, तो प्रोटोकॉल 3 चरणों ४.१ और ४.२ नीचे प्रोटोकॉल 2 प्रारंभ करने से पहले पूरा किया जाना चाहिए ।

  1. माइक्रोस्कोप और कंप्यूटर चालू करें
    1. लगभग एक से दो घंटे के प्रयोग शुरू करने से पहले, पर बारी और ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए चरण शीर्ष मशीन कचौरी,2 से 5% सेट, और ८५% करने के लिए आर्द्रता सेट. है मशीन नमी जलाशय भरें, खाली अगर ।
    2. दो खुले स्थानों में से एक में एक खाली कक्षों स्लाइड प्लेस, और आसुत जल के साथ भरें । यदि उपलब्ध हो, चैंबर तापमान नियंत्रण के लिए प्रतिक्रिया थर्मामीटर सुरक्षित ।
      नोट: यदि प्रतिक्रिया थर्मामीटर उपलब्ध है, यह सत्यापित करने के लिए कि चैंबर equilibrated है इस "मशीन तापमान" का उपयोग करें ।
    3. स्लाइड को नीचे से गर्म करने के लिए 39-42 ° c पर एक द्वितीयक ब्लोअर सेट चालू करें और संघनित्र को कम करें ।
    4. जब तक प्रयोगात्मक स्लाइड को जोड़ा नहीं जा सकता तब तक दूसरी स्लाइड को रिक्त के रूप में जोड़ें । यह स्लाइड सेटअप के दौरान वैयक्तिक कुओं के लिए छवि प्राप्ति सेटिंग्स के कॉन्फ़िगरेशन के लिए स्थान प्लेसहोल्डर के रूप में कार्य करती है.
    5. इमेजिंग प्रयोग के दौरान शर्तों की नकल करने के लिए दूसरी स्लाइड पर कुओं के आसपास के जलाशय में पानी जोड़ें । कुओं के आसपास के पानी माइक्रोस्कोप सेटअप और overheating के दौरान नमी के आकलन में सक्षम बनाता है ।
      नोट: चरण-शीर्ष मशीन और द्वितीयक ब्लोअर के पूर्व equilibration एक स्थिर संवर्धन वातावरण बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है । अधिकांश रहते सेल चैंबर नियंत्रकों के तापमान, CO2, और आर्द्रता प्रणाली की तत्परता का आकलन करने के लिए वास्तविक समय प्रतिक्रिया दे । जारी रखने से पहले, स्लाइड पर नमी के संचय और जलाशय के अत्यधिक सुखाने के लिए जांच के रूप में 4.1.5 में भरा । आर्द्रता अगर वहां अत्यधिक सुखाने या कक्ष में संघनित्र है समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है । आर्द्रता बढ़ाने के लिए, आसुत जल के साथ गीला पोंछे जोड़ें । के लिए, या तो कम तापमान की एक संकेत हो सकता है के रूप में शुू में समायोजित नमी की स्थापना में कमी, या के रूप में संघनित्र, चैंबर तापमान सेटिंग्स की जांच करें और माध्यमिक ब्लोअर की स्थिति ।
  2. equilibration के दौरान मूल छवि प्राप्ति सेटिंग्स कॉंफ़िगर करें ।
    नोट: छवि प्राप्ति को स्टेज, शटर और कैमरे को नियंत्रित करने वाले सॉफ़्टवेयर के माध्यम से कॉन्फ़िगर किया गया है. एक बहुआयामी सेटअप उपकरण सॉफ्टवेयर विन्यस्त करने के लिए सबसे आसान तरीका है. इसके अलावा, सॉफ्टवेयर के लिए प्रयोग की अवधि पर ध्यान केंद्रित नियंत्रण सुनिश्चित करने के लिए ध्यान केंद्रित दिनचर्या की आवश्यकता होगी ।
    1. सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए एक अच्छी तरह से कई चरण पदों सेट । इस प्रोटोकॉल के लिए, कुओं के केंद्र का चयन करें ।
    2. कॉंफ़िगर छवि अधिग्रहण ऐसी है कि प्रत्येक चरण की स्थिति में, पूरी तरह से छवि है । उदाहरण के लिए, 10-20% छवि ओवरलैप और लगभग 5 x 5 क्षेत्रों के साथ एक tilescan का उपयोग करें, कैमरा और अंतिम आवर्धन पर निर्भर करता है ।
    3. इमेजिंग के लिए समय चूक हर 15 मिनट कॉंफ़िगर करें ।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित विन्यास का उपयोग करते हुए, स्लाइड के सभी 15 कुओं एक 15 मिनट के अंतराल के भीतर imaged हैं.
  3. प्रायोगिक स्लाइड लोड
    1. मशीन कक्ष के निंनलिखित equilibration, प्रयोगात्मक स्लाइड के साथ रिक्त स्लाइड बदलें ।
      नोट: एक equilibrated चैंबर स्थिर तापमान, CO2, और आर्द्रता कम से कम 20 मिनट के लिए होगा । एक बार प्रयोगात्मक स्लाइड तैयार है, यह जरूरी है कि कदम जल्दी पूरा कर रहे है चढ़ाना और प्रारंभिक समय माइक्रोस्कोप द्वारा कब्जा कर लिया के बीच "मृत समय" को कम करने के लिए । इसके अलावा, इमेजिंग प्रयोगों के बीच तुलना की सुविधा के लिए, इस समय सुसंगत होना चाहिए । इन प्रयोगों में प्रोटोकॉल 3 खंड ४.३ में उल्लिखित सभी चरणों को पूरा करने के लिए लगभग 30 मिनट की आवश्यकता है ।
    2. स्लाइड ढक्कन निकालें और स्लाइड पर कुओं आसपास के जलाशय में पानी जोड़ें ।
      नोट: इमेजिंग प्रयोग की अवधि के लिए ढक्कन हटा दिया जाता है ।
  4. अंतिम छवि प्राप्ति सेटिंग्स कॉंफ़िगर करें
    1. स्थिति में CFI योजना Fluor डीएल 10x उद्देश्य प्लेस और संघनित्र पर Ph1 चरण की अंगूठी का चयन करें । पहले अच्छी तरह से ध्यान में के साथ, Köhler रोशनी के लिए diascopic प्रकाश पथ को समायोजित करने और उद्देश्य चरण मास्क के साथ संघनित्र में चरण अंगूठी के संरेखण की जांच द्वारा चरण प्रकाशिकी विन्यस्त करें ।
    2. जोखिम समय कॉन्फ़िगर करें और चरण कंट्रास्ट के लिए लैंप तीव्रता समायोजित करें, जो सामान्यतया ५०० ms से कम है.
    3. प्रत्येक चरण 4.2.1 में निर्धारित स्थिति के माध्यम से चक्र और पुष्टि करते है कि अच्छी तरह का केंद्र चुना है, और इसे समायोजित करें, यदि आवश्यक हो ।
    4. प्रत्येक चरण की स्थिति में, अच्छी तरह से मढ़वाया कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करने और मंच की स्थिति जेड सॉफ्टवेयर में इमेजिंग के लिए इस्तेमाल की स्थिति निर्धारित किया है ।
    5. माइक्रोस्कोप के लिए फोकस प्रणाली का परीक्षण करें । यदि फ़ोकस हार्डवेयर आधारित है, तो सुनिश्चित करें कि यह चालू है और सभी चरण स्थितियों के लिए सही रूप से स्थित है ।
      नोट: के रूप में नमूना और चरण खड़ी प्रयोग के दौरान बहाव हो सकता है, यह महत्वपूर्ण है कि सॉफ्टवेयर प्रत्येक चरण की स्थिति और हर समय बिंदु पर समय-पाठ्यक्रम के दौरान विश्वसनीय इमेजिंग सुनिश्चित करने के लिए ध्यान केंद्रित की जांच करें । यदि संभव हो, तो पिछले समय बिंदु में निर्धारित एक पूर्व-फ़ोकस स्थिति को क्रमिक फ़ोकस रूटिन के लिए प्रारंभिक बिंदु के रूप में उपयोग किया जाना चाहिए । इस तरह, पर जा रहा बहाव आसानी के लिए समायोजित किया जा सकता है ।
    6. माइक्रोस्कोप रूम में लाइट्स को कम या बुझाएं और इमेजिंग प्रयोग शुरू करें ।

5. प्रोटोकॉल 4: छवि प्रसंस्करण और Vasculogenesis के काइनेटिक विश्लेषण (KAV)

  1. प्रत्येक अच्छी तरह के लिए एक छवि ढेर के रूप में व्यक्तिगत समय अंक से छवियों को बचाओ
    नोट: छवि कैप्चर के लिए अधिकांश सॉफ़्टवेयर समय श्रृंखला के multipage झगड़े (स्टैक्स) निर्यात कर सकते हैं । KAV डेटासेट पर काम करने के लिए डिज़ाइन किया गया है जिसमें एकाधिक समय बिंदु शामिल हो सकते हैं । इस प्रकार, विश्लेषण किसी दिए गए चरण स्थिति के लिए संपूर्ण छवि स्टैक पर होता है । यदि आवश्यक हो, छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर प्रत्येक समय बिंदु से एक चित्र आयात करने के लिए एक छवि ढेर पुनर्निर्माण कर सकते हैं ।
  2. कंप्यूटर पर छवि संसाधन सॉफ़्टवेयर खोलें
  3. छवि संसाधन सॉफ्टवेयर में KAV जोड़ें
    1. KAV फ़ाइल को किसी फ़ोल्डर से सॉफ़्टवेयर विंडो के नीचे धूसर पट्टी में खींचें । सूची में सॉफ़्टवेयर जोड़ने के लिए ' सहेजें ' क्लिक करें ।
  4. छवि स्टैक विश्लेषण किया जा करने के लिए खोलें
    1. ' फ़ाइल ' पर क्लिक करें तो ' ओपन ' छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर में ड्रॉपडाउन मेनू के माध्यम से, या छवि फ़ाइल चरण 5.3.1 में के रूप में ग्रे पट्टी में खींचें ।
    2. ' इमेज ', ' टाइप ', ' 8 बिट ' पर क्लिक करके इमेज को 8 बिट में कन्वर्ट करें ।
  5. ब्याज का एक क्षेत्र बनाएं (ROI)
    1. उपकरण पट्टी में ' विश्लेषण ' पर क्लिक करके रॉय प्रबंधक खोलें । फिर ' रॉय ' प्रबंधक के बाद ' उपकरण ' का चयन करें ।
    2. उपकरण पट्टी में सर्कल या आयत चयन उपकरण पर क्लिक करके और छवि पर वांछित चयन क्षेत्र ड्राइंग द्वारा एक नया रॉय बनाएं । उस आकृति को सहेजने के लिए ROI प्रबंधक विंडो में ' जोड़ें ' पर क्लिक करें.
      नोट: पहले बनाए गए ROI को प्रबंधक में खोलने के लिए सहेजे गए ROIs (ज़िप्ड फ़ोल्डर) को ' ड्रैग एंड ड्रॉप ' पट्टी में खींचकर खोला जा सकता है.
    3. रॉय प्रबंधक में सूचीबद्ध पर रॉय लेबल पर क्लिक करें यह छवि पर देखने के लिए ।
      नोट: अगर roi छवि पर दिखाई नहीं देगा, तो दूसरा roi (किसी भी आकार/आकार) बनाएँ और उसे प्रबंधक में जोड़ें. एक बार दोनों ROIs सूची में दिखाई देते हैं, दो के बीच आगे और पीछे क्लिक करें और इच्छित ROI छवि पर दिखाई देगा.
    4. यदि आवश्यक हो तो रॉय संरेखित करें । एक बार जब रॉय इच्छित स्थान में छवि पर जगह में है, तो मेनू पर जाएं और ' संपादित करें ' तो ' बाहर साफ ' । यह ढेर में हर छवि के लिए रॉय (गैर-आयताकार आकृतियों के लिए उपयोगी) के बाहर के छवि डेटा को हटा देगा ।
      नोट: यदि आप आयताकार आकार के ROI का उपयोग कर रहे हैं, तो आप ' छवि ' और ' क्रॉप ' पर भी क्लिक कर सकते हैं.
  6. KAV सॉफ़्टवेयर चलाएं
    1. मेनू पट्टी में ' प्लग-इन ' पर क्लिक करें ।
    2. का चयन करें ' नेटवर्क का विश्लेषण ' प्लग में । यह प्लग में सेटिंग्स में परिवर्तन करने के लिए विकल्पों के साथ एक खिड़की खुल जाएगा.
    3. ड्रॉप डाउन तीर का उपयोग करके थ्रेशोल्ड विधि परिवर्तित करें ।
    4. एक बार सभी उचित सेटिंग्स का चयन कर रहे हैं, पर क्लिक करें ' ठीक ' सॉफ्टवेयर प्रसंस्करण शुरू करने के लिए ।
      नोट: उपयुक्त सेटिंग्स कंकाल और मुखौटा KAV, जो सॉफ्टवेयर की पहचान करने के लिए और कक्ष विपरीत छवि में पृष्ठभूमि से नेटवर्क से विचार करने के लिए accurary का संकेत कर रहे है द्वारा उत्पंन गायन के दृश्य के माध्यम से निर्धारित कर रहे हैं ।
  7. KAV-जनरेटेड डेटा सहेजें
    1. एक बार प्लग-इन विश्लेषण समाप्त हो गया है, दो खिड़कियों संख्यात्मक मूल्यों के साथ एक डेटा तालिका और कंकाल और मुखौटा गायन चित्रण से जुड़े छवियों के ढेर सहित स्क्रीन पर पॉप अप होगा ।
    2. डेटा तालिका के ऊपरी बाएँ कोने में नेविगेट करके संख्यात्मक मानों को सहेजें और किसी excel स्प्रेडशीट में मानों को चिपकाने के लिए ' संपादित करें ' फिर ' प्रतिलिपि ' या ' काटें ' पर क्लिक करके.
    3. जुड़े कंकाल और मुखौटा छवि पर क्लिक करें । एक टैग की गई छवि फ़ाइल स्वरूप (tiff) फ़ाइल पर क्लिक करके ' फ़ाइल ', ' इस रूप में सहेजें ', ' tiff ' के रूप में जुड़े कंकाल/मास्क छवि स्टैक सहेजें
    4. ' फ़ाइल ' क्लिक करके फसली चरण कंट्रास्ट छवि स्टैक (ROI का उपयोग करके बनाया गया) सहेजें, ' ' इस रूप में सहेजें, ' ' TIFF ।
    5. रॉय प्रबंधक विंडो पर क्लिक करें और लागत पर रॉय फसल के लिए इस्तेमाल किया छवियों । भविष्य में उपयोग के लिए ROI बचाने के लिए ' अधिक ' के बाद ' सहेजें ' पर क्लिक करें.
      नोट: समान ROI का उपयोग करने से विश्लेषणों में एकरूपता बनाए रखने में मदद मिलेगी.

Representative Results

KAV नेटवर्क संरचना के दृश्य निरूपण का उत्पादन
चरण कंट्रास्ट छवियों में ECFCs और मैट्रिक्स पृष्ठभूमि के बीच विपरीत कोशिका-विशिष्ट संरचनाओं की पहचान करने के लिए KAV सक्षम बनाता है । ECFC नेटवर्क KAV द्वारा पहचाने कंकाल और मुखौटा गायन के रूप में सचित्र प्रतिनिधित्व कर रहे है ठहराव के लिए सॉफ्टवेयर (चित्रा 2ए) के द्वारा प्रयुक्त संरचनाओं वर्णन । महत्वपूर्ण बात, कंकाल और मुखौटा गायन के गुणात्मक मूल्यांकन KAV संवेदनशीलता और सटीकता की तेजी से पहचान है, जो इष्टतम सीमा सेटिंग्स का निर्धारण और विश्लेषण परिणामों की व्याख्या करने में उपयोगी हो सकता है सक्षम बनाता है । जब चरण कंट्रास्ट छवियों की गुणवत्ता उच्च है और पर्याप्त कंट्रास्ट हासिल की है, KAV सही चरण विपरीत छवि और KAV जनित कंकाल और मुखौटा गायन के बीच समानता द्वारा संकेत के रूप में ECFC नेटवर्क की पहचान करता है (चित्रा 2 एक और वीडियो 1) ।

वैकल्पिक रूप से, यदि चरण इसके विपरीत चित्र उच्च कंट्रास्ट और/या इमेजिंग की कलाकृतियों ऐसे gridding के रूप में नहीं है, नेटवर्क का पता लगाने सटीकता कम हो जाती है और परिणाम अस्पष्ट हो (चित्रा 2बी) । इसके अतिरिक्त, सेल मीडिया के भीतर हवा के बुलबुले का गठन भी पता लगाने सटीकता अस्पष्ट कर सकते हैं (चित्रा 2) । हालांकि, छवि गुणवत्ता के साथ समस्याओं को अक्सर अलग थ्रेसहोल्ड KAV सॉफ्टवेयर में शामिल तरीकों के चयन के माध्यम से दूर किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, चित्रा 2B में चरण कंट्रास्ट छवि को थ्रेशोल्ड विधि के अलावा समान छवि संसाधन सेटिंग का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था । कंकाल और मुखौटा गायन से, यह स्पष्ट है कि Otsu थ्रेसहोल्ड ECFC नेटवर्क के चरण विपरीत छवि (चित्रा 2बी) में दिखाया गया है की एक और अधिक सटीक का पता लगाने के परिणामस्वरूप । इसलिए, छवि गुणवत्ता इस परख में सही और सार्थक परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है । हालांकि, KAV यूज़र इंटरफ़ेस में शामिल विभिंन थ्रेशोल्ड पद्धतियां इनपुट छवियों की गुणवत्ता के आधार पर छवि विश्लेषण के समायोजन की अनुमति देती हैं ।

समय चूक माइक्रोस्कोपी ECFC vasculogenesis निम्नलिखित अंतर्गर्भाशयी गर्भावधि मधुमेह जोखिम में गुणात्मक और मात्रात्मक मतभेदों को पहचानता है
हाल ही में, KAV विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण भ्रूण ECFC समारोह के लिए मातृ प्रकार 2 मधुमेह (T2DM) utero में16के बाद जोखिम का आकलन करने के लिए लागू किया गया था । KAV का प्रयोग, vasculogenesis के बदल कैनेटीक्स भ्रूण ECFCs में पहचाने गए T2DM को उजागर । हालांकि, T2DM जोखिम है, जो पूरे हमल भर में होता है के अलावा, गर्भावधि मधुमेह (GDM), या गर्भावस्था की तीसरी तिमाही में आमतौर पर ग्लूकोज असहिष्णुता के विकास, भी बिगड़ा ECFC समारोह13. इसलिए, KAV यदि GDM उजागर ECFCs भी ECFC नेटवर्क के गठन की बदल कैनेटीक्स प्रदर्शन निर्धारित करने के लिए लागू किया गया था । चरण 1 (0-5 ज) और 2 चरण (5 + एच) KAV विश्लेषण के साथ युग्मित समय चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया (चित्रा 3) । प्रतिनिधि चरण इसके विपरीत छवि अधिग्रहण (०.५० ज) के शुरू में और समय पाठ्यक्रम (५.०० और १०.०० एच) में अधिग्रहीत ECFC नेटवर्क के गठन के चार नमूनों में एक प्रयोगात्मक दिन (चित्रा 3 और वीडियो 1 से परीक्षण का चित्रण ). समकक्ष सेल लोडिंग के बावजूद, के रूप में ०.५० घंटे में चरण कंट्रास्ट छवियों में मनाया, नेटवर्क संरचना में गुणात्मक अंतर ५.०० और १०.०० घंटे के समय अंक पर स्पष्ट कर रहे हैं । सीधी गर्भावस्था से ECFCs (यूसी) एक जटिल और जटिल नेटवर्क 5 घंटे के बाद चढ़ाना, हमारे पहले से प्रकाशित डेटा16के लिए इसी तरह के रूप में. इसके विपरीत, ECFCs से GDM नमूना 1 (GDM1) फार्म बहुत कुछ नेटवर्क संरचनाओं कि परस्पर नहीं कर रहे हैं । हालांकि, इस पद्धति के नमूनों के बीच विविधता का संकेत है, GDM गर्भधारण से प्राप्त सभी ECFC नमूनों में प्रतिबिंबित नहीं है । GDM2 और GDM3 नमूने GDM1 की तुलना में अधिक नेटवर्क गठन प्रदर्शित करते हैं, हालांकि कनेक्टिविटी के प्रतिमान UC नमूने की तुलना में परिवर्तित दिखाई देते हैं । महत्वपूर्ण बात, KAV ECFC नेटवर्क के कई संरचनात्मक घटकों के उपाय करने के लिए दोनों स्पष्ट और सूक्ष्म phenotypes की पहचान ।

नेटवर्क संरचना के कंकाल और मुखौटा गायन पैदा करने के अलावा, KAV quantitates नेटवर्क संरचना के दस मैट्रिक्स, व्यक्तिगत नेटवर्क संरचनाओं की संख्या, नोड्स, ट्रिपल शाखाओं में शामिल नोड्स, चौगुनी शाखाओं में बंटी नोड्स, कुल शाखा की लंबाई, औसत शाखा की लंबाई, नोड अनुपात में शाखा, कुल बंद नेटवर्क, और नेटवर्क क्षेत्र16। KAV समय पाठ्यक्रम के सभी छवियों के लिए मूल्यों की एक एकल तालिका में प्रत्येक नमूने के लिए डेटा compiles । तालिका 1 प्रतिनिधि raw डेटा एक इमेजिंग अध्ययन से एक ECFC नमूना के लिए शामिल है । KAV द्वारा मापी गई नेटवर्क संरचना के पैरामीटर्स को स्तंभों में व्यवस्थित किया जाता है, और समय पर अधिग्रहीत अनुक्रमिक छवियों के लिए डेटा को पंक्तियों में व्यवस्थित कर लिया जाता है । उदाहरण के लिए, हमारे अध्ययन में, छवि 1 30 मिनट बाद प्राप्त किया गया बाद छवियों के साथ चढ़ाना हर 15 मिनट एकत्र किया जा रहा है KAV द्वारा उत्पंन कच्चे मूल्यों तो रेखांकन या आगे और अधिक जटिल सांख्यिकीय दृष्टिकोण का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है16।

तीन अलग प्रयोगों से नेटवर्क संरचना के अर्थ मूल्यों का चित्रण पांच रेखांकन एक एकल सीधी नमूना (यूसी) और तीन GDM नमूनों (चित्रा 4) के लिए दिखाया जाता है । इन प्रयोगों में uc sample ने पहले uc samples16का विश्लेषण करने के लिए इसी तरह प्रदर्शन किया. पहले, यह पहचान की थी कि ECFC vasculogenesis इन विट्रो में द्वि-phase, चरण 1 (0-5 ज) और चरण 2 (5-10ज) 16 से मिलकर है । इस पद्धति के मौजूदा अध्ययनों में एकरूप है, के रूप में बंद नेटवर्क डेटा (चित्रा 4) चित्रण ग्राफ द्वारा सबूत है । यूसी नमूना सभी तीन GDM नमूनों की तुलना में बंद नेटवर्क की एक बड़ी संख्या का गठन किया. दिलचस्प है, चार नमूनों में से तीन को बंद नेटवर्क है, जो २.५ और 3 घंटे के बीच होता है की अधिक से अधिक संख्या के लिए एक समान समय है दिखाई देते हैं । हालांकि, GDM2 नमूना अधिक से अधिक बंद नेटवर्क है, जो 5 घंटे के बाद हुआ चढ़ाना तक पहुंचने के लिए धीमी थी । और, GDM2 नमूना uc नमूना की तुलना में कम अधिक से अधिक नेटवर्क बनाने के बावजूद, नेटवर्क यह रूपों यूसी नमूना करने के लिए समय पर इसी तरह बनाए रखा गया. इसके विपरीत, GDM1 और GDM3, जो यूसी नमूने की तुलना में कम नेटवर्क का गठन भी समय के साथ नेटवर्क संख्या में एक समग्र कमी का प्रदर्शन किया. कुल मिलाकर, बंद नेटवर्क संख्या चित्रण ग्राफ से, यह स्पष्ट है कि सभी ECFC नमूने नेटवर्क के गठन के एक द्वि-phase पैटर्न प्रदर्शित, लेकिन गठन की दर और नेटवर्क के अधिक से अधिक संख्या हासिल नमूनों में भिंनता है ।

नेटवर्क क्षेत्र ECFCs द्वारा गठित बंद नेटवर्क के भीतर औसत क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है । इसलिए, अधिक बंद नेटवर्क संख्या, छोटे नेटवर्क क्षेत्रों । इस प्रतिमान नेटवर्क क्षेत्र रेखांकन जहां UC नमूना है, जो बंद नेटवर्क की एक बड़ी संख्या का गठन, समय के साथ तीन GDM नमूनों की तुलना में छोटे नेटवर्क क्षेत्रों में परिलक्षित होता है (चित्रा 4) । GDM2, जो अधिक से अधिक धीरे बंद नेटवर्क तक पहुंच, शुरू में उच्च नेटवर्क क्षेत्र का प्रदर्शन किया, लेकिन क्षेत्र समय के साथ स्थिर है, और यह सबसे UC नमूना के लिए 15 घंटे में इसी तरह की थी । समय के साथ, सभी नमूनों में औसत नेटवर्क क्षेत्र नेटवर्क डे-स्थिरीकरण के कारण बढ़ गया । हालांकि, कुछ नमूनों, GDM1 और GDM3 की तरह, नेटवर्क क्षेत्र में एक और अधिक तेजी से वृद्धि का प्रदर्शन किया है, जो एक और अधिक क्रमिक वृद्धि का प्रदर्शन अंय नमूनों की तुलना में कम स्थिरता का संकेत है की संभावना है ।

GDM-उजागर ECFCs प्रदर्शन कम नेटवर्क स्थिरता
नोड्स के लिए शाखाओं का अनुपात एक उपंयास phenotype KAV द्वारा गणना की है और हमारे पिछले अध्ययन में पहचान की है, और यह नेटवर्क कनेक्टिविटी का संकेत है16। वर्तमान अध्ययन में, यूसी नमूना एक कम अनुपात था, जो समय (चित्रा 4) पर बनाए रखा गया था कि नेटवर्क कनेक्टिविटी का एक उच्च स्तर का प्रतिनिधित्व किया. इसके विपरीत, तीन GDM नमूने नोड्स के लिए शाखाओं के एक उच्च अनुपात था, विशेष रूप से नेटवर्क के गठन के चरण 2 में । यह अवलोकन कम कनेक्टिविटी और नेटवर्क संरचनाओं के de-स्थिरीकरण को दर्शाता है ।

कुल मिलाकर, GDM1 अंय नमूनों की तुलना में कम नोड्स और शाखाओं का गठन, प्रयोग के पाठ्यक्रम पर बनाए रखा कमी के साथ । GDM2 और GDM3 का गठन और विशेष रूप से 5-15 एच के बीच UC नमूना, की तुलना में शाखाओं की अधिक से अधिक संख्या बनाए रखा । GDM2 और GDM3 नेटवर्क्स में पाए गए नोड्स की संख्या, विशेष रूप से 10-15 h के बीच, UC sample में नोड्स की संख्या के समान थे । शाखाओं की एक बड़ी संख्या है, लेकिन नोड्स की एक समान संख्या, GDM नमूनों में बाद में समय बिंदुओं पर स्पष्ट नोड अनुपात करने के लिए बढ़ी हुई शाखा के लिए खाते सकता है । महत्वपूर्ण बात, शाखा और नोड संख्या में एक साथ परिवर्तन के लिए अलग रेखांकन में व्याख्या मुश्किल हो सकता है । हालांकि, नोड अनुपात के लिए उपंयास शाखा एक तरीका है कैसे परिवर्तन, मामूली परिवर्तन सहित व्यक्तिगत रेखांकन में पता लगाने के लिए मुश्किल का आकलन प्रदान करता है, दोनों शाखा और नोड संख्या में, बदल नेटवर्क कनेक्टिविटी में परिणाम ।

Figure 1
चित्र 1 : योजनाबद्ध Vasculogenesis (KAV) के काइनेटिक विश्लेषण द्वारा मात्रा 10 मापदंडों रूपरेखा । KAV quantitates दस नेटवर्क संरचना के अलग मापदंडों । सभी मापदंडों रंग कोडित रहे हैं और योजनाबद्ध संख्यात्मक (1-10) में उल्लिखित. पैरामीटर्स में शाखाओं की संख्या (हरा, 1), बंद नेटवर्क (नीला, 2), और नोड्स (लाल, 3), औसत नेटवर्क क्षेत्र (नारंगी, 4), नेटवर्क संरचनाओं की संख्या (काला, 5), ट्रिपल-शाखाओं में नोड्स (पीला, 6), और quad-शाखाओं में बंटी नोड्स (बैंगनी, 7), के रूप में अच्छी तरह के रूप में कुल (9) और औसत (10) शाखा की लंबाई, और नोड्स (10) की संख्या के लिए शाखाओं की संख्या का अनुपात । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : Vasculogenesis (KAV) quantitates नेटवर्क संरचना के काइनेटिक विश्लेषण । (क) नेटवर्क संरचनाओं के कंकाल और मुखौटा गायन चरण कंट्रास्ट छवियों का उपयोग कर KAV द्वारा की पहचान की पहचान और KAV द्वारा मात्रा नेटवर्क संरचनाओं के दृश्य प्रतिनिधित्व प्रदान करते हैं । स्केल बार = ५०० µm. (ख) एक प्रतिनिधि चरण ECFC नेटवर्क के विपरीत छवि 10 एच पद चढ़ाना कि कम इसके विपरीत और एक साथ सिलाई व्यक्तिगत छवियों से ग्रिड निशान है । अलग थ्रेसहोल्ड तरीकों, जैसे मतलब है या Otsu, KAV प्लग में चुना जा सकता है quantitation सटीकता में सुधार करने के लिए, यदि चरण कंट्रास्ट छवियों कम विपरीत है या यदि gridding होता है । कंकाल और मुखौटा गायन चरण विपरीत छवि के दोनों मतलब है और Otsu थ्रेसहोल्ड तरीकों के लिए दिखाए जाते हैं । चरण कंट्रास्ट छवियां एक 10x उद्देश्य का उपयोग कर कब्जा कर लिया गया । स्केल बार = ५०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : अंतर्गर्भाशयी GDM एक्सपोजर बदल ECFC नेटवर्क गठन । ECFC नेटवर्क के गठन की छवियां 15 घंटे के लिए चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी द्वारा १५ मिनट पर कब्जा कर लिया गया । 5 एच वेतन वृद्धि पर प्रतिनिधि चरण कंट्रास्ट छवियों, चढ़ाना के समय शुरू (०.५ ज), UC और तीन GDM नमूनों के लिए दिखाए जाते हैं । चरण कंट्रास्ट छवियां एक 10x उद्देश्य का उपयोग कर कब्जा कर लिया गया । स्केल बार = ५०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : ECFCs उजागर करने के लिए अंतर्गर्भाशयी GDM प्रदर्शन बदल नेटवर्क गठन कैनेटीक्स. ECFCs एक सीधी गर्भावस्था से प्राप्त किया गया (यूसी, काला) और तीन गर्भधारण गर्भावधि मधुमेह (GDM 1-3, लाल) द्वारा जटिल. चरण कंट्रास्ट छवियों 15 h. काइनेटिक विश्लेषण Vasculogenesis (KAV) सॉफ्टवेयर quantitated बंद नेटवर्क, नेटवर्क क्षेत्रों, शाखाओं, नोड्स, और शाखाओं के अनुपात के लिए नोड्स के 15 मिनट के अंतराल पर कब्जा कर लिया गया । डेटा सचित्र अर्थ का मतलब है ± मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व (SEM) प्रत्येक नमूने के लिए तीन अलग प्रयोगों की । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Video 1
वीडियो 1: अंतर्गर्भाशयी GDM एक्सपोजर ECFC नेटवर्क गठन के कैनेटीक्स बदल जाता है । ECFC नेटवर्क के गठन की छवियां 15 घंटे के लिए चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी द्वारा १५ मिनट पर कब्जा कर लिया गया । चरण कंट्रास्ट छवियां UC और तीन GDM नमूनों के लिए 15 घंटे से अधिक ०.५ ज पर शुरू में दिखाए जाते हैं । स्केल बार का प्रतिनिधित्व करता है ५०० µm. कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

छवि कुल शाखा नेटवर्क नोड्स triples quadruples गेल्या कुल शाखा की लंबाई * औसत शाखा लंबाई * शाखा को नोड अनुपात बंद नेटवर्क नेटवर्क क्षेत्र * *
1 ३८२ २९० २७८ 11 ९४३ ४७२१० १२४ ३.२५ 9 ४८०२१४
2 २८४ ३४५ ३३७ 8 ९४० ५०६९९ १७९ २.७२ 16 २६४४६९
3 २०५ ३७६ ३६६ 9 ९१० ५५७२८ २७२ २.४२ 27 १५०६२१
4 १६२ ४२२ ४०७ 15 ९४७ ५९६९२ ३६८ २.२४ ४० ९८७१३
5 १३२ ४५४ ४४१ 12 ९६७ ६१९२३ ४६९ २.१३ ५३ ७२९५१
6 १२२ ४३५ ४१९ 14 ९०७ ६२५८७ ५१३ २.०९ ६८ ५६९४८
7 ८८ ४२९ ४११ 17 ८५२ ६३९८३ ७२७ १.९९ ७४ ५१४२९
8 ६८ ४५१ ४३७ 13 ८७४ ६३९६० ९४१ १.९४ ७४ ५१७८०
9 ९३ ४३७ ४१७ 18 ९०५ ६०९०१ ६५५ २.०७ ४९ ८२९१९
10 १२६ ५११ ४८७ 24 १०७५ ६१९८१ ४९२ २.१ ३७ ११६८५७
11 ४९ ३९७ ३८४ 12 ७३७ ६१८२३ १२६२ १.८६ ७९ ४८८०५
12 ८१ ३७६ ३६४ 10 ७५१ ५६८१७ ७०१ 2 ६३ ६४४३१
13 ९८ ५०९ ४८२ 26 १०२८ ६०७९९ ६२० २.०२ ४४ ९८०५६
14 ९३ ४४९ ४१६ 31 ९०९ ५८२८२ ६२७ २.०२ ४५ ९४०८१
* निकटतम माइक्रोन के लिए गोल, * * निकटतम माइक्रोन ^ 2 के लिए गोल

तालिका 1: एक ECFC नमूना के लिए एक इमेजिंग अध्ययन से प्रतिनिधि रॉ डेटा.

Discussion

KAV एकाधिक समय बिंदुओं के साथ बड़े डेटा सेट का मूल्यांकन सक्षम करता है
परंपरागत रूप से, quantitation इन विट्रो में vasculogenesis के एक एकल, या कुछ समय बिंदु माप शामिल किया गया है । यह स्थिर दृष्टिकोण बस पर कब्जा करने और एक गतिशील और जटिल प्रक्रिया को बढ़ाता है के लिए अपर्याप्त है । इसलिए, इस उपंयास विधि के लिए नेटवर्क गठन कैनेटीक्स के कुशल विश्लेषण सक्षम करने के लिए संभावित आणविक vasculogenesis के गतिशील प्रक्रिया में शामिल तंत्र में अंतर्दृष्टि लाभ विकसित किया गया था । दक्षता और स्वचालन उपंयास तकनीक के विकास में महत्वपूर्ण घटक उत्पंन करने और इमेजिंग डेटा की बड़ी मात्रा का विश्लेषण कर रहे हैं । KAV विशेष रूप से बड़ी छवि छवियों के सैकड़ों से मिलकर ढेर समय और श्रम समय चूक डेटा सेट से जैविक रूप से सार्थक निष्कर्ष निकलने के लिए आवश्यक कमी का विश्लेषण करने के लिए विकसित किया गया था । महत्वपूर्ण बात, KAV छोटे के लिए सेकंड के एक मामले में छवि प्रसंस्करण और डेटा पीढ़ी का आयोजन करता है (कम से १०० छवियों) छवि ढेर और बड़ा के लिए मिनट (१०० से अधिक छवियों) छवि स्टैक, अद्वितीय दक्षता में जिसके परिणामस्वरूप. इसके अतिरिक्त, समय और मापदंडों द्वारा स्प्रेडशीट में डेटा संगठन मापा जाता है सक्षम बनाता है चित्रमय प्रस्तुति और सांख्यिकीय विश्लेषण के तेजी से पीढ़ी ।

इस दृष्टिकोण के सफल अनुप्रयोग में चुनौतियां
हालांकि इस परख दोनों छवि अधिग्रहण और विश्लेषण करने के लिए सुधार भी शामिल है, कुछ चुनौतियों का सफल कार्यांवयन में बाधा हो सकती है । चार मुख्य बाधाओं नमी स्थिरता, छवि अधिग्रहण, सॉफ्टवेयर और हार्डवेयर विश्वसनीयता के लिए चढ़ाना से समय परिशुद्धता, और बड़े डेटा प्रत्येक प्रयोग के लिए उत्पंन सेट के प्रबंधन शामिल हैं । कई घंटे से अधिक स्थिर लाइव सेल इमेजिंग चुनौतीपूर्ण हो सकता है । विशेष रूप से, उपयुक्त और संगत humidification इमेजिंग कक्षों के लिए आवश्यक है । Angiogenesis स्लाइड इस परख है, जो parallelizing मैट्रिक्स के लिए डिजाइन किए है Angiogenesis परख आधारित में उपयोग किया जाता है । उनकी कम मात्रा, लगभग ५० µ एल, वाष्पीकरण और संघनित्र विस्तारित संस्कृति की स्थिति के लिए महत्वपूर्ण विचार करता है । इस प्रयोगात्मक मुद्दे का मुकाबला करने के लिए, यह एक मशीन है कि नमी को विनियमित का उपयोग करने के लिए आवश्यक है । हालांकि, यह भी अगर इमेजिंग चैंबर के अत्यधिक सुखाने समय पर होता है इस विनियमन बढ़ाने के लिए आवश्यक हो सकता है । हमने पाया है कि सबसे सरल दृष्टिकोण नमी बढ़ाने के लिए चैंबर में पानी की सतह क्षेत्र को बढ़ाने के लिए है । इस लक्ष्य को पूरा करने के लिए, हमारे प्रोटोकॉल निंनलिखित तीन जल स्रोतों से पता चलता है: एक दूसरे चैम्बर पानी से भरा स्लाइड, जो भी है जहां मशीन तापमान मापा जाता है, स्लाइड पर कुओं के आसपास के क्षेत्र में पानी, और गीला फ़िल्टर कागज या पोंछे. इसके विपरीत, संघनित्र तब होता है जब कमरे में हवा का तापमान स्लाइड के नीचे ठंडा हो जाता है और चैंबर के अंदर की आर्द्रता स्लाइडों और कुओं पर गाढ़ा होती है । इस जटिलता सेल मीडिया और एक लेंस प्रभाव है कि चरण के विपरीत के साथ हस्तक्षेप के कमजोर पड़ने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इन अध्ययनों में, स्लाइड के तल पर गर्म हवा (39-42 डिग्री सेल्सियस) के आवेदन के माध्यम से कम किया गया ।

किसी भी समय चूक अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण विचार प्रयोग दीक्षा और इमेजिंग के बीच निरंतरता है । जब इमेजिंग शुरू होता है के समय के बहाव की घटनाओं की व्याख्या के लिए महत्वपूर्ण है । इस परख के समय परिशुद्धता सुनिश्चित करने के लिए, प्रारंभिक चढ़ाना और पहली imaged समय बिंदु के बीच बार कसकर नियंत्रित किया जाना चाहिए । व्यवहार में, इस ' डेड टाइम ' को कम किया जा सकता है, लेकिन अधिक महत्वपूर्ण बात, यह तुलना करने के लिए विभिन्न दिनों पर प्रयोगों की अनुमति के अनुरूप होने की जरूरत है. उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल में हम लगभग 30 मिनट के एक मृत समय की उंमीद है । इससे प्रायोगिक तैयारी और इमेजिंग सुविधाओं की निकटता से सुविधा की जा सकती है.

क्या पहली नज़र में सांसारिक विवरण की तरह लग सकता है सॉफ्टवेयर, हार्डवेयर स्थिरता, और डेटा प्रबंधन के लिए महत्वपूर्ण हैं । सॉफ़्टवेयर और संबद्ध हार्डवेयर ड्राइवर्स, नेटवर्क परिवेश और स्वचालित सॉफ़्टवेयर अद्यतन सभी सॉफ़्टवेयर की स्थिरता को प्रभावित करते हैं । यह एक "शुष्क भागो" में इस प्रोटोकॉल के परीक्षण के लिए बाधाओं और छवि अधिग्रहण में समस्याओं के संभावित स्रोतों की पहचान करने के लायक है; उदाहरण के लिए, अविश्वसनीय लाइव सेल सेटअप, स्टेज, शटर, और कैमरा विश्वसनीयता और स्वचालित ऑपरेटिंग सिस्टम और सॉफ़्टवेयर अद्यतनों पर संस्थागत सूचना प्रौद्योगिकी नीतियों के लिए जांच करें ।

डेटा प्रबंधन किसी भी इमेजिंग प्रयोग है कि छवियों के हजारों के लिए सैकड़ों उत्पंन की एक निरंतर चिंता का विषय है । सौभाग्य से, वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर अक्सर उपलब्ध अंतरिक्ष के लिए एक इमेजिंग प्रयोग शुरू करने से पहले की जांच । हालांकि, इस परख भी पोस्ट-कैप्चर छवि प्रसंस्करण और विश्लेषण है कि हार्ड ड्राइव अंतरिक्ष बोझ को जोड़ सकते है और इमेजिंग प्रयोगों के साथ हस्तक्षेप, यदि उपलब्ध स्थान सीमित है शामिल हैं । इसके अलावा, सुरक्षा और कंप्यूटर की स्थिरता की गारंटी नहीं किया जा सकता, भी हार्डवेयर समाधान जैसे समान डिस्क की एक अनावश्यक सरणी के साथ । इस प्रकार, एक डेटा प्रबंधन रणनीति के लिए चल रहे प्रयोगों और एक मजबूत दूरदराज के संग्रह के लिए कंप्यूटर की हार्ड ड्राइव पर अंतरिक्ष सुनिश्चित करने के लिए, उदाहरण के लिए एक संस्थागत संग्रह संसाधन के साथ, आवश्यक है ।

छवि गुणवत्ता को अधिकतम करने के लिए रणनीतियां
हालांकि KAV की क्षमता को सही मैट्रिक्स पृष्ठभूमि से ECFCs विचार मजबूत है, परख की संवेदनशीलता छवि गुणवत्ता पर निर्भर है । उदाहरण के लिए, यदि छवि कम कंट्रास्ट है, तो सॉफ़्टवेयर कम सटीकता (चित्र 2B) के साथ सेल नेटवर्क्स का पता लगाएगा । चरण इसके विपरीत की गुणवत्ता कई कारकों से प्रभावित है, छवि अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल माइक्रोस्कोप की सेटिंग सहित, मैट्रिक्स की लोडिंग और परख तैयारी के दौरान सेल निलंबन मीडिया, और कुओं के भीतर मीडिया के स्तर के रखरखाव इमेजिंग के दौरान । इन परख के लिए चरण इसके विपरीत अनुकूलन, मामूली समायोजन करने के लिए माइक्रोस्कोप में चरण अंगूठी संरेखण के विपरीत सुधार किए गए । इसके अतिरिक्त, नमूना तैयारी कड़ाई से बराबर और लगातार मीडिया लोडिंग सुनिश्चित करने के लिए परीक्षण किया गया था । यदि मैट्रिक्स और/या कुओं में भरी हुई मीडिया की राशि या तो नीचे या इष्टतम सीमा से ऊपर है, एक meniscus बदल चरण कंट्रास्ट के लिए अग्रणी फार्म कर सकते हैं । अंत में, कुओं में तरल की छोटी मात्रा के कारण, यह वाष्पीकरण और संघनित्र को कम करके मीडिया के स्तर को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में ऊपर उल्लेख किया । कुल मिलाकर, परख अनुकूलन के लिए विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता कंट्रास्ट छवियां उत्पंन महत्वपूर्ण है ।

चरण इसके विपरीत गुणवत्ता के अलावा, अंय कारकों को भी मीडिया संदूषण, मैट्रिक्स में खामियों, और कणों या मैट्रिक्स या मीडिया में मलबे सहित परख परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं । संदूषण इस परख का खतरा है क्योंकि यह कई घंटे से अधिक एक सूक्ष्म चैंबर में रहते सेल इमेजिंग शामिल है । संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए, मैट्रिक्स और सेल सस्पेंशन एक बाँझ डाकू में स्लाइड पर लोड कर रहे हैं । इसके अलावा, प्रत्येक नमूना आम तौर पर एक प्रयोग के लिए डुप्लिकेट या तपसिल में चढ़ाया जाता है के कारण डेटा की हानि के जोखिम को कम करने के लिए अप्रत्याशित मुद्दों जैसे मलबे या विश्लेषण को मिला कणों ।

नमूना विविधता ड्राइव वृद्धि की परख संवेदनशीलता के लिए की आवश्यकता
विविधता मनाया गया है और ECFCs के पिछले अध्ययनों में रिपोर्ट GDM13से अवगत कराया । सेल समारोह में विविधता के एक उच्च स्तर पर इन नमूनों में मनाया मातृ रोग की गंभीरता, रोग की अवधि, और प्रबंधन के लिए रक्त शर्करा के स्तर को विनियमित इस्तेमाल शैली सहित कई कारकों के कारण अटकलें है । महत्वपूर्ण बात, यह विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण ECFC vasculogenesis की गतिशील रेंज कब्जा, यह phenotypic गर्भधारण से नमूनों में कार्यात्मक विविधता के कारण मतभेदों की पहचान करने के लिए संभव बना रही है । कुल मिलाकर, प्राथमिक रोगी नमूनों का उपयोग, जैसे इन अध्ययनों में प्रयुक्त होने वाले, एक सेल लाइन की तुलना में बड़ा परिवर्तनशीलता लागू कर सकते हैं । के रूप में अधिक से अधिक जोर अनुवाद कार्यात्मक परिवर्तनशीलता के साथ कई प्राथमिक पशु या मानव नमूनों को शामिल अध्ययन पर रखा गया है, परख संवेदनशीलता का पता लगाने और जैविक रूप से सार्थक माप और निष्कर्ष के व्युत्पत्ति के लिए आवश्यक है । इसलिए, KAV जैसे दृष्टिकोण के विकास की मात्रा और डेटा की गुणवत्ता में सुधार होगा द्वारा उत्पंन इन विट्रो vasculogenesis और angiogenesis परख और अधिक मजबूत टिप्पणियों और निष्कर्षों को सक्षम करने के लिए । इसके अलावा, इन आंकड़ों अंतर्निहित आणविक तंत्र की भविष्य की जांच की सुविधा है कि बदल ECFC vasculogenesis अंतर्गर्भाशयी GDM एक्सपोजर निंनलिखित योगदान के लिए होगा ।

इस दृष्टिकोण के भविष्य अनुप्रयोगों
हालांकि इस विधि इन अध्ययनों में इन विट्रो में भ्रूण ECFC vasculogenesis का आकलन करने के लिए लागू किया गया था, इस दृष्टिकोण के संभावित अनुप्रयोगों के कई हैं. इस तकनीक को आसानी से किसी भी कोशिका जनसंख्या है कि vasculogenesis या angiogenesis की प्रक्रियाओं में भाग का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है । विशेष रूप से, यह व्यक्तिगत कोशिका आबादी का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में इस अध्ययन में प्रदर्शन किया गया था, लेकिन यह भी सह संस्कृति प्रणालियों के लिए लागू किया जा सकता है । भविष्य में, यह दो से परे इस दृष्टिकोण का विस्तार करने के लिए लाभकारी होगा आयामी इन विट्रो परख तीन आयामी (3d) मॉडल का आकलन करने के लिए. हालांकि KAV के वर्तमान संस्करण quantitating 3d इमेजिंग डेटा के लिए अपर्याप्त होगा, एक समान रूप से डिजाइन समय चूक, बहु-पैरामीट्रिक विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण विशेष रूप से 3 डी के लिए या vivo में मॉडल यदि अवलोकन दो-आयामों में किए गए सूचित करेंगे इन विट्रो में एक अधिक जैविक रूप से प्रासंगिक सेटिंग में सेल समारोह के प्रतिनिधि हैं ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक लुसी मिलर, Leanne Hernandez, डॉ डेविड हास, ब्रिटनी Yeley (इंडियाना यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन), डॉ करेन Pollok, जूली मुंद, मैथ्यू दर्रा स्वीकार करते हैं, और एमिली Sims (एंजियो इंडियाना विश्वविद्यालय शमौन कैंसर केंद्र में) ECFC नमूनों को संस्थाओ में उत्कृष्ट तकनीकी सहायता । लेखक भी डीआरएस को स्वीकार करते हैं । मॉरीन ए. Harrington, एडवर्ड एफ Srour, रिचर्ड एन दिवस, Mervin सी. Yoder, और मथायस ए क्लॉस (इंडियाना विश्वविद्यालय चिकित्सा के स्कूल) के विद्वानों के रूप में अच्छी तरह के रूप में जेनिस की दीवारों (इंडियाना विश्वविद्यालय चिकित्सा के स्कूल) के लिए व्यवस्थापकीय समर्थन । सभी इमेजिंग जैव माइक्रोस्कोपी, इंडियाना विश्वविद्यालय के स्कूल ऑफ मेडिसिन के लिए इंडियाना केंद्र में प्रदर्शन किया था । यह काम स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (R01 HL094725, P30 CA82709, और U10 HD063094) और रिले बच्चों की नींव द्वारा समर्थित किया गया था । इसके अतिरिक्त, इस प्रकाशन संभव राष्ट्रीय दिल से आंशिक समर्थन के साथ बनाया गया था, फेफड़े, और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के रक्त संस्थान पुरस्कार के तहत # T32 HL007910 ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm Tissue Culture Plates Fisher 353003
15 mL conical tubes Fisher 1495949B
Angiogenesis 15-well micro-slides Ibidi 81506
Matrigel Fisher (Corning) 354234
EGM2 Medium Lonza CC3162
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11550
PSA Antimyocytic, Antibiotic Fisher MT30004C1 Added 5 mL per 500 mL bottle of EGM2 medium.
0.5% Trypsin/0.53 nM EDTA in HBSS Fisher (Corning) MT25052CI
Type 1 Collagen Fisher (Corning) 354226 100 mg of liquid, concentration range 3-4 mg/mL. Dilute in 20 nM acetic acid in ddH2O to use at a final concentration of 0.05 mg/mL.
Glacial Acetic Acid Fisher A38-212 Used in Type 1 Collagen solution at a final concentration of 20 nM.
Kim Wipes Fisher 06-666
Chambered slide Ibidi 80296 This slide can be filled with distilled water to maintain humidity in the imaging chamber.
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher (Gibco) 20012027 1x solution, pH 7.2
Microscope Nikon Instruments MEA53100 and MEF55030 Motorized TiE including Ph1 phase ring for phase contrast with objective
Stage Prior Instruments ProScan II Other OKOlab and Nikon Elements AR compatible stage may be used
Objective Nikon Instruments 93178 CFI Plan Fluor DL 10X
Camera Hamamatsu C11440-42U ORCA Flash 4.0LT
Stage Blower Precision Controls N/A This item has been discontinued, alternatives include Smart Air-Therm Heater(AIRTHERM-SMT-1W) from World Precision Instruments
Stage-top Incubator  OKOLabs H301 BoldLine including a two position slide holder
Computer Hewlett-Packard Z620 or equivalent 4 core Intel Xeon processor, >32 GB RAM, >2 TB RAID 10, nVidia Quadro graphics card 
Nikon Elements Software Nikon Instruments AR v 4.20 ND Acquisition is a multidimensional setup tool used to configure Elements software.
FIJI (ImageJ) Software N/A N/A Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://imagej.net/Fiji/Downloads
KAV Plug-In N/A N/A Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://github.com/icbm-iupui/kinetic-analysis-vasculogenesis

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References

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Varberg, K. M., Winfree, S., Dunn, K. W., Haneline, L. S. Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro. J. Vis. Exp. (131), e57044, doi:10.3791/57044 (2018).

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