Kinetisk analyse av Vasculogenesis kvantifiserer dynamikken i Vasculogenesis og angiogenese In Vitro

Summary

Her presenterer vi en protokoll for tidsinnstilt bildebehandling og analyse av vasculogenesis i vitro bruker fase kontrast mikroskopi kombinert med åpen kildekode programvare, kinetisk analyse av Vasculogenesis. Denne protokollen kan brukes til å vurdere kvantitativt vasculogenic potensialet i mange celletyper eller eksperimentelle forhold som modell vaskulær sykdom.

Abstract

Vasculogenesis er en kompleks prosess som stammen og stamfar endotelceller gjennomgå de novo fartøyet formasjon. Kvantitativ vurdering av vasculogenesis har blitt en sentral avlesning endoteliale progenitor celle funksjonalitet, og derfor flere forsøk er gjort for å forbedre både i vitro og vivo vasculogenesis modeller. Men er standard metoder begrenset i omfang, med statisk mål ikke å ta mange aspekter av denne svært dynamisk prosessen. Målet med utvikling av denne romanen protokollen var derfor å vurdere the kinetics av i vitro vasculogenesis for å quantitate nettverk dannelse og stabilisering, i tillegg til å gi innsikt i potensielle mekanismene bak vaskulære dysfunksjon. Anvendelsen av denne protokollen er demonstrert med fosterets endothelial kolonien danne celler (ECFCs) utsatt for mors diabetes mellitus. Føtal ECFCs var avledet fra navlestrengsblod etter fødselen, kultivert og belagt i lysbilder som inneholder kjelleren membran matrise, hvor de gjennomgikk vasculogenesis. Bilder av hele lysbildet ble kjøpt med time-lapse fase kontrast mikroskopi over 15 timer. Bildene ble analysert for avledning av kvantitative data benytter en analyseprogramvare alarmert kinetisk analyse av Vasculogenesis (KAV). KAV bruker bildesegmentering etterfulgt av skeletonization for å analysere nettverkskomponenter fra stabler av multi-tid punkt fase kontrast bilder å utlede ti parametere (9 målt, 1 beregnet) nettverk struktur inkludert: lukket nettverk, nettverksområder, noder, grener, totalt gren lengde, gjennomsnittlige armen lengde, trippel forgrenet noder, quad-forgrenet noder, nettverksstrukturer og avslaget til noden forholdet. Anvendelsen av denne protokollen identifisert endret priser på vasculogenesis i ECFCs fra svangerskap komplisert av diabetes mellitus. Men har denne teknikken brede implikasjoner utenfor omfanget rapporteres her. Gjennomføringen av denne tilnærmingen vil forbedre mekanistisk vurdering og forbedre funksjonelle readouts vasculogenesis og andre biologisk viktig forgrening prosesser i mange celletyper eller sykdom stater.

Introduction

Evne til endoteliale progenitor celler å gjennomgå vasculogenesis eller de novo fartøyet formasjon, er viktig å etablere embryonale blodkar under utvikling¹. Dessuten er ytterligere fartøyet dannelse og modning av eksisterende fartøyer, som er kjent som angiogenese, også en viktig prosess i utvikling og i postnatal liv opprettholde blodstrøm og homeostase hele kroppen². Alle organer i kroppen er avhengig av det vaskulære systemet for levering av oksygen og næringsstoffer, og fjerning av avfall³. Hvis vaskulær homeostase ikke opprettholdes, slik at blod fartøy dannelse og reparasjon er utilstrekkelig eller i overkant, kan vascular sykdommer føre til⁴. Derfor er vaskulær dannelse og tilpasning vanligvis studert, som de er avgjørende for vedlikehold av orgel helse og er involvert i utviklingen av mange patologisk stater.

På grunn av en økt forståelse av involvering av vaskulære system i utvikling og i sykdom manifestasjon og fremdrift, er analyser utviklet modellen vasculogenesis og angiogenese i vitro og i vivo^{5 ,6,7}. Modellering fartøyet formasjon innebærer plating vaskulære celler, for eksempel endotelceller, i kjelleren membran matrise som fremmer celle organisasjon og dannelse av fartøyet nettverk^8,9,10. Vanligvis følgende overnatting inkubasjon bilder av cellen nettverk er fanget på et enkelt punkt, som resulterer i et lite antall bilder for analyse^11,12,13. Derfor er analytiske metoder i stor grad utviklet og optimalisert for eneste gang punkt vurderinger^10,14. Men statisk analyser er bare ikke nok på å fange dynamisk prosess av fartøyet formasjon og gi begrenset innsikt i potensielle mekanismene som er involvert. Selv om økende tenkelig frekvens ville trolig gi de nødvendige dataene for å identifisere formasjon kinetikk, ville anvendelse av tidligere utviklet analytics til et multi-tid punkt imaging tilnærming være ineffektiv og arbeidskraft intensiv¹⁴. I tillegg til tross for utviklingen av kommersielt tilgjengelig analyser gjengir en betal-per-image avgift dette alternativet kostnadseffektive uoverkommelige for kinetic studier der tusenvis av bilder er generert¹⁵. Derfor er det behov innen en strømlinjeformet og effektiv tilnærming til fange og kvantifisere vasculogenesis i vitro, inkludert muligheten til å analysere store bildet sett generert av time-lapse levende celle mikroskopi.

For å overvinne disse begrensningene, utviklet en ny tilnærming å utvide enkelt punkt imaging aktivere dynamiske vurdering av vasculogenesis med bilder kjøpt hver 15 min¹⁶. Ved å fange flere tidspunkt over adskillige timene, gir denne tilnærmingen en mer detaljert beskrivelse av prosessen med vasculogenesis, i tillegg til innsikt i potensielle mekanismer bidrar til dannelsen og vedlikeholdet av fartøyet nettverk. I tillegg til å forbedre frekvens og kvaliteten på bildeopptak, har denne romanen programvare i form av en åpen kildekode plugin¹⁷. Programvaren, referert til som kinetisk analyse av Vasculogenesis (KAV), er et strømlinjeformet program som inkorporerer bildebehandling og analyse for stort bilde sett fra multi-tid punkt oppkjøp. KAV analyserer fase kontrast bilder gjennom bildesegmentering etterfulgt av skeletonization¹⁸. Ti parametere av nettverkets struktur er kvantifisert ved KAV inkludert: grener, lukkede nettverk, noder, nettverksområder, nettverksstrukturer, trippel forgrenet noder, quad-forgrenet noder, totalt gren lengde, gjennomsnittlige armen lengde og avslaget til noden forholdet (se skjematisk i figur 1)¹⁶. Anvendelse av KAV tilnærmingen omfatter en roman, beregnede fenotypen av i vitro vasculogenesis, kalles avslaget til noden forholdet. Våre siste arbeid vist at dette forholdet antyder nettverkstilkobling og kan knyttes til andre cellulære prosesser i nettverket formasjonen, som motilitet¹⁶.

Selv om fosterets endothelial kolonien danne celle (ECFC) vasculogenesis ble vurdert i disse studiene, kan dette bilde oppkjøpet og analyse tilnærming lett brukes for å evaluere alle celletyper som gjennomgå vasculogenesis eller angiogenese. Denne tilnærmingen kan i tillegg brukes til å identifisere endret vaskulær funksjon som følge av en rekke patologisk stater, som gestational diabetes mellitus, som vist i disse studiene. Videre er kan denne metoden tilpasses for å vurdere nettverk dannelse og forgrening, som er viktige for andre biologisk relevante prosesser. Dermed er den potensielle virkningen av denne romanen gjelder unike biologiske systemer ennå skal fastsettes.

Protocol

1. forberedelser

1. Kultur endothelial kolonien danne celler (ECFCs)
   Merk: Føtal ECFC prøver som brukes i disse eksperimentene ble isolert fra menneskelige navlestrengsblod og kultivert av Angio BioCore (ABC) ved Indiana University School of Medicine som tidligere beskrevet⁶. Rutinemessig kvalitetskontroll phenotyping ble utført i ABC å bekrefte uttrykk for endothelial antigener som beskrevet tidligere^19,20,21. Prøver forsøk var passaged minimal (2 - 3 ganger). Alle vev kultur arbeidet ble utført i vev kultur hette. Reagenser, inkludert vev kultur plater og løsninger, var sterilt.
   1. To dager før eksperimentet pels 100 mm runde vev kultur plater med 6 mL av 0,05 mg/mL type 1 kollagen og ruge på 37 ° C over natten.
      Merk: Type 1 kollagen er utvannet i dobbel-destillert vann som inneholder 20 nM eddiksyre til en fungerende konsentrasjon av 0,05 mg/mL.
   2. Dagen før eksperimentet, trypsinize og replate ECFCs på type 1 kollagen belagt plater i 1.1.1. (Se merknad under 1.1).
   3. For å trypsinize ECFCs, Sug opp medier fra belagt celler og vask med 7 mL PBS. Sug opp PBS, deretter legger 2-3 mL 0,5% trypsin og ruge celler for 2-5 min på 37 ° C.
   4. Etter inkubasjon med trypsin, legge 3 mL EGM2 og Pipetter opp og ned for å fjerne alle tilhenger celler. Overføre celle suspensjon slik konisk 15 mL.
   5. Sentrifuge alle prøver på 500 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
   6. Sug opp nedbryting og å suspendere celle pellets i 1-2 mL av EGM2. Bland celle suspensjon godt og ta en liten aliquot (20-40 μL) for opptelling.
   7. Legg like deler trypan blå til aliquot-cellen og Pipetter 10 µL på en hemocytometer. Tell antall celler i fire primære quadrants av hemocytometer.
      Merk: Bruk begge sider av hemocytometer for alle utvalg teller for å øke nøyaktigheten.
   8. Vask kollagen-belagt vev kultur platene, som ble utarbeidet i trinn 1.1.1, to ganger med 7 mL av PBS. Kultur medier med 10% fosterets bovin serum til platene etter aspirating andre PBS vask, legge 10 mL av endothelial oppblomstringen medium 2 (EGM2).
   9. Bruker celletall fikk i trinn 1.1.7, beregne volumet av cellen suspensjon må plate 4 x 10⁵ celler. Plate 4 x 10⁵ ECFCs på vev kultur platene forberedt i trinn 1.1.8 og ruge på 37 ° C og 5% karbondioksid (CO₂) over natten.
2. Før eksperimentet, lagre forsyninger på 4 °C over natten
   1. Lagre en 3 "x 2" metallplaten, lysbilde (hold i pakken til åpen i panseret), en boks av sterile 20 mikroliter (μL) tips og kjelleren membran matrise (matrise).
      Merk: Matrix holdes på-80 ° C for langtidslagring; alltid tine det på 4 ° C over natten eller i flere timer før å bruke.
3. Bekrefte tilgjengeligheten av tilstrekkelig plass for bildene på datamaskinens harddisker.
   Merk: Bruker konfigurasjonen i denne protokollen, var ca 60 gigabyte (GB) plass nødvendig per forsøk (4 GB/vel). Imidlertid plass estimatene er basert på maskinvarekonfigurasjonen og må fastslås for hvert system.

2. protocol 1: Eksperimentelle oppsett: forbereder lysbildet

1. Samle og forberede rekvisita
   1. Dagen for eksperimentet, samle forsyninger for plating celler på lysbildet, inkludert en bøtte med is, en liten beholder med tørris, et par saks og en 20 μL pipette. Spray alle elementer med 70% etanol, tørk deretter tørt med papirhåndklær og plassere elementer i sterilt vev kultur hette.
   2. Samle alle forsyninger lagret på 4 ° C (se trinn 1.2) inkludert metallplaten, boks med tips, lysbilde og matrise. Spray boksen tips med 70% etanol og sted boksen inne av tørris.
      Merk: Fjern matrise fra 4 ° C kjøleskapet bare når du er klar til bruk, og alltid holde matrisen på is.
   3. Spray metallplaten med 70% etanol og legge den i isen i isen bøtte. Åpne pakken inneholder lysbildet, og plassere lysbildet på metallplaten å holde den kald.
2. Last matrix på lysbildet
   1. Sett Pipetter til 10 μL og fjerne spissen fra kalde Verktøytips-boksen med pipette. Kuttet ca 1 cm på slutten av spissen med saksen.
      Merk: kutt vinkelrett spissen for å redusere bobler i matrisen. Pipette kan settes til et volum litt større enn 10 μL konto for matrisen fast på innsiden av tuppen.
   2. Sakte trekke matrisen i pipette spissen. Umiddelbart plassere pipette på midten av brønnen. Trykk forsiktig pipette spissen til bunnen av brønnen og sakte skyve matrix ut.
      Merk: ikke over pipette, da dette vil føre til bobler til skjemaet. Hvis en boble former, pop det umiddelbart med et lite tips.
   3. Lysbildet inneholder 15 individuelle brønner. Gjenta det forrige trinnet for hver brønn. Bruk nye pipette tips for hver godt å opprettholde konsistens og redusere matrix styrket i spissen.
   4. Når lysbildet er lastet med alle brønner som inneholder matrise, dytte lokket helt inn i lysbildet og ruge på 37 ° C i 30-60 minutter før matrix stivner.
      Merk: Ikke la matrix tørke ut. Legg til et lite volum (2-3 mL) på PBS i cap av en 50-mL konisk rør nær lysbildet i inkubator å redusere risikoen for matrise tørking.

3. protocol 2: Plating ECFCs på matrisen

1. Fjerne tilhenger ECFCs fra vev kultur plater og samle i suspensjon
   1. Få vev kultur plater som inneholder ECFCs belagt dagen (se avsnitt 1.1.9). Sug opp EGM2 media og vask tilhenger ECFCs gang med 7 mL av PBS.
   2. Sug opp PBS legge 2-3 mL av trypsin og ruge tilhenger celler for 2-5 min på 37 ° C.
   3. Etter inkubasjon legge 3 mL EGM2 og Pipetter opp og ned for å fjerne alle tilhenger celler. Overføre celle suspensjon slik konisk 15 mL.
   4. Gjenta trinn 3.1.1-3.1.3 for de resterende tre ECFC prøvene til alle fire cellen prøver er samlet i suspensjon.
2. Forberede master mikser
   1. Sentrifuge alle prøver på 500 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
   2. Sug opp nedbryting og å suspendere celle pellets i 1-2 mL av EGM2.
   3. Bland celle suspensjon godt og ta en liten aliquot (20-40 μL) for opptelling.
   4. Legg like deler trypan blå til aliquot-cellen og Pipetter 10 μL på en hemocytometer. Tell antall celler i fire primære quadrants av hemocytometer.
      Merk: Bruk begge sider av hemocytometer for alle utvalg teller for å øke nøyaktigheten.
   5. Med cellen teller ovenfra, beregne volumet av hver celle utvalg som inneholder 1.4x10⁴ celler. Bland alle cellen suspensjoner godt og aliquot 1.4 x 10⁴ celler i en fersk tube å forberede en master blanding hver eksperimentelle tilstand. Legg EGM2 media slik at det siste bindet av hver master mix er 175 μL.
   6. Bland hver master blanding ved forsiktig pipettering og aliquot 50 μL av master mix i individuelle brønner på lysbildet.
      Merk: alle prøvene er belagt i tre eksemplarer, med master mikser beregnet for 3,5-tommers brønner for å sikre tilstrekkelig volum 3 brønner.
3. Inkuber lysbildet
   1. Inkuber lysbildet på 37 ° C før det kan flyttes inn i mikroskopet kammeret for bildebehandling.
      Merk: Tiden mellom plating og bildebehandling bør være så kort som mulig å begrense tap av data i den tidlige fasen av vasculogenesis.

4. protokoll 3: Mikroskop oppsett og bilde

Merk: For våre studier, protokoller 2 og 3 ble utført samtidig av separate individer. Hvis protokoller 2 og 3 må fullføres av samme person, skal protokoll 3 trinn 4.1 og 4.2 nedenfor være fullført før starte protokollen 2 ovenfor.

1. Slå på mikroskopet og datamaskinen
   1. Omtrent en til to timer før du starter eksperimentet, aktivere og Forvarm scenen topp inkubator 37 ° c, satt CO₂ til 5%, og sette fuktighet til 85%. Fyll inkubators fuktighet reservoaret, hvis tom.
   2. Plasser et tomt kamret lysbilde i en av de to ledige stillingene, og fylle med destillert vann. Sikre tilbakemelding termometeret for kammer temperaturkontroll, hvis tilgjengelig.
      Merk: Hvis tilbakemelding termometeret er tilgjengelig, bruker denne "inkubator temperatur" bekrefte at kammeret har equilibrated.
   3. Slå på en sekundær blåser satt til 39-42 ° C til varme lysbilder nedenfor og minimere kondens.
   4. Legge til en andre lysbildet som en tom til eksperimentelle lysbildet kan legges. Dette lysbildet fungerer som en plassering plassholder for konfigurasjon av oppkjøpet bildeinnstillingene for individuelle brønner under installasjonen.
   5. Tilsett vann til reservoaret rundt brønnene på det andre lysbildet å etterligne betingelsene under tenkelig eksperimentet. Vannet rundt brønnene gjør vurdering av fuktighet under mikroskopet oppsett og forvarming.
      Merk: Før balanse av scenen-top inkubatoren og sekundære viften er avgjørende for å opprettholde et stabilt culturing miljø. De fleste levende celle kammer kontrollere gi tilbakemelding av temperatur, CO₂, og fuktighet å vurdere beredskap for systemet. Før du fortsetter, kontroller for akkumulering av fuktighet på lysbildet og overdreven tørking av reservoaret fylt 4.1.5. Fuktigheten må justeres hvis det er overdreven tørking eller kondens i kammeret. For å øke luftfuktigheten, legge kluter wetted med destillert vann. Du kan redusere kondens, enten redusere innstillingen fuktighet som justert i 4.1.1, eller kondens kan være et tegn på lav temperatur, sjekk temperaturinnstillinger kammer og plasseringen av den sekundære blåseren.
2. Konfigurere grunnleggende oppkjøpet innstillinger under balanse.
   Merk: bildeopptak konfigureres gjennom programvaren som styrer den scenen, nedleggelse og kamera. En flerdimensjonal setup-verktøyet er den enkleste måten å konfigurere programvaren. Videre må programvaren ha autofokus rutiner for å sikre fokus kontroll over varigheten av eksperimentet.
   1. Bruke programvaren til å angi flere scenen stillinger for hver brønn. For denne protokollen, velger du midten av brønnene.
   2. Konfigurere bilde oppkjøpet slik at på hver scene posisjon, hele godt er fotografert. Bruk for eksempel en tilescan med 10-20% bildet overlapping og ca 5 x 5 felt, avhengig av kameraet og endelige forstørrelse.
   3. Konfigurere tidsforløp for imaging hvert 15 min.
      Merk: Bruker konfigurasjonen i denne protokollen, er alle 15 brønner på lysbildet fotografert i en 15 min intervall.
3. Laste eksperimentelle lysbildet
   1. Etter balanse av inkubator kammeret, erstatte det tomme lysbildet med eksperimentelle lysbildet.
      Merk: en equilibrated kammeret har stabil temperatur, CO₂og fuktighet i minst 20 min. Når eksperimentelle lysbildet er klar, er det viktig at trinnene er fullført raskt for å minimere "døde-tid" mellom plating og det første punktet fanget av mikroskopet. Videre, for å lette sammenligning mellom tenkelig eksperimenter, denne gangen bør være konsekvent. I disse eksperimentene må alle trinnene som er beskrevet i protokoll 3 del 4.3 tilgang ca 30 minutter å fullføre.
   2. Fjern lysbildet lokket og tilsett vann til reservoaret rundt brønnene på lysbildet.
      Merk: Lokk fjernes for varigheten av tenkelig eksperimentet.
4. Konfigurere siste oppkjøpet innstillinger
   1. Plasser CFI Plan Fluor DL 10 X målet i posisjon og velg Ph1 fase ringen på kondensoren. Med den første brønnen i fokus, justere diascopic lys banen for Köhler belysning og konfigurere fase optikk ved å kontrollere justeringen av fase ring i kondensatoren med objektive fase maske.
   2. Konfigurere eksponeringstid og Juster intensiteten etter lampe fase kontrast, som vanligvis er mindre enn 500 ms.
   3. Bla gjennom hver scene posisjon satt i 4.2.1 og bekrefte at midten av brønnen er valgt, og justere det, om nødvendig.
   4. På hvert stadium posisjon, fokus på cellene belagt i brønnen og sette scenen stillingens z posisjon brukes til bildebehandling i programvaren.
   5. Teste autofokus mekanismen for mikroskopet. Hvis autofokus er maskinvarebasert, sikre det på og riktig plassert for alle scenen stillinger.
      Merk: som den prøven og scenen kan drive loddrett under eksperimentet, er det viktig at programvaren kontrollere autofokus på hver scene posisjon og hver tidspunkt å sikre pålitelig bildebehandling i tid-løpet. Hvis mulig, bør en autofokus posisjon i forrige tidspunktet brukes som utgangspunkt for påfølgende autofokus rutine. På denne måten pågående drift kan justeres for lett.
   6. Redusere eller slå av lysene på mikroskopet rommet og starte tenkelig eksperimentet.

5. protocol 4: Bilde prosessering og kinetisk analyse av Vasculogenesis (KAV)

1. Lagre bilder fra individuelle poeng som en bildestakk for hver brønn
   Merk: de fleste programvare for bildebehandling kan eksportere flersidige TIFF (stabler) av tiden serien. KAV er utformet på datasett som kan inneholde flere tidspunkt. Dermed oppstår analyse på hele bildet stakken for trinn posisjon. Om nødvendig kan bildebehandlingen importere enkeltbilder fra hvert punkt å rekonstruere en bildestakk.
2. Åpne bildebehandlingen på datamaskinen
3. Legge til KAV bildebehandlingen
   1. Dra filen KAV fra en mappe til den grå linjen nederst i vinduet programvare. Klikk "Lagre" for å legge til programvaren i listen.
4. Åpne bildestakk skal analyseres
   1. Klikk "fil" og "Åpen" gjennom rullegardinmenyen i bildebehandling eller dra bildefilen inn i grå stang som i trinn 5.3.1.
   2. Konvertere bilder til 8-biters ved å velge 'Image', 'Skriv inn', "8 bit".
5. Opprett et område av interesse (ROI)
   1. Åpne ROI Manager ved å klikke på 'Analyser' på verktøylinjen. Velg "Verktøy" etterfulgt av "Avkastningen Manager".
   2. Opprette en ny avkastning ved å klikke på sirkelen eller rektanglet utvalget verktøyene på verktøylinjen og tegning ønsket merket område i bildet. Klikk "Add" i Avkastningen manager-vinduet for å lagre denne figuren.
      Merk: En tidligere opprettet avkastning kan åpnes ved å dra lagret ROIs (zipped brosjyre) i "Dra og slipp" for å åpne Manager.
   3. Klikk på Avkastningen etiketten vises i Avkastningen Manager til å vise den på bildet.
      Merk: Hvis Avkastningen ikke vises på bildet, opprette en andre avkastning (uansett størrelse/form) og legge den til sjefen. Når begge ROIs vises i listen, klikk frem og tilbake mellom to, og den ønskede Avkastningen vises på bildet.
   4. Juster Avkastningen hvis nødvendig. Når Avkastningen er på plass på bildet i ønsket sted, gå til menyen, og klikk "Rediger" så "Klart utenfor". Dette vil slette bildedata utenfor Avkastningen (nyttig for ikke-rektangulært figurer) for hvert bilde i stakken.
      Merk: Du kan også klikke på "Image" og "Crop" Hvis du bruker en rectangularly formet avkastning.
6. Kjøre KAV programvare
   1. Klikk "Plug-ins" i menylinjen.
   2. Velg 'Analysere nettverk' Plug-in. Dette vil åpne opp et vindu med alternativene for å endre innstillingene i plugin.
   3. Endre terskelverdi metoden bruker miste ned pilen.
   4. Når alle de aktuelle innstillingene er valgt, klikk "OK" for å starte programvaren behandling.
      Merk: Riktige innstillinger fastsettes gjennom visualisering av skjelettet og maske gjengivelser generert av KAV, som er tegn på accurary av programvaren til å identifisere og skille celler og nettverk fra bakgrunn i fase kontrast bildet.
7. Lagre KAV-genererte dataene
   1. Når plugin-modulen er ferdig analyse, vises to vinduer på skjermen inkludert en datatabell med numeriske verdier og en stabel med smeltet bildene viser skjelettet og maske gjengivelser.
   2. Lagre de numeriske verdiene ved å navigere til øvre venstre hjørne av tabellen og klikke "Rediger" deretter "Kopier" eller "Klippe ut" du limer inn verdier i et excel-regneark.
   3. Klikk på bildet for smeltet skjelettet og maske. Lagre bildestakk smeltet skjelett /-maske som Tagged Image File Format (TIFF)-fil ved å klikke 'Fil,' 'Bevare idet' TIFF.
   4. Lagre den beskårede kontrasten bilde stabel (opprettet ved hjelp av ROI) ved å klikke 'Fil,' 'Bevare idet' "TIFF."
   5. Klikk på vinduet ROI Manager og velg Avkastningen brukes til å beskjære bildene. Velg "Mer" etterfulgt av "Lagre" for å lagre Avkastningen for fremtidig bruk.
      Merk: Bruke samme Avkastningen vil hjelpe opprettholde konsistens over analyser.

Representative Results

KAV produserer visuelle representasjoner av nettverkets struktur
Kontrasten mellom ECFCs og matrix bakgrunnen i fase kontrast bilder kan KAV å identifisere celle-spesifikke strukturer. ECFC nettverk identifiseres av KAV representeres pictorially som skjelettet og maske gjengivelser å illustrere strukturer av programvaren for kvantifisering (figur 2A). Viktigere, muliggjør kvalitativ vurdering av skjelettet og maske gjengivelsene rask identifisering av KAV følsomhet og nøyaktighet, som kan være nyttig i å bestemme optimale innstillingene og tolke analysen resultatene. Når kvaliteten av fase kontrast bildene er høy og tilstrekkelig kontrast oppnås, identifiserer KAV nøyaktig ECFC nettverk som angitt av likheten mellom fase kontrast bildet og KAV generert skjelettet og maske gjengivelsene (figur 2 A og Video 1).

Alternativt hvis fase kontrast bilder ikke har høy kontrast og/eller gjenstander Imaging som gridding oppstår, nettverk gjenkjenning nøyaktighet er redusert og resultater blir tvetydig (figur 2B). I tillegg kan dannelsen av luftbobler i cellen media også skjule oppdagelsen nøyaktighet (figur 2). Problemer med bildekvaliteten kan imidlertid ofte løses gjennom utvalg av forskjellige terskelverdi metodene i programmet KAV. For eksempel ble fase kontrast bildet i figur 2B analysert med identiske image bearbeiding innfatningene bortsett fra metoden terskelverdi. Fra skjelettet og maske gjengivelsene er det tydelig at Otsu terskelverdi resulterte i en mer nøyaktig oppdagelse av ECFC nettverk vist i fase kontrast bildet (figur 2B). Derfor er image kvalitet avgjørende for å oppnå nøyaktig og meningsfull resultater i denne analysen. Men tillater forskjellige terskelverdi metodene i brukergrensesnittet KAV justering av bildeanalyse basert på kvaliteten på input bildene.

Time-lapse mikroskopi identifiserer kvalitativ og kvantitativ forskjeller i ECFC vasculogenesis etter intrauterine gestational diabetes mellitus eksponering
Nylig ble KAV analytisk tilnærming brukt for å vurdere føtal ECFC funksjonen etter eksponering for mors type 2 diabetes mellitus (T2DM) i utero¹⁶. Bruker KAV, endret kinetics av vasculogenesis ble identifisert i fosterets ECFCs utsatt for T2DM. Men i tillegg til T2DM svekker eksponering, som oppstår i løpet av hele svangerskapet gestational diabetes mellitus (GDM) og utviklingen av glukose intoleranse vanligvis i tredje trimester av svangerskapet, også ECFC funksjonen¹³. Derfor ble KAV brukt for å avgjøre hvis GDM-eksponerte ECFCs også vise endret kinetics ECFC nettverk-formasjonen. Fase 1 (0-5 h) og fase 2 (5 + h) ble vurdert ved hjelp tid forfalle mikroskopi kombinert med KAV analyse (Figur 3). Representant fase kontrast bilder ervervet ved starten av image vinningen (0,50 h) og gjennom tid (5,00 og 10.00 h) skildrer ECFC nettverk formasjon i fire prøvene testet fra en enkelt eksperimentelle dag (Figur 3 og Video 1 ). Til tross for tilsvarende cellen lasting, som observert i fase kontrast bilder på 0,50 timer er kvalitative forskjeller i nettverkets struktur tydelig på 5,00 og 10.00-timers points. ECFCs fra ukomplisert graviditet (UC) danner et komplekse og intrikate nettverk timer etter plating, ligner på våre tidligere publiserte data¹⁶. Derimot eksempelskjemaet ECFCs fra GDM 1 (GDM1) veldig få nettverk strukturer som ikke er koblet sammen. Dette mønsteret gjenspeiles imidlertid ikke i alle ECFC prøver innhentet fra GDM svangerskap, indikativ av heterogenitet mellom eksempler. Prøver GDM2 og GDM3 vise større nettverk formasjon sammenlignet med GDM1, selv om mønstre av tilkobling vises endrede forhold til UC prøven. Viktigere, måler KAV flere strukturelle komponenter av ECFC nettverk å identifisere både åpenbar og subtile fenotyper.

I tillegg genererer skjelettet og maske gjengivelser av nettverkets struktur, quantitates KAV ti beregninger av nettverksstruktur, inkludert antall individuelle nettverkstrukturer, noder, trippel forgrenet noder, firedoble forgrenet noder, greiner, totalt lengde for gren, gjennomsnittlige armen lengde, avslaget til noden forhold, totalt lukket nettverk og nettverk området¹⁶. KAV kompilerer dataene for hvert utvalg i en enkelt tabell med verdiene for alle bilder av time course. Tabell 1 inkluderer representant rådata fra en tenkelig studie for en ECFC prøven. Parameterne for nettverksstruktur målt ved KAV er ordnet i kolonner og data for sekvensielle bilder kjøpt over tid er ordnet i rader. For eksempel i våre studier, bilde 1 ble innhentet 30 min etter plating med etterfølgende bilder blir samlet inn hvert 15 min. rå verdier generert av KAV kan deretter fremstilles grafisk eller ytterligere analysert bruker mer komplekse statistiske tilnærminger¹⁶.

Fem grafer viser mener verdier av nettverksstruktur fra tre separate forsøk vises for en enkelt ukomplisert prøve (UC) og tre GDM prøvene (Figur 4). UC eksemplet i disse eksperimentene utført på samme måte tidligere analysert UC prøver¹⁶. Tidligere ble det identifisert at ECFC vasculogenesis i vitro er bi-phasic, bestående av fase 1 (0 - 5 h) og fase 2 (5-10 h)¹⁶. Dette mønsteret er konsekvent i gjeldende studiene, som dokumentert av grafen viser lukkede nettverksdata (Figur 4). UC prøven dannet et større antall lukkede nettverk sammenlignet med alle tre GDM prøvene. Interessant, synes tre av de fire prøvene å ha en lignende tid til maksimal antall lukkede nettverk, som oppstår mellom 2,5 og 3 timer. GDM2 prøven var imidlertid tregere å nå maksimal lukkede nettverk, som skjedde timer etter plating. Og til tross for GDM2 prøven danner færre maksimal nettverk sammenlignet med UC prøven, nettverk danner ble opprettholdt tilsvarende til UC prøven over tid. Omvendt, GDM1 og GDM3, som dannet færre nettverk sammenlignet med UC prøven, også utstilt en samlet reduksjon i nettverksnummer over tid. Samlet fra grafen viser lukkede nettverksnummeret, er det tydelig at alle ECFC prøver vises et bi-phasic mønster av nettverket formasjon, men frekvensen av formasjonen og maksimalt antall nettverk oppnådd variere prøver.

Nettverksområdet representerer gjennomsnittlig området i de lukkede nettverkene dannet av ECFCs. Derfor, jo større det lukkede nettverket nummer, jo mindre nettverk områdene. Dette mønsteret er reflektert i nettverk området grafer der UC utvalget, dannet et større antall lukkede nettverk, hadde mindre nettverksområder over tid i forhold til tre GDM prøvene (Figur 4). GDM2, som nådde maksimalt lukkede nettverk saktere, utstilt høy nettverksområdet først, men området stabilisert over tid, og dette var mest ligner UC prøven på 15 timer. Over tid, gjennomsnittlig nettverksområdet i alle prøvene økt på grunn av nettverk de stabilisering. Men utstilt noen eksempler, som GDM1 og GDM3, en rask økning i nettverksområdet, som er trolig indikativ av redusert stabilitet i forhold til andre prøver viser en mer gradvis økning.

GDM-eksponerte ECFCs viser redusert nettverk stabilitet
Grenene til noder er en roman fenotypen beregnet av KAV og identifisert i våre tidligere studier, og dette er et tegn på nettverk connectivity¹⁶. I denne studien hadde UC utvalget en lav ratio, som representerte høy nettverkstilkobling som var over tid (Figur 4). Derimot hadde tre GDM prøvene en høyere andel av grenene til noder, spesielt i fase 2 nettverk-formasjonen. Denne observasjonen viser redusert tilkobling og de stabilisere nettverksstrukturer.

Samlet dannet GDM1 færre noder og grener sammenlignet med de andre prøvene, med reduksjon vedlikeholdes i løpet av eksperimentet. GDM2 og GDM3 dannet og vedlikeholdes flere grener sammenlignet med UC prøven, særlig mellom 5-15 h. Antall noder i GDM2 og GDM3 nettverkene var mer lik antall noder i UC utvalget, særlig mellom 10-15 h. Flere grener, men et tilsvarende antall noder, kunne redegjøre for økt avslaget til noden forholdet tydelig på senere tidspunkt i GDM utvalgene. Viktigere, kan samtidige endringer i grenen og noden være vanskelige å tolke i separate diagrammer. Men tilbyr romanen avslaget til noden forholdet en måte å vurdere hvordan endringer, inkludert små endringer vanskelig å oppdage i individuelle diagrammene, i både gren og node føre til endrede nettverkstilkobling.

Figur 1 : Skjematisk skisserte 10 parametere kvantifisert av kinetisk analyse av Vasculogenesis (KAV). KAV quantitates ti forskjellige parametere av nettverksstruktur. Alle parametere er fargekodet og skissert i skjematiske numerisk (1-10). Parametere inkluderer antall filialer (grønn, 1), lukket nettverk (blå, 2) og noder (rød, 3), gjennomsnittlig nettverksområdet (oransje, 4), antall nettverksstrukturer (svart, 5), trippel forgrenet noder (gul, 6) og quad-forgrenet noder (lilla, 7), som totalen (9) og gjennomsnittlig (10) grenen lengde, og forholdet mellom antall grenene til antall noder (10). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2 : Kinetisk analyse av Vasculogenesis (KAV) quantitates nettverksstruktur. (A) skjelettet og maske gjengivelser av nettverksstrukturer identifisert av KAV med fase kontrast bilder gir visuell representasjon av nettverksstrukturer identifisert og kvantifisert ved KAV. Skala bar = 500 µm. (B) et representativt fase kontrast bilde av ECFC nettverk 10t etter plating som har lav kontrast og rutenettet markerer fra søm enkeltbilder sammen. Forskjellige terskelverdi metoder, som betyr eller Otsu, kan velges i KAV plug-in å forbedre kvantifisering nøyaktighet, hvis fase kontrast bilder har lav kontrast eller gridding oppstår. Skjelettet og maske gjengivelser av fase kontrast bildet vises for både gjennomsnitt og Otsu terskelverdi metoder. Fase kontrast bilder ble tatt ved hjelp av en 10 X-målet. Skala bar = 500 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3 : Intrauterine GDM eksponering endrer ECFC nettverk formasjonen. Bilder av ECFC nettverk formasjon ble fanget i 15 min intervaller på 15 h av fase kontrast mikroskopi. Representant fase kontrast bilder på 5 h trinn, starter ved plating (0,5 h), vises for Høgskolen og tre GDM eksempler. Fase kontrast bilder ble tatt ved hjelp av en 10 X-målet. Skala bar = 500 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4 : ECFCs utsatt for intrauterine GDM utstillingen endret nettverk formasjon kinetics. ECFCs ble Hentet fra en ukomplisert graviditet (UC, svart) og tre graviditeter komplisert av gestational diabetes mellitus (GDM 1-3, rød). Fase kontrast bilder ble tatt på 15 min intervaller for 15 h. kinetisk analyse av Vasculogenesis (KAV) programvare quantitated lukket nettverk, nettverksområder, avdelinger, noder og forholdet mellom grenene til noder. Dataene illustrert representerer gjennomsnittlig ± standardfeil av gjsnitt (SEM) av tre separate forsøk for hvert utvalg. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Video 1: Intrauterine GDM eksponering endrer kinetics ECFC nettverk formasjonen. Bilder av ECFC nettverk formasjon ble fanget i 15 min intervaller på 15 h av fase kontrast mikroskopi. Fase kontrast bilder vises for Høgskolen og tre GDM prøver over 15 h starter på 0,5 h. Baren skala representerer 500 µm. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Bilde	Totalt gren nettverk	Noder	Tremannsrom	Firemannsrom	Grener	Totalt gren lengde *	AVG gren lengde *	Avslaget til noden forholdet	Lukkede nettverk	Nettverk området **
1	382	290	278	11	943	47210	124	3.25	9	480214
2	284	345	337	8	940	50699	179	2.72	16	264469
3	205	376	366	9	910	55728	272	2,42	27	150621
4	162	422	407	15	947	59692	368	2,24	40	98713
5	132	454	441	12	967	61923	469	2.13	53	72951
6	122	435	419	14	907	62587	513	2.09	68	56948
7	88	429	411	17	852	63983	727	1,99	74	51429
8	68	451	437	13	874	63960	941	1,94	74	51780
9	93	437	417	18	905	60901	655	2.07	49	82919
10	126	511	487	24	1075	61981	492	2.1	37	116857
11	49	397	384	12	737	61823	1262	1.86	79	48805
12	81	376	364	10	751	56817	701	2	63	64431
13	98	509	482	26	1028	60799	620	2,02	44	98056
14	93	449	416	31	909	58282	627	2,02	45	94081
* avrundet til nærmeste mikron, ** avrundet til nærmeste mikron ^ 2

Tabell 1: Representant rådata fra en tenkelig studie for ett ECFC utvalg.

Discussion

KAV gjør evaluering av store datasett med flere tidspunkt
Tradisjonelt har kvantifisering av vasculogenesis i vitro besto av ett eller få tid punktet mål. Denne statiske tilnærmingen er rett og slett utilstrekkelig for opptak og kvantifisere en dynamisk og kompleks prosess. Derfor ble denne romanen metoden utviklet for å muliggjøre effektiv analyser av nettverket formasjon kinetics å få innsikt i potensielle molekylære mekanismer involvert i dynamiske prosessen med vasculogenesis. Effektivitet og automatisering er viktige komponenter i utviklingen av nye teknikker for å generere og analysere store mengder bildebehandling data. KAV ble utviklet spesielt for å analysere store bildestakker bestående av hundrevis av avbildninger for å redusere tid og arbeid må utlede biologisk meningsfull konklusjoner fra time-lapse datasett. Viktigst, KAV gjennomfører bildebehandling og data generasjon i løpet av sekunder for små (mindre enn 100 bilder) image stabler og minutter for større (større enn 100 bilder) bildestakker, noe som resulterer i uovertruffen effektivitet. I tillegg kan organisering av data i regneark ved tid og målte parametere rask generasjon av grafisk fremstilling og statistisk analyse.

Utfordringer i bruk av denne tilnærmingen
Selv om denne analysen inkluderer forbedringer både bildeopptak og analyse, kan noen utfordringer hindre vellykket implementering. De fire viktigste hindringene inkluderer fuktighet stabilitet, timing presisjonsnivå plating bildeopptak, programvare og maskinvare pålitelighet og håndtering av store datasett som er generert for hvert eksperiment. Stabil levende celle imaging over flere timer kan være utfordrende. Spesielt kreves passende og konsekvent luftfukting for bildebehandling kamrene. Angiogenese lysbilder brukes i denne analysen, som er utformet for parallelizing matrix-baserte angiogenese analyser. Deres lavt volum, ca 50 µL, gjør fordampning og kondensasjon betydelige hensyn for utvidet kultur forhold. For å bekjempe problemet eksperimentelle, er det nødvendig å bruke en inkubator som regulerer fuktighet. Imidlertid kan det også være nødvendig å utvide denne forskriften hvis overdreven tørking av tenkelig kammeret oppstår over tid. Vi fant at den enkleste måten å øke luftfuktigheten er å øke vann areal i kammeret. For å oppnå dette målet, våre protokollen foreslår følgende tre vannkilder: en andre kamret lysbilde fylt med vann, som er også der inkubator temperaturen er målt, vann i området rundt brønnene på lysbilder og fuktet filter papir eller kluter. Derimot oppstår kondens når temperaturen i rommet kjøler bunnen av lysbildet og fuktighet inne i kammeret kondenserer på lysbildene og brønnene. Denne komplikasjonen kan føre til en fortynning av cellen media og lensing effekt som forstyrrer kontrasten. I disse studiene, var kondens minimert gjennom anvendelse av oppvarmet luft (39-42 ° C) på bunnen av lysbildet.

En viktig vurdering for en time-lapse studier er konsistens mellom eksperiment initiering og bildebehandling. Tidspunktet for når bildebehandling starter er avgjørende for tolkning av nedstrøms hendelser. For å sikre timing presisjonen for denne analysen, bør tiden mellom første plating og første fotografert gang punktet være strengt kontrollert. I praksis, denne "død tid" kan minimeres, men enda viktigere, det må være konsekvent å tillate eksperimenter på ulike dager skal sammenlignes. For eksempel i denne protokollen forventer vi en død tid på ca 30 min. Dette kan ordnes ved nærhet av eksperimentelle forberedelse og tenkelig fasiliteter.

Hva kan virke som detaljer ved første øyekast er viktig for programvare, maskinvare stabilitet og databehandling. Programvare og tilknyttet maskinvaredrivere, nettverk og automatisert programvare oppdaterer alle påvirker stabiliteten i programvaren. Det er verdt å teste denne protokollen i en"tørr" til å identifisere flaskehalser og potensielle kilder til problemer i bildeopptak; for eksempel, sjekk for upålitelige levende celle oppsett, scenen, nedleggelse og kamera pålitelighet og institusjonelle teknologi informasjonsbehandling for automatiserte operativsystemet og programvareoppdateringer.

Behandling er en pågående bekymring for enhver tenkelig eksperiment som genererer hundrevis til tusenvis av bilder. Heldigvis sjekker kommersiell programvare ofte for plass før du starter et tenkelig eksperiment. Denne analysen omfatter imidlertid også etter fangst bildebehandling og analyse kan legge til harddisk plass byrden og forstyrre imaging eksperimenter, hvis plass er begrenset. Videre, sikkerheten og stabiliteten på datamaskinen er ikke garantert, selv med hardware løsninger som redundant array of identiske disker. Dermed er en data management strategi for å sikre plass på datamaskinens harddisker for pågående eksperimenter og en robust ekstern arkivering med en institusjonell arkivering ressurs, nødvendig.

Strategier for å maksimere bildekvaliteten
Selv om muligheten for KAV å skjelne nøyaktig ECFCs fra matrisen bakgrunnen er robust, er følsomheten til analysen avhengig av bildekvalitet. For eksempel hvis bildet har lav kontrast, vil programvaren oppdage cellen nettverk med mindre nøyaktighet (figur 2B). Kvaliteten på kontrasten påvirkes av flere faktorer, inkludert innstillingene for mikroskopet brukes for bildeopptak, lasting av matrix og celle suspensjon media under analysen utarbeidelse og vedlikehold av media nivåer i brønnene gjennom bildebehandling. For å optimalisere kontrast for disse analyser, ble mindre justeringer til fase ring justering i mikroskopet gjort for å forbedre kontrasten. I tillegg ble prøve forberedelse grundig testet for å sikre lik og konsekvent lasting. Hvis mengden av matrix og/eller medier inn i brønnene er under eller over optimal området, kan en menisk danne fører til endrede kontrast. Til slutt, på grunn av liten volumet av væske i brønnene er det avgjørende å opprettholde media nivåer ved å minimere fordampning og kondensasjon, som nevnt ovenfor. Samlet er analysen optimalisering kritisk til å generere bilder med høy kvalitet kontrast for analyse.

I tillegg til fase kontrast kvalitet, kan andre faktorer påvirke analysen resultater inkludert media forurensning, feil i matrise, og partikler eller rusk i matrise eller media. Forurensning er en fare for denne analysen siden det innebærer levende celle imaging over flere timer i en mikroskopi kammer. For å redusere risikoen for forurensing, lastes matrise og celle suspensjoner inn i lysbildet på sterilt hette. I tillegg er hver prøve vanligvis belagt i to og tre eksemplarer for et eksperiment for å minimere risikoen av data forlis på grunn av uforutsette problemer som rusk eller partikler confounding analysen.

Eksempel heterogenitet stasjoner trenger for økt analysen følsomhet
Heterogenitet har blitt observert og rapportert i tidligere studier av ECFCs utsatt for GDM¹³. Høy heterogene i celle-funksjonen i disse prøvene er spekulert for å skyldes flere faktorer, inkludert alvorlighetsgraden av mors sykdom, varighet av sykdom og lederstil brukes til å regulere blodsukkernivået. Viktigere, fanger denne analytiske tilnærmingen dynamisk utvalg av ECFC vasculogenesis, noe som gjør det mulig å identifisere fenotypiske forskjellene skyldes funksjonelle heterogenitet i prøver fra GDM svangerskap. Generelt kan bruk av primære pasientprøvene, som de som brukes i disse studiene, introdusere større variasjon i forhold til en celle linje. Som legges større vekt på translational studier som involverer flere primære dyr eller human prøvene med funksjonell variasjon, er analysen følsomhet viktig for deteksjon og avledning av biologisk meningsfull målinger og konklusjoner. Derfor generert utviklingen av tilnærminger som KAV vil øke mengden og kvaliteten på data av i vitro vasculogenesis og angiogenese analyser for å aktivere mer robust observasjoner og konklusjoner. Videre vil disse dataene lette fremtidige undersøkelse av underliggende molekylære mekanismer som bidrar til endrede ECFC vasculogenesis etter intrauterine GDM eksponering.

Fremtidige anvendelser av denne tilnærmingen
Selv om denne metoden ble brukt til å vurdere føtal ECFC vasculogenesis i vitro i disse studiene, er den potensielle anvendelser av denne tilnærmingen mange. Denne teknikken kan gjennomføres lett for å studere noen celle befolkningen som deltar i prosessene av vasculogenesis eller angiogenese. Spesielt det kan brukes å studere enkelt celle populasjoner, slik det ble demonstrert i denne studien, men det kan også brukes på co kultur systemer. I fremtiden, ville det være gunstig å utvide denne tilnærmingen utover todimensjonal i vitro analysen å vurdere tredimensjonale (3D) modeller. Selv om gjeldende versjon av KAV ville være utilstrekkelig for quantitating 3D bildeprodukter data, vil en lignende utformet time-lapse, multi parametrisk analytisk tilnærming for 3D eller i vivo modeller informere om observasjoner gjort i to-dimensjoner i vitro er representant for celle-funksjonen i en mer biologisk innstillingen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Tissue Culture Plates	Fisher	353003
15 mL conical tubes	Fisher	1495949B
Angiogenesis 15-well micro-slides	Ibidi	81506
Matrigel	Fisher (Corning)	354234
EGM2 Medium	Lonza	CC3162
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11550
PSA Antimyocytic, Antibiotic	Fisher	MT30004C1	Added 5 mL per 500 mL bottle of EGM2 medium.
0.5% Trypsin/0.53 nM EDTA in HBSS	Fisher (Corning)	MT25052CI
Type 1 Collagen	Fisher (Corning)	354226	100 mg of liquid, concentration range 3-4 mg/mL. Dilute in 20 nM acetic acid in ddH2O to use at a final concentration of 0.05 mg/mL.
Glacial Acetic Acid	Fisher	A38-212	Used in Type 1 Collagen solution at a final concentration of 20 nM.
Kim Wipes	Fisher	06-666
Chambered slide	Ibidi	80296	This slide can be filled with distilled water to maintain humidity in the imaging chamber.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher (Gibco)	20012027	1x solution, pH 7.2
Microscope	Nikon Instruments	MEA53100 and MEF55030	Motorized TiE including Ph1 phase ring for phase contrast with objective
Stage	Prior Instruments	ProScan II	Other OKOlab and Nikon Elements AR compatible stage may be used
Objective	Nikon Instruments	93178	CFI Plan Fluor DL 10X
Camera	Hamamatsu	C11440-42U	ORCA Flash 4.0LT
Stage Blower	Precision Controls	N/A	This item has been discontinued, alternatives include Smart Air-Therm Heater(AIRTHERM-SMT-1W) from World Precision Instruments
Stage-top Incubator	OKOLabs	H301	BoldLine including a two position slide holder
Computer	Hewlett-Packard	Z620 or equivalent	4 core Intel Xeon processor, >32 GB RAM, >2 TB RAID 10, nVidia Quadro graphics card
Nikon Elements Software	Nikon Instruments	AR v 4.20	ND Acquisition is a multidimensional setup tool used to configure Elements software.
FIJI (ImageJ) Software	N/A	N/A	Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://imagej.net/Fiji/Downloads
KAV Plug-In	N/A	N/A	Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://github.com/icbm-iupui/kinetic-analysis-vasculogenesis