Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

הערכה שיטתית של רווחה בעכברים להליכי באמצעות הרדמה כללית

Published: March 20, 2018 doi: 10.3791/57046
Automatic Translation
1,2, 2,3, 2, 4, 2, 1
1Institute of Animal Welfare, Animal Behavior and Laboratory Animal Science, Department of Veterinary Medicine, Freie Universität Berlin, 2Institute of Pharmacology and Toxicology, Department of Veterinary Medicine, Freie Universität Berlin, 3German Federal Institute for Risk Assessment (BfR), 4Unit of Physiology, Pathophysiology and Experimental Endocrinology, Department of Biomedical Sciences, University of Veterinary Medicine

Summary

פיתחנו פרוטוקול כדי להעריך רווחה בעכברים במהלך הליכי באמצעות הרדמה כללית. סדרה של פרמטרים התנהגותית המציינת רמות של רווחה וכן glucocorticoid מטבוליטים נותחו. הפרוטוקול יכול לשמש כסיוע כללי כדי להעריך את מידת חומרת בצורה מדעית, מהחי.

Abstract

תוך שמירה 3R עקרון (החלפת, צמצום, עידון) שפותחה על ידי ראסל ברץ, המחקר המדעי יש להשתמש חלופות לניסויים בבעלי חיים במידת האפשר. כאשר אין כל חלופה לניסויים בבעלי-חיים, המספר הכולל של חיות מעבדה המשמש צריך להיות מינימום צריכה להשיג נתונים יקרי ערך. יתר על כן, צריך להיות מיושם באמצעים המתאימים עידון כדי למזער את הכאב, הסבל, מצוקה ליווי בהליך ניסיוני. קטגוריות המשמשות לסיווג מידת כאב, סבל ומצוקה הם ללא שחזור, קלה, מתונה או חמורה (להנחיית האיחוד האירופי 2010/63). כדי לקבוע אילו קטגוריות, להחיל במקרים בודדים, חשוב להשתמש בכלים מבחינה מדעית.

פרוטוקול היטב-being-ההערכה המובאת כאן מיועד הליכים שבמהלכה משמש הרדמה כללית. הפרוטוקול מתמקד הביתה כלוב התנהגויות פעילות, סולם גרימיס העכבר ו יוקרה כגון ומחילות הקן בונים התנהגות כמו אינדיקטורים של רווחה. היא משתמשת גם הפרדיגמה גישוש חינם להתנהגות הקשורות חרדת תכונה. מטבוליטים corticosterone צואה כמו אינדיקטורים כהתקפת נמדדים על התקופה שלאחר הרדמה 24 שעות ביממה.

הפרוטוקול מספק מידע מדעי מוצק על מצבם של עכברים בעקבות הרדמה כללית. בשל פשטותו, הפרוטוקול יכול בקלות להיות מותאם, משולב במחקר המתוכנן. אמנם הוא אינו מספק סולם לסיווג מצוקה בקטגוריות בהתאם להנחיית האיחוד האירופי 2010/63, זה יכול לעזור לחוקרים להעריך את מידת החומרה של הליך שימוש בנתונים מבחינה מדעית. הוא מספק דרך לשפר את ההערכה של רווחה בצורה מדעית, מהחי.

Introduction

האיחוד האירופי דירקטיבה 2010/631 קובע כי העיקרון 3R (החלפת, הפחתה, עידון) שפותחה על ידי ראסל ו ברץ2 הוא להיות מיושם בכל פעם ניסויים בבעלי חיים הכרחי. מטרתה העיקרית של ההנחיה של האיחוד האירופי כדי לשלב את כל ניסויים בבעלי חיים, אבל ההנחיה מודה, לעת עתה, ניסויים בבעלי חיים יש עדיין צורך לערוך מחקר שיכול להגן על בריאות האדם ושל בעלי החיים. לפיכך, אם ניסוי בבעלי חיים לא יכול להיות מוחלף על ידי כל שיטה חלופית, רק את המספר המינימלי של חיות מעבדה היא לשמש כדי להשיג תוצאות אמינות. בנוסף, הסכום של כאב, סבל ומצוקה המלווה בצרות צריך להיות ממוזער באמצעות אמצעים עידון המתאים. האיחוד האירופי דירקטיבה 2010/63 קובע כי חומרת הליך חייב להיות פרוספקטיבי מסווגים ללא שחזור, קלה, מתונה או חמורה1. כמו סיווג חומרת הוחלט על בסיס מקרה מקרה חשוב יש כלי מבחינה מדעית כדי להעריך את חומרת הליך נתון.

גליונות ניקוד כפי שהוצע על ידי מורטון ו גריפית3 הן כלי חיוני באיתור כל לחריגות מצב נורמלי, כולל השפעות שליליות על רווחה4. גליונות ניקוד משמשות לקביעת retrospectively כאב, סבל, ואת המצוקה הנגרמת על ידי ניסוי ולהתמקד השינויים גלויים במצב הפיזי לחיה הבודדת (למשל, משקל הגוף, פרווה, בהליכה). למרות, נספח השמיני של להנחיית האיחוד האירופי 2010/63 מספק דוגמאות של כל קטגוריית חומרה, החוקרים עדיין חוסר כלים להעריך את מידת החומרה של הליך נתון באמצעות מדעית מבוססת נתונים.

בהעדר אינדיקטורים מציג שלילית רווחתם היא לא הדרך היחידה כדי לקבוע את המצב של החיה; הנוכחות של אינדיקטורים הצבעה על רווחה חיובי הוא גם חשוב5,-6,-7,-8. לדוגמה, חיות להציג יוקרה התנהגויות כמו ומחילות, מקננים בניין התנהגות רק כאשר מתקיימים כל צרכיהם החיוניים. אם רווחה מופחת, התנהגויות יוקרה הם הראשונים לרדת5,7. פרוטוקולים כדי לשמש בהערכת well-being צריך לכלול אינדיקטורים המצביעים פיזית, פיזיולוגית ביוכימית, מצבים פסיכולוגיים של בעלי חיים על מנת להעריך את רווחתם באופן מפורט ומקיף9.

בתוך ההקשר של עידון, פרוטוקול פותחה כדי לעמוד בדרישות אלה, כדי להעריך את ההשפעות של הליך מעורבים הרדמה כללית על שלומם של עכברים10. באותו הזמן, המטרה היא למזער את כל הלחץ נוספים כדי לאפשר את שילוב קל של הפרוטוקול ניסוי נתון. הפרוטוקול מתייחס ומחילות התנהגות הביתה כלוב התנהגות כגון פעילות, צריכת המזון, קינון, התנהגות הקשורות חרדת תכונה. בנוסף, הוא כולל קנה מידה גרימיס העכבר (תאסוף אותם), וניתוח פולשני של מטבוליטים corticosterone בצואה. הפרוטוקול נועד להקל את ההערכה של רווחה בצורה מדעית מהחי כדי לספק מידע על רווחה התומך את הסיווג של מידת חומרתה. בנוסף גליונות ניקוד, זה יכול לספק מידע שימושי עבור הסיווג חומרתה של פרוצדורה. הפרוטוקול קל לבצע, לא דורשת ציוד מקיף, אותו ניתן לשלב ניסוי מתמשך מבלי להשפיע על התוצאות של מחקר. יש לציין כי המחקר בעל חיים: דיווח ב- Vivo ניסויים (יגיעו) מנחה11 הוא להיות נצפתה ב כל מחקרים שכללו ניסויים בבעלי חיים, עם המטרה של שיפור עיצוב, ניתוח ודיווח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

המחקר בוצע על פי הנחיות השכיבו על ידי חוק רווחת בעלי חיים גרמנית, אושרה על-ידי הרשות מדינת ברלין ("Landesamt לדנציג Gesundheit und Soziales", מספר רישיון: G0053/15).

הערה: המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היה לחקור את השפעת ההרדמה חוזרות ונשנות על מטבוליטים glucocorticoid. חישוב גודל המדגם בוצע כדי לקבוע את המספר של בעלי חיים כדי לשמש: n ≥ 2 × (s/ממוצע1- ממוצע2)2 × (zα + zβ)2. ממוצע1- ממוצע2 הוא ההפרש בין ממוצעי אוכלוסיה בחברת החשמל אשר דוגמת גודל החישובים נעשים (α = 5%, β = 80%); zα = 1.96 ו- zβ = 0.84 הן quantiles של ההתפלגות הנורמלית הסטנדרטית. איור 1 מדגימה קו הזמן של פרוטוקול זה. אם פרמטר של הפרוטוקול מראה הבדל עם רמת שליטה, בעל החיים צריך לפקח מקרוב, יש למדוד את הפרמטר שוב לאחר תקופה מתאימה. לדוגמה, אם תכונה התנהגות הקשורות חרדה מוגברת, התנהגות זו צריך להיבדק שוב כעבור שבוע, כדי לעזור לקבוע את התקופה עד החלמה מלאה. עת נקודות ותקופות חנומ פרוטוקול זה ניתן להתאים לשימוש עם הליכים אחרים. בעת שינוי נקודות זמן, יש לשמור habituation תקופות כמפורט בפרוטוקול. על מנת להפחית גורמים אשר עשויים להשפיע על ההתנהגות של העכברים, בדיקות הדורשות מניפולציה יותר וצריך להתנהל לאחר בדיקות. נא לא להפריע את ההתנהגות הרגילה של עכברים. איור 2 מסכמת כל הבדיקות של הפרוטוקול באמצעות גיליון סיכום הניקוד. איור 3 מספק סולמות מפושטת של הציון של רווחה, אשר נותן סקירה של כיצד לפרש את תוצאות הבדיקה.

1. הרגלה עכברים טיפול על ידי הנסיין

  1. לאפשר עכברים habituate למתקן בעלי חיים לפחות 2 שבועות לאחר שהם הושגו מן המתקן או ספק אחר.
  2. בית עכברים בקבוצות ולתחזק אותם בתנאים סטנדרטיים (בטמפרטורת החדר 22 ± 2 ° C; לחות יחסית 55 10% ±) על מחזור אור: האפל של 12:12 h.
  3. לספק כל הקבוצות nestlets המנהרה וכותנה כמו העשרה רגיל, ו לספק מזון ומים ad libitum.
  4. Habituate עכברים כל המנהרה ו/או גביע טיפול לפחות שבוע לפני בדיקות12.
    הערה: אוסף עכברים בזנב יכול לגרום מתח או חרדה, אשר בתורו משפיע על רווחה, יש גם השפעה על התוצאות של זה פרוטוקול12.

2. הכנת החדר בדיקה התנהגותית, מנגנוני

הערה: מספקים חדר נפרד לבדיקה, במיקום אידיאלי ליד חדר שבהם נשמרים החיות. תחבורה העכברים בכלובים שלהם הביתה מינימום מקום לפחות 60 בדיקה לפני ההליך מתנהל. במידת האפשר, לנהל את כל הבדיקות של פרוטוקול זה באותו חדר בדיקות שבו מתבצע ההליך.

  1. הכינו את הכלוב תצפית לבחון את התנהגות ומחילות8 , לקחת את התמונות לשימוש המקלעים13 (איור 4).
    1. להשתמש בתיבת זכוכית עם שטח של 220 מ מ × 290 מ מ, בגובה של 390 מ מ.
    2. מכסים את הרצפה של תיבה זו עם 0.5 ס מ של מצעים חומר.
    3. פיזור קומץ של מצעים בשימוש חומר מן הכלוב הביתה על גבי החומר מצעים חדשים להפחתת המצוקה הנגרמת על ידי הסביבה החדשה.
    4. לספק מזון, מאותו סוג זה מסופק בדרך כלל כמו דיאטה, ואת המים.
      הערה: אם אפשרי, להשתמש בקבוקי מים, כי עכברים עשויים למלא קעריות מים עם מצעים חומר.
  2. להכין כלוב (סוג III: 420 מ"מ × 260 מ"מ × 150 מ מ) לתקופה השגחה 24 שעות ביממה, אשר עכברים שוכנים בנפרד (איור 5).
    הערה: על מנת לצמצם את המשך למגורים נפרדים, לאסוף נתונים עבור קן בניית התנהגות, פעילות הביתה כלוב, צריכת המזון של מטבוליטים corticosterone צואה (FCM) בתקופה זו.
    1. מקום חדש מצעים חומר הכלוב (כ 0.5 ס מ עמוקה) ואת פיזור קומץ של מצעים בשימוש חומר ללא צואה מן הכלוב בבית על החומר החדש, על מנת להפחית מצוקה.
    2. לספק nestlet כותנה מרובע מתוקננת של משקל מוגדר, העשרה סביבתית היחיד (ראו טבלה של חומרים)14.
      הערה: nestlets מסחרי שאולי נבדלים במשקל. לכן, אנו ששינה את נטל nestlet מתוארת על ידי דיקון, להשתמש 2.0 g במקום 2.7 גרם14.
    3. הר חיישן אינפרה אדום על גג הכלוב, בעת שימוש בחיישני אינפרא אדום למדידת פעילות כלוב הביתה (ראה טבלה של חומרים).
    4. לספק מזון, מאותו סוג זה מסופק בדרך כלל כמו דיאטה, ומים ad libitum.

3. העכבר גרימיס סולם

הערה: צילומים עבור תאסוף אותם נלקחים בכלא של התבוננות בשלוש נקודות זמן: (i) יומיים לפני ההליך רמות המקלעים הבסיס הרשומה, (ii) 30 דקות לאחר ההליך ו- (iii) 150 דקות לאחר ההליך. כאשר רווחה לקוי, להגביר את הציונים תאסוף אותם. אם הציונים המקלעים מוגברת עדיין שנצפו לאחר מינימום 150, לקחת תמונות נוספות בשלב מאוחר יותר.

  1. השתמש מצלמה באיכות high-definition לצילום.
  2. בעדינות להעביר את העכבר לתוך הכלוב תצפית ולאפשר את העכבר כדי habituate את הסביבה החדשה במשך לפחות 30 דקות.
  3. לקחת ללא הרף על 30-40 צילומים על כל הזמן הצבע בתוך 1-2 דקות.
  4. למיין את כל התמונות על-ידי בחירת התצלומים פרונטלית או צדדיים חדה ומחיקת תמונות מטושטשות או תצלומים המציגים העכבר פרצופים מזוויות אחרות מאשר תצוגה חזיתית או צדדיים.
  5. באופן אקראי, בחר תמונה אחת מנקודה כל הזמן, (דהיינו יומיים לפני הליך 30 דקות לאחר ההליך, 150 דקות לאחר ההליך) עבור כל עכבר.
  6. לחתוך את התמונות כדי להציג רק את הראש של העכבר כך תנוחת הגופה אינה גלויה13.
  7. צור קובץ גיליון אלקטרוני עם גיליון אחד עבור כל התמונה ולהוסיף טבלה כולל חמש יחידות פעולה פנים תאסוף אותם לכל אחד מהגליונות.
    הערה: הקובץ מכיל תמונות בסיסית, כמו גם הליך פוסט תמונות.
  8. אקראי מסדר הסדינים.
  9. להציג את הקובץ על גבי מסך מחשב שלוש ישויות עצמאיות, שהוכשרו בעבר כדי להשתמש תאסוף אותם שפותחה על ידי לנגפורד. et al. ויש להם ציון היחידות פעולה פנים באמצעות 3-נקודת-סרגל (0 = לא להציג, 1 = בינוני להציג, 2 = ברור קיים).
    הערה: הבקיע מבוסס על בעקבות פרמטרים13: מסלולית הידוק ("הצטמצמות של האזור-מסלולית, עם העפעף סגורים היטב או לסחוט את העין"); הבליטה את האף ("מעוגלים הרחבה של העור גלוי על גשר האף"); בליטה בלחי ("קמורה המראה של שריר הלחי"); תפקיד האוזן ("אוזניים הוציא לגזרים, חזרה מן העמדה הבסיסית שלהם או הכוללים רכסים אנכי טופס זה בשל טיפים של האוזניים נמשך אחורה"); שינוי משערה ("תנועת שפם מקו שלהם למקם גם אחורה, כנגד הפנים או קדימה, כאילו עומדים על קצה; . שפם עשוי גם להתאחד").
  10. לנתח ציונים, כדלקמן (מקורי לנגפורד. et al. 13).
    1. ממוצע כל פעולה פנים היחידות עבור כל התמונה כדי ליצור את הציון MGS.
      הערה: אם אחד של יחידות פעולה פנים יכול להיות מנוקדות, ממוצע היחידות פעולה פנים הנותרים.
    2. הפחת הממוצע עבור התמונות בסיסית מן הממוצע לקבלת ההליך פוסט תמונות לקבל ניקוד ההבדל המקלעים עבור כל עכבר.
    3. הבדיקה לגבי הבדלים את התוצאות ההבדל המקלעים האנשים (nonparametric לבדיקת דגימות קשורים).
      הערה: אם יש הבדל משמעותי (p < 0.05), לקבוע הציונים של כל התמונות או רק עשרות כמה תצלומים שונים בין האנשים. אם האחרון נכון, חזור על הניקוד של תמונות אלו. אחרת, האנשים צריך לחזור על ההכשרה המקלעים והם שוב ואז זוכים הצילומים.
    4. ממוצע הציונים ההבדל המקלעים להשיג scorers שונה עבור כל עכבר, אם התוצאות של כל אדם לא שונות באופן משמעותי.
    5. השתמש מבחן סטטיסטי nonparametric כדי להשוות בין הציונים ההבדל המקלעים בממוצע בין קבוצות המחקר.

4. מתחפרים התנהגות8,15,16

  1. להכין את בורוז על-ידי הצבת 140 ± 2 g באוכל שלהן בדרך כלל שסופק כמו דיאטה רגילה אטום מים בקבוק פלסטיק (250 מ ל, 150 מ מ אורך, בקוטר 55 מ מ, 45 מ מ בקוטר של צוואר בקבוק)8.
    הערה: עכברים מעדיפים צינורות רחב, בורוז בקוטר של 68 מ מ יכול לשמש כפי שתואר על ידי דיקון16.
  2. מקום למחילה מלאה באוכל שלהן בכלוב בבית 5 ימים לפני ההליך עבור הסתגלות.
    הערה: יחידת לחילוק מזון רגיל בתוך הכלוב צריך לא תתרוקן אך גם תישאר מלא באוכל שלהן, עכברים משמשים את זה.
  3. לבצע את הבדיקה פעמיים, יומיים לפני ההליך (בסיסית); לבצע את האחרון 30 דקות פוסט ההליך גם כן.
    1. תן את העכבר habituate במשך לפחות 30 דקות לכלוב התבוננות היכן צולמו תמונות עבור תאסוף אותם.
    2. המקום שהיה בבקבוק פלסטיק מלאים באוכל שלהן מקבילה לקיר האחורי של הכלוב תצפית.
    3. שוקלים באוכל שלהן (g) שנותרו למחילה לאחר 2 h.
  4. לחשב את המשקל של כדורי מזון יוסר למחילה על ידי עכברים יחסי המשקל ההתחלתי (%).

5. 24 שעות ביממה תקופה התבוננות

הערה: עכברים שוכנות בנפרד, כמתואר ב- 2.2. (איור 5), במשך תקופה של 24 שעות ביממה, על מנת למדוד את המזון צריכת, פעילות הביתה כלוב, מקננים בניין התנהגות, ורמות FCM. התצפית 24 שעות ביממה מתקיים פעמיים: (i) 2 ימים לפני ההליך עבור רמות הבסיס, (ii) ביום של ההליך.

  1. צריכת המזון
    1. שוקלים העכברים במרווחי זמן קבועים (למשל 2 ימים לפני הרדמה, מיד לפני הרדמה, יומיים לאחר הרדמה ושבועית לאחר הרדמה), על מנת להעריך שינויים במשקל הגוף (חלק הגיליון ניקוד).
      הערה: משקל הגוף נדרש כדי לחשב את צריכת המזון לגרם של משקל הגוף. ניתן גם למדוד צריכת מים במהלך התקופה השגחה 24 שעות ביממה. אם צריכת מזון מופחת, רווחה עשוי להיות לקוי.
    2. לקבוע את המשקל ההתחלתי של דיאטה מזון רגיל (גרם) הניתנים יחידת המזון של הכלוב (כ 100 גרם).
    3. לקבוע את המשקל של מזון רגיל בסוף התקופה השגחה 24 שעות ביממה.
    4. סריקה בצד הכלוב מתחת יחידת המזון בקפידה עבור מזון זליגת ולהוסיף כל כדורי עוד אוכל למצוא את המשקל של כדורי מזון שנותרו יחידת המזון.
    5. חישוב צריכת המזון לכל יחידת משקל הגוף.
  2. פעילות כלוב הביתה
    הערה: ההוראות הבאות מתייחסות לשימוש חיישן אינפרא-אדום (ראה טבלה של חומרים), אבל גם יכול להיות מוערך הביתה כלוב פעילות עם תוכניות חלופיות. חריגה של הכלוב הביתה פעילות של רמות שליטה (למשל hypoactivity, היפראקטיביות) עשוי להיות סימן של רווחה לקוי.
    1. הפעלת התוכנית.
    2. לבחור מרווח דגימה של 1 דקות והשעה של רכישה של 24 שעות, כלומר דחפים נרשמים כל דקה במשך 24 שעות ביממה.
      הערה: אם הנסיין נכנס לחדר מספר פעמים לאחר ההקלטה, להשתמש רק נתונים מכל התקופות, כאשר עכברים היו לא מופרע (דהיינו במהלך תקופת כהה).
    3. לסכם 10 דקות במרווחים של דחפים.
    4. לחשב את השטח מתחת העקומה זמן (דחפים × דקות).
  3. התנהגות לבניין הקן
    הערה: קינים מורכבים ולא גבוהה יכול לשמש כמחוון של רווחה.
    1. המקום של nestlet כותנה מרובע (ראה טבלה של חומרים) עם משקל מוגדר (למשל 2.0 g) באמצע הכלוב.
    2. ציון הקן בסולם 5-נקודה (ראו להלן) על פי דיקון14 למחרת בבוקר, בערך שעתיים אחרי נדלקת. שוקלים את כל חתיכות untorn nestlet כי הם לפחות 5% ממשקל nestlet הראשונית. ציון קינים כדלקמן14
      1. להקצות ניקוד של "1" אם 90% nestlet שלמות.
      2. להקצות ציון של "2" אם זה 50-90% ללא פגע.
      3. להקצות ניקוד "3" אם 50-90% nestlet משופשף.
      4. להקצות ניקוד "4" אם למעלה מ-90% משופשף אבל הקן הוא שטוח, פחות מ 50% של היקף שלו הוא גבוה יותר מאשר גובה גוף העכבר כאשר מקופלת.
      5. להקצות ניקוד "5" אם יותר מ 90% nestlet משופשף, קן גבוה, יותר מ 50% של היקף שלו הוא גבוה יותר מאשר הגוף בגובה של עכבר מכורבלת.
  4. מטבוליטים Corticosterone צואה
    הערה: עליות של FCM מעל רמת שליטה לשקף רמות הלחץ חריפה על התקופה postanesthetic 24 שעות ביממה.
    1. לאסוף את כל כדורי צואה יבשה מן הכלוב באמצעות מלקחיים בסוף התקופה השגחה 24 שעות ביממה, לחסל את כדורי רטוב מזוהם עם השתן.
    2. תמצית FCM לפי Palme. et al. 17, כפי שמוצג להלן.
      1. דגימות צואה יבשה בטמפרטורה של 60-70 מעלות צלזיוס.
      2. Homogenize דגימות צואה באמצעות מרגמה.
      3. לרעוד aliquot של 0.05 g עם 1 מ"ל של 80% מתנול שפופרת צנטרפוגה במשך 30 דקות על מערבולת מרובה.
      4. צנטריפוגה דגימות ב 2500 x g למשך 15 דקות.
      5. פיפטה 0.5 מ של תגובת שיקוע לתוך צינור צנטריפוגה אחר.
      6. לאחסן דגימות צואה (ותמציות) לכל הפחות-18 ° c
      7. לנתח את כרטיס FCM באמצעות האנזים 5α-pregnane-3b,11b,21-triol-20-one מתכלה (EIA)18,19 או אחר EIA מאומתים באופן מלא.
    3. לחשב את אחוז השינוי של ריכוזים FCM ביחס הריכוזים FCM בסיסית.

6. חינם הפרדיגמה גישוש

  1. ניקח את הכלוב הביתה מחוץ לארון התקשורת והנח אותו על משטח השולחן בסוף התקופה השגחה 24 שעות ביממה.
  2. מניחים מלמעלה כלוב gridded (ללא מזון או בקבוקי מים) בכלוב בזווית של 45 מעלות לצד יותר של הכלוב.
    הערה: לא מחריבים את הקן, אשר משמש כמקום מסתור אחר העכבר, אך המקום העליון כלוב באלכסון מעל הקן.
  3. צג או וידאו-רשומה העכברים במשך 10 דקות ממרחק של-1.5 מ'.
    1. התחל את הטיימר.
    2. הערה כל הזמן כאשר העכבר מטפס על החלק העליון של הכלוב (עם ארבע רגליים למעלה כלוב) או משאיר את הכלוב העליון (עם הכפות אחת או יותר על רצפת הכלוב).
      הערה: בחלק מהעכברים עשויים לטפס לפסגה כלוב ולהשאיר אותה כדי להלך לאורך הקצה של הכלוב. עכברים האחורי גם על החלק העליון של הכלוב. רואים מקרים אלה העכברים היו עדיין על החלק העליון של הכלוב.
  4. הערכת פרמטרים בעקבות ברט. et al. 20.
    1. לנתח את השהיה כדי חקר הראשון (בשניות).
    2. נתח מספר החקירות.
    3. לנתח את משך הזמן (בשניות) של חקר.
      הערה: השהיה גבוהה חקר הראשון, מספר נמוך של החקירות של משך סך נמוך של חקר ניתן לציין רמות גבוהות יותר של חרדה תכונה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה פותח במקור כדי להעריך את שלומם של עכברים C57BL/6JRj בעקבות חוויה אחת של איזופלוריין הרדמה (מושב הרדמה 45-מין אחד, n = 13 נקבות) או הרדמה איזופלוריין חוזרות ונשנות (שישה 45-מין הרדמה פגישות עם 3-4 ימים בין ההפעלות הרדמה, n = 13 נקבות) לעומת לרווחתם של בקרת עכברים (n = 6 נקבות)10, אשר התקבל בלי הרדמה אלא נבדקו על פי האמצעים אותו. אנחנו העריכו את ההשפעה של חוויה יחידה של הרדמה איזופלוריין והרדמה איזופלוריין החוזרות ונשנות על מצבם של עכברים C57BL/6JRj לעומת שליטה שלא טופלו עכברים. כאן, התוצאות נציג של עכברים C57BL/6JRj הנשי, כולל חלק מהנתונים שפורסמו קודם לכן ב-. Hohlbaum et al. 10, כמו גם בעבר שלא פורסמו תוצאות, מוצגות.

ניתוח סטטיסטי

ניתוח נתונים לקטעים ובדיקות לנורמליות בוצעו עבור כל פרמטר. הבדלים בין קבוצות המחקר (כלומר שליטה, הרדמה איזופלוריין יחיד, חזר איזופלוריין הרדמה נותחו באמצעות הבדיקה המתאימה, כאמור האגדות איור. כאשר נתונים נפגשו הנחות התפלגות נורמלית, חד-כיווני אנובה בוצעה. Non-בדרך כלל נתונים מבוזרים נותחו באמצעות ההבדלים Kruskal-ווליס-כשהילדים נחשבו משמעותית ב p < 0.05.

ערכים של תוכנית בסיסית

ערכים של תוכנית בסיסית, שנאספו לפני ההליך מתבצעת, מכריעים לקבוע אם קבוצות הטיפול נבדלים הפרמטר בהתאמה. כפי שמתואר באיור 6, איור 7, איור 8, 9 איור , איור 10, רמות הבסיס של תאסוף אותם ניקוד (p = 0.762, Kruskal-ווליס-Test), יוקרה התנהגויות כמו ומחילות (p = 0.896, Kruskal-ווליס-Test), קינון (p = 0.723, Kruskal-ווליס-Test), צריכת המזון (p = 0.398, חד-כיווני אנובה), ופעילות כלוב הביתה (p = 0.208, Kruskal-ווליס-Test) לא שונים באופן משמעותי בין הקבוצות. יתר על כן, אין הבדלים משמעותיים בריכוזים FCM בסיסית נמצאו (חציון, בין רבעוני טווח בסוגריים מרובעים [ng/50 מ"ג]: שליטה: 123.01 (82.70-193.46); הרדמה יחיד: 118.31 (101.73-153.54); הרדמה חוזרות: 129.55 (92.58-139.48)) (p = 0.904, Kruskal-ווליס-Test). אם מתרחשים הבדלים ברמות בסיסית, ניתן לחשב ערכי דלתא.

העכבר גרימיס סולם

כאשר הציונים המקלעים רשע מושווים, ציונים גבוהים משמעותית לעומת הפקד נמצאו לאחר החוויה הרדמה (p = 0.001) ואחרי האחרון חזר על הרדמה הפעלה (p = 0.021) גרם ב 30 דקות לאחר שעבר הרדמה (איור 6A) . ב 150 דק ' לאחר הרדמה האחרון, כבר לא היו הבדלים בין הקבוצות (p = 0.910).

לקחת בחשבון את העובדה הבסיסית המקלעים ציונים הם לא שווה ל- 0 בכל המקרים, התוצאה ההבדל המקלעים מחושב, כמפורט בפרוטוקול. שני יחיד ניסיון של הרדמה (p = 0.002) חוזרות ונשנות הרדמה (p = 0.008) גדל ההבדל המקלעים הציונים לעומת הפקד בכל 30 דקות לאחר הרדמה. ב 150 דק ' לאחר ההרדמה האחרון, עכברים כל חזר לרמות שליטה (p = 0.617) (איור 6B)10.

התנהגות ומחילות

חזר על הרדמה הקטינה באופן משמעותי את אחוז המשקל של מזון גללים עכברים יוסר למחילה לעומת הפקד (p = 0.036, Kruksal-ווליס-Test) (איור 7)10.

התנהגות לבניין הקן

היו אין הבדלים משמעותיים הציונים קן בין חוויה יחידה של הרדמה, הרדמה חוזרות הפקד (p = 0.240, Kruksal-ווליס-Test) (איור 8)10.

צריכת המזון

ב- 1 יום לאחר ההרדמה האחרון, עכברים שעברו הרדמה חוזרות הראו באופן משמעותי מופחתת צריכת המזון לעומת עכברים חוותה הרדמה יחיד (p = 0.047, חד-כיווני אנובה). לעומת זאת, כעבור שבוע, עכברים שקיבלו חזר הרדמה נצרך באופן משמעותי יותר אוכל ממה פקדים (p = 0.012, חד-כיווני אנובה) או עכברים שקיבלו הרדמה של יחיד (p = 0.001, חד-כיווני אנובה) (איור 9)10.

פעילות כלוב הביתה

ב- 1 יום לאחר ההרדמה האחרון, פעילות הביתה כלוב במהלך תקופת כהה, שמציין את האזור תחת עקומת פעילות, לא משמעותית משתנים בין עכברים שקיבלו הרדמה יחיד, הרדמה חוזרות, או טיפול בקרה (p = 0.498, Kruskal-Wallis-Test) (איור 10)10.

הפרדיגמה גישוש חינם

כל העכברים חקר הכלוב העליון, כאשר הבדיקה בוצעה. עם זאת, יום אחד לאחר ההרדמה האחרון, עכברים שקיבלו חזר הרדמה (חציון, בין רבעוני טווח בסוגריים מרובעים [s]: 78.00 (55.00-89.00)) חקר העליון הכלוב באופן משמעותי בהמשך הזמן מאשר פקדים (31.00 (18.25-42.75); p = 0.009, Kruskal-Wallis-Test) בעכברים שקיבלו הרדמה יחיד (27.00 (21.00-45.50); p = 0.001, Kruskal-ווליס-Test), כפי שצוין בעבר פורסם10. שהמשך הכולל פרמטרים של חקר (איור 11 א) ואת מספר החקירות (איור 11B) הם מקביל ההשהיה כדי חקר הראשון. חזר על הרדמה הקטינה באופן משמעותי את מספר החקירות נגד שליטה (p = 0.023, Kruskal-ווליס-Test) וכן את משך הזמן הכולל של חקר (p = 0.032, Kruskal-ווליס-Test) לעומת הרדמה יחיד ב- 1 יום לאחר ההרדמה האחרון. ב- 8 ימים לאחר ההרדמה האחרון, כל הפרמטרים, כלומר השהיה כדי חקר הראשון (שליטה: 27.50 (13.50-47.25); הרדמה יחיד: 18.00 (9.50-38.50); הרדמה חוזרות: 20.00 (12.50-42.00); p = 0.722, Kruskal-ווליס-Test), מספר החקירות (p = 0.057), וסה כ משך חקר (p = 0.579), כבר לא שונה בין קבוצות המחקר (איור 11).

מטבוליטים corticosterone צואה

כדי לקחת בחשבון הערכים הבסיסיים שהושג, אחוז שינוי יחסית חושבה בסיסית, אין הבדלים משמעותיים בין הקבוצות נמצאו (p = 0.119, Kruskal-ווליס-Test) (איור 12)10.

Figure 1
איור 1 : ציר של פרוטוקול הזמן. שדות בצבע אפור ולבן מסמלים בחושך והדליקו תקופות של יום, בהתאמה. בהתאם לנוהל, פרוטוקול זה עשוי להיות מותאם. "Habituation למאורה" פירושו כי עכברים צריך להיות תוך כדי שימוש שהיה בבקבוק פלסטיק מאורת בכלוב בבית שלהם, לפני הבדיקה burrowing עשויים להתנהל. B, ערך בסיסית; FCM, מטבוליטים corticosterone צואה. דמות זו שונתה מ. Hohlbaum et al. 10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : סיכום גיליון הניקוד. גיליון זה כולל כל הבדיקות, ניתן למלא עבור כל עכבר בודדות. התאריך והשעה צריכים להתווסף כאשר הבדיקה מתבצעת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : סולמות של הציון של רווחה- מאזני נע בין "שהצ'י רווחה" (ירוק) "לקוי" (אדום) ועל אקספרס משמעות תוצאות הבדיקה באופן פשוט. בשלב זה של ידע ב מחוונים עבור well-being, נוכל הצהרה ברורה על הציון של רווחה עבור כל בדיקה, רק הצהרה כללית. המקלעים, העכבר גרימיס סולם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : התבוננות הכלוב. הכלוב הזה משמש את המבחן של נבירה התנהגות, לצלם כדי להיות מנותח בהתאם מידה גרימיס העכבר (המקלעים). החזית של הכלוב היא ברורה, בהתאם הצבעים פרווה של העכברים, שלושת הקירות. האחרים צריכים להיות צבעוני או שחור או לבן כדי ניגוד עם העכברים. הרצפה של תיבת זכוכית מכוסה כ 0.5 ס מ של חומר מצעים כולל מצעים בשימוש חומר הכלוב הביתה. תקן מזון ומים הינם מסופקים. במידת האפשר, בקבוקי מים במקום קערות אמור לשמש, כי עכברים עשויים למלא קעריות עם מצעים חומר. לאחר תקופה habituation לפחות 30 דקות, למחילה נוספת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 : תקופת השגחה 24 שעות ביממה. כדי להעריך את הקן בניית התנהגות, כלוב הביתה פעילות של צריכת המזון וכדי לאסוף דגימות צואה כדי למדוד את corticosterone צואה מטבוליטים (FCM), עכברים שוכנים בנפרד במשך 24 שעות ביממה (בכלוב סוג III: 420 מ"מ × 260 מ"מ × 150 מ"מ; מצע חומר כ 0.5 ס מ עמוקה עם שימוש מצעים חומר מן הכלוב הביתה מפוזרים על העליונה, nestlet כותנה, ברז מים ומזון רגיל דיאטה ad libitum). חיישן אינפרא-אדום, מותקן על גג הכלוב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6 : עכבר סולם גרימס (המקלעים). תיבת מייצג את טווח בין רבעוני (IQR), קצות התיבה של 25th ו 75 הרביעוןth . נכון לייצג ערכים אשר הם לא יותר מ 1.5 × IQR. הנקודות הם ליניאריים עם ערכים בין 1.5 – 3.0 × IQR. כוכביות צבעוניים הם ליניאריים עם ערכים הגדולים מ- 3.0 × IQR. (א) אומר המקלעים ניקוד. (B) מתכוון המקלעים הפרש ניקוד. ערכים p חושבו באמצעות Kruskal-ווליס-Test: * 0.05 < p; * * p < 0.01. כתוצאה מתקלה טכנית (מצלמה, קנה מידה), היו ארבעה עכברים בקבוצה הרדמה יחיד ייכללו הסטטיסטיקה. דמות זו שונתה מ. Hohlbaum et al. 10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7 : ומחילות התנהגות. תיבת מייצג את טווח בין רבעוני (IQR), קצות התיבה של 25th ו 75 הרביעוןth . נכון לייצג ערכים אשר הם לא יותר מ 1.5 × IQR. כוכביות צבעוניים הם ליניאריים עם ערכים הגדולים מ- 3.0 × IQR. ערכים p חושבו באמצעות Kruskal-ווליס-Test: * p < 0.05. כתוצאה מתקלה טכנית (מצלמה, קנה מידה), היו ארבעה עכברים בקבוצה הרדמה יחיד ייכללו ניתוח סטטיסטי. דמות זו שונתה מ. Hohlbaum et al. 10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 8
איור 8 : הקן בונים התנהגות. תיבת מייצג את טווח בין רבעוני (IQR), קצות התיבה של 25th ו 75 הרביעוןth . נכון לייצג ערכים אשר הם לא יותר מ 1.5 × IQR. הנקודות הם ליניאריים עם ערכים בין 1.5 – 3.0 × IQR. ערכים p חושבו באמצעות Kruskal-ווליס-מבחן; יום ד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 9
איור 9 : צריכת מזון. הנתונים הם הממוצע ± סטיית התקן. ערכים p חושבו באמצעות חד-כיווני אנובה (פוסט-הוק Tukey-HSD): * 0.05 < p; * * p < 0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 10
איור 10 : הביתה כלוב פעילות. תיבת מייצג את טווח בין רבעוני (IQR), קצות התיבה של 25th ו 75 הרביעוןth . נכון לייצג ערכים אשר הם לא יותר מ 1.5 × IQR. הנקודות הם ליניאריים עם ערכים בין 1.5 – 3.0 × IQR. ערכים p חושבו באמצעות Kruskal-ווליס-ילדי אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 11
איור 11 : הפרדיגמה גישוש בחינם. תיבת מייצג את טווח בין רבעוני (IQR), קצות התיבה של 25th ו 75 הרביעוןth . נכון לייצג ערכים אשר הם לא יותר מ 1.5 × IQR. הנקודות הם ליניאריים עם ערכים בין 1.5 – 3.0 × IQR. כוכביות צבעוניים הם ליניאריים עם ערכים הגדולים מ- 3.0 × IQR. (א) משך הזמן של חקר. (ב) מספר החקירות. ערכים p חושבו באמצעות Kruskal-ווליס-Test: * p < 0.05. דמות זו שונתה מ. Hohlbaum et al. 10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 12
איור 12 : צואה corticosterone מטבוליטים (FCM). תיבת מייצג את טווח בין רבעוני (IQR), קצות התיבה של 25th ו 75 הרביעוןth . נכון לייצג ערכים אשר הם לא יותר מ 1.5 × IQR. כוכביות צבעוניים הם ליניאריים עם ערכים הגדולים מ- 3.0 × IQR. רמות FCM נמדדו 2 ימים לפני ויום 1 לפרסם נוהל. השינוי באחוזים [%] של ריכוזים FCM יחסית ערך בסיסית בהתאמה חושבו. הנתונים נותחו באמצעות Kruskal-ווליס-ילדי אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול פותח במקור כדי להעריך את שלומם של C57BL/6JRj עכברים שקיבלו הרדמה יחיד או הרדמה איזופלוריין חוזרות ונשנות. התוצאות לאשר את הבדיקות של התנהגויות יוקרה, כמו גם אמצעים אחרים (למשל התבנית גישוש חינם, תאסוף אותם, צריכת המזון ומחילות) היו רגישים שיטות להערכת well-being. הרדמה איזופלוריין חוזרות נגרמת השפעות לטווח קצר על התנהגות הקשורות חרדת תכונה, המקלעים ו ומחילות התנהגות. יתר על כן, איזופלוריין חוזרות ונשנות הרדמה הופיע להשפיע על צריכת המזון10.

הפרדיגמה גישוש חינם שצוין מופחת התנהגות גישוש, כתוצאה מכך, רמות גבוהות יותר של חרדה תכונה בעכברים כי היו שוב ושוב מרדימים בהשוואה עם עכברים ומורדמת רק פעם אחת, את הפקדים. עם זאת, עכברים של כל קבוצות חקר את הכלוב gridded ראש10,20. כאשר חוקרים התנהגות הקשורות לחרדה, חשוב להבחין בין תכונה אחת ומדינה חרדה21,22. הצבת העכבר סביבה לא מוכרת גורם למצב חרדה. לעומת זאת, הפרדיגמה גישוש חינם מאפשרת החיות להישאר בכלובים בבית שלהם, לפיכך, חוקר לתכונת החרדה.

ההפחתה בהתנהגות גישוש בקרב עכברים לאחר הרדמה החוזרות ונשנות לא יכולה להיות מוסברת על ידי ירד פעילות מוטורית. כלוב הביתה פעילות במהלך תקופת כהה שונה משמעותית בין קבוצות המחקר. אפשרות זו מציינת כי עכברים כבר פיזית התאושש מההרדמה כאשר בוצעה הבדיקה חינם הפרדיגמה גישוש.

תאסוף אותם למעשה פותחה כדי להעריך את הכאב, אבל יש ראיות כי הבעות פנים גם שונו על ידי הלחץ ואת רגשות חיוביים13,23. תצלומיו של הפרצופים העכבר ציינו כי הן הרדמה איזופלוריין יחיד, חוזרות ונשנות מוגבר ציונים על תאסוף אותם מעל לטווח קצר בתקופה שלאחר הרדמה מיידית. התוצאה ההבדל המקלעים נשארו מתחת 1, רמת הסטרס הופיע מתון10. התוצאות מסכים עם התצפיות האחרונות של. מילר ואח 24 , 25 והראה כי עכברים חזר לשלוט ברמת מינימום 150 פוסט הרדמה10.

יוקרה התנהגויות כמו ומחילות הקן בונים התנהגות ספציפית, יכול לשמש מחוונים עבור רווחה7 ובריאות כללית טובה עכברים26. עכברים תציג רק התנהגויות יוקרה כאשר מתקיימים כל צרכיהם החיוניים. אם רווחה מופחת, התנהגויות יוקרה הם הראשונים להיות לקוי5,7. מחקרים קודמים הראו כי הן ומחילות ובניית הקן יכול להיות לקוי על ידי כאב ומצוקה6,8, אבל יש גם ראיות כי נגעים בהיפוקמפוס יכול להשפיע על אלה שתי התנהגויות15,27 , 28 , 29 , 30 , 31.

יוקרה התנהגויות נחקרו בתקופה שלאחר הרדמה מוקדם (ומחילות התנהגות) ועל -ידי בבוקר יום המחרת (הקן בונים התנהגות). המבחן עבור ומחילות התנהגות שפותחה על ידי דיקון. et al. , אומצה על ידי. Jirkof et al. שונה לגבי הסתגלות (קבוצת הדיור במקום למגורים נפרדים) ומשך המדידה התנהגותית (רק 2 שעות במקום 24 שעות ביממה) 8 , 15 , 16.

. זה ראוי לציון זה חוזר על עצמו בהרדמה מופחתת ומחילות התנהגות, רומז כי היה ליקוי של רווחה מיד פוסט הרדמה10, אשר נמסר על ידי. Jirkof et al. 8. אבל בבוקר יום המחרת, כאשר עכברים היו יותר זמן להתאושש מן ההרדמה, קינים גבוהים ומורכבים שהם בנו ציינו כי הם היו חווים רווחה10. ממצאים אלה נבדלים דוחות קודמים הבקיע קינים-זמן קודמות32. לכן, יתכן שימושי כדי להתאים את הפרוטוקול וציון קינים קודם בזמן. עם זאת, שעון ביולוגי של קן בניית התנהגות עדיין להביא בחשבון, כמו עכברים נוטים להכין את קיניהם בסוף שלב כהה32.

צריכת המזון שולית ירדו 1 יום לאחר הרדמה חוזרות, אך זה היה מוגבר שבוע לאחר מכן. כמו עכברים לא איבדת משקל הגוף (ראה Hohlbaum. et al. 10) סוג של מנגנון פיצוי שמתבצעים ולאחר ירידת ערך של רווחה לגבי צריכת המזון יכולה להיות מסווגת קלה10. צריכת המזון מספק תובנה מצוקה שלאחר הניתוח, רווחתם, התיאבון בעכברים, אשר יכול להיות לקוי על ידי בחילה לאחר הניתוח26 ו מתח לאחר הניתוח27.

FCM מציינים באופן אמין מתח עכברים33,34,35. הריכוזים FCM שיא בדרך כלל מתרחשים 8-10 שעות לאחר יותר מלחיץ אבל תלוי זמן מעבר במעי18. לכן, חשוב לעקוב גם אחר פעילות כלוב הביתה, כפי הכלול בפרוטוקול זה. בשל ההשפעה שעון ביולוגי על FCM מופרש18, רצוי לאסוף דגימות צואה על פני תקופה של 24 ה FCM ריכוזים משתקף כהתקפת על התקופה שלאחר הרדמה 24 שעות ביממה. כמו FCM רמות משתנות מאדם לאדם, מחושב אחוז השינוי של רמות FCM ביחס בסיסית. כרטיס FCM תוצאות החקירה נוכח ציינו כי לא חוויה אחת של הרדמה או הרדמה חוזרים ונשנים באופן משמעותי מוגבר היפותלמי-יותרת המוח-יותרת הכליה (HPA) ציר פעילות10.

בסך הכל, הממצאים גילו זה חוזר על עצמו איזופלוריין ההרדמה גרם מצוקה קלה לטווח קצר, ליקויי רווחה בתקופה postanesthetic מוקדם מעט יותר מאשר חוויה יחידה של הרדמה איזופלוריין10.

פרוטוקול כדי להעריך well-being צריך לכפות מצוקה נוספות על בעלי החיים. מגבלה של הפרוטוקול הנוכחי הוא כי הוא כולל דיור בודדות במהלך תקופת השגחה 24 שעות ביממה, אשר ידוע כדי להגדיל את רמות corticosterone פלזמה36. עם זאת, למגורים נפרדים יש צורך לאסוף נתונים חוקיים עבור לגבי פעילות הביתה כלוב, צריכת המזון, התנהגות בניית קן ו FCM רמות. משך הזמן של דיור בודדות היה ממוזער על ידי חוקרים אלה ארבעת הפרמטרים במקביל (דהיינו במהלך תקופת השגחה 24 שעות ביממה). כדי למנוע את התוצאות להיות מוטה על ידי למגורים נפרדים, בקרת עכברים עברה המבחנים זהים, התוצאות שלהם נלקחו בחשבון. אם שיטות זמינות למדוד את הפרמטרים האלו סביבה קבוצה-דיור, הם צריכים להיות בשימוש (למשלמערכת ממוכנת הביתה כלוב ניתוח עבור פעילות הביתה כלוב37 , צריכת המזון). עם זאת, מערכות ניתוח אוטומטיות כלוב בבית דורשים ציוד נוסף, אשר לא יהיו זמינים. ב לימודי התמקדות קבוצות של בעלי חיים במקום יחידים, כלוב הביתה פעילות, צריכת המזון, מקננים בניין התנהגות, גם ניתן להעריך FCM רמות עבור קבוצה של עכברים. אותו הדבר חל על הפרדיגמה גישוש חינם, המחייב רק העכברים בעליל תסומן כך שהם עשויים להיות מכובד. אם רווחה מופחת בקבוצה, כל העכברים בקבוצה שייבדקו בקפידה (באמצעות גיליון הניקוד של בדיקה קלינית) כדי לזהות את העכבר או עכברים מודאג. תצפיות נוספות ברמת הקבוצה נדרשים כדי לקבוע את רמת הרגישות של קבוצת ערכים.

לגבי עידון, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם, לשלב לימודי מתמשך לאמוד את ההשפעה של פרוצדורה מסוימת על מצבם של עכברים. בהתאם העיצוב בהליך של מחקר מסוים, יש לבחור את הבדיקות המתאימות ביותר של פרוטוקול זה. כאן, חופרת הקן בונים, בדיקה, המקלעים, הפרדיגמה גישוש חינם של מדידה של צריכת המזון הופיעו להיות מועיל במיוחד. כמו התנהגות של עכברים אחרי השעון הביולוגי38, מומלץ לבצע בדיקות התנהגותית בעכברים של כל הקבוצות בנקודת זמן מוגדרת. עכברים פעילים יותר בבוקר מאשר אחר הצהריים38. עם זאת, אם תכנון המחקר אינו מאפשר בדיקה בבוקר, ניתן לעשות את הבדיקה בזמן אחר. חשוב גם לוודא כי כל מבחן יחיד מתנהל באותן נקודות זמן עבור כל קבוצות. אחרת, השפעת הריתמוס הביולוגי של הפרמטרים יכול לגרום אינטרה - או הבדלים בין קבוצות. יתר על כן, בקרת עכברים ייכללו במסגרת המחקר, כך ניתן להשוות את התוצאות של עכברים התייחס ועכברים שליטה. בקרת עכברים חייב להיבדק בנקודת זמן זהה כמו עכברים התייחס. אם הפרוטוקול מראה שכי רווחה פגום, ההליך צריך להיות מעודן, וחזר בפרוטוקול. גישה זו יכולה להראות אם המאמצים כדי לחדד את ההליך היו יעילים.

בפרוטוקול הנוכחי יכול לשמש כסיוע כללי כדי להעריך את מידת הסיכון הנגרם על ידי פרוצדורה. לכן, הוא מסייע לסיווג חומרת הליך ברמה המדעית, חיה-ממורכז. עם זאת, הפרוטוקול אינו מספק סולם לסיווג פרוצדורה קלה, מתונה או חמורה. כדי לסווג את חומרת הליך, זה הכרחי להפנות הדוגמאות ב נספח השמיני של להנחיית האיחוד האירופי 2010/63.

לסיכום, בפרוטוקול הנוכחי תומך הערכה שיטתית של רווחה בעכברים בצורה מדעית, מהחי בעקבות הליכים שבמהלכה משמש הרדמה כללית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

תודה סבין ג'ייקובס על סיוע עם אוסף דגימה, אדית Klobetz-Rassam לניתוח של FCM, PD dr. וטרינר התיכון. הביל. Roswitha מרל על סיוע עם ניתוח סטטיסטי, Wiebke Gentner להגהת כתב היד. המחקר הוא חלק פלטפורמת מחקר ברלין-ברנדנבורג BB3R (www.bb3r.de), מומן על ידי הגרמני הפדרלי במשרד החינוך מחקר (להעניק את המספר: 031A262A) (www.bmbf.de/en/index.html).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isofluran CP-Pharma Handelsgesellschaft mbH 1214
InfraMot - Sensore Units TSE Systems 302015-SENS
InfraMot - Control Units TSE Systems 302015-C/16
InfraMot - Software TSE Systems 302015-S
Nestlet N Ancare - Plexx NES3600
Camera EOS 350D Canon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. 2010 EU. Directive 2010/63/EU. Official Journal of the European Union. , L276/33-L276/29 (2010).
  2. Russell, W. M. S., Burch, R. The principles of humane experimental technique. , London: Methuen. (1959).
  3. Morton, D. B., Griffiths, P. H. Guidelines on the recognition of pain, distress and discomfort in experimental animals and an hypothesis for assessment. Vet Rec. 116 (16), 431-436 (1985).
  4. Bugnon, P., Heimann, M., Thallmair, M. What the literature tells us about score sheet design. Lab Anim. 50 (6), 414-417 (2016).
  5. Boissy, A., et al. Assessment of positive emotions in animals to improve their welfare. Physiol Behav. 92 (3), 375-397 (2007).
  6. Arras, M., Rettich, A., Cinelli, P., Kasermann, H. P., Burki, K. Assessment of post-laparotomy pain in laboratory mice by telemetric recording of heart rate and heart rate variability. BMC Vet Res. 3, 16 (2007).
  7. Jirkof, P. Burrowing and nest building behavior as indicators of well-being in mice. J Neurosci Methods. 234, 139-146 (2014).
  8. Jirkof, P., et al. Burrowing behavior as an indicator of post-laparotomy pain in mice. Front Behav Neurosci. 4, 165 (2010).
  9. Hawkins, P., et al. A guide to defining and implementing protocols for the welfare assessment of laboratory animals: eleventh report of the BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement. Lab Anim. 45 (1), 1-13 (2011).
  10. Hohlbaum, K., Bert, B., Dietze, S., Palme, R., Fink, H., Thöne-Reineke, C. Severity classification of repeated isoflurane anesthesia in C57BL/6JRj mice-Assessing the degree of distress. PLoS ONE. 12 (6), e0179588 (2017).
  11. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 8 (6), e1000412 (2010).
  12. Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nat Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
  13. Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nat Methods. 7 (6), 447-449 (2010).
  14. Deacon, R. M. Assessing nest building in mice. Nat Protoc. 1 (3), 1117-1119 (2006).
  15. Deacon, R. M., Raley, J. M., Perry, V. H., Rawlins, J. N. Burrowing into prion disease. Neuroreport. 12 (9), 2053-2057 (2001).
  16. Deacon, R. M. Burrowing in rodents: a sensitive method for detecting behavioral dysfunction. Nat Protoc. 1 (1), 118-121 (2006).
  17. Palme, R., Touma, C., Arias, N., Dominchin, M. F., Lepschy, M. Steroid extraction: get the best out of faecal samples. Wien Tierarz Monats. 100 (9-10), 238-246 (2013).
  18. Touma, C., Palme, R., Sachser, N. Analyzing corticosterone metabolites in fecal samples of mice: a noninvasive technique to monitor stress hormones. Horm Behav. 45 (1), 10-22 (2004).
  19. Touma, C., Sachser, N., Mostl, E., Palme, R. Effects of sex and time of day on metabolism and excretion of corticosterone in urine and feces of mice. Gen Comp Endocrinol. 130 (3), 267-278 (2003).
  20. Bert, B., Schmidt, N., Voigt, J. P., Fink, H., Rex, A. Evaluation of cage leaving behaviour in rats as a free choice paradigm. J Pharmacol Toxicol Methods. 68 (2), 240-249 (2013).
  21. Lister, R. G. Ethologically-based animal models of anxiety disorders. Pharmacol Ther. 46 (3), 321-340 (1990).
  22. Belzung, C., Berton, F. Further pharmacological validation of the BALB/c neophobia in the free exploratory paradigm as an animal model of trait anxiety. Behav Pharmacol. 8 (6-7), 541-548 (1997).
  23. Finlayson, K., Lampe, J. F., Hintze, S., Wurbel, H., Melotti, L. Facial indicators of positive emotions in rats. PLoS ONE. 11 (11), e0166446 (2016).
  24. Miller, A., Kitson, G., Skalkoyannis, B., Leach, M. The effect of isoflurane anaesthesia and buprenorphine on the mouse grimace scale and behaviour in CBA and DBA/2 mice. Appl Anim Behav Sci. 172, 58-62 (2015).
  25. Miller, A. L., Golledge, H. D., Leach, M. C. The influence of isoflurane anaesthesia on the rat grimace scale. PLoS ONE. 11 (11), e0166652 (2016).
  26. Deacon, R. Assessing burrowing, nest construction, and hoarding in mice. J Vis Exp. (59), e2607 (2012).
  27. Felton, L. M., Cunningham, C., Rankine, E. L., Waters, S., Boche, D., Perry, V. H. MCP-1 and murine prion disease: separation of early behavioural dysfunction from overt clinical disease. Neurobiol Dis. 20 (2), 283-295 (2005).
  28. Deacon, R. M., Croucher, A., Rawlins, J. N. Hippocampal cytotoxic lesion effects on species-typical behaviours in mice. Behav Brain Res. 132 (2), 203-213 (2002).
  29. Filali, M., Lalonde, R., Rivest, S. Subchronic memantine administration on spatial learning, exploratory activity, and nest-building in an APP/PS1 mouse model of Alzheimer's disease. Neuropharmacology. 60 (6), 930-936 (2011).
  30. Guenther, K., Deacon, R. M., Perry, V. H., Rawlins, J. N. Early behavioural changes in scrapie-affected mice and the influence of dapsone. Eur J Neurosci. 14 (2), 401-409 (2001).
  31. Deacon, R. M., Reisel, D., Perry, V. H., Nicholas, J., Rawlins, P. Hippocampal scrapie infection impairs operant DRL performance in mice. Behav Brain Res. 157 (1), 99-105 (2005).
  32. Jirkof, P., et al. Assessment of postsurgical distress and pain in laboratory mice by nest complexity scoring. Lab Anim. 47 (3), 153-161 (2013).
  33. Atanasov, N. A., Sargent, J. L., Parmigiani, J. P., Palme, R., Diggs, H. E. Characterization of train-induced vibration and its effect on fecal corticosterone metabolites in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (6), 737-744 (2015).
  34. Voigt, C. C., et al. Hormonal stress response of laboratory mice to conventional and minimally invasive bleeding techniques. Anim Welf. 22 (4), 449-455 (2013).
  35. Walker, M. K., et al. A less stressful alternative to oral gavage for pharmacological and toxicological studies in mice. Toxicol Appl Pharmacol. 260 (1), 65-69 (2012).
  36. Miyashita, T., et al. Social stress increases biopyrrins, oxidative metabolites of bilirubin, in mouse urine. Biochem Biophys Res Commun. 349 (2), 775-780 (2006).
  37. Bains, R. S., et al. Analysis of individual mouse activity in group housed animals of different inbred strains using a novel automated home cage analysis system. Front Behav Neurosci. 10 (106), (2016).
  38. Saibaba, P., Sales, G. D., Stodulski, G., Hau, J. Behaviour of rats in their home cages: daytime variations and effects of routine husbandry procedures analysed by time sampling techniques. Lab Anim. 30 (1), 13-21 (1996).

Tags

התנהגות גיליון 133 רווחה רווחה מצוקה סיווג חומרת הערכת חומרת מטבוליטים glucocorticoid צואה עכברים עידון בדיקה התנהגותית התנהגות יוקרה 3R הרדמה העכבר גרימיס סולם
הערכה שיטתית של רווחה בעכברים להליכי באמצעות הרדמה כללית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hohlbaum, K., Bert, B., Dietze, S.,… More

Hohlbaum, K., Bert, B., Dietze, S., Palme, R., Fink, H., Thöne-Reineke, C. Systematic Assessment of Well-Being in Mice for Procedures Using General Anesthesia. J. Vis. Exp. (133), e57046, doi:10.3791/57046 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter