Un protocole simple à haut rendement pour l'isolement des îlettes pancréatiques des souris

Summary

Ce protocole d'isolement d'îlots a décrit une nouvelle voie d'injection de collagène pour digérer le tissu d'exocrine et une procédure simplifiée de gradient pour purifier les îlots des souris. Il s'agit de la digestion enzymatique, de la séparation/purification des gradients et de la cueillette manuelle des islets. L'isolement réussi peut donner 250-350 îlots de haute qualité et entièrement fonctionnels par souris.

Abstract

Les îlots pancréatiques, également appelés les îlots de Langerhans, sont un groupe de cellules endocriniennes qui produit des hormones pour la régulation du glucose et d'autres fonctions biologiques importantes. Les îlots se composent principalement de cinq types de cellules sécrétrices d'hormones : les cellules sécrètent le glucagon, les cellules sécrètent l'insuline, les cellules sécrètent la somatostatine, les cellules sécrètent la ghréline et les cellules PP sécrètent du polypeptide pancréatique. Soixante à 80 % des cellules des îlots sont des cellules d'A, qui sont la population cellulaire la plus importante pour étudier la sécrétion d'insuline. Les îlots pancréatiques sont un système modèle crucial pour étudier la sécrétion d'insuline ex vivo. L'acquisition d'îlots de haute qualité est d'une grande importance pour la recherche sur le diabète. La plupart des procédures d'isolement d'înet exigent techniquement difficile d'accéder au site de l'injection de collagène, des procédures dures et complexes de digestion, et des étapes multiples de purification de gradient de densité. Cet article comporte une méthode simple d'isolement d'îlet de souris à haut rendement avec des descriptions détaillées et des démonstrations réalistes, montrant les étapes spécifiques suivantes : 1) injection de collagène P à l'ampulla de Vater, une petite zone joignant le conduit pancréatique et le canal biliaire commun, 2) la digestion enzymatique et la séparation mécanique du pancréas exocrine, et 3) une seule étape de purification de gradient. Les avantages de cette méthode sont l'injection d'enzyme digestive en utilisant l'ampulla plus accessible de Vater, une digestion plus complète en utilisant la combinaison d'approches enzymatiques et mécaniques, et une étape de purification de gradient unique plus simple. Ce protocole produit environ 250 à 350 îlots par souris; et les îlots conviennent à diverses études ex vivo. Les mises en garde possibles de cette procédure sont des îlots potentiellement endommagés en raison de la digestion enzymatique et/ou de l'incubation prolongée de gradient, qui peuvent toutes être en grande partie évitées par la justification d'annonces soigneuses du temps d'incubation.

Introduction

Il y a deux méthodes communes dans la littérature pour l'isolement pancréatique d'îcle. Il faut l'exciser le pancréas et le découper en petits morceaux à l'aide de ciseaux chirurgicaux, puis le digérer dans une solution de collagène^1,2,3. Une autre méthode plus précise est d'utiliser le réseau de conduits présents dans le pancréas pour introduire l'enzyme digestive. Les sites suivants ont été utilisés pour l'injection d'enzymes digestives: la jonction de la bile et le conduit cystique, la vésicule biliaire dans le canal biliaire commun, ou le canal biliaire commun lui-même^1,4,5. On sait que les îlots ne sont pas répartis uniformément dans le pancréas; la région splénique contient le plus d'îlots⁶. Alors que la deuxième méthode utilisant des voies anatomiques pour délivrer des enzymes digestives permet une perfusion plus complète du pancréas, y compris la région splénique, cette procédure nécessite souvent le serrage ou la suture de l'ampulla de Vater qui est techniquement qui met au défi. En termes de purification des îlots, des gradients de densité multiples, ainsi que des passoires cellulaires et une rétraction magnétique ont été utilisés pour purifier les îlots^3,7. L'utilisation de ces gradients peut prendre du temps et les gradients Ficoll peuvent entraîner des dommages toxiques des îlots⁸.

Le protocole actuel est construit sur la méthode décrite par Li et al.⁷, avec des modifications supplémentaires ajoutées basées sur l'expérience de nous-mêmes et d'autres^1,4. Les étapes les plus critiques de notre protocole sont le serrage du canal biliaire commun près de l'extrémité du foie, l'injection de collagène P via l'ampulla de Vater pour digérer le tissu exocrine, puis en utilisant un bain d'eau secouant pour accélérer la digestion mécaniquement^{1, 4,7}. Par la suite, une solution «STOP» est appliquée pour inhiber la digestion des îlots; HBSS est utilisé pour laver la solution restante de collagène P et STOP. Lorsque la méthode Ficoll a été utilisée pour purifier les îlots humains, le rendement a été signalé comme étant deux fois plus élevé que les îlots ayant une plus grande capacité fonctionnelle (p. ex., sécrétion d'insuline) par rapport à l'utilisation des gradients Percoll⁹. Cependant, des études ont remis en question l'utilisation du gradient Ficoll en raison de son effet toxique sur les îlots^1,10. Il a été rapporté que le gradient Histopaque fournit la cinétique optimale de purification pour l'isolementd'îlots de souris, qui produit le bon rendement des îlots de haute qualité avec des étapes plus simples et le coût inférieur 1. Dans notre protocole, Histopaque-1077 est utilisé pour purifier les îlots d'autres tissus résiduels^8,11. Les îlots récoltés peuvent être cultivés dans des milieux COMPLETs RPMI-1640, ou directement utilisés dans la quantitation d'ARN/protéines.

Notre protocole, utilisant une combinaison de digestion de P de collagène et d'une étape simple de purification de gradient, est plus simple que d'autres protocoles édités. Notre méthode ne nécessite pas d'interventions chirurgicales exigeantes et n'a que quelques étapes simples. Plus important encore, ce protocole produit constamment un bon rendement des îlots fonctionnels de haute qualité (250-350/mouse) comme nous l'avons rapporté¹².

Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité des soins et de l'utilisation des animaux (ACUC) de l'Université Texas A et M. Les outils chirurgicaux nécessaires sont indiqués à la figure 1 et le diagramme schématique de la procédure est indiqué dans la figure 2.

1. Solutions

1. Préparer la solution de sel équilibré de Hank (HBSS) en ajoutant 100 ml de 10X HBSS (à partir du stock) à 900 ml d'eau distillée pour faire 1 L HBSS (1X).
2. Préparer la solution STOP (doit être fraîche et doit être utilisée dans un délai de 1 h) en ajoutant 50 ml de sérum bovin fœtal de 100X (FBS) à 450 ml de glace 1X HBSS; cela rend la solution STOP de 500 mL. Maintenez la solution STOP à 4 oC.
3. Préparer la solution P de collagène (doit être fraîche dans un délai de 1 h après avoir été utilisée) en ajoutant 1 mg/ml de collagène P à la glace froide 1X HBSS; utiliser 6 mL/souris.
   1. Ajouter 0,05 % (w/v) d'albumine de sérum bovin (BSA) à la solution de collagène P (ce qui fournit des nutriments aux îlots isolés). Par exemple, utilisez 3 mg de BSA dans la solution P de collagène de 6 ml. Garder sur la glace.
   2. Calculer et préparer la quantité de collagène P nécessaire pour toutes les souris dans un tube de 50 ml.
4. Préparer rpMI 1640 moyen complet en ajoutant 10% FBS, 100 U/mL pénicilline, 100 streptomycine sténopage g/mL, supplément cellulaire INS-1 (10 mM HEPES, 2 mM L-glutamine, 1 mM de pyruvate de sodium et 0,05 mM 2 mercaptoéthanol) à 500 mL RPMI 1640 media contenant 5,5 mM de glucose à utiliser pour la culture du jour au lendemain et l'incubation.

2. Préparation

1. Remplir trois tubes de 50 ml d'une solution inhibitrice rNase de 25 ml, 70 % d'éthanol ou de H₂O distillé. Ces solutions seront utilisées pour le nettoyage des outils chirurgicaux avant et pendant l'intervention.
2. Faire tremper les pointes des outils dans la solution inhibitrice RNase pendant 30 minutes avant de commencer le protocole; cela élimine toute RNase potentielle sur les outils.
3. Pré-coupetampons absorbants à 6 dans x 6 dans la taille pour une utilisation pendant la chirurgie.
4. Préparer la solution 1X HBSS à l'avance et le conserver à 4 oC. Préparer la solution STOP avant la chirurgie. Conserver à 4 oC.
5. Préparer la solution de collagène P immédiatement avant la chirurgie et conserver sur la glace.
   REMARQUE: Cela doit être utilisé dans les 2 heures suivant la préparation.
6. Étiqueter les tubes de 50 ml pour la digestion et la purification; préparer 2 tubes pour chaque souris, l'un pour la digestion et l'autre pour la purification des îîaux. Assurez-vous que l'iD animal est sur les deux tubes.
7. Ajouter 3 mL de solution P de collagène dans le premier tube de 50 ml. Les 3 ml restants de collagène P seront injectés.
8. Dessiner les 3 ml restants de solution de collagène dans une seringue de 3 ml montée avec 30 G 1/2 dans l'aiguille. Placez la seringue sur la glace.

3. Procédure

1. Retirez tous les outils de la solution inhibitrice de la RNase, puis trempez-les d'abord dans le tube avec 70 % d'éthanol, puis dans le tube contenant du H₂O distillé, puis séchez à l'air sur du papier essuie-tout propre.
2. Placez la souris dans une chambre contenant 0,5 ml d'isoflurane jusqu'à ce que la souris soit profondément anesthésiée.
3. Retirez la souris de la chambre et vérifiez l'état d'anesthésie en pinçant un coussinet avec des forceps. L'anesthésie profonde est basée sur l'observation que la respiration devient régulièrement lente et que la souris n'est pas réactive au pincement des pieds. Après avoir confirmé que la souris est profondément anesthésié, euthanasier la souris avec la dislocation cervicale, puis placer la souris sur le tampon absorbant.
   1. Placez la souris anesthésié sur son estomac, en appliquant une pression sur le cou et en disloquant la colonne vertébrale du cerveau en tirant la queue.
4. Tapez les membres de la souris en position de supine sur le tampon absorbant, vaporisez le corps avec 70 % d'éthanol et essuyez l'excès d'éthanol.
5. Utilisez des forceps en verre de couverture et des ciseaux chirurgicaux incurvés pour faire des incisions. D'abord faire une incision horizontale sur la peau de la région abdominale (3 cm), tirer la peau grande ouverte pour exposer la paroi abdominale. Ensuite, faites une incision verticale (3 à 4 cm) sur le péritoine abdominal pour exposer pleinement le pancréas dans la cavité abdominale (Figure 3).
6. Poussez les lobes du foie supérieurement pour exposer le canal biliaire, il apparaîtra comme un tube rose pâle (Figure 3).
7. Déplacez soigneusement les intestins de la bonne région lombaire/iliaque de la cavité abdominale vers la droite, en exposant le canal biliaire et l'artère hépatique (Figure 3).
8. Serrez soigneusement le conduit biliaire commun à l'aide du Schwartz micro serrefines (Figure 1) aussi près que possible du foie.
9. Identifier l'ampulla de Vater, qui est situé à la papille duodénale, formée par l'union du conduit pancréatique et le canal biliaire commun. L'ampulla de Vater semble gonflé lorsqu'il est vu sous un microscope de dissection qui est le point d'entrée du canal biliaire commun (Figure 4).
   REMARQUE : L'ajustement de l'intensité/angle de lumière du microscope de dissection peut faciliter la localisation.
10. Insérer la seringue avec 3 ml de la solution de collagène P dans l'ampulla de Vater. Poussez l'aiguille dans le conduit pendant environ 1/4 de la longueur du conduit biliaire commun (ampulla conduit dans le conduit) comme indiqué dans la figure 5.
11. Une fois que l'aiguille est dans l'ampulla, assurez-vous que l'orientation de l'aiguille est telle qu'elle est parallèle avec le conduit.
12. Stabiliser l'aiguille en serrant avec des micro-forceps Adson pour l'empêcher de perforer le conduit (Figure 5).
13. Injecter lentement et régulièrement 3 mL de la solution P de collagène de la seringue dans le canal biliaire commun (assez pour ressentir une résistance) comme le montre la figure 6. Le but est de créer une pression de retour pour forcer la collagène à entrer dans le canal pancréatique. L'injection est considérée comme réussie si la tête, le cou, le corps et la queue du pancréas sont tous entièrement gonflés.
    REMARQUE : Le rendement des îlettes sera faible si le pancréas n'est pas complètement gonflé, ou si la zone splénique n'est pas complètement gonflée. La zone splénique contient le plus grand nombre d'îlots⁶. L'inflation peut être confirmée par l'apparition d'espaces ouverts entre les tissus pancréatiques qui sont remplis de solution.
14. Disséquez soigneusement le pancréas gonflé et placez-le dans un tube de digestion de 50 ml contenant 3 ml de solution P de collagène glacée.
    1. Enlever le pancréas à l'aide de 2 forceps (courbé et Micro Adson; Voir Figure 1) ( (à partir de la rate, tirer le pancréas loin de la rate et continuer à enlever de l'estomac et le long du duodénum.
       REMARQUE: Aucune incision requise.
    2. Hacher le pancréas pendant 3 à 5 s dans le tube de digestion avec 3 ml de solution de collagène P glacée à l'aide de ciseaux chirurgicaux fins (Figure 7A).
15. Fixer le tube sur une grille dans un bain d'eau de 37 oC et secouer à 100 à 120 tr/min pendant environ 12 à 13 minutes.
16. Après l'incubation, secouer doucement les tubes à la main pour perturber le tissu jusqu'à ce que la solution de digestion de collagène P devienne homogène (Figure 7B). L'homogénéité est confirmée par une apparence de sable de particules fines du pancréas. Environ 30 s de doux tremblement de main est généralement suffisant. Tenir le tube à la lumière pour examiner si le tissu est bien homogénéisé; secouer pendant un autre 15 s si nécessaire.
17. Une fois digérés, placez immédiatement les tubes sur la glace et ajoutez 40 ml de solution STOP glacée pour mettre fin à la digestion enzymatique.
    REMARQUE: À ce stade, les tubes de digestion peuvent être laissés sur la glace jusqu'à 2 h, si vous travaillez sur plusieurs souris.
18. Centrifuger le tube dans une centrifugeuse à seau oscillant à 300 x g pour 30 s (la température de la centrifugeuse est flexible).
    REMARQUE : Utilisez une centrifugeuse à seau oscillant de sorte que la pastille de tissu soit formée au fond du tube de 50 ml et non sur la paroi du tube; c'est essentiel pour un meilleur rendement des islets.
19. Décanter et répéter la centrifugation avec la solution STOP 2 fois de plus, en décantant la solution après chaque rotation. Utilisez 20 ml de solution STOP pour chaque lavage ultérieur.
    1. Avant chaque rotation, perturber la pastille en secouant doucement la pastille tissulaire dans le tube de 50 ml dans la solution STOP de 20 ml.
20. Suspendre à nouveau la pastille de tissu avec 40 ml de HBSS froid glacé et la centrifugeuse à 300 x g pour 30 s.
21. Décanter et répéter la centrifugation à l'aide d'une centrifugeuse à seau oscillant avec la solution HBSS deux fois de plus, en décantant la solution après chaque vrille. Utilisez 20 ml de HBSS pour chaque lavage.
    1. Avant chaque vrille, perturber la pastille, pour la détacher du fond du tube en secouant doucement le tube contenant une solution HBSS de 20 ml.
22. Après la dernière centrifugation, retirez tous les HBSS.
23. Ensuite, ajoutez 5 ml de gradient de densité de température ambiante au tube de 50 ml contenant la pastille. Vortex brièvement à basse vitesse jusqu'à homogénéisation.
24. Ajouter un autre 5 ml du gradient de densité de température ambiante au tube de 50 ml. Ne pas vortex/mix.
    REMARQUE : Il est essentiel de rester stable et de permettre à un meilleur gradient de se former sans interruption.
25. Pipette 10 ml de tampon HBSS à température ambiante dans le tube (contenant le gradient de densité), goutte par goutte doucement et lentement pour permettre à un gradient de se former. Utilisez un canon pipette avec une pipette de 10 ml pour ajouter HBSS dropwise.
26. À l'aide d'une centrifugeuse à seau oscillant, les tubes de rotation à 1700 x g pendant 15 min. Assurez-vous de changer la vitesse de l'accélération/décélération au réglage le plus bas pour maintenir le gradient (figure 7C).
27. Après le spin, retirez soigneusement les tubes sans perturber le gradient. À l'aide d'un canon à pipette pré-wetted avec HBSS froid (pipette HBSS de haut en bas), pipette sur la couche d'îlots (5 à 10 ml) formé entre le gradient de densité et HBSS dans le nouveau tube de collecte des îlots de 50 mL.
    REMARQUE : Il est utile de mouiller la pipette avec le HBSS froid avant de pipetting les îlots pour empêcher les îlots de coller aux parois intérieures de la pipette.
    1. Dans le cas où la séparation est incomplète, les îlots seraient visibles dans la couche de gradient de densité, pipette sur l'ensemble de 10 ml du gradient de densité (couche inférieure) avec la couche d'îlots formé à l'interface (seulement pour laisser environ 8 à 10 ml de la couche supérieure HBSS derrière).
       REMARQUE : La collecte de la couche d'îf et de la couche de gradient de densité (couche inférieure) peut entraîner la collecte de débris qui peuvent allonger le temps de cueillette des înles, mais aucune autre étape ne sera modifiée. La collecte de ces deux couches n'est pas nécessaire lorsque la couche d'islet est bien formée.
28. Ajouter 20 ml de HBSS glacé au nouveau tube de 50 ml contenant des îlots, puis centrifuger à 350 x g pendant 3 min dans une centrifugeuse à seau oscillant.
29. Après le spin, soigneusement pipette (nepas décanter) sur le supernatant (laisser 3 ml au fond) sans déranger la boulette contenant les îlots au fond. Jetez le supernatant.
30. Répéter le lavage et le centrifuage au moins 3 fois. Ajouter 20 ml de HBSS à chaque fois, et assurez-vous de suspendre le granule avant chaque vrille.
31. Chauffer la bouteille de support complète RPMI-1640 dans un bain d'eau à 37 oC avant de l'utiliser. Après la dernière centrifugation, retirez tout le HBSS et ajoutez 4 ml de milieux RPMI-1640 complets préalablement préparés (contenant FBS, SUPPLÉMENT de cellules INS-1 et pénicilline/streptomycine) à la pastille.
32. Déloger la pastille en faisant tourbillonner doucement le tube et verser immédiatement le support RPMI-1640 dans un plat Petri de 100 mm. Ajouter un autre 5 ml de support RPMI-1640 au tube et le faire tourbillonner doucement pour laver les îlots restants, puis aussi verser le support dans le même plat Petri.
    1. Sous un microscope à dissection, choisissez des îlots sains du plat Petri à l'aide d'une pipette de 20 l et placez-les dans un nouveau plat Petri contenant 10 ml de support RPMI 1640 complet. Lorsqu'ils sont vus sous un microscope de dissection, les îlots devraient apparaître de couleur sphérique/oblongue et brun doré avec une surface lisse par rapport au tissu exocrine relativement transparent et vaporeux.
       REMARQUE : Le grossissement du microscope de dissection est habituellement réglé à 12.5-16x. Le rendement des islets varie en fonction de divers facteurs, y compris la tension, l'âge et le sexe de la souris. Ce protocole donne habituellement 250-350 îlots sains de l'âge sain de souris de C57BL/6J 4-10 mois.
33. Incuber les îlots dans un incubateur stérile à 37 oC avec 5 % d'infusion de CO₂ et 95 % d'air humidifié pendant la nuit pour des expériences le lendemain, ou congeler les îlots pour l'analyse souhaitée à une date ultérieure.
    1. Une fois que les îlots sont congelés, ils ne peuvent pas être utilisés pour des analyses de sécrétion, seulement l'ARN ou la quantification des protéines. Pour recueillir les cellules à congeler, placez-les dans le tampon HBSS, collectez tous les îlots dans une solution tampon de 200 à 500 l, transférez-les dans un tube de 1,5 mL, centrifugeuse 350 x g pendant 1 x 2 min, retirez le supernatant ne laissant pas plus de 30 à 40 l, placez-le dans -20 oC pour le stockage à court terme ( plusieurs jours) ou -80 oC pour un stockage à long terme.

Representative Results

L'achèvement approprié de cette procédure exige une certaine compréhension de l'anatomie de la souris dans la cavité abdominale. Cela permet d'identifier correctement l'ampulla de Vater et le serrage du canal biliaire commun. L'ensemble de la procédure prend normalement 1/2 h. Il est plus efficace d'isoler les îlots de 4 à 6 souris en même temps, de sorte que plusieurs échantillons peuvent être centrifuges ensemble. Le temps de la cueillette des îlots varie en fonction du nombre d'îlots et de l'efficacité de la digestion; il peut prendre environ une heure pour choisir 250 à 350 îlots de 1 souris.

Dans cet article, un certain nombre d'images très réalistes sont incluses : La figure 3 montre la cavité abdominale de la souris, exposant le canal biliaire commun et l'artère hépatique. La figure 4 montre toute la longueur du canal biliaire commun, qui semble être une couleur plus claire, ainsi que l'ampulla de Vater, qui est plus grand et plus brillant près de la jonction (où l'aiguille sera insérée) entre le pancréas et le duodénum. Une pince est placée au canal biliaire commun et faisceau d'artère hépatique près du foie pour bloquer le flux de collagène P dans le foie. Le défaut de serrer le conduit biliaire correctement ou assez serré entraînera des fuites et une perfusion incomplète du pancréas. La figure 5 montre l'aiguille insérée à l'ampulla de Vater dans le canal biliaire commun. Une fois que l'aiguille est dans le conduit commun, les forceps sont utilisés pour stabiliser l'aiguille pour l'empêcher de perforer le conduit pendant l'injection. Une fois que l'injection commence, le pancréas commencera à gonfler de la fin proximale à l'extrémité distale ; la région splénique devrait commencer à gonfler après environ 1 ml d'injection de collagène. Le retour dans les intestins peut conduire à une inflation indésirable du duodénum; cela peut être corrigé en réajustant le placement de l'aiguille (tirez-la un peu, ou réinsérer légèrement plus profond) et en stabilisant correctement l'aiguille à l'aide de forceps. L'injection est considérée comme un succès si toutes les régions du pancréas sont gonflées (lobes duodénal, gastrique et splénique) comme le montre la figure 6. L'enlèvement du pancréas devrait commencer à partir de la région splénique. Le pancréas gonflé est coupé en morceaux à l'aide de ciseaux chirurgicaux fins (Figure 7A). Après la digestion de 12 à 13 min et le mélange par poignée de main, la suspension contenant des tissus semble plus homogène (Figure 7B). Par la suite, les îlots sont purifiés par le gradient de densité après centrifugation. La figure 7C montre qu'une couche de suspension d'îfle se forme entre HBSS et le gradient de densité après centrifugation. Les îlots bons/sains apparaissent en forme ronde lisse; les îlots mauvais/endommagés montrent des bords rugueux, et le tissu exocrine non digéré montre la forme irrégulière et semble plus translucide comme indiqué dans la figure 8.

Figure 1 : Outils chirurgicaux.
Des ciseaux chirurgicaux courbés, des forceps en verre de couverture, des forceps micro Adson, des forceps courbés, de petits ciseaux chirurgicaux et des micro serrefines de Schwartz (pince microvasculaire) sont montrés. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Illustration schématique du protocole.
Les étapes les plus critiques de cette procédure sont le serrage du conduit biliaire commun près du foie, et l'injection de collagène P via l'ampulla de Vater dans le canal biliaire commun pour digérer le pancréas. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Emplacement du canal biliaire commun.
Les forceps tiennent le canal biliaire commun et le faisceau d'artère hépatique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4: Illustration du canal biliaire commun et ampulla de Vater.
Une pince est placée sur le canal biliaire commun et le faisceau d'artère hépatique près du foie. Les flèches noires pointent vers l'ampulla de Vater où l'aiguille sera insérée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5 : Annulation du canal biliaire commun.
Après le cannulation approprié du canal biliaire commun, l'ampulla de Vater est injecté avec le bleu trypan (pour le but de démonstration seulement) pour mieux souligner le placement du conduit biliaire commun. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6 : Pancréas entièrement gonflé.
La ligne pointillée montre la limite du pancréas entièrement perfusé. Les forceps retiennent la région splénique où les îlots sont les plus concentrés. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7 : Étapes d'isolement et de purification des îlettes.
(A) Morceaux de pancréas hachés mécaniquement avant la digestion. (B) pancréas digéré — suspension tissulaire homogène du pancréas perfusé de collagène après 13 min d'incubation dans un bain d'eau tremblant à 37 oC, suivi de 30 s de mélange à la main. (C) La couche de suspension d'îplier est formée entre le HBSS et le gradient de densité après centrifugation. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 8 : Images d'ist représentatifs de Fluorescence Cell-Imager.
(A) De bons îlots, de mauvais îlots et des tissus exocrines sont observés. (B) Un groupe de bons îlots est montré. (C) Le panneau montre le tissu exocrine non digéré attaché à un bon islet. Les îlots bons/sains montrent des bords ronds lisses, indiqués par la lettre rouge « G » ; les îlots mauvais/endommagés montrent la forme irrégulière et les bords rugueux, et sont indiqués par la lettre bleue « B ». Les tissus exocrines non digérés semblent translucides, souvent attachés aux îlots, et sont indiqués par la lettre verte « E ». Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Ce protocole comprend la perfusion et la digestion du collagène, suivie s'il y a purification des îlots. Les étapes les plus critiques de ce protocole sont l'injection efficace et la perfusion complète du pancréas^1,4,7. La méthode d'administration de ce protocole permet à l'enzyme de traverser les voies anatomiques pour mieux digérer le tissu exocrine entourant les îlots¹. En outre, cette technique est bien adaptée pour la digestion complète de la région splénique, qui a la plus forte concentration d'îlots^4,6. Ce protocole, avec un temps de digestion bien contrôlé et des étapes de purification soigneusement exécutées, peut produire 250 à 350 îlots sains. Les îlots isolés de ce protocole ont été utilisés avec succès pour étudier la sécrétion d'insuline stimulée par le glucose ex vivo¹². De notre expérience, la sécrétion d'insuline a augmenté de 4 fois sur la stimulation élevée de glucose (22.2 mM) comparée à la ligne de base (3.3 mM) après l'incubation de nuit dans 5.5 mM glucose-contenant RPMI-1640 médias complets. La capacité de survie/fonctionnalité des îlots sous incubation prolongée (2 à 7 jours) n'a pas été testée.

Même si le protocole présenté comprend des notes détaillées et des démonstrations visuelles, certains ajustements sont nécessaires pour atteindre les conditions optimales pour les îlots à haut rendement et de haute qualité. Deux problèmes les plus courants qui peuvent entraver le succès sont cannulation incorrect de l'ampulla de Vater ou perforation accidentelle du conduit. Pour éviter cela, il faut s'assurer que le site de pénétration est précisément là où l'ampulla rencontre avec le duodénum. Cette zone est plus grande et relativement facile à identifier, ce qui permet de multiples perforations sans compromettre sérieusement l'intégrité du conduit. Une fois à l'intérieur de l'ampulla, l'orientation de l'aiguille doit être parallèle avec le conduit plutôt que inclinée. À ce stade, poussez l'aiguille dans le conduit pendant environ 1/4 de la longueur du conduit, puis stabilisez l'aiguille avec des forceps tout en injectant lentement du collagène; ceci aidera à empêcher l'aiguille de se pencher sous la pression et percer accidentellement le conduit. D'autres problèmes peuvent inclure une sur- ou une sous-digestion du pancréas; cela peut nécessiter une modification basée sur l'âge, la souche et le sexe des souris. Des îlots endommagés dus à une surdigestion (enzymatique et mécanique) ou à une exposition prolongée au gradient de densité peuvent se produire. Ce sont des problèmes communs qui existent pour des méthodes similaires; quelques ajustements mineurs devraient apporter des améliorations significatives. Une suggestion lorsqu'il s'agit de ce genre de questions est de choisir une variable à modifier à la fois (par exemple, le temps de digestion ou la concentration de collagène).

Le principal avantage de ce protocole est la voie de la livraison d'enzymes: avoir la collagène P pour digérer directement le pancréas exocrine en utilisant un itinéraire anatomique plus facile qui augmente l'efficacité de la digestion¹. Cette méthode a été rapportée pour produire une augmentation de 50% du nombre d'îlots comparés à la méthode d'exciser le pancréas, de le hacher, et de l'exposer au collagène^13. Ce protocole ne nécessite que l'utilisation d'un gradient de densité unique, ce qui le rend beaucoup moins exigeant en main-d'œuvre et plus rentable, par rapport à d'autres méthodes qui nécessitent la préparation de gradients multiples à des densités différentes, ou le complexe Méthode Percoll qui nécessite du temps supplémentaire^1,8,11. La méthode de gradient utilisée dans ce protocole a également été utilisée dans l'isolement des îaux par d'autres⁴. Cette méthode d'isolement des îlots fournit au scientifique un outil amélioré pour l'étude des îlots pancréatiques. Les applications futures de ce protocole incluent l'altération pour augmenter l'efficacité en traitant avec des souris diabétiques. Comme Do et coll. l'ont observé, les souris diabétiques, selon les niveaux de glucose, produisent moins d'îlots (moins de 100), avec une taille et une apparence réduites d'îlots⁴. Nous avons observé ce phénomène et croyons que les îlots diabétiques sont plus vulnérables à la digestion enzymatique et mécanique qui nécessitent des soins spéciaux. En outre, la densité des îlots peut modifier son apparence dans le gradient de densité, une optimisation plus poussée du protocole aiderait à augmenter le rendement des îlots diabétiques.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mL syringe	BD	309657	Hoding collagenase P
Coverglass forceps	VWR	82027-396	Holding skin of mouse to aid incision procedure
Curved forceps	Sigma-Aldrich	Z168696	Holding tissues during pancreas removal
Isoflurane	Piramal	B13B16A	To anaesthetize mice prior surgery
100 mm petri dishes	VWR	30-2041	Used for islet culture
30 G. ½ inch needle	BD	305106	For penetration of Ampulla of vater to deliver Collagenase P - this guage is used as it fits well in most CBDs
50ml tube	VWR	89039-658	Holding digested pancreatic tissue, collagenase P, and purified islets
Absorbent pads with waterproof moisture barrier	VWR	82020-845	To absorb blood from syurgical procesdudes
Centrifuge 5810R with swing bucket and deceleration capability	Eppendorf	5811FJ478114	Use for pelleting tissues, pellet is formed at bottom of conical tube - swing bucket centrifuge is needed. Also the decelaration feature is important to form the gradient layers.
Collagenase P- 1g	Roche Diagnostics	11249002001	For digestion of exocrine pancreas
Curved surgical scissors	Fisher-Scientific	13-804-21	For cutting open mouse abdomen
Dissection microscope	Olympus	SZX16	Used for identification of key anatomical structures to accurately deliver collagenase into pancreas
Hank's Balanced Salt Solution 10x	Corning	20-023-CV	Washing cells
Histopaque-1077	Sigma	RNBF5100	For gradient formation
Light source	Leeds	LR92240	Enhancing visibility of microscope
RNaseZap	Fisher-Scientific	AM9780	For removing RNase
RPMI-1640 Media w/o L-Glutamine	Corning	15-040-CV	Culturing Islets
Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp)	Fine Science Tools	18052-01	Clamping common bile duct and hepatic artery
Shaking waterbath	Boekel/Grant	8R0534008	Important for mechanical digestion of exocrine tissue
Small surgical scissors	VWR	82027-578	Cuttitng tissue that atached to pancreas