Summary
Этот протокол изоляции островка описал новый маршрут инъекции коллагеназы для переваривания экзокринной ткани и упрощенную процедуру градиента для очищения островков от мышей. Она включает в себя ферментативное пищеварение, градиент разделения / очистки, и на кашет ручной сбор. Успешная изоляция может дать 250-350 высококачественных и полностью функциональных островков на мышь.
Abstract
Островки поджелудочной железы, также называемые островками Лангерганс, представляют собой кластер эндокринных клеток, который производит гормоны для регулирования глюкозы и других важных биологических функций. Островки в основном состоят из пяти типов гормоноскрытяющих клеток: «клетки выделяют глюкагон, клетки выделяют инсулин, клетки выделяют соматостатин, клетки выделяют грелин, а PP-клетки выделяют полипептид поджелудочной железы. Шестьдесят до 80% клеток в островках являются клетками, которые являются наиболее важной популяцией клеток для изучения секреции инсулина. Островки поджелудочной железы являются важнейшей модельной системой для изучения секреции инсулина ex vivo. Приобретение высококачественных островков имеет большое значение для исследования диабета. Большинство процедур изоляции газа требуют технически трудно получить доступ к месту инъекции коллагеназа, суровые и сложные процедуры пищеварения, и несколько шагов градиента плотности. Эта статья имеет простой метод изоляции высокой урожайности мыши с подробным описанием и реалистичными демонстрациями, показывая следующие конкретные шаги: 1) инъекция коллагеназа P на ампуле Vater, небольшой площади присоединения поджелудочной железы и общий желчный проток, 2) ферментативное пищеварение и механическое разделение экзокринной поджелудочной железы, и 3) один шаг очистки градиента. Преимуществами этого метода являются инъекция пищеварительного фермента с использованием более доступной ампулы Vater, более полное пищеварение с использованием сочетания ферментативных и механических подходов, а также более простой шаг очистки градиента. Этот протокол производит примерно 250-350 островков на мышь; и островки подходят для различных исследований ex vivo. Возможными предостережениями этой процедуры являются потенциально поврежденные островки из-за ферментативного пищеварения и/или длительного градиентного инкубации, все из которых можно в значительной степени избежать путем тщательного обоснования инкубационного времени.
Introduction
Есть два распространенных метода в литературе для изоляции поджелудочной железы, атакжем. Один требует иссечения поджелудочной железы и dicinging его на мелкие кусочки с помощью хирургических ножниц, а затем переваривание его в растворколленаза1,2,3. Другой более точный метод заключается в использовании сети протоков, присутствующих в поджелудочной железе, чтобы ввести пищеварительный фермент. Следующие участки были использованы для инъекции пищеварительного фермента: соединение желчного и кистозного протока, желчного пузыря в общий желчный проток, или общий желчный проток сам1,4,5. Известно, что островки не равномерно распределены в поджелудочной железе; селезенки содержит большинство островков6. В то время как второй метод с использованием анатомических путей для доставки пищеварительных ферментов позволяет более полное perfusion поджелудочной железы, в том числе селезенки области, эта процедура часто требует зажима или зашивания ампулы Vater, что технически Сложной. С точки зрения очистки островка, градиенты множественной плотности, а также ситектов и магнитного опрокидки были использованы для очистки островков3,7. Использование этих градиентов может занять много времени, и градиенты Ficollмогут привести к токсическим повреждениям островков 8.
Текущий протокол построен на методе, описанном Li et al.7, с дополнительными изменениями, добавленными на основе опыта себя и других1,4. Наиболее важными шагами нашего протокола являются зажим общего желчного протока вблизи конца печени, инъекционные коллагеназа P через ампулу Ватера, чтобы переварить экзокринную ткань, а затем с помощью трясущейся водяной ванны для ускорения пищеварения механически1, 4,7. Впоследствии, 'STOP' решение применяется для ингибирования дальнейшего пищеварения островков; HBSS используется для смывания оставшегося коллагеназа P и STOP раствора. Когда метод Ficoll был использован для очистки человеческих островков, выход, как сообщается, в два раза островки с большей функциональной способностью (например, секреция инсулина) по сравнению с использованием градиентов Percoll9. Тем не менее, исследования поставили под сомнение использование градиента Ficoll из-за его токсического воздействия на островки1,10. Было сообщено, что градиент Histopaque обеспечивает оптимальную очистку кинетики для изоляции островка мыши, который производит хороший выход высококачественных островков с более простыми шагами и более низкой стоимостью1. В нашем протоколе, Histopaque-1077 используется для очистки островков от других остаточных тканей8,11. Собранные островки могут быть культивированы в полном носителе RPMI-1640 или непосредственно использованы в Квантину РНК/белка.
Наш протокол, использующий комбинацию коллагеназа P пищеварения и один шаг очистки градиента, проще, чем другие опубликованные протоколы. Наш метод не требует сложных хирургических процедур и имеет всего несколько простых шагов. Что еще более важно, этот протокол последовательно производит хороший выход высокого качества функциональных островков (250-350/мышь), как мы сообщали12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь, были одобрены Комитетом по уходу за животными и использованию (ACUC) Техасского университета. Потребность в хирургических инструментах показана на рисунке 1, а схематическая схема процедуры показана на рисунке 2.
1. Решения
- Подготовка Хэнка сбалансированное решение соли (HBSS), добавив 100 мл 10X HBSS (из запасов) до 900 мл дистиллированной воды, чтобы сделать 1 L HBSS (1X).
- Подготовка STOP решение (должны быть свежими и должны быть использованы в течение 1 ч) путем добавления 50 мл 100X сыворотки крупного рогатого скота (FBS) до 450 мл ледяной 1X HBSS; это делает решение STOP 500 мл. Держите раствор STOP при 4 градусах по Цельсию.
- Подготовка коллагеназа P раствор (должен быть свежим в течение 1 ч от использования), добавив 1 мг /мл коллагеназа P к ледяной 1X HBSS; использовать 6 мл/мышь.
- Добавьте 0,05% (w/v) бычья сыворотку альбумина (BSA) в раствор коллагеназы P (это обеспечивает питательные вещества изолированным островкам). Например, используйте 3 мг BSA в растворе коллагеназы P 6 мл. Держите на льду.
- Рассчитайте и подготовьте количество коллагеназы P, необходимое для всех мышей в одной трубке 50 мл.
- Подготовка полного RPMI 1640 среды, добавив 10% FBS, 100 U/mL пенициллин, 100 мкг/мЛ стрептомицин, INS-1 клеточная добавка (10 мМ HEPES, 2 мМ L-глутамин, 1 мМ натрия пирувате, и 0,05 мМ 2-меркаптоэтанол) до 500 мл RPMI 1640 медиа, содержащих 5,5 м глюкозы, которые используются для использования для ночной культуры и инкубации.
2. Подготовка
- Заполните три 50 мл труб 25 мл RNase ингибирующее решение, 70% этанола или дистиллированной H2O. Эти решения будут использоваться для очистки хирургических инструментов до и во время процедуры.
- Замочите кончики инструментов в RNase ингибирующее решение в течение 30 минут перед началом протокола; это устраняет любые потенциальные RNase на инструменты.
- Предварительно вырезать абсорбирующими прокладками до 6 в х 6 в размере для использования во время операции.
- Подготовьте 1X решение HBSS заранее и храните при 4 градусах Цельсия. Подготовьте решение STOP до операции. Хранить при 4 градусах по Цельсию.
- Приготовьте раствор коллагеназа P непосредственно перед операцией и храните на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно быть использовано в течение 2 ч подготовки. - Этикетка 50 мл труб для пищеварения и очистки; подготовить 2 трубки для каждой мыши, один для пищеварения, а другой для очистки газолика. Убедитесь, что идентификатор животного находится на обеих трубках.
- Добавьте 3 мл раствора коллагеназа P в первую трубку 50 мл. Остальные 3 мл коллагеназа P будут введены.
- Нарисуйте оставшиеся 3 мл раствора коллагеназа в 3 мл шприца, установленного с 30 G 1/2 в игле. Поместите шприц на лед.
3. Процедура
- Удалите все инструменты из rNase ингибирующего раствора, затем окуните их сначала в трубку с 70% этанолом, затем в трубку, содержащую дистиллированной H2O, затем сухую воздух на чистом бумажном полотенце.
- Поместите мышь в камеру, содержащую 0,5 мл изофлурандо, пока мышь не будет глубоко обезглавлена.
- Удалить мышь из камеры и проверить состояние анестезии, щипать подножку с щипцы. Глубокая анестезия основана на наблюдении, что дыхание становится постоянно медленным и мышь нереагирует на ногу щипать. Подтвердив, что мышь глубоко анестезирована, эвтаназии мыши с вывихом шейки матки, а затем поместить мышь на абсорбируемой площадку.
- Поместите анестезирующую мышь на живот, применяя давление на шею и вывихнув позвоночник из мозга, потянув за хвост.
- Лента конечностей мыши в положении лежа на абсорбирующим колодки, распылить тело с 70% этанола, и протрите избыток от избыточного этанола.
- Используйте крышку стеклянные щипцы и изогнутые хирургические ножницы, чтобы сделать разрезы. Сначала сделайте горизонтальный разрез на коже брюшной области (3 см), потяните кожу широко открытыми, чтобы разоблачить брюшную стенку. Затем сделайте вертикальный разрез (3-4 см) на брюшной брюшной брюшной полости, чтобы полностью разоблачить поджелудочной железы в брюшной полости(рисунок 3).
- Нажмите на доли печени превосходно подвергать желчный проток, он появится как бледно-розовая трубка(рисунок 3).
- Тщательно перемещайте кишечник из правой поясничной/подвздошной области брюшной полости вправо, обнажая желчный проток и печеночные артерии(рисунок3).
- Тщательно зажими общего желчного протока с помощью Шварц микро serrefines(Рисунок 1) как можно ближе к печени, как это возможно.
- Определите ампулу Ватера, которая находится у двенадцатиперстной кишки, образованной союзом протока поджелудочной железы и общего желчного протока. Ампула Вейтерпоявляется появляется опухшие при просмотре под микроскопом вскрытия, который является точкой входа в общий желчный проток (Рисунок 4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Регулировка интенсивности/угол света микроскопа рассечения может облегчить поиск. - Вставьте шприц с 3 мл раствора коллагеназа P в ампулу Ватера. Нажмите иглу в проток около 1/4 длины общего желчного протока (ампулла ведет в проток), как показано на рисунке 5.
- После того, как игла находится в ампуле, убедитесь, что ориентация иглы такова, что она параллельна с протоком.
- Стабилизировать иглу путем зажима с микро Adson щипками, чтобы предотвратить его от прокола воздуховода(Рисунок 5).
- Медленно и неуклонно вводят 3 мл раствора коллагеназы P из шприца в общий желчный проток (достаточно, чтобы чувствовать сопротивление), как показано на рисунке 6. Цель состоит в том, чтобы создать давление обратного потока, чтобы заставить коллагенеза войти в проток поджелудочной железы. Инъекции считаются успешными, если голова, шея, тело и хвост области поджелудочной железы все полностью завышены.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выход на газ будет низким, если либо поджелудочная железа не полностью завышена, либо селезенка не полностью завышена. Селезенка содержит наибольшее количество островков6. Инфляция может быть подтверждена появлением открытых пространств между ткани поджелудочной железы, которые заполнены раствором. - Тщательно вскрыть надутую поджелудочную железу и поместить ее в трубку пищеварения 50 мл, содержащую 3 мл ледяного раствора коллагеназы P.
- Удалите поджелудочную железу с помощью 2 щипк (изогнутые и Micro Adson; См. Рисунок 1): (начиная с селезенки, вытащить поджелудочной железы от селезенки и продолжать удаление из желудка и вдоль двенадцатиперстной кишки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не требуется разрезов. - Нарезать поджелудочную железу для 3-5 с в трубке пищеварения с 3 мл ледяной коллагеназы P раствор с помощью тонких хирургических ножниц(Рисунок 7A).
- Удалите поджелудочную железу с помощью 2 щипк (изогнутые и Micro Adson; См. Рисунок 1): (начиная с селезенки, вытащить поджелудочной железы от селезенки и продолжать удаление из желудка и вдоль двенадцатиперстной кишки.
- Закрепите трубку стойке в водяной бане 37 градусов и встряхните при 100-120 об/мин в течение примерно 12-13 мин.
- После инкубации, осторожно встряхнуть трубки вручную, чтобы нарушить ткани, пока коллагенеза P пищеварения раствор становится однородным(Рисунок 7B). Однородность подтверждается песчаноподобным появлением мелких частиц поджелудочной железы. Около 30 с нежной рукопожатия, как правило, достаточно. Держите трубку до света, чтобы изучить, если ткань хорошо гомогенизированы; встряхнуть еще 15 с, если это необходимо.
- После переваривания, немедленно поместите трубки на лед и добавить 40 мл ледяной STOP раствор прекратить ферментативное пищеварение.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этот момент пищеварения трубки могут быть оставлены на льду до 2 ч, если работать на нескольких мышей. - Центрифуга трубки в размахивая ведро центрифуги на 300 х г на 30 с (температура центрифуги является гибким).
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте центрифугу с размахивая ведро так, чтобы гранулы ткани образуется в нижней части трубки 50 мл, а не на стене трубки; это имеет решающее значение для лучшего выхода на изыки. - Декант и повторить центрифугацию с решением STOP еще 2 раза, декантируя раствор после каждого спина. Используйте 20 мл раствора STOP для каждой последующей стирки.
- Перед каждым спином нарушить гранулы, осторожно встряхивая гранулы ткани в трубке 50 мл в 20 мл STOP раствора.
- Повторно приостановить ткани гранулы с 40 мл ледяной HBSS и центрифуги на 300 х г в течение 30 с.
- Декант и повторить центрифугию с помощью размахивая ведро центрифуги с hBSS решение еще два раза, декантирование решения после каждого спина. Используйте 20 мл HBSS для каждой стирки.
- Перед каждым спином нарушить гранулы, чтобы отделить его от нижней части трубки, аккуратно встряхивая трубку, содержащую 20 мл HBSS раствора.
- После последнего центрифугирования удалите все HBSS.
- Затем добавьте 5 мл градиента плотности комнатной температуры в трубку 50 мл, содержащую гранулы. Вихрь кратко на низкой скорости до гомогенизированного.
- Добавьте еще 5 мл градиента плотности комнатной температуры в трубку 50 мл. Не вихрь / смесь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно оставаться устойчивым и по-прежнему, с тем чтобы позволить лучше градиент аформироваться без сбоев. - Пипетка 10 мл комнатной температуры HBSS буфер в трубку (содержащий градиент плотности), падение за падением мягко и медленно, чтобы градиент сформироваться. Используйте пипетку с 10 мл пипетки, чтобы добавить HBSS dropwise.
- Использование размахивая ведро центрифуги, спина трубки на 1700 х г в течение 15 мин. Убедитесь в том, чтобы изменить скорость как ускорение / замедление до самой низкой настройки для поддержания градиента (Рисунок 7C).
- После спина, тщательно удалить трубки, не нарушая градиента. Используя пушку пипетки, предварительно увлажненный холодным HBSS (пипетка HBSS вверх и вниз), пипетка из слоя островков (5-10 мл), образующегося между градиентом плотности и HBSS в новую трубку сбора островка 50 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полезно намочить пипетку с холодным HBSS до pipetting островков для предотвращения островков от прилипания к внутренней стенке пипетки.- В случае, если разделение является неполным, островки будут видны в слое градиента плотности, pipette из всего 10 мл градиента плотности (нижний слой) вместе с островк слой формируется на интерфейсе (только оставить около 8-10 мл верхнего слоя HBSS позади).
ПРИМЕЧАНИЕ: Сбор как слоя на простота и градиентного слоя плотности (нижний слой) может привести к сбору мусора, который может удлинить время сбора на быте, но никакие другие шаги не будут изменены. Сбор обоих этих слоев не является необходимым, когда слой акромы хорошо сформирован.
- В случае, если разделение является неполным, островки будут видны в слое градиента плотности, pipette из всего 10 мл градиента плотности (нижний слой) вместе с островк слой формируется на интерфейсе (только оставить около 8-10 мл верхнего слоя HBSS позади).
- Добавьте 20 мл ледяного HBSS в новую трубку 50 мл, содержащую островки, затем центрифугу на 350 х г в течение 3 мин в центрифуге, качающейся ковше.
- После спина, тщательно пипетка (недекант)из супернатанта (оставьте 3 мл в нижней части), не нарушая гранулы, содержащие островки в нижней части. Отбросьте супернатант.
- Повторите стирку и центрифуги по крайней мере 3 раза. Добавить 20 мл HBSS каждый раз, и не забудьте приостановить гранулы перед каждым спином.
- Разогрейте бутылку носителя RPMI-1640 на водяной бане при 37 градусах Цельсия перед использованием. После последнего центрифугирования, удалить все HBSS и добавить 4 мл ранее подготовленных полных носителей RPMI-1640 (содержащий FBS, INS-1 клеточной добавки и пенициллина / стрептомицина) в гранулы.
- Выбить гранулы, осторожно закрученного трубки и сразу же залить RPMI-1640 средств массовой информации в 100 мм Петри блюдо. Добавьте еще 5 мл носителя RPMI-1640 в трубку и аккуратно закружайте ее, чтобы смыть оставшиеся островки, а затем также залить носителя мизанами в ту же чашку Петри.
- Под микроскопом вскрытия, выбрать здоровые островки из чашки Петри с помощью 20 л пипетка, и положить их в новое блюдо Петри, содержащий 10 мл полного RPMI 1640 средств массовой информации. При просмотре под микроскопом вскрытия островки должны казаться сферическими/продолговатыми и золотисто-коричневого цвета с гладкой поверхностью по сравнению с относительно прозрачной, тонким экзокринной тканью.
ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение рассечения микроскопа, как правило, устанавливается на 12,5-16x. Выход на изрядный выход будет варьироваться в зависимости от различных факторов, включая деформацию, возраст и пол мыши. Этот протокол обычно дает 250-350 здоровых островков от здорового возраста мыши C57BL/6J 4-10 месяцев.
- Под микроскопом вскрытия, выбрать здоровые островки из чашки Петри с помощью 20 л пипетка, и положить их в новое блюдо Петри, содержащий 10 мл полного RPMI 1640 средств массовой информации. При просмотре под микроскопом вскрытия островки должны казаться сферическими/продолговатыми и золотисто-коричневого цвета с гладкой поверхностью по сравнению с относительно прозрачной, тонким экзокринной тканью.
- Инкубировать островки в стерильном инкубаторе при 37-C с 5% CO2 инфузии и 95% увлажненного воздуха на ночь для экспериментов на следующий день, или заморозить островки для желаемого анализа на более позднее время.
- После того, как островки заморожены, они не могут быть использованы для секреции анализов, только РНК или белка количественной оценки. Чтобы собрать ячейки, чтобы заморозить, поместите их в буфер HBSS, соберите все островки в 200-500 л буфера, перенесите на трубку 1,5 мл, центрифугу 350 х г на 1-2 мин, удалите супернатант, оставив не более 30-40 градусов по Цельсию, поместите в -20 градусов по Цельсию на короткий срок ( несколько дней) или -80 градусов по Цельсию для длительного хранения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Правильное завершение этой процедуры требует некоторого понимания анатомии мыши в брюшной полости. Это позволяет правильно идентифицировать ампулу Ватера и зажим общего желчного протока. Вся процедура обычно занимает 1-2 ч. Более эффективно изолировать островки от 4-6 мышей одновременно, поэтому несколько образцов могут быть центрифугированными вместе. Время сбора островка варьируется в зависимости от количества островков и эффективности пищеварения; это может занять примерно час, чтобы выбрать 250-350 островков от 1 мыши.
В этой работе, ряд очень реалистичные изображения включены: Рисунок 3 показывает брюшной полости мыши, подвергая общий желчный проток и печеночной артерии. На рисунке 4 показана вся длина общего желчного протока, который, как представляется, более светлый цвет, а также ампула Вейтера, который больше и блестящее вблизи стыка (где игла будет вставлена) между поджелудочной железой и двенадцатиперстной железой. Зажим помещается на общий желчный проток и печеночной артерии расслоение близко к печени, чтобы блокировать поток коллагенеза P в печень. Неспособность зажать желчный проток правильно или достаточно плотно приведет к утечке и неполной перфузии поджелудочной железы. На рисунке 5 показана игла, вставленная в ампулу Ватера в общий желчный проток. Как только игла находится в общем протоке, щиппы используются для стабилизации иглы, чтобы предотвратить его от прокола протока во время инъекций. Как только инъекция начинается, поджелудочная железа начнет набухать от проксимального конца до дистального конца; селезенки области должны начать надуваться примерно после 1 мл инъекции коллагеназа. Обратный приток в кишечник может привести к нежелательной инфляции двенадцатиперстной кишки; это может быть исправлено путем сверкания размещения иглы (вытащить его немного, или восстановить немного глубже) и путем правильной стабилизации иглы с помощью щипкелок. Инъекция считается успешной, если все области поджелудочной железы завышены (двенадцатиперстные, желудочные и селезенки), как показано на рисунке 6. Удаление поджелудочной железы должно начинаться с селезенки. Надувная поджелудочная железа нарезается на куски с помощью тонких хирургических ножниц(рисунок 7A). После 12-13 мин пищеварения и смешивания вручную, ткани содержащие суспензии появляется более однородным(Рисунок 7B). Впоследствии островки очищаются градиентом плотности после центрифугирования. На рисунке 7С показано, что слой суспензии на киксе образуется между HBSS и градиентом плотности после центрифугирования. Хорошие/здоровые островки выглядят как гладкие круглой формы; плохие/поврежденные островки показывают шероховатости, а непереваренные экзокринная ткань показывает неправильную форму и выглядит более полупрозрачной, как показано на рисунке 8.
Рисунок 1: Хирургические инструменты.
Показаны изогнутые хирургические ножницы, крышка стеклянных щипцов, микро-Адсонщины, изогнутые щипцы, небольшие хирургические ножницы и микросероза Шварца (микрососудистый зажим). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Схематическая иллюстрация протокола.
Наиболее важными шагами этой процедуры являются зажим общего желчного протока вблизи печени, и инъекционные коллагеназы P через ампулу Vater в общий желчный проток, чтобы переварить поджелудочной железы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Расположение общего желчного протока.
Оспуги удерживают общий желчный проток и пучок печеночной артерии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Иллюстрация общего желчного протока и ампулы Ватера.
Зажим помещается на общий желчный проток и печеночной артерии расслоение вблизи печени. Черные стрелки указывают на ампулу Ватера, где будет вставлена игла. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Каннулирование общего желчного протока.
После надлежащей каниляции общего желчного протока, ампула Vater вводится с трипан синий (только для демонстрационных целей), чтобы лучше подчеркнуть размещение общего желчного протока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Полностью надутая поджелудочная железа.
Пунктирная линия показывает границу полностью проникнутой поджелудочной железы. Силовые силы удерживают селезенку, где островки наиболее сконцентрированы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: Этапы изоляции и очистки.
(A) Механически нарезанные кусочки ткани поджелудочной железы перед пищеварением. (B) Усваивается поджелудочной железы-однородные ткани суспензии коллагеназы-перфированной поджелудочной железы после 13 мин инкубации в тряске водяной бане при 37 градусов по Цельсию, а затем 30 с смешивания вручную. (C) Слой подвески islet сформирован между HBSS и градиентом плотности после центрифугирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 8: Представитель аклетизображения от Fluorescence Cell-Imager.
(A) Видны хорошие островки, плохие островки и экзокринная ткань. (B) Показано скопление хороших островков. (C) Панель показывает непереваренные экзокринной ткани, прикрепленные к хорошему наикстому. Хорошие/здоровые островки показывают гладкие круглые края, обозначенные красной буквой "G"; плохие/поврежденные островки показывают неправильную форму и шероховатости, и обозначены синей буквой "B". Непереваренные экзокринные ткани кажутся полупрозрачными, часто прикрепленными к островкам и обозначены зеленой буквой "Е". Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол включает в себя коллагенеза перфузии и пищеварения, а затем очищение островков. Наиболее важными шагами этого протокола являются эффективнаяинъекция и полная перфузия поджелудочной железы 1,4,7. Метод доставки этого протокола позволяет ферменту пройти анатомические пути, чтобы лучше переваритьэкзокринную ткань, окружающую островки 1. Кроме того, эта техника хорошо подходит для полного переваривания селезенки, которая имеет самую высокую концентрацию островков4,6. Этот протокол, с хорошо контролируемым временем пищеварения и тщательно выполненными шагами очистки, может вызвать 250-350 здоровых островков. Островки, изолированные от этого протокола, успешно используются для изучения глюкозно-стимулируемой секреции инсулина ex vivo12. Из нашего опыта, секреция инсулина увеличилась в 4 раза при высокой стимуляции глюкозы (22,2 мм) по сравнению с базовым (3,3 мм) после ночной инкубации в 5,5 мМ глюкозосодержащих RPMI-1640 полных носителей. Выживаемость/функциональность островков при длительной инкубации (2-7 дней) не была проверена.
Несмотря на то, что представленный протокол включает подробные заметки и визуальные демонстрации, для достижения оптимальных условий для высокой урожайности и высококачественных островков необходимы некоторые корректировки. Две наиболее распространенные проблемы, которые могут препятствовать успеху являются неправильной каниляции ампулы Vater или случайный прокол протока. Чтобы избежать их, следует убедиться, что сайт проникновения именно там, где ampulla встречается с двенадцатиперстной кишки. Эта область больше и относительно легко определить, что позволяет несколько проколов без серьезного ущерба целостности протока. После того, как в ампула, ориентация иглы должна быть параллельно с протоком, а не под углом. В этот момент, нажмите иглу в проток около 1 /4 длины протока, а затем стабилизировать иглу с щипками при медленном инъекционных коллагенеза; это поможет предотвратить изгиб иглы под давлением и случайно прокалывание протока. Другие проблемы могут включать чрезмерное или недостаточное переваривание поджелудочной железы; это может потребовать модификации в зависимости от возраста, деформации и пола мышей. Возможны поврежденные островки из-за переваривания (ферментативного и механического) или длительного воздействия градиента плотности. Это общие проблемы, которые существуют для аналогичных методов; некоторые незначительные корректировки должны привести к значительным улучшениям. Предложение при работе с этими типами вопросов заключается в том, чтобы выбрать одну переменную для изменения в то время (например, время пищеварения или концентрации коллагеназа).
Основным преимуществом этого протокола является маршрут доставки ферментов: наличие коллагеназы P для непосредственного переваривания экзокринной поджелудочной железы с помощью более простого анатомического маршрута, который повышает эффективность пищеварения1. Этот метод, как сообщается, дают 50% увеличение числа островков по сравнению с методом эксцизии поджелудочной железы, измельчения его, и подвергая его коллагеназы13. Этот протокол требует только использования одного градиента плотности, что делает его значительно менее трудоемким и более рентабельным, по сравнению с другими методами, которые требуют подготовки нескольких градиентов в разной плотности, или комплекса Метод Percoll, требующий дополнительного времени1,8,11. Метод градиента, используемый в этом протоколе,также используется в изоляции на многоднек другими 4. Этот метод изоляции островка дает ученому улучшенный инструмент для изучения островков поджелудочной железы. Будущие применения этого протокола включают изменения для повышения эффективности при работе с диабетическими мышами. Как отмечают Do et al., диабетические мыши, в зависимости от уровня глюкозы, дают меньше островков (менее 100), с уменьшенным размером и появлением островков4. Мы наблюдали это явление и считаем, что диабетические островки более уязвимы для ферментативного и механического пищеварения, которые требуют особого ухода. Кроме того, плотность островка может изменить его внешний вид в градиенте плотности, дальнейшая оптимизация протокола поможет увеличить урожайность диабетических островков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы чрезвычайно признательны г-же Дженнифер Мунгиа за ее художественную иллюстрацию схематической диаграммы. Мы благодарим г-на Майкла Р. Хонига в Хьюстоне общественной радиостанции KPFT за его редакционную помощь. Это исследование было поддержано Американской диабетической ассоциацией #1-15-BS-177 (YS) и NIH R56DK118334/R01DK18334 (YS). Эта работа была также поддержана Национальным институтом продовольствия и сельского хозяйства Министерства сельского хозяйства США, Hatch проекта 1010840 (YS) и R01 DK095118 (SG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | Hoding collagenase P |
| Coverglass forceps | VWR | 82027-396 | Holding skin of mouse to aid incision procedure |
| Curved forceps | Sigma-Aldrich | Z168696 | Holding tissues during pancreas removal |
| Isoflurane | Piramal | B13B16A | To anaesthetize mice prior surgery |
| 100 mm petri dishes | VWR | 30-2041 | Used for islet culture |
| 30 G. ½ inch needle | BD | 305106 | For penetration of Ampulla of vater to deliver Collagenase P - this guage is used as it fits well in most CBDs |
| 50ml tube | VWR | 89039-658 | Holding digested pancreatic tissue, collagenase P, and purified islets |
| Absorbent pads with waterproof moisture barrier | VWR | 82020-845 | To absorb blood from syurgical procesdudes |
| Centrifuge 5810R with swing bucket and deceleration capability | Eppendorf | 5811FJ478114 | Use for pelleting tissues, pellet is formed at bottom of conical tube - swing bucket centrifuge is needed. Also the decelaration feature is important to form the gradient layers. |
| Collagenase P- 1g | Roche Diagnostics | 11249002001 | For digestion of exocrine pancreas |
| Curved surgical scissors | Fisher-Scientific | 13-804-21 | For cutting open mouse abdomen |
| Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Used for identification of key anatomical structures to accurately deliver collagenase into pancreas |
| Hank's Balanced Salt Solution 10x | Corning | 20-023-CV | Washing cells |
| Histopaque-1077 | Sigma | RNBF5100 | For gradient formation |
| Light source | Leeds | LR92240 | Enhancing visibility of microscope |
| RNaseZap | Fisher-Scientific | AM9780 | For removing RNase |
| RPMI-1640 Media w/o L-Glutamine | Corning | 15-040-CV | Culturing Islets |
| Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp) | Fine Science Tools | 18052-01 | Clamping common bile duct and hepatic artery |
| Shaking waterbath | Boekel/Grant | 8R0534008 | Important for mechanical digestion of exocrine tissue |
| Small surgical scissors | VWR | 82027-578 | Cuttitng tissue that atached to pancreas |
References
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).
- Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. An improved method for isolation of mouse pancreatic islets. Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).
- O'Dowd, J. F. The isolation and purification of rodent pancreatic islets of Langerhans. Methods in Molecular Biology. 560, 37-42 (2009).
- Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (99), e52632 (2015).
- Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. Mouse islet of Langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (67), (2012).
- Wang, X. Regional Differences in Islet Distribution in the Human Pancreas - Preferential Beta-Cell Loss in the Head Region in Patients with Type 2 Diabetes. PLOS ONE. 8, (2013).
- Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nature Protocols. 4 (11), 1649-1652 (2009).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (88), e50374 (2014).
- Scharp, D. W., Lacy, P. E., Finke, E., Olack, B. Low-temperature culture of human islets isolated by the distention method and purified with Ficoll or Percoll gradients. Surgery. 107 (5), e50374 (1987).
- Salvalaggio, P. R. Islet filtration: a simple and rapid new purification procedure that avoids ficoll and improves islet mass and function. Transplantation. 74 (66), 877-879 (2002).
- Saliba, Y., Bakhos, J. J., Itani, T., Fares, N. An optimized protocol for purification of functional islets of Langerhans. Laboratory Investigation. 97 (1), 70-83 (2017).
- Pradhan, G., et al. Obestatin stimulates glucose-induced insulin secretion through ghrelin receptor GHS-R. Scientific Reports. 7 (1), 979 (2017).
- Shapiro, A. M. J., Hao, E., Rajotte, R. V., Kneteman, N. M. High yield of rodent islets with intraductal collagenase and stationary digestion--a comparison with standard technique. Cell Transplantation. 5 (6), 631-638 (1996).
