Summary
Courant multiplexés diagnostic pour détecter Zika, virus de la dengue et chikungunya nécessitent la préparation des échantillons complexes et instrumentation coûteuse et sont difficiles à utiliser dans des environnements peu de ressource. Nous montrons un diagnostic qui utilise l’amplification isotherme avec sondes déplaçable volet spécifique à la cible à détecter et différencier ces virus avec une spécificité et une sensibilité élevée.
Abstract
Zika, virus chikungunya et la dengue sont transmis par les moustiques, responsables de maladies ayant des symptômes similaires de patients. Cependant, ils ont des potentiels de transmission différent de patient à l’autre en aval et nécessitent des traitements pour les patients très différents. Ainsi, les flambées récentes de Zika qu’il est urgent de développer des outils qui sont discriminatoires rapidement ces virus chez les patients et pris au piège à moustiques, de sélectionner le bon traitement des patients et à comprendre et à gérer leur épidémiologie en temps réel.
Malheureusement, les tests de diagnostic actuels, y compris les urgences 2016 récepteur utiliser autorisations et accélérée statut, détecter l’ARN viral par reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), qui exige d’instrumentation, formation utilisateurs, et préparation de l’échantillon considérable. Par conséquent, elles doivent être transmises à des laboratoires de référence « approuvés », exigeant des temps. En effet, en août 2016, le Center for Disease Control (CDC) demandait les femmes enceintes qui avait été piqué par un moustique et présenté une éruption de Zika-indiquant d’attendre un inacceptable de 2 à 4 semaines avant d’apprendre qu’elles étaient infectées. Nous avons tellement besoin de tests qui peuvent être faits sur place, avec peu de ressources et par un personnel qualifié, mais pas nécessairement sous licence.
Cette vidéo montre un test répondant à ces spécifications, travaillant avec l’urine ou de sérum (pour les patients) ou de carcasses de moustiques écrasés (pour la surveillance de l’environnement), tout cela sans beaucoup de préparation échantillon. Carcasses de moustique sont capturées sur papier portant des groupes de d’ammonium quaternaire (papier Q) suivies par un traitement de l’ammoniaque pour gérer les risques biologiques. Ceux-ci sont ensuite directement, sans isolement d’ARN, mis dans des tubes à essai contenant des réactifs lyophilisés nécessitant aucune chaîne du froid. Une forme modifiée de la transcription inverse boucle-mediated amplification isotherme avec sondes déplaçables fluorescent étiquetés spécifique à la cible produit lecture, en 30 min, comme un signal de fluorescence trois couleurs. C’est visualisé avec un dispositif de poche, piles, avec un filtre orange. Contamination directe est empêchée avec des tubes scellés et l’utilisation de thermolabile uracile DNA glycosylase (UDG) en présence de dUTP dans le mélange d’amplification.
Introduction
Infections à virus transmises par les moustiques, y compris virus Zika, chikungunya et la dengue sont sur les stratégies de prise en charge immédiate de montée et de la demande. Virus de la dengue et le chikungunya sont déjà endémiques dans nombreuses régions tropicales où Zika se répand maintenant dans l' hémisphère occidental1. Zika virus, comme la dengue, est membre de la famille des Flaviviridae et est originaire d’Afrique avec un asiatique et deux lignées génétiques africaine2. Même si l’identification du virus Zika remonte à 1947, Zika infection chez l’homme est restée sporadique pendant un demi-siècle avant d’émerger dans le Pacifique et les Amériques. La première épidémie signalée de Zika fièvre s’est produite sur l’île de Yap dans les États fédérés de Micronésie, en 2007, suivie de la Polynésie Français en 2013 et 2014. La première épidémie majeure dans les Amériques a eu lieu en 2015 au Brésil.
Virus Zika, chikungunya et la dengue sont transmis principalement par Aedes aegypti et Aedes albopictus. Cependant, Zika a les possibilités de transmission de humain en aval supplémentaire, probablement, se réparties par contact sexuel, l’interaction mère-à-foetus et via l’allaitement3,4,5. Zika fièvre pensait tout d’abord à provoquer une maladie bénigne seulement. Cependant, il fut plus tard associée à syndrome de Guillain-Barré chez l’adulte, une microcéphalie chez les nouveau-nés et des maladies musculo-squelettiques chroniques qui peuvent le mois derniers à ans. Diagnostic de la maladie de Zika peut être difficile, étant donné que les symptômes d’une infection de Zika sont semblables à celles des autres virus moustique-propagation6. Co-infections communes de ces virus font Diagnostics différentiels, encore plus difficile7,8. Par conséquent, la détection rapide et fiable des acides nucléiques de Zika et d’autres virus est nécessaire pour comprendre épidémiologie en temps réel, d’engager des mesures préventives et contrôle et de gérer les soins aux patients,9.
Les tests de diagnostic actuels pour ces virus incluent des tests sérologiques, isolement du virus, virus séquençage et PCR de transcription inverse (RT-PCR). Des procédures types sérologiques souffrent souvent de sensibilité insuffisante et résultats peuvent être compliquées par réaction croisée chez les patients qui ont déjà été infectés par les autres flavivirus.
Test de dépistage reste donc le moyen le plus fiable pour détecter et différencier ces virus. Détection de Zika et autres virus transmissibles par le moustique est généralement réalisée à l’aide de RT-PCR ou RT-PCR en temps réel dans une variété de liquides biologiques, comme le sérum, urine, salive, sperme, le lait maternel et le liquide cérébral10,11. Échantillons d’urine et la salive sont généralement préférés au sang, puisqu’ils montrent moins de PCR-inhibition, une charge virale supérieure, présence de virus pour des périodes plus longues et une facilité accrue de prélèvement et de manipulation de12,13. Tests de diagnostic à base de RT-PCR, toutefois, comprennent des étapes de préparation d’échantillon vaste et coûteux équipement cyclisme thermique, rendant moins optimal pour le point-of-care.
Transcription inverse amplification isotherme boucle-négociée (RT-lampe) a émergé comme une alternative de RT-PCR puissante grâce à sa haute sensibilité et spécificité14, sa tolérance pour des substances inhibitrices dans biological samples15, et opération sur la température unique, qui a considérablement réduit dosage complexité et les coûts connexes, adapté aux environnements de faibles ressources. RT-lampe, telle qu’elle est implémentée classiquement, comprend six amorces qui se lient aux huit régions distinctes au sein de l’ARN cible. Il fonctionne à des températures constantes entre 60 ° et 70 ° C et utilise une transcriptase inverse et une ADN polymérase avec fil fort déplacement de l’activité.
Pendant les premières étapes de RT-lampe, amorces internes avant et arrière (FIP et BIP, Figure 1 a) avec des amorces avant et arrière extérieures (F3 et B3) forment une structure de l’haltère, la structure de la graine d’amplification exponentielle de lampe. L’amplification est encore accélérée par les boucle avant et en arrière des amorces (LF et LB), qui visent à lier les régions simples brin de l’haltère, et conduit à la formation de concatémères répétés plusieurs boucles16. Turbidité basée sur des analyses de lampe classique ou affichage par ADN intercalant colorants n’est pas tout à fait adapté pour détection de point-of-care de Zika, où certains niveau de multiplexage est désiré17,18,19. Multiplexage par répartition n’est pas facilement obtenu dans ces systèmes, car ils sont susceptibles de générer des faux positifs en raison de l’amplification hors cible.
Pour gérer ces questions, la littérature ajoute une composante supplémentaire sous la forme d’une « sonde de brin-déplacement » à la RT-lampe classique architecture20,21,22. Chaque sonde est une région de double-brin de séquence-spécifique et une région simple brin d’amorçage. La sonde avec la région monocaténaire est étiquetée avec un fluorophore 5', et la sonde complémentaire est modifiée avec un extincteur d’extrémité 3'. En l’absence d’une cible, aucune fluorescence n’est observée en raison de l’hybridation des brins complémentaires de sonde, qui apporte le fluorophore et extincteur à proximité. En présence d’une cible, la portion monocaténaire de la sonde fluorescente se lie à son effectif sur la cible et est ensuite étendue par un brin déplaçant polymérase. Prolongation de polymérase amorces inverse provoque la séparation du brin désactivateur de son brin complémentaire fluorescent étiqueté, permettant l’émission de fluorescence (Figure 1 b)) . Grâce à cette conception, le signal est généré après la formation de l’haltère, réduisant les chances de signaux de faux-positifs.
La partie double-brin de la sonde strand-déplacement peut être une séquence et multiplexage est appliqué, la même séquence peut-être être utilisée avec les paires différentes fluorophore-extincteur. Avec cette architecture, urine contaminée par le virus, sérum ou moustique échantillons écrasés sur papier ont été introduits directement à l’essai sans préparation de l’échantillon. Afficheurs de fluorescence trois couleurs visibles à le œil humain ont été obtenues dans les 30-45 min, des signaux ont été visualisés par une boîte d’observation imprimés 3D qui utilise une LED bleue et un filtre orange. Lyophilisation les réactifs de RT-lampe a permis le déploiement de ce kit pour abaisser les paramètres des ressources sans besoin de réfrigération.
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Protocol
Remarque : Les moustiques étaient les seuls animaux directement utilisées dans cette étude. Les procédures pour gérer les poulets, dont le sang a été utilisé pour nourrir les moustiques infectés, ont été approuvés comme IACUC protocole #201507682 par la propagation de l’Université de Floride Institutional Animal Care et utilisation Committee.Virus et études d’infection de moustiques ont été effectuées à l’installation de niveau de biosécurité 3 du laboratoire d’entomologie médicale en Floride à Vero Beach, FL. RT-lampe expériences ont été effectuées dans le laboratoire BSL-2 partagé par FfAME et Firebird Biomolecular Sciences LLC à Alachua, FL.
1. conception des amorces et Strand déplaçant des sondes
- Extraire des séquences virales pour la Dengue 1 du Broad Institute de base de données23; séquences de Zika et chikungunya du NIAID Virus pathogène de base de données et analyse ressources24.
- Créer des alignements de séquences multiples (MSAs) pour les séquences d’intérêt en utilisant le logiciel MUSCLE v3.8.3125. MSAs générés permet de rechercher des jeux d’amorces lampe dans une région conservée de la cible et d’éviter les cibles intentionnelles ou non pertinents, tels que les distinctions entre les sous-types d’une cible.
- Suivez les règles de conception pour les amorces de lampe comme décrit en ligne (http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/) et permettre l’utilisation des bases mixtes dans les amorces pour couvrir le virus divergence26. Pour éviter les réactions croisées de paires d’amorces, comparer des amorces de lampe générés à la base de données de virus ARN NCBI utilisant NCBI BLAST27. Comparez chaque set pour éliminer les amorces qui seraient dimériser lors d’un test multiplexé en utilisant NCBI BLAST ainsi.
- La partie double-brin de la sonde strand-déplacement contre toute séquence du génome viral et la séquence génomique de moustique de l’écran. Modifier 5'-extrémités de liaison cible sonde avec fluorescéine amidite (FAM), colorant HEX et 5-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) colorant pour Zika, chikungunya et Dengue 1, respectivement.
- Inclure une amorce de contrôle positif pour les échantillons d’urine. Concevoir des amorces de lampe pour cibler l’ADN mitochondrial humain. Sonde du label strand-déplaçant avec TET sur l’extrémité 5'. Sondes de désactiveur d’étiquette qui sont partiellement complémentaires à chaque fluorescent étiqueté sonde avec extincteur (p. ex., Iowa noir-FQ) sur l’extrémité 3' (tableau 1).
2. virus isole et infecté des échantillons de moustiques
- Utilisation des isolats de virus de Zika (souche de Puerto Rico), le virus Chikungunya (déformation de La Réunion ou les îles Vierges britanniques) et virus Dengue de sérotype 1 (souche de Key West). Déterminer des titres viraux à l’aide de plaque test28 ou de RT-PCR quantitative29. Extraire l’ARN viral en utilisant des kits d’extraction RNA commercialement disponibles.
Remarque : Le tableau 2 représente les titres viraux de chaque isolat de virus utilisée dans cette étude. - Suivez l’article publié par Yaren et coll. pour un protocole détaillé sur l’infection des femelles Ae. aegypti avec Zika et chikungunya virus20. Voir le tableau 2 pour le titre viral de l’échantillon de moustiques infecté par le virus Zika.
3. RT-lampe couplé avec Thermolabile uracile DNA Glycosylase
-
10 x préparation d’amorce mix.
- Préparer la solution mère de 100 µM de chaque amorce et de sonde (voir étape 1) par adjonction d’eau libre nucléase. Vortex bien et conserver à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.
- Pour 10 mix X Primer pour chaque Zika, Dengue 1 ou cible d’ADN mitochondrial, mix 16 µL du PCIM, 16 µL BIP, 2 µL de F3, 2 µL de B3, 5 µL de LF, 2 µL de LB, 3 µL de LB-fluorescent étiquetés sonde, 4 µL de sonde d’extincteur et 50 µL d’eau exempte de nucléase, pour un total de 100 volumes µL.
- Pour 10 X Primer mix pour le Chikungunya, mixer 16 µL du PCIM, 16 µL BIP, 2 µL de F3, 2 µL de B3, 5 µL de LB, 2 µL de LF, 3 µL de LF-fluorescent étiquetés sonde, 4 µL de sonde de l’extincteur et 50 µL d’eau exempte de nucléase, pour un total de volume 100 µL.
Remarque : La sonde concentration décrite ci-dessus utilise 300 nM de la sonde fluorescente et 400 nM de sonde de l’extincteur. Vous pouvez également utiliser 80 nM de sonde couplée et 200 nM de sa sonde d’extincteur pour l’analyse en temps réel.
- Ajouter 5 µL de 10 X mélange primer (pour 3-plex, ajouter 5 µL de chaque 10 X mix amorce), 5 µL de la mémoire tampon de l’amplification isotherme 10 X (1 X tampon composition : 20 mM Tris-HCl tampon pH 8,8, 50 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 8 mM MgSO4 0,1 % Tween-20, 1 millimètre DTT), 7 µL du mélange dNTP (10 mM de dATP, dCTP et dGTP ; 5 mM de dTTP et dUTP), 16 unités de l’ADN polymérase, 15 unités de Transcriptase inverse, 80 unités d’inhibiteur de la ribonucléase recombinante, 2 unités d’UDG thermolabile, 1-2 µL de quantités variables de vi RAL RNAs et eau pour porter le volume total jusqu'à 50 µL dans un PCR de 0,25 mL de tube (voir Table des matières).
- Inclure des essais de contrôle négatif à ce stade en remplaçant le viral RNA volume avec de l’eau. Incuber les échantillons entre 65 et 68 ° C pendant 45 min à 1 h, puis analyser en exécutant 5 µL de chaque échantillon sur gel d’agarose de 2,5 % en 1 tampon de X TBE contenant du bromure d’éthidium (0,4 µg/mL). Utilisez un 25 bp ou échelle d’ADN de 50 PB comme marqueur sur le gel.
Remarque : L’ajout d’un modèle spécifique de non-cible est facultative. - Pour détecter la présence d’ARN pathogène, tester chaque d’amorces et de son contrôle de non-modèle en faisant varier la concentration de température et/ou du magnésium, puisque chaque amorces RT-lampe a été conçu pour fonctionner à des températures différentes (65 ° C et 68 ° C) ou de magnésium concentrations (finale de 6 à 10 mM). Préparer les expériences à température ambiante.
4. RT-lampe à l’aide d’Urine de crampons ARN Viral
- Tester les amorces RT-lampe en variant la concentration finale d’urine (0 %, 10 %, 20 % et 50 %) dans 50 µL de volume de réaction totale. Pour la concentration de 10 % d’urine finale, ajouter 1 µL d’ARN viral à 5 µL d’urine. Pour la concentration de 20 % d’urine finale, ajouter 1 µL d’ARN viral à 10 µL d’urine. Pour la concentration de 50 % d’urine finale, ajouter 1 µL d’ARN viral à 25 µL d’urine.
- Pour la surveillance en temps réel de RT-lampe dans 10 % des urines, utiliser un appareil de PCR en temps réel (voir Table des matières) avec un fluorophore différents filtres.
- Pour lire les signaux de fluorescence amplicons marqué FAM pour Zika, utiliser un filtre allant de 483 à 533 nm ; pour les amplicons marqué HEX pour le chikungunya, utiliser un filtre allant de 523 à 568 nm ; pour les amplicons TAMRA marqués pour la Dengue 1, utilisez un filtre allant de 558 à 610 nm ; et pour les amplicons TET marqués pour l’ADN mitochondrial, utiliser un filtre allant de 523 à 568 nm.
NOTE : FAM a maxima d’excitation et d’émission de 495 nm et 520 nm, respectivement. HEX a maxima d’excitation et d’émission de 538 nm et 555 nm, respectivement. TAMRA a maxima d’excitation et d’émission de 559 nm et 583 nm, respectivement. TET a maxima d’excitation et d’émission de 522 nm et 539 nm, respectivement.
- Pour lire les signaux de fluorescence amplicons marqué FAM pour Zika, utiliser un filtre allant de 483 à 533 nm ; pour les amplicons marqué HEX pour le chikungunya, utiliser un filtre allant de 523 à 568 nm ; pour les amplicons TAMRA marqués pour la Dengue 1, utilisez un filtre allant de 558 à 610 nm ; et pour les amplicons TET marqués pour l’ADN mitochondrial, utiliser un filtre allant de 523 à 568 nm.
- 96 utilisation plats et joint de la plaque avec une feuille en plastique transparent, puis incuber les échantillons à 65-68 ° C pendant 60 à 90 min et enregistrent la fluorescence toutes les 30 s en utilisant la lumière cycleur. Au départ utiliser 80 nM de sondes fluorescent étiquetés, puis test les 300 nM de sondes fluorescent étiquetés.
- Déterminer la limite de détection pour chaque cible en ajoutant en série dilué l’ARN viral en concentration urine finale de 10 %.
Remarque : Utiliser en temps réel RT-lampe pour déterminer la température optimale, concentration en magnésium, sonde couplée à concentration et temps de réaction.
- Déterminer la limite de détection pour chaque cible en ajoutant en série dilué l’ARN viral en concentration urine finale de 10 %.
- Pour visualiser la fluorescence générée par sondes déplaçable brin par oeil, utilisez une source de lumière LED bleue d’un cycleur léger avec excitation à 470 nm (n’importe quelle boîte de l’électrophorèse sur gel avec une source lumineuse intégrée bleue va travailler, voir table des matières) et d’enregistrer l’image avec une caméra de téléphone portable dans l’obscurité à température ambiante.
Remarque : Utilisation de 300 nM de sondes fluorescent étiquetés, lorsque la visualisation de tous les trois couleurs par le œil à l’aide de LED bleue est nécessaire.
5. RT-lampe sur détection de moustiques infectés par Zika en utilisant la technologie Q-papier
- Préparer du Quaternaire d’ammonium-modification filtre papier (Q-), selon des méthodes publiées antérieurement avec de légères modifications30.
- Plongez 1 g de cercles de papier filtre de cellulose (voir Table des matières), avec un diamètre de 3,5 cm dans 50 mL de 1,8 % de solution aqueuse de NaOH pendant 15 min pour l’activation.
- Recueillir des cercles de papier activés par filtration sous vide et puis immergez-les dans 40 mL de solution aqueuse de chlorure (0,28 g) (2, 3-époxypropylénique) du jour au lendemain à la température ambiante.
NOTE : Conserver le rapport de masse de chlorure de triméthylammonium (2, 3-époxypropylénique) de papier-filtre à 0,28 à 1. - Recueillir le papier cationique qui en résulte par filtration sous vide et neutraliser avec 50 mL de 1 % d’acide acétique.
- Laver le livre trois fois avec de l’éthanol et sécher à l’air sous une hotte à flux d’air constant.
- Couper les feuilles de la Q-papier en petits rectangles (3 x 4 mm) à l’aide d’un perforateur à papier ou des ciseaux. Écraser les moustiques femelles Ae. aegypti potentiellement infectés par Zika sur chaque papier avec un pilon de micro.
- Ajouter à chaque papier 20 µL de solution d’ammoniaque aqueuse de 1 M (pH ≈ 12) et attendre 5 min. Puis laver chaque papier une fois avec 20 µL de 50 % EtOH et une fois avec 20 µL d’eau exempte de nucléase. Sécher le papier dans la prévention des risques biotechnologiques BSL-2 armoire pendant environ 1 h.
Remarque : À ce stade, échantillons peuvent être conservés à-20 ° C durant la nuit jusqu'à l’utilisation. - À l’aide de pinces à épiler, placez chaque papier dans 100 µL du mélange réactionnel RT-lampe et incuber à 65-68 ° C pendant 45 min. Assurez-vous de submerger complètement le papier dans la solution ; il ne devrait pas être variable. Lire et noter la fluorescence dus aux virus Zika à l’aide de la source de lumière LED bleue et orange ou jaune filtre.
6. la lyophilisation des réactifs de RT-lampe pour 100 µL de Volume réactionnel
- Préparer 10 X lampe apprêt mélange conformément à l’article 3.1 et préparer le mélange dNTP contenant dUTP conformément au point 3.2. Magasin ABC mélange et dNTPs à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.
- Préparer 10 mL de tampon de dialyse enzyme pour retirer le glycérol, en mélangeant 100 µL de 1 M Tris-HCl pH 7.5, 500 µL de KCl, 2 µL de 0,5 M EDTA, 100 µL de 10 % 1 M X-100 Triton, 100 µL de 0,1 M DTT et 9,198 mL d’eau exempte de nucléase. Stocker le tampon de dialyse à 4 ° C.
Remarque : Veillez à filtrer (filtre à 0,2 microns) toutes les solutions de réactif tampon avant de les utiliser et les stocker à 4 ° C.- Utiliser une membrane d’ultrafiltration avec 10 kDa seuil limite (voir Table des matières). Placez 350 µL de tampon de dialyse, 4 µL de 32 unités de l’ADN polymérase, 2 µL de 30 unités de la Transcriptase inverse et 2 µL de 80 unités d’inhibiteur de RNase dans la membrane d’ultrafiltration et centrifuger à 14 000 x g pendant 5 min à 4 ° C.
- Ajouter un autre 350 µL de tampon de la dialyse à la membrane d’ultrafiltration et centrifuger (14 000 x g) pendant un autre 5 min vide le tube de prélèvement et répétez cette étape, puis centrifuger (14 000 x g) pendant 3 min.
- Pour l’élution, inverser la membrane et le placer dans un nouveau tube de prélèvement. Tournant à 1 000 x g pendant 2 min. mesure le volume d’élution ; Si moins de 8 µL, porter le volume jusqu'à 8 µL par adjonction de tampon de dialyse. Stocker l’élution à 4 ° C et de procéder immédiatement à l’étape suivante.
Remarque : Ce protocole est pour la lyophilisation de tube unique, mais Préparez au moins 10 tubes de réaction à la fois en utilisant la même membrane d’ultrafiltration et utilisent la même quantité de mémoire tampon de dialyse.
- Mélanger 10 µL d’apprêt de lampe X 10 si singleplex (pour 3-plex, ajouter 10 µL de chaque 10 X mix amorce), 14 µL du mélange dNTP, 8 µL du mélange enzymatique dialysée, 2 µL de 2 unités d’UDG thermolabile et 66 µL de nucléase libre de l’eau (pour 3-plex Utilisez 46 µL) dans un tube à microcentrifugation 0,5 mL et laisser le couvercle ouvert. Au lieu de cela, ajoutez un autre couvercle percé avec une aiguille pour permettre à la vapeur de s’échapper.
- Immédiatement geler les tubes à-80 ° C pendant 2 h et lyophiliser le tube pendant 4 h. couvercle de la chambre de lyophilisation avec papier d’aluminium pour la protection contre la lumière. Lorsque les réactifs sont séchées, enlever les couvercles perforés, fermer le couvercle original et entreposer les tubes avec des réactifs lyophilisés à 4 ° C à l’obscurité.
NOTE : Les réactifs peuvent être lyophilisées du jour au lendemain, si nécessaire.
7. test lyophilisé RT-lampe réactifs sur l’Urine et des échantillons de moustiques contenant Zika
- Utilisez les éléments suivants du kit (voir la Table des matières) pour Zika : une boîte d’observation 3D-imprimé avec orange (filtre longue passe, coupe-sur ~ 540 nm), 2 piles AAA pour l’observation de boîte, lyophilisé réactionnels étiquetés ZV pour détection de Zika, et 1.1 X réhydratation tampon à couvercle à vis 1,5 mL tubes.
- Préparer 50 mL de 1,1 X tampon de réhydratation en mélangeant 5,5 mL de 10 X tampon d’amplification isotherme qui vient avec l’ADN polymérase (voir la Table des matières), 3,3 mL de 100 mM MgSO4, 110 µL de 0,5 M DTT et 41,09 mL d’eau exempte de nucléase. Bien mélanger, aliquote 1 mL de cette solution pour tubes de 1,5 mL couvercle à vis et conserver à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.
- Ajouter 90 µL de tampon de réhydratation 1,1 X dans chaque tube de réaction (0,5 mL). Veiller à ce que le liquide remplit le fond du tube contenant les réactifs lyophilisés (dissoudre les avec le mélange en brassant, puis brièvement tournent vers le bas (1 000 x g)). Ajouter 10 µL de l’échantillon d’urine additionné de l’ARN viral dans les tubes de réaction (voir la section 4.1 pour plus de détails).
- Si les tests de moustiques, ajouter un rectangle de papier Q tenant des carcasses de moustique (tel qu’établi dans les étapes décrites dans sections 5.2 et 5.3), ainsi que de 10 µL purifié l’eau plutôt que des échantillons d’urine.
NOTE : Également ajouter 10µl d’échantillons de salive ou de sérum au lieu de l’urine. Si les échantillons sont extraits de l’ADN ou d’ARN, ajouter 2 à 5 µL de l’échantillon dans le mélange réhydraté et remplissez avec de l’eau exempte de nucléase à 10 µL de volume de l’échantillon final.
- Si les tests de moustiques, ajouter un rectangle de papier Q tenant des carcasses de moustique (tel qu’établi dans les étapes décrites dans sections 5.2 et 5.3), ainsi que de 10 µL purifié l’eau plutôt que des échantillons d’urine.
- Fermer le couvercle des réactionnels. Placez-les dans un bloc/bain de chaleur (ou incubateur) réglé à 65-68 ° C. Incuber pendant 30-45 min, mais pas plus de 1 h. Après incubation, retirer le tube du feu. Pour prévenir la contamination des analyses futures, veiller à ce que ces tubes restent fermés.
- Placer les tubes de réaction dans la zone d’observation ; la température baissera à la température ambiante (préférence 25 ° C). Allumez l’interrupteur à l’arrière de la zone d’observation. Observer l’échantillon à travers le filtre orange et capturer l’image d’une caméra de téléphone portable qui est maintenue à une distance où l’image remplit 80 % du champ de vision.
NOTE : La meilleure visualisation sera assurée dans les environnements de basse lumière. - Après que visualisation est terminée, éteignez l’interrupteur. Stocker les tubes scellés dans l’obscurité, de préférence avec réfrigération, si visualisation ultérieure est nécessaire.
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Representative Results
Au départ, les performances de chaque amorce RT-lampe (tableau 1) avec son substrat correspondante d’ARN viral, mais aussi les témoins négatifs ont été évalués par électrophorèse sur gel. Amorces RT-lampe visaient à cible NS5 région (l’ARN polymérase ARN-dépendante) de Zika et Dengue 1 et nsP2 région (P2 de protéines non structurelles) de Chikungunya. Les modèles étaient des ARN total extrait de stocks viraux cultivées dans les cellules rénales (Vero) singe vert africain. Dans un cas, totale en acides nucléiques (ADN et ARN) a été extraite une femelle infectés par le virus Chikungunya Ae. aegypti (tableau 2).
Figure 2 a montre que quelques résultats représentatifs avec RT-lampe réalisée avec ces échantillons. En singleplex et en cas de multiplex (3-plexed), RT-lampe produits apparaissent comme une échelle de concatémères lorsqu’il est exécuté sur gel d’agarose. Échantillons de contrôle négatif contenant de l’eau quand échantillon donné seulement les bandes pour amorces eux-mêmes, y compris le contrôle cible non spécifique dans lequel l’acide nucléique total extraite une non infectés Ae. aegypti femelle moustique a servi en tant que modèle.
Pour trouver des conditions optimales de RT-lampe, des concentrations différentes de magnésium et la température d’incubation ont été testée. Il a été constaté que des concentrations plus élevées de magnésium et des températures plus basses peuvent générer des amplicons non-spécifiques, donnant lieu à de faux positifs. Par conséquent, 8 mM de magnésium et d’incubation à 65 ° C ont été utilisés dans toutes les expériences alors (Figure 2 b).
Électrophorèse sur gel nécessite l’ouverture du tube de réaction, ce qui peut donner lieu à la contamination de la prochaine série d’expériences par les amplicons générés précédemment, conduisant à des faux positifs. Pour éviter la contamination avant, dTTP a été remplacé par des proportions égales de dTTP et dUTP, afin que dUTP serait incorporée dans les amplicons RT-lampe. Cette option active la possible contamination amplicon dans un substrat pour uracile-DNA glycosylase (UDG) lors de la préparation de n’importe quel ultérieures RT-lampe réactions31,32. Lorsqu’une version thermolabile de UDG est utilisée, les amplicons contenant dU peuvent être digérées à température ambiante que les échantillons de RT-lampe sont mis en place, et l’UDG sera inactive pendant l’amplification isotherme. En outre, le tube de réaction peut être ouverts pour une analyse en aval, lorsque nécessaire. Outre l’utilisation de la digestion de l’UDG, une architecture à l’aide de sondes déplaçables génère fluorescence qui peut être lu sans devoir ouvrir le tube de réaction.
Figure 3 a livre le résultat de la limite de détection (LD) pour Zika à l’aide de sondes fluorescentes ciblage Zika RNA. Dilution en série études ont montré que des analyses aussi bas que 1,42 pfu pouvait être détectés dans les 30 minutes dans un essai de singleplex ou un plexed-3. Lorsque les échantillons étaient plus dilués à 0.71 pfu, un signal fluorescent a été observé après 40 min pour un dosage de singleplex et après 50 min pour les mélanges de 3-plexed. En plus en temps réel RT-lampe, fluorescence a été visualisée après 35 min à travers un filtre orange, après que les échantillons ont été exposés au bleu lumière LED avec une longueur d’onde d’excitation de 470 nm (Figure 3 b). De même, limites de détection ont été mesurées à 37,8 copies et 1,22 pfu Chikungunya et Dengue 1, respectivement (Figure 3-D).
Pour déterminer la concentration de l’urine optimales, Zika ARN viral (2,85 pfu) a été ajouté à des concentrations variables d’un échantillon d’urine humaine authentique (0 %, 10 %, 20 % et 50 %). Probablement à cause de ses électrolytes, le signal de RT-lampe a été retardé de 15 à 35 min lorsque 50 % urine a été utilisée dans le test. urine de 10 % a été jugée optimale en raison de présenter un fond inférieur. En l’absence de cibles de Zika, aucune amplification a été observée à n’importe quelle concentration, mais la fluorescence de fond plus élevée a été observée dans des échantillons avec la plus forte concentration d’urine (Figure 3E).
Pour permettre de multiplexage avec afficheurs de couleurs différentes de fluorescence, 80 nM de sondes déplaçable brin ont été étiquetés avec des fluorophores différents (FAM pour Zika, HEX pour le Chikungunya et TAMRA pour Dengue 1), mais accompagnée de l’extincteur même (Iowa noir-FQ) avec une concentration de 200 nM. Cellule culture-extrait l’ARN viral (pfu 2,85 pour Zika, 242 exemplaires de RNA virales pour le Chikungunya et 1,22 pfu pour Dengue 1) ont été utilisés comme cibles, dilués dans l’urine de 10 %. Analyse en temps réel les données de fluorescence a montré un retard dans la génération de signaux (env. 10 min) pour des dosages de 3-plexed où se trouvaient les amorces pour toutes les cibles. En cas de singleplex, en revanche, la réaction a été achevée dans les 10-15 min (Figure 4 a-C). Lorsque fluorescence a été visualisée à l’aide d’une LED bleue et le filtre orange, différences dans l’intensité du signal ont été observés pour des fluorophores différents, où marqué FAM amplicons ont été les plus visibles. C’est prévu, depuis l’excitation à 470 nm est plus proche de vous au maximum le spectre d’excitation de FAM (Figure 4).
Pour permettre la visualisation de toutes les couleurs de trois avec une seule longueur d’onde de LED excitation (470 nm), les concentrations de sondes déplaçables ont augmenté à 300 nM et l’extincteur complémentaire sonde à 400 nM. Dans singleplex cas, génération de signaux a été achevée dans les 10 min pour Zika, 20 min pour le Chikungunya et 40 min pour la Dengue 1. Lors d’essais de 3-plexed, cependant, elle a été repoussée par 20 min dans tous les essais ()Figure 5 a- C). Néanmoins, le sacrifice dans le temps de génération de signaux activé la visualisation de tous les trois couleurs à l’aide de lumière bleue LED avec filtre orange. Fluorescence verte est observée pour Zika à l’aide de sondes extrémité 5'-étiquetée avec FAM, lumière fluorescence vert-jaune est attribué à Chikungunya où la sonde est extrémité 5'-étiquetée avec HEX et fluorescence orange-rouge est utilisée pour la Dengue 1, où sa sonde est 5'-fin étiquetée avec TAMRA (Figure 5).
Pour tester des échantillons de moustiques infectées par Zika possible, laboratoire infectés par Ae. aegypti moustiques femelles (tableau 2) ont été écrasés sur un rectangle de papier Q, suivie par un traitement de l’ammoniaque pour stériliser le virus et pour lier les exposés virale RNA sur Q-papier chargé positivement. Le livre a été brièvement lavé avec de l’éthanol pour éliminer pterin composés présents dans les carcasses de moustique qui pourraient interférer avec la fluorescence lecture33,34. Q-papiers contenant des moustiques ont été submergés alors directement dans le mélange de RT-lampe et après incubation à 65 ° C pendant 30 min, fluorescence vert vif a été observée en présence de virus Zika (Figure 6).
Pour offrir le kit de détection sans une chaîne du froid et de faire le test facile à utiliser, les réactifs de RT-lampe étaient lyophilisés et accompagnés d’un tampon de réhydratation et une boîte d’observation imprimés 3D qui utilise un 470 nm émettant dirigée et un filtre orange (Figure 7 a). à l’aide de 9 volumes de tampon de réhydratation et 1 volume d’échantillon d’urine, fluorescence verte visible peut être généré dans les 30 minutes et l’image peut être saisie par tout appareil photo de téléphone cellulaire (Figure 7 b). Par ailleurs, des échantillons de moustiques sur Q-papier utilisable par la même épreuve en ajoutant 1 volume d’eau au lieu de l’échantillon d’urine.
Figure 1 : test de lampe Design (A) RT-lampe amorces et la formation d’une structure d’haltère par un brin d’ADN polymérase de déplacement. (B) Introduction de sondes strand-déplacement pour permettre la lecture de multiplexage et de fluorescence et pour suivre les progrès de la RT-lampe en temps réel. Réimprimé avec la permission de Yaren al 201720. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Gel analyse par électrophorèse des amplicons. (A) des amorces de lampe test dans singleplex ou multiplex (3-plex) format avec des contrôles positifs et négatifs appropriés. Positif de contrôles incluent l’ARN viral purifiée avec les titres suivants : 2,85 pfu Zika (ZV), 242 exemplaires génomiques pour le Chikungunya (CH) et 1,22 pfu pour Dengue 1 (D1). NTC-z, NTC-c et NTC-d représentent aucun contrôle de modèle pour les amorces de Zika, Chikungunya et Dengue 1 au format singleplex, respectivement. NSC est synonyme de contrôle non-spécifiques cible dans lequel total xNA (ADN et ARN) est extraite exempte d’infection Ae. aegypti. M est synonyme de marqueur (échelle d’ADN de 50 paires de bases). (B) optimisation du dosage des conditions de test à une température d’incubation de gamme de RT-lampe (à partir de 55 ° C à 70 ° C) et MgSO4 concentrations (de 4 à 10 mM) en multiplex format en l’absence de cible RNA. Réimprimé avec la permission de Yaren al 201720. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : lampe en temps réel RT. (A) Singleplex et multiplexé limite de détection (LD) pour Zika (ZV) utilisant 80 nM marqué FAM strand-déplacement de sonde en temps réel à l’aide des appareil de PCR en temps réel (canal 483-533 nm). Des échantillons ont été incubés à 65° C pour environ 50 min. (B) Fluorescence a été observée mais un filtre orange, suivi par l’excitation des échantillons à 470 nm avec la lumière bleue. Échantillons de A ont été utilisés pour la visualisation. (C) analyse en temps réel pour LOD sur la cible de Chikungunya (CH) à l’aide de 80 nM de HEX-roulement lampe sondes au format singleplex à l’aide de canaux de fluorescence de 523-568 nm sur un appareil de PCR en temps réel. Analyse en temps réel (D) pour LOD sur la Dengue 1 (D1) cibles à l’aide de 80 nM de TAMRA-roulement lampe sondes au format singleplex à l’aide de canaux de fluorescence de 558-610 nm sur un appareil de PCR en temps réel. Dosage (E) de l’urine maximale dans la réaction de RT-lampe. Une gamme de concentrations de l’urine définitive (0 %-50 %) ont été testés à l’aide de la sonde marquée par un FAM de 80 nM en présence de 2,85 pfu de Zika vRNA.NTC ne = aucun modèle de contrôle sur tous les panneaux. Réimprimé avec la permission de Yaren al 201720. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Singleplex et multiplex de détection de virus dans les urines à l’aide de 80 sonde nM. (A) Zika détection dans les urines de 10 % au format singleplex et multiplex à l’aide de 2,85 pfu d’ARN viral Zika (ZV) avec sonde marquée par FAM (80 nM). (B) détection de Chikungunya dans l’urine de 10 % au format singleplex et multiplex utilisant 242 copies d’ARN viral Chikungunya (CH) avec sonde marquée par un sortilège (80 nM). (C) la Dengue 1 détection dans les urines de 10 % au format singleplex et multiplex à l’aide de pfu 1.22 de l’ARN viral de Dengue 1 (D1) avec sonde marquée par TAMRA (80 nM). (D) des réactions de visualisation de RT-lampe par filtre orange après excitation à 470 nm avec lumière LED bleue. Réimprimé avec la permission de Yaren al 201720. NTC ne = aucun modèle de contrôle sur tous les panneaux. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Singleplex et multiplex de détection de virus dans les urines à l’aide de 300 sonde nM. (A) Zika détection dans les urines de 10 % au format singleplex et multiplex à l’aide de 2,85 pfu d’ARN viral Zika (ZV) avec sonde marquée par FAM (300 nM). (B) détection de Chikungunya dans l’urine de 10 % au format singleplex et multiplex utilisant 242 copies d’ARN viral Chikungunya (CH) avec sonde marquée par un sortilège (300 nM). ()C) la Dengue 1 détection dans les urines de 10 % au format singleplex et multiplex à l’aide de 1,22 pfu de Dengue1 ARN viral (D1) avec sonde marquée par TAMRA (300 nM). (D) des réactions de visualisation de RT-lampe par filtre orange après excitation à 470 nm avec lumière LED bleue. Comme témoin positif dans les expériences de l’urine, une amorce de lampe la valeur cible de l’ADN mitochondrial (ADNmt) humain a été utilisée avec la sonde marquée par un TET (300 nM). NTC ne = aucun modèle de contrôle sur tous les panneaux. Réimprimé avec la permission de Yaren al 201720. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Workflow pour la détection de Zika des échantillons de moustique infecté en utilisant la technologie Q-papier avec sains et infectés par Zika Ae. aegypti (ZV 9, tableau 2). Réimprimé avec la permission de Yaren al 201720. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : la zone d’observation. (A) l’observation boîte utilise deux piles AAA dans l’assiette. Ces piles alimentent quatre lumières LED bleues qui illuminent les échantillons détenus dans 0,5 mL tubes placés dans les quatre trous. Les voyants sont allumés avec un interrupteur. Les échantillons sont visualisées à travers le filtre orange. Fluorescence (B) dans la zone d’observation. De gauche à droite : négatifs et positifs pour Zika, négatif et positif pour Zika. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Virus de la cible | Nom | Séquence (5' - 3') | Longueur | Position de départ | Fin de course | |||
| Zika | ZV-F3 | GAGACTGCTTGCCTAG | 16 | 9905 | 9920 | |||
| ZV-B3 | CTGGGGTCTTGTCTTC | 16 | 10145 | 10130 | ||||
| ZV-LF | CAGTTGGAACCCAGTCAAC | 19 | 10028 | 10010 | ||||
| ZV-LB | GTGGAACAGAGTGTGGATTG | 20 | 10093 | 10112 | ||||
| ZV-FIP | CCATGGATTGACCAGGTAGTTTTTTCGACTGATGGCCAATG | 41 | 9974 | 10053 | ||||
| ZV-BIP | ACCACTGARGACATGCTTGTTTTTCATGTGGTCGTTYTCC | 40 | 10070 | 10129 | ||||
| ZV-LB_NatTail |
FAM-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG GTGGAACAGAGTGTGGATTG |
60 | 10093 | 10112 | ||||
| Chikungunya | CH-F3 | CGTCAACGTACTCCTAAC | 18 | 2891 | 2908 | |||
| CH-B3 | ACGTTGGCTTTRTTTTGG | 18 | 3094 | 3077 | ||||
| CH-LF | AGCGTCTTTATCCACGGG | 18 | 2968 | 2951 | ||||
| CH-LB | AYGCATCRATAATGGCGGG | 19 | 3025 | 3043 | ||||
| CH-FIP | GAAGTTTCCTTTCGGTGGGTTTTTGGAAGACACTYTCYGG | 40 | 2932 | 2993 | ||||
| CH-BIP | AAGGAGTGGGAGGTGGATTTTTTCAYTTGGTGACTGCAG | 39 | 3006 | 3063 | ||||
| CH-LF_NatTail |
HEX-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG AGCGTCTTTATCCACGGG |
58 | 2968 | 2951 | ||||
| La dengue-1 | D1-F3 | ACAGCYCTGAATGAYATGG | 19 | 9583 | 9601 | |||
| D1-B3 | GCAGTTTCTCTCAGGC | 16 | 9803 | 9788 | ||||
| D1-LF | CACTTGYTGCCARTCATTCC | 20 | 9666 | 9647 | ||||
| D1-LB | CCATGCCGYAACCAAG | 16 | 9727 | 9742 | ||||
| D1-FIP | CTGGTGGAARTGGTGTGATTTTTTGGGAACCTTCAAAAGG | 40 | 9628 | 9693 | ||||
| D1-BIP | GAAGGAYGGGAGGGAAATAGTTTTTTTAGCCCTRCCCA GCPC |
42 | 9702 | 9763 | ||||
| D1-LB_NatTail |
TAMRA-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG CCATGCCGYAACCAAG |
56 | 9727 | 9742 | ||||
| ADN mitochondrial | ADNmt-F3 | AGCCTACGTTTTCACAC | 17 | 9183 | 9199 | |||
| ADNmt-B3 | GCGCCATCATTGGTAT | 16 | 9410 | 9395 | ||||
| ADNmt-LB | GCCTAGCCATGTGATTTCAC | 20 | 9322 | 9341 | ||||
| ADNmt-LF | GGCATGTGATTGGTGGGT | 18 | 9254 | 9237 | ||||
| ADNmt-FIP | GTCATGGGCTGGGTTTTACTTTTTCTACCTGCACGACAAC | 40 | 9213 | 9228 | ||||
| ADNmt-BIP | CTCAGCCCTCCTAATGACCTTTTTGAGCGTTATGGAGTGG | 40 | 9359 | 9344 | ||||
| ADNmt-LB_NatTail |
TET-CGGGTTTGCGCTCAGCCATCCGTTCAGTCCGTCAGGTCAG GCCTAGCCATGTGATTTCAC |
60 | 9322 | 9341 | ||||
| Extincteur commune | CTGACCTGACGGACTGAACGGATGGCTGAGCGCA AACCCG-Iowa FQ noir |
40 | ||||||
Tableau 1 : amorces et sondes déplaçable strand. Réimprimé avec la permission de Yaren al 201720. Séquences en gras représentent la région de double-brin de brin, déplaçant des sondes. FAM-étiquetés (considérée comme la fluorescence verte), marqué HEX (vu aussi légère fluorescence vert-jaune), TAMRA marqués (considérée comme la fluorescence orange-rouge) et marqués au TET (considérée comme la fluorescence jaune) sondes ont été assignés à détecter Zika, Chikungunya, Dengue 1, et l’ADN mitochondrial dans les urines, respectivement. FAM a maxima d’excitation et d’émission à 495 nm et 520 nm, respectivement. HEX a maxima d’excitation et d’émission à 538 nm et 555 nm, respectivement. TAMRA a maxima d’excitation et d’émission à 559 nm et 583 nm, respectivement. TET a l’excitation et les maxima à 522 nm et 539 nm, respectivement. Pour activer l’utilisation d’un extincteur unique pour tous les fluorophores, Iowa noir-FQ a été utilisé en raison de son aire de répartition d’absorption large (420-620 nm).
| Virus, souche (numéro d’accession GenBank) | Famille/genre | Titres viraux |
| Zika virus (ZV), Porto Rico (PRVABC59, KU501215.1) | Flaviviridae/Flavivirus Groupe IV, positif, ARN simple brin | 2,85 x 108 UFP/mL |
| Virus Chikungunya (CH), Iles vierges (lignée asiatique, KJ451624) | ARN simple brin positif, Togaviridae/Alphavirus Groupe IV, | 2.42 x 108 génomes/mL |
| Virus Chikungunya (CH), La réunion (océan Indien de la lignée, LR2006-OPY1, KT449801) | ARN simple brin positif, Togaviridae/Alphavirus Groupe IV, | 1.89 x 108 génomes/mL |
| Le virus Chikungunya (CH), extrait de La Reunion NA total Aedes aegypti femelle (lignée de l’océan Indien, LR2006-OPY1, KT449801) | ARN simple brin positif, Togaviridae/Alphavirus Groupe IV, | 3,85 x 105 génomes/mL |
| Sérotype de dengue 1 (D-1), Key West (Floride) (JQ675358) | Flaviviridae/Flavivirus Groupe IV, positif, ARN simple brin | 1,22 x 106 UFP/mL |
| Identité de moustique Zika (ZV), souche | Titre de jambe UFP/mL | |
| ZV 9, Puerto Rico | 4.76 x 103 |
Tableau 2 : les titres viraux dans les cultures cellulaires et moustique infecté. PFU : unité de formation de plaques. Réimprimé avec la permission de Yaren al 201720.
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Discussion
Virus transmises par les moustiques, y compris Zika, chikungunya et dengue menacent la santé publique et la surbrillance de flambées récente Zika la nécessité des alternatives de détection de point-of-care de faible coût pour le diagnostic de patients, ainsi que pour la surveillance des moustiques. L’amplification isotherme méthodes ont été développées comme solutions de rechange abordables aux systèmes basées sur la PCR. En particulier, RT-lampe-plates-formes ont été appliquées pour détecter un large éventail d’agents pathogènes. Cependant, l’utilisation des plateformes isothermes a été surtout limitée à la détection de cible unique. La méthode mentionnée ici utilise une mis à jour le RT-lampe pour permettre la détection simultanée des trois cibles différentes dans un mélange de réaction unique, qui se déroule à une gamme de températures modérées (65-68 ° C), s’est avérée particulièrement commode parce que des températures supérieures à 60 ° C rendre Zika et autres virus non-infectieux30,35.
En outre, les données présentées ici montrent que RT-lampe est capable de tolérer inhibant les substances qui pourraient être présentes dans divers liquides biologiques15. Cela permet à l’ARN viral à amplifier sans une étape supplémentaire de la purification de RNA en ajoutant directement l’échantillon dans le mélange réactionnel. Selon le type d’échantillon, le volume maximal d’échantillon autorisés doit être déterminée quant à pas inhiber la réaction et ne provoque pas de fluorescence de fond (faux positif). L’étude présentée ici se concentre sur l’utilisation du volume final de 10 % pour les échantillons d’urine. Toutefois, les échantillons de salive et de sérum aussi peuvent être appliqués qu’à l’analyse de la même manière20. Limites de détection se sont révélés bien au-dessus de la charge virale déclarée dans le patient urine13, ainsi que des moustiques infectés par le virus de36,20,37.
Surveillance des moustiques a généralement une priorité plus faible pour les ressources de santé publique, donc un peu coûteux multiplexés kit d’arpenter un ménage ou une zone publique aurait pour valeur spéciale. Par conséquent, ce kit a été modifié par l’ajout de Q-papier pour permettre la détection de virus dans le moustique carcasses. Q-papier contient des niveaux élevés des groupes ammonium quaternaire par covalence attaché, qui permet la capture des acides nucléiques viraux sur sa surface grâce à l’interaction coulombienne. Même si c’était un sujet de préoccupation que Q-papier pourrait inhiber la RT-lampe, il a été constaté qu’en ajoutant des carcasses de moustique porteurs Q-papier directement dans le mélange de RT-lampe, détection de virus avec succès pourrait être atteint dans les 30 minutes. Pour la génération de signaux avec succès, Q-papier doit être petit assez (p. ex., taille 3 x 4 mm pour le volume de réaction 100 µL) à être submergés dans le mélange réactionnel de RT-lampe. S’il est trop grand pour le tube de réaction, ou commence à flotter au lieu de rester immergé dans le liquide, la réaction ne peut pas avoir lieu et les résultats peuvent apparaître sous forme de faux négatifs.
Pour la détection réussie et la différenciation de chaque virus, chaque amorce définie doit suivre les lignes directrices pour la conception d’amorce de RT-lampe, les règles de conception permettant de deplacer les sondes et incluent un choix des fluorophores pour le multiplexage. Chaque amorce la valeur doit être projeté contre des cibles différentes pour éviter des réactions croisées. En outre, la température d’incubation et de la concentration de magnésium doivent être optimisé pour chaque jeu. Méthodes présentées ici utilisent des lectures de fluorescence visibles par le œil, qui a été accompli en introduisant le brin sondes déplaçable à l’architecture RT-lampe. Trois couleurs distinctes peuvent être visualisées dans un essai multiplexé lorsque fluorophores différents ont été assignés à chaque virus cible. Ceci fournit des avantages sur les méthodes de détection Zika isothermes, étant donné que la plupart des méthodes publiées s’appuient sur la détection de cible unique et l’utilisation de colorants intercalant ou la fluorescence, qui ne sont pas des séquences spécifiques et sont susceptibles de générer amplicons non-spécifique.
Une étape cruciale à considérer est la détermination de la concentration finale de sondes deplaceur fluorescent étiquetés. On a constaté que 80 à 100 nM de déplacer les sondes pourrait générer des signaux de fluorescence dans les 15-20 min, alors que le temps de signal a été retardé alors que 300 nM de la concentration de la sonde a été utilisé. Temps de réaction a été repoussée lorsque les dosages ont été testés de façon multiplexée. La raison pour la commutation de 80 nM à 300 nM était de permettre la visualisation des trois fluorochromes à l’aide d’une source unique de la LED. Bleu LED avec excitation à 470 nm est adapté aux sondes marquées à la FAM, mais est moins approprié pour HEX ou TAMRA-sondes marquées à la. Par conséquent, un sacrifice était fait sur le temps d’incubation pour pouvoir visualiser les trois cibles.
Un des problèmes avec la RT-lampe est contamination vers l’avant. RT-lampe produit de grandes quantités d’amplicon dans un temps d’incubation courte, et les amplicons pourraient être facilement libérés sous forme d’aérosols. Pour atténuer ce problème, dUTP figurait ainsi que d’autres dNTPs suivie par digestion UDG lors de l’installation de dosage. Il est important d’utiliser une version thermolabile de l’UDG, puisqu’il est nécessaire inactiver UDG pour empêcher la digestion des amplicons de RT-lampe nouvellement créées.
Pour permettre la distribution du kit sans réfrigération, tous les composants du dosage nécessaire pour être lyophilisées et le kit complété avec un tampon de réhydratation. Par conséquent, toute glycérol présent dans les enzymes disponibles dans le commerce a été supprimé par ultrafiltration parce que le glycérol ne peut être enlevée par lyophilisation. À une concentration élevée dans un mélange, glycérol peut interférer avec l’activité enzymatique. La seule enzyme non inclus dans le processus de suppression de glycérol était l’UDG thermolabile. UDG est une enzyme petite avec masse moléculaire du kDa 24,6, rendant impropre pour des expériences de l’ultrafiltration. Par conséquent, il a été ajouté au mélange de lyophilisation achetées. Le glycérol résiduelle n’affecte pas négativement les résultats de l’essai.
Une des limites de cette technique de RT-lampe fluorescente est l’utilisation de la source unique de la LED. Lorsque des essais ont été testés au format multiplex ou de singleplex, des concentrations plus élevées de remplacement des sondes étaient nécessaires pour la visualisation du signal de toutes les cibles. Toutefois, ce changement était source de retards dans la production de temps-à-signal. Une façon possible de résoudre ce problème pourrait être l’utilisation de deux sources de LED pour mieux accueillir les autres fluorophores (HEX et TAMRA). De cette façon, plus faible concentration en sonde pourrait servir pour générer un signal avec des temps d’incubation plus courtes.
Une autre limitation qui mérite un examen est juger la couleur de la fluorescence par œil dans un environnement faiblement éclairé. Il est plus facile si une cible unique se trouve dans un singleplex ou un format multiplex, puisque les amorces ont été conçus pour ne pas interagir entre eux. Le test serait plus difficile à interpréter si plusieurs cibles étaient présents dans un tube à essai unique, tel qu’un pool de moustiques ou d’un patient avec plus d’une infection virale. Cela nécessiterait une modification de l’architecture de lecture, comme un affichage numérique plutôt qu’à en juger par le œil.
Une approche future possible serait d’augmenter le niveau du multiplexage en créant un plus grand panel d’arbovirus transmises par les moustiques. Cela requiert attention amorce concevoir d’éviter des interactions amorce-primer et peut nécessiter l’utilisation des analogues d’acide nucléique modifiés comme éviter des systèmes de reconnaissance moléculaire (SAMRS) et artificiellement étendu système d’information génétique (AEGIS) à mieux répondre aux besoins de haut niveau du multiplexage38. Par conséquent, la solution pour lecture de signal en un système multiplex plus serait d’utiliser un fluorophore unique pour chaque sonde deplaceur, assigner une séquence unique de déplacés pour chaque cible et capturer les sondes déplacés sur une surface solide par l’ADN hybridation. Cela créerait une plate-forme au format tableau avec un fluorophore seul et LED pour exciter, mais jugeant la présence de chaque cible se fonderait sa position dans le tableau39.
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Disclosures
Plusieurs des auteurs et leurs institutions propres propriété intellectuelle associée à ce test.
Acknowledgments
Le travail a été soutenu en partie par 1R21AI128188-01 FDOH-7ZK15 et NIAID. Recherche rapporté dans cette publication a été financée en partie par le National Institutes of Allergy and Infectious Diseases et en partie par Biomedical Research Programme du Florida Department of Health. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles du NIH ou Florida Department of Health. LLC de chimie combinatoire dynamique est reconnu pour leur soutien et leur contribution à ce projet.
Virus de la dengue 1 (souche BOL-KW010) a été aimablement fourni par le département de Florida le Bureau santé des laboratoires. Zika virus et la lignée asiatique du virus du chikungunya ont été gracieusement fournis par les centres pour Disease Control and Prevention. La lignée de l’océan Indien du virus chikungunya a été aimablement fournie par Robert Tesh (Centre de référence mondiale pour les virus émergents et arbovirus, par le biais de l’University of Texas Medical Branch à Galveston, Texas, États-Unis) à l’UF-FMEL. Nous remercions S. Bellamy, B. Edouard, S. Ortiz, D. Velez, K. Wiggins, ZimLer r. et K. Zirbel d’assistance avec les études d’infection. Nous remercions également M. S. Kim pour la fourniture de papier Q.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SafeBlue Illuminator/ Electrophoresis System, MBE-150-PLUS | Major Science | MBE-150 | Gel electrophoresis |
| G:BOX F3 | Syngene | G:BOX F3 | Gel imaging |
| LightCycler 480 Instrument II, 96-well | Roche Applied Science | 05 015 278 001 | Real-time PCR |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore Sigma | UFC501096 | ultrafiltraton membrane for dialysis |
| Eppendorf 5417C Centrifuge | Marshall Scientific | EP-5417C | centrifuge |
| Myblock Mini Drybath | Benchmark Scientific | BSH200 | drybath |
| FreeZone Plus 6 Liter Cascade Console Freeze Dry System | Labconco | 7934020 | lyophilizer |
| all priers and probes | IDT | custom | RT-LAMP primers and probes |
| dNTP set | Bioline | BIO-39049 | |
| Deoxyuridine Triphosphate (dUTP) | Promega | U1191 | |
| Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase | New England Biolabs | M0538L | enzyme |
| WarmStart RTx Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0380L | enzyme |
| RNase Inhibitor, Murine | New England Biolabs | M0314L | enzyme |
| Antarctic Thermolabile UDG | New England Biolabs | M0372L | enzyme |
| 50bp DNA Step Ladder | Promega | G4521 | marker |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Applied Science | 4729692001 | real-time RT-LAMP analysis |
References
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