Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Examinar las conexiones Monosynaptic en Drosophila utilizando canales de sodio Tetrodotoxin resistentes

Published: February 14, 2018 doi: 10.3791/57052

Summary

Este artículo presenta un método para probar las conexiones monosynaptic entre neuronas mediante el empleo de tetrodotoxin y el canal de sodio tetrodotoxin resistentes, NaChBac.

Abstract

Aquí, se aplica una nueva técnica denominada Tetrotoxin (TTX) resistencia diseñado para sondeo sinapsis (TERPS) para probar conexiones monosynaptic entre neuronas de destino. El método se basa en la expresión de un activador de transgénico con el canal de sodio tetrodotoxin resistentes, NaChBac, en la neurona presináptica específico. Conexiones con supuestos socios postsinápticos dependen de grabaciones de celulares en presencia de TTX, que bloquea la actividad eléctrica de las neuronas que no expresan NaChBac. Este enfoque puede ser modificado para trabajar con cualquier activador o proyección de imagen de calcio como un reportero de conexiones. TERPS agrega al conjunto creciente de herramientas disponibles para determinar la conectividad en redes. Sin embargo, los TERPS es único en que confiablemente también divulga a granel o transmisión de volumen y derrame transmisión.

Introduction

Una meta importante de la neurociencia es mapear las conexiones entre las neuronas para entender cómo fluye la información a través de circuitos. Numerosos enfoques y recursos se han convertido en disponibles para probar la conectividad funcional entre las neuronas en una gama de modelo sistemas1,2. Para generar los diagramas más precisos utilizando electrofisiología, es importante resolver si las conexiones observadas entre dos células son directos y monosynaptic versus indirecta y polysynaptic. Un estándar de oro para hacer esta distinción en las neuronas mamíferas es medir la latencia entre action potentials solo en las células presinápticas y la aparición de corrientes postsinápticas excitatorias (EPSCs) en la segunda neurona. Conexiones monosynaptic deben tener latencias cortas de unos pocos milisegundos y baja variabilidad3. Este enfoque puede ser complicado en invertebrados neuronas porque las sinapsis pueden ocurrir en sus dendritas lejos del sitio de grabación somáticos, provocando retrasos en la detección debido a las distancias largas electrotónicos entre conductancias postsinápticas y la grabación electrodo. Estos retrasos pueden introducir ambigüedad con respecto a poli-versus contribuciones monosynaptic. Además, pequeños eventos sinápticos puede decaer antes de llegar a la página grabaciones somática y conducir la actividad presináptica más fuerte, es probables que contratar eventos polysynaptic.

Han desarrollado varias técnicas para probar las conexiones monosynaptic en invertebrados. Un método utiliza soluciones de cationes divalentes alta (Hi-Di) que contiene exceso de magnesio++ y Ca++. Esta solución bloquea conexiones polysynaptic reduce probabilidad de liberación y aumento umbral potencial de acción a favor de la detección de monosynaptic entrada4,5. Determinar la proporción exacta de Mg++ ++ de CA requiere, sin embargo, no es trivial y polysynaptic contribuciones pueden persistir incluso modesta estimulación6. Un enfoque alternativo denominado reconstitución GFP a través de socios sináptica (GRASP) aprovecha la proximidad entre las membranas previas y postsinápticas en sinapsis para inferir una conexión monosynaptic 7. Aquí, un componente de la proteína verde fluorescente (GFP) se expresa en una neurona, y el fragmento complementario de la molécula se expresa en un supuesto socio postsináptico. La presencia de fluorescencia indica que las dos neuronas están lo suficientemente cerca para permitir la reconstitución de la molécula GFP e implica la existencia de sinapsis. ASIMIENTO puede Informe sinapsis falso, sin embargo, si dos celdas han estrechamente apposed membranas, como en un nervio o fascículo. Variantes del asimiento de eliminan tales falsos positivos por atar el presináptico fragmento de GFP directamente a synaptobrevin, permitiendo así la reconstitución solamente en sinapsis activa8. Mientras que asimiento y sus variantes han sido instrumentales en la determinación de conectividad funcional en la Drosophila del CNS, algunas conexiones pueden no hacerse visibles por comprensión si las distancias entre los socios pre- y postsinápticas es relativamente grande. Esto es particularmente pertinente en la evaluación de la transmisión de volumen asociada a neuromodulación9 o GABAérgicas inhibición10.

Aquí, se demuestra una técnica complementaria y novedosa para probar conexiones monosynaptic directas en Drosophila del CNS. Este método, llamado tetrodotoxina resistencia diseñado para sondeo sinapsis (TERPS), funciona por la coexpresión de la tetrodotoxina (TTX)-canal sodio resistente, NaChBac y un activador de optogenetic en una célula presináptica durante la grabación de la supuesta socios postsynaptic9. En presencia de TTX, se suprime toda actividad mediada por el potencial de acción en células distintas de las que NaChBac. El canal de NaChBac selectivamente restaura la excitabilidad en las celdas presinápticos específicos, permitiendo la transmisión sináptica evocada por la luz. Este método permite la fuerte activación de las neuronas presinápticas, tal que las conexiones se pueden resolver postsynaptically somática grabación mientras reduce la probabilidad de contratar circuitos polysynaptic. Importante, esta técnica permite el estudio de la transmisión de volumen y revela la difusión del transmisor liberado de una sola neurona a lo largo de un circuito. Además, los TERPS puede revelar la naturaleza química de la conexión a través de la farmacología convencional. TERPS es conveniente para el uso en cualquier modelo de sistema que permite la expresión transgénica de los canales de sodio TTX-insensible.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. preparar moscas y promotor de GAL4 identificar líneas

  1. Seleccione una línea de promotor de GAL4 y cruzar con las moscas con el transgén de UAS-NaChBac y un transgen de optogenetic para la activación.
    Nota: CsChrimson UAS11 se selecciona debido a su alta conductancia y la facilidad con la cual activa mediada por NaChBac los potenciales de acción. UAS-NaChBac y UAS-CsChrimson están disponibles en el repositorio de las poblaciones de Bloomington.
  2. Preparar todo-trans retinal como una solución en etanol (35 mM) y guardar la solución en el congelador a-20 ° C.
  3. Mix 28 μl de este stock en aproximadamente 5 mL de patata rehidratado escamas alimento y añadir esta mezcla a la parte superior de un frasco de medios convencionales de Drosophila .
  4. Criar moscas adultas expresar csChrimson en alimentos que contienen 0,2 mM all-trans-retinal para 1 – 3 días11.

2. preparar Stock TTX

  1. Crear una solución stock de 1 mM TTX en agua destilada o desionizada. Almacenar esta solución en un refrigerador de laboratorio durante varios meses. Revise las políticas de las instituciones en relación con el almacenamiento de TTX como muchas instituciones clasifican TTX como una sustancia peligrosa o controlada.

3. preparar moscas para electrofisiología

  1. Recoger 1 – 3 días adulto viejo vuela que sobresalen en la comida con todo-trans-retinal.
    Nota: Consulte Murthy y Turner en 2013 para una descripción detallada del parche sujeción Drosophila las neuronas12,13.
  2. Poner las moscas en un vial de centelleo de vidrio. Coloque el frasco en hielo durante 1 minuto inmovilizar a las moscas.
  3. Utilizar pinzas gruesas para insertar una mosca en una cámara de grabación a medida. La cámara consta de un 3 ½" círculo corte láser de acrílico de 1/16". Corte un agujero de ¾" está en el centro donde se une una hoja personalizada con epoxy en 2 partes. La hoja contiene un triangular en forma de esperanza de que la mosca se le introduce.
  4. Aplique cera o epoxi curable UV alrededor del animal para fijarla firmemente dentro de la cámara de grabación.
  5. Iluminar la preparación con un cuello de cisne de fibra óptica para visualización bajo un estereomicroscopio. Fijar las fibras de cuello de cisne para la iluminación oblicua ajustando para que iluminan la marcha directamente desde el lado.
  6. Ajustar el nivel de luz a la posición más baja posible que todavía permite la clara visualización de la mosca. Esta intensidad de la luz variará a través de experimentos individuales.
    Nota: Este protocolo puede ser adaptado mediante el uso de un in situ cerebro explante método14.
  7. Recuperar la solución salina de grabación externos. La solución salina contiene en mM: NaCl 103, 3 KCl, 5 N-tris (hidroximetil) metil-2-aminoethane-sulfónico, trehalosa 8, glucosa 10, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4, 1.5 CaCl2y 4 de MgCl2 (ajustado a mΩ 270 – 275). La solución salina es burbujeada con 95% O25% CO2 (carbogen) y cuenta con un pH ajustado a 7.315.
  8. Coloque 4-6 gotas de solución salina de grabación extracelular sobre la preparación de la mosca. En este punto, aumentar el nivel de luz en el microscopio de disección para una mejor visibilidad.
  9. Afilar un alambre de tungsteno mediante electrólisis. Para hacer el cable, preparar una solución saturada de KNO3 y aplicar aproximadamente 20 V de CA corriente sumergir la punta del alambre en la solución 20 veces para 100 ms hasta que la punta es afilada. Use el alambre de tungsteno afilada para quitar la cutícula sobre la cabeza de la mosca y exponiendo el cerebro.
  10. Además exponer el cerebro quitando tráquea y cuerpos grasos que lo rodean. Si acceder a los lóbulos antenales, use un alambre de tungsteno doblado o una herramienta similar a meter suavemente antenas por debajo de la hoja de grabación cámara para aumentar la visibilidad. Utilice pinzas afiladas para rasgar suavemente lejos el revestimiento glial que cubre el área de interés donde se harán grabaciones.
  11. Transferencia de la cámara de grabación a la plataforma de electrofisiología. Inmediatamente iniciar la perfusión con solución salina de grabación externo burbujas con carbogen para preservar el cerebro. El depósito de solución salina se coloca sobre la platina del microscopio y es gravedad-alimentó a la preparación. Utilice una línea de vacío y un matraz de Erlenmeyer de 2 L para recoger los residuos salinos.

4. obtener el registro de celulares

  1. Tire un extractor comercial pipeta pipetas de parche. Consulte el manual de configuración conseguir una pipeta adecuada con una resistencia de punta cerca de mΩ 7.
  2. Añadir 4 μL de solución de grabación interno en una pipeta de parche. La solución salina interna consta de aspartato de potasio 140, 10 HEPES, MgATP 4, Na 0,53GTP, 1 EGTA y 1 KCl en mM.
  3. Configurar el amplificador de abrazadera de parche para registro de celulares. Cero offset del amplificador y el amplificador para entregar pulsos de prueba. Aquí, se utiliza un amplificador de abrazadera AM sistemas parche 2.400.
  4. Aplicar presión positiva a través de la pipeta y acercarse a la célula. Uso de un micromanipulador para dirigir la pipeta y en contacto con la célula. Libere la presión positiva. Conjunto del explotación potencial de la membrana a -60 mV. La pipeta debe formar un sello gigaohm con membrana de la célula según lo evidenciado por una sub-picoamp bajo tenencia actual.
    Nota: Si usando GFP celular objetivo, intentar minimizar el uso de la luz epifluorescente para evitar activación de ChR2 y potencial depresión sináptica. También espere unos minutos antes de aplicar el paso 5.
  5. El amplificador para entregar pulsos de prueba de -50 mV a -60 mV. Esta opción es estándar en los amplificadores de la abrazadera del remiendo. Pulsos de prueba revelará un gran capacitativa transitorio que representa la corriente necesaria para cargar la pipeta patch. Eliminar transitorios capacitativa ajustando las perillas de la compensación de capacidad en el AM 2400 o similar amplificador.
  6. Se aplican breves impulsos de presión negativa para romper la membrana celular y obtener configuración de celulares.
    Nota: Una configuración de células enteras se observa cuando hay un gran aumento en los transitorios capacitativa mostrando la capacitancia de la neurona. Un pequeño aumento en la explotación actual (línea base) es probable que también se observará. El amplificador a modo de pinza y ajuste potencial de la célula de -50 a -60 mV.

5. probar la conectividad sináptica

  1. Configurar el sistema de adquisición (DAQ) de datos para activar un controlador LED para generar pulsos de luz. Aquí, se utiliza un sistema DAQ instrumentos nacionales con Matlab para entregar una señal analógica a un conductor del LED. La intensidad del LED se ajusta a través de la señal analógica al conductor. El LED es 620-630 nm longitud de onda LED.
  2. Coloque el LED rojo alta potencia directamente debajo de la preparación. Ajustar la intensidad de luz para que la mosca llegue a 0.238 mW/mm2 .
  3. Activar las neuronas presinápticas durante la grabación de la célula postsináptica de interés. Lograr optogenetically de activación de la célula, pharmacogentically, o a través de la estimulación nerviosa. Aquí, se aplican csChrimson y pulsos breves de luz roja.
    Nota: Las conexiones sinápticas pueden ser monitoreadas en pinza como EPSPs o abrazadera del voltaje como EPSCs. Una conexión sináptica debe ser visible antes de aplicar la TTX en respuesta a un pulso de luz de 40 ms. Si no se observa ninguna conexión, no es probable que las neuronas synaptically están conectados ya sea mono - o polysynaptically. La explotación potencial puede ajustarse para enfatizar las conexiones excitatorias o inhibitorias en consecuencia.
  4. Si una conexión se observa en solución salina normal, añadir TTX al sistema de perfusión para lograr una concentración final de 1 μm. Utilice una bomba de recirculación para capturar y reutilizar la solución salina para conservar la TTX. La bomba peristáltica se dibuja la solución salina del baño y volver al depósito de solución salino.
  5. Ajustar la velocidad de la bomba para proporcionar un fuerte vacío constante que no permite ese nivel salino en el baño al subir y bajar.
    Nota: La aplicación de TTX dará lugar a la cesación de clavar la actividad en la neurona que se está controlando en célula entera. Esto confirma que suficiente TTX ha sido añadido a la solución salina.
  6. Volver a aplicar pulsos breves de luz roja (40 ms para cada pulso). En este punto, es probable que cualquier conexión sináptica que permanece monosynaptic. Añadir a antagonistas farmacológicos a la solución salina recirculación para probar la naturaleza química de las conexiones sinápticas que permanecen en la TTX.
    Nota: Cuando se combinan optogenetics y focalización fluorescente de neuronas, puede ser importante no activar persistentemente la población presináptica de las neuronas, tratando de obtener una grabación. Esto puede conducir a la depresión sináptica y hace difícil ver las conexiones. Porque csChrimson tiene una banda de excitación larga que se extiende ampliamente en la gama de la proteína verde fluorescente, un fluoróforo rojo puede utilizarse para visualizar neuronas y channel2rhodopsin (Ch2R) puede utilizarse para excitar a las poblaciones de la célula. Hacerlo requiere genética específica y un cubo de filtro personalizado. Para generar moscas adecuadas, hacer moscas que expresan el fluoróforo rojo (RFP o mCherry) bajo los sistemas de expresión binaria de sistema LexA o Q. Estos tendrán que ser cruzado con moscas expresando un promotor Gal4 y UAS-Ch2R y UAS-NaChBac genes efectores. El cubo de filtro óptimo para epifluorescencia tendrá una gama estrecha de excitación excitar el fluoróforo rojo, pero no excita Ch2R. Además, el sistema de filtro debe incluir un filtro de emisión del pase largo para recoger la mayor cantidad de luz emitida. Se utilizó un filtro personalizado de croma que incluía números de parte et580/25 x y t600lpxr (del conjunto 49306), pero con un filtro de barrera/emisión de et610lp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

TERPS se utiliza para distinguir entre mono - y polysynaptic en conexiones sinápticas entre las neuronas. Mientras que una estimulación débil de una célula puede utilizarse para probar las conexiones directas, conduciendo a una mayor actividad presináptica a menudo reclutas polysynaptic conexiones (figura 1A). TERPS funciona Co expresando el canal de sodio TTX-insensible NaChBac y un activador de optogenetic y pruebas de conexiones en presencia de TTX para eliminar conexiones polysynaptic (figura 1B). TTX bloquea eficazmente los potenciales de acción en el cerebro de la Drosophila , lo que es una preparación adecuada para TERPS (figura 2A). Expresión transgénica del canal de sodio NaChBac rescata la excitabilidad en las neuronas y los resultados en un potencial gran plateau (figura 2B).

Interneuronas locales (LN) en el lóbulo antenal muestran sólidas respuestas al estímulo olfativo (Figura 3A). Sin embargo, porque EPSPs individuales no son fácilmente resueltas en el soma de la LN, no queda claro si estas respuestas surgen directamente de la entrada de la neurona olfativa del receptor (ORN) o indirectamente la entrada a través de las neuronas de proyección (PN) (figura 3B). Utilizando TERPS, ORNs se muestra aquí, de hecho hacen conexiones sinápticas directas con LNs (figura 3).

Una característica única de la TERPS es su capacidad para resolver específicamente la transmisión de volumen extra sináptica que puede ocurrir con GABA o neuromoduladores como la serotonina. Estimulación de una neurona serotonergic (CSDn) en el lóbulo antenal de Drosophila resulta en una mezcla de excitación y la inhibición de una interneurona local (Figura 4A y Figura 4B). La excitación es meditada por la acetilcolina transmisor excitatorio y la inhibición es causada por serotonina (figura 4 y figura 4). TERPS puede utilizarse para determinar si las conexiones monosynaptic eliminando conexiones polysynaptic (figura 4E). En TTX, una fuerte inhibición se observa todavía en el LN, sugiriendo que llega desde directamente en la activación de una neurona serotonergic específica (figura 4F y figura 4). Esta conexión está bloqueada por la metisergida antagonista de serotonina. La sinapsis excitatoria mediada por acetilcolina fue eliminada en TTX, sugiriendo que se presentó de polysynaptic fuentes.

Figure 1
Figura 1 : TERPS elimina conexiones polysynaptic y aísla entradas monosynaptic. (A). un diagrama esquemático que muestra que el aumento de la actividad presináptica puede reclutar polysynaptic conexiones. (B). un diagrama que ilustra cómo TERPS puede quitar polysynaptic contribuciones mediante TTX para eliminar actividad clavaba en las neuronas. La excitabilidad se restablece exclusivamente en una población de neuronas que puede ser excitado optogenetically. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : NaChBac restaura la excitabilidad neuronal en Drosophila neuronas. (A) la aplicación de 1 μm que TTX suprime clavar en las neuronas de la Drosophila . La actividad espontánea y evocada por el olor de la inhibición se eliminarán TTX. (B) NaChBac y csChrimson se expresan en la CSDn y el cerebro se expone a la TTX. csChrimson estimulación despolarizan la CSDn y después se cruza un umbral, hay gran aumento en el voltaje de la membrana de la CSDn no lineal. Esta despolarización rápida constituye un potencial de meseta-como (recuadro). Cada color a través de intensidades de la simulación se corresponde con el mismo color en el margen de tensión. Esta figura ha sido modificada de Zhang y Gaudry 20169. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : TERPS revela conexiones monosynaptic entre ORNs y LNs. Grabación de muestra (A) A que muestran una respuesta de olor en un LN. Esta respuesta puede ser mono o polysynaptic en la naturaleza. TERPS (B) puede ser probado en la ORN a sinapsis LN. TTX se utiliza para bloquear los potenciales de acción y excitabilidad en todas las células en la preparación. Excitabilidad es restaurada exclusivamente en las ORNs vía el canal de sodio NaChBac. Las ORNs entonces pueden ser excitadas con channelrhodopsin para obtener la liberación sináptica. Eventos sinápticos se miden postsinápticamente usando grabaciones de celulares. (C) TERPS revela que la ORN a sinapsis LN es monosynaptic. TERPS puede combinarse también con farmacología para mostrar que la sinapsis colinérgica y bloqueado por el receptor nicotínico antagonista mecamilamina (200 μm). La barra vertical gris indica el momento de la estimulación de la ORN. Esta cifra ha sido modificada de Zhang y Gaudry en 20169. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : TERPS es sensible al volumen o a granel transmisión liberación de moduladores neuronas. (A) la estimulación de los resultados de la CSDn en un potencial de acción de un LN registrada en el lóbulo antenal de Drosophila . (B) el LN es hyperpolarized para que CSDn estimulación resulta en una actividad subliminal. La respuesta de LN consiste en una rápida despolarización seguida de una hiperpolarización más lento. La barra gris denota el momento de la estimulación de la CSDn. Metisergida (50 μm), un antagonista de receptor 5-HT amplio, bloquea la hiperpolarización lenta pero no tiene efecto sobre la despolarización. Mecamilamina bloquea la despolarización rápida, sugiriendo que es colinérgica en la naturaleza. TERPS (C) puede utilizarse para resolver los componentes químicos de la CSDn a sinapsis LN son mono-versus polysynaptic. (D) la CSDn es estimulada en presencia de TTX y postsinápticas respuestas LN se miden en grabaciones de celulares. La hiperpolarización persiste en TTX es monosynaptic en la naturaleza. Esta hiperpolarización también es bloqueado por la metisergida, consistente con la transmisión serotonergic. La despolarización breve que sigue TTX probablemente es mediada por brecha eléctrica enganche, como no bloqueados por antagonistas nicotínicos. Esta cifra ha sido modificada de Zhang y Gaudry en 20169. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo complementario 1: hoja de Drosophila. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 2: fisiología cámara. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Análisis TERPS complementan técnicas actuales utilizadas para circuito agrietarse permitiendo la detección de las sinapsis entre las neuronas identificadas. Específicamente, el enfoque revela conexiones monosynaptic por silenciamiento ampliamente los potenciales de acción con TTX restableciendo la excitabilidad en una población selecta de neuronas con el canal de sodio TTX-insensible NaChBac. Liberación sináptica se produce por el estímulo de optogenetic mientras que eventos postsinápticos son monitoreados con grabaciones de celulares. TERPS se distingue de otros enfoques como el asimiento por ser sensible a granel o transmisión de volumen provocada en largas distancias y la capacidad para realizar manipulaciones farmacológicas. La técnica es relativamente sencilla de utilizar y requiere solamente una grabación electrodo y una fuente de luz para la estimulación de la optogenetic, que es más factible que la obtención de grabaciones de celulares duales en partes pre- y postsinápticos de la sinapsis. Un requisito básico de la TERPS es que los potenciales de acción son fácilmente bloqueados por TTX en el sistema en estudio. Pero, como TTX actúa sobre las neuronas a través de una amplia gama de filos taxonómicos, es probable que TERPS podría aplicarse ampliamente a ambos sistemas modelo mamíferos e invertebrados.

TERPS fácilmente modificable en un número de maneras para facilitar tanto la estimulación de la supuesta población presináptica o para la grabación de dianas postsinápticas. Aquí, se utiliza una herramienta de optogenetic para estimular las poblaciones objetivo, aunque es posible la activación de una variedad de mecanismos. Estímulo del nervio de axones sensoriales, por ejemplo, es habitual en estudios de la transmisión del nervio antenal en Drosophila16 y es conveniente en otros sistemas sensoriales, incluyendo los nervios periféricos que contiene mechanosensory neuronas. Un enfoque similar a las pruebas de conectividad funcional en Drosophila expresó GCaMP indicadores de calcio en una población de neuronas durante la conducción de actividad en otra población a través de los ionotrópicos purinoceptor P2X2 y ATP aplicación2. Este enfoque debe ser compatible con TERPS manifestando simplemente Co el transgén de NaChBac con los receptores P2X2 en una neurona y GCaMP en otra población para un método totalmente libre de parche. Sin embargo, se debe tener precaución con los enfoques provocando despolarizaciones más lento, como los receptores diseñador muscarínicos basado exclusivamente activados por una droga de diseño (DREADDs)17,18. Despolarización lenta podría llevar a la inactivación de NaChBac antes de la generación del potencial de acción.

Se han empleado métodos similares para TERPS en sistemas mamíferos. Estas técnicas combinan TTX y channelrhodopsin trazar conectividad entre las neuronas. Channelrhodopsin activación solo generalmente no despolarizar las neuronas suficientemente, y así se aplica el bloqueador de canal potasio 4-AP con TTX para obtener la liberación de19,20,21. Mientras que funciona en muchas sinapsis, puede que no funcione en algunas sinapsis metabotrópicos si el destino corriente abajo del receptor es un canal de potasio sensible 4-AP. Por ejemplo, serotoninérgico modulación de la respuesta olfativa en polillas se basa directamente en la modulación de tal un 4-AP sensible K+ corriente (IA)22. También este enfoque no ha funcionado en la CSDn a sinapsis LN (datos no mostrados). Así, TERPS tiene una ventaja de que requiere menos intervención farmacológica respecto a otros métodos comúnmente usados y pueden trabajar en el rango más amplio o sinapsis.

Hay algunas limitaciones a los TERPS que deben ser considerados. En primer lugar, puede haber efectos secundarios potenciales de expresión crónica del canal de NaChBac en todo el desarrollo. Función y montaje de circuito apropiado pueden confirmarse mediante la comparación de la actividad de las neuronas entre control vuela falta la construcción de NaChBac y vuela con la construcción en ausencia de TTX. Para evitar estos problemas, expresión del transgén NaChBac podría controlarse temporal mediante expresión del represor termosensible de GAL4, GAL8023. Además, si una sinapsis sólo se observa en una forma dependiente de estado, es concebible que la supresión de la actividad de la red con TTX podría ocultar tal conexión. Es importante destacar que una conexión positiva observada con TERPS probablemente representa una verdadera conexión mono sinápticos, mientras que un resultado negativo no es prueba de la ausencia de una conexión.

TERPS puede revelar la capacidad del transmisor liberan de una neurona para afectar a postsynaptic socio claramente, la dinámica de canal lento de la NaChBac y el potencial de meseta asociado con su activación hacerla menos aplicables al estudio de los clásicos neurotransmisión. Un método para alterar TERPS para más rápido, más natural liberación de transmisor será expresar una versión modificada de la TTX-insensible de la endógena Drosophila sodio canal para NaChBac. Esta alteración sería causar actividad naturalista clavaba en la célula presináptica y permiten análisis más convencional de la transmisión sináptica en la ausencia de actividad de la red. Esto tendría grandes posibilidades para estudios de codificación tipo de sinapsis, que suscitar una amplia gama de la actividad presináptica sin reclutar redes polysynaptic sería deseable.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Nos gustaría agradecer a Joshua Singer, Jonathan Schenk, así como revisores pensativos por comentarios en el manuscrito. También nos gustaría agradecer a Ben White y Harold Zakon debates sobre la técnica. Jonathan Schenk proporciona los datos de la Figura 3A. Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Fundación de Whitehall y un R21 de NIH a QG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UAS-csChrimson Bloomington Drosophila Stock Center 55135 Used as a neural activator
UAS-NaChBac Bloomington Drosophila Stock Center 9466 Resotores excitibility in cells in TTX
Tetrodotoxin Tochris 1078 Special permission may be needed to purchase TTX as it is a controlled substance
all trans-Retinal Sigma-Aldrichall trans-Retinal R2500 Require co-factor for channelrhodopsin
Weldable 321 Stainless Steel Sheet, 0.002" Thick, 10" Wide McMaster Carr 3254K7 Used to make custom fly holder. Custom foil can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file
Dissection Microscope Zeiss Stemi 2000-C Used for dissection of preparation
Waxer Almore Eectra Waxer 66000 Used during dissection to secure fly in foil
Paraffin Wax Joann 4917217 Used with waxer
Number 5 forceps Fine Science Tools #5CO Used for dissection and desheathing
Dissection Scissors Fine Science Tools 15001-08 Used to remove parts of the cuticle during dissection
Tungsten wire A-M Systems 797500 Use with electrolysis to make sharpened needles for dissection
Reciculating Peristaltic Pump Simply Pumps (Amazon) PM200S for recirculating TTX
Speed Controller for peristaltic pump Zitrades (Amazon) N/A PWM Dimming Controller For LED Lights or Ribbon, 12 Volt 8 Amp,Adjustable Brightness Light Switch Dimmer Controller DC12V 8A 96W for Led Strip Light B
Versa-Mount Precision Compressed Air Regulator McMaster Carr 1804T1 For applying positive pressure during patching
Glass capilaries World Precision Instruments TW150F-3 For patch pipettes
Multipurpose Gauge McMaster Carr 3846K431 Gauge for pressure regulator
Electrophysiology Camera Dage MTI  IR-1000 Any camera that works in the IR range (850 nm) will work. You do not want to use red illumination as this can activate csChrimson
IR LED Thorlabs  M850F2 For oblique illumination
fiber optic for IR LED Thorlabs M89L01 Couples to IR LED
Objective lens  Olympus 40X LUMPlanFLN This can be used on most microscipes and works well for visualizing fly neurons.
Amber LED Thorlabs M590L3d For visualizing RFP and mCherry
Blue LED Thorlabs M470L3d For visualizing GFP
GFP filter set Chroma 49011 For visualizing GFP or stimulating channel2rhodopsin
Custom mCherry Filter Set Chroma  et580/25x and t600lpxr (from the 49306 set) but with an et610lp barrier/emission optic Use only if you wish to patch identified neurons with channel2rhodopsin
Dichroic to combine Amber and blue LED Thorlabs DMLP550R Use only patch under mCherry and excite channel2rhodopsin with blue light.
Red LED LEDSupply Cree XPE 620 - 630 nm Used to drive csChrimson
LED Driver LEDSupply 3021-D-E-1000 Used to drive LEDs for optogenetic stimulation
Manipulator Sutter Instruments MP-225 Used to position pipette during recordings
Patchclamp Amplifier A-M Systems Model 2400 An equivalent amplifier is suitable
Bessel Filter Warner Instruments  LPF 202A Auxillary filter used to filter current trace to oscilloscope during patching.
Data Acquisition System  National Instruments NI PCIe-6321       781044-01 Used to record data from amplifier to computer
Connector Block - BNC Terminal BNC-2090A National Instruments 779556-01 Used to connect amplifier to DAQ card.
Steel Foil  McMaster Carr 3254K7 Steel foil for custom recording chamber
Magnets K&J Magnetics D42 To secure recording chamber to ring stand
1/16" Cell Cast Acrylic Clear Pololu Used to make custom recording chamber. Acrylic can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).
  2. Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain. J Neurophysiol. , 684-696 (2012).
  3. Doyle, M. W., Andresen, M. C. Reliability of monosynaptic sensory transmission in brain stem neurons in vitro. J Neurophysiol. 85, 2213-2223 (2001).
  4. Nicholls, J. G., Purves, D. Monosynaptic chemical and electrical connexions between sensory and motor cells in the central nervous system of the leech. J Physiol-London. 209, 647-667 (1970).
  5. Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J Neurophysiol. 41, 418-431 (1978).
  6. Liao, X., Walters, E. T. The use of elevated divalent cation solutions to isolate monosynaptic components of sensorimotor connections in Aplysia. J Neurosci Meth. 120, 45-54 (2002).
  7. Feinberg, E. H., et al. GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems. Neuron. 57, 353-363 (2008).
  8. Macpherson, L. J., et al. Dynamic labelling of neural connections in multiple colours by trans-synaptic fluorescence complementation. Nat Commun. 6, 10024-10029 (2015).
  9. Zhang, X., Gaudry, Q. Functional integration of a serotonergic neuron in the Drosophila antennal lobe. Elife. 5, (2016).
  10. Wilson, R. I. Early olfactory processing in Drosophila: mechanisms and principles. Annu Rev Neurosci. 36, 217-241 (2013).
  11. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11, 338-346 (2014).
  12. Murthy, M., Turner, G. C. Whole-cell in vivo patch-clamp recordings in the Drosophila brain. Cold Spring Harb Protoc. , 140-148 (2013).
  13. Murthy, M., Turner, G. C. Dissection of the head cuticle and sheath of living flies for whole-cell patch-clamp recordings in the brain. Cold Spring Harb Protoc. 2013, 134-139 (2013).
  14. Gu, H., O'Dowd, D. K. Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila. J Vis Exp. , (2007).
  15. Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe. Science. 303, 366-370 (2004).
  16. Kazama, H., Wilson, R. I. Homeostatic Matching and Nonlinear Amplification at Identified Central Synapses. Neuron. 58, 401-413 (2008).
  17. Becnel, J., et al. DREADDs in Drosophila: a pharmacogenetic approach for controlling behavior, neuronal signaling, and physiology in the fly. Cell Reports. 4, 1049-1059 (2013).
  18. Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. P Natl Acad Sci USA. 104, 5163-5168 (2007).
  19. Sun, Q. Q., Wang, X., Yang, W. Laserspritzer: A Simple Method for Optogenetic Investigation with Subcellular Resolutions. PLoS One. 9, e101600-e101608 (2014).
  20. Holloway, B. B., et al. Monosynaptic Glutamatergic Activation of Locus Coeruleus and Other Lower Brainstem Noradrenergic Neurons by the C1 Cells in Mice. J Neurosci. 33, 18792-18805 (2013).
  21. Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457, 1142-1145 (2009).
  22. Kloppenburg, P., Ferns, D., Mercer, A. R. Serotonin enhances central olfactory neuron responses to female sex pheromone in the male sphinx moth manduca sexta. J Neurosci. 19, 8172-8181 (1999).
  23. Suster, M. L., Seugnet, L., Bate, M., Sokolowski, M. B. Refining GAL4-driven transgene expression in Drosophila with a GAL80 enhancer-trap. Genesis. 39, 240-245 (2004).

Tags

Neurociencias número 132 Drosophila tetrodotoxin monosynaptic conectividad NaChBac circuito connectomics
Examinar las conexiones Monosynaptic en <em>Drosophila</em> utilizando canales de sodio Tetrodotoxin resistentes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, X., Gaudry, Q. ExaminingMore

Zhang, X., Gaudry, Q. Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels. J. Vis. Exp. (132), e57052, doi:10.3791/57052 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter