Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

הדמיה הירארכי עם מודאלים מרובים סעיפים טורי למציאת מטרות תאיות ספציפיים בתוך כמויות גדולות

Published: March 20, 2018 doi: 10.3791/57059
Automatic Translation
1,2, 3, 2,4, 2,4, 5, 6, 2,4, 1,2,3
1Cryo Electron Microscopy, Centre for Advanced Materials, Universität Heidelberg, 2Heidelberg Karlsruhe Research Partnership (HEiKA), 3Cryo Electron Microscopy, BioQuant, Universitätsklinikum Heidelberg, 4Institute for Automation and Applied Computer Science, Karlsruhe Institute of Technology (KIT), 5Carl Zeiss Microscopy GmbH, 6Electron Microscopy Core Facility, Universität Heidelberg

Summary

פרוטוקול זה מטרות תאים ספציפיים ברקמות עבור הדמיה ברזולוציה הננומטרי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (SEM). תחילה עם תמונה של מספר גדול של טורי מקטעים של שרף-מוטבע בחומר ביולוגי במיקרוסקופ אור כדי לזהות את המטרה ולאחר מכן באופן היררכי ב- SEM.

Abstract

פילוח תאים ספציפיים ברזולוציה ultrastructural בתוך אוכלוסיה לתא מעורב או רקמה יכולה להיות מושגת על ידי הדמיה היררכי באמצעות שילוב של אור ואלקטרון. דוגמאות נעוץ שרף למחלקה לתוך מערכי המורכב סרטים של מאות סעיפים ודק במיוחד, שהופקדו על חתיכות של פרוסות סיליקון או coverslips מצופה conductively. מערכים הם עם תמונה ברזולוציה נמוכה באמצעות הצרכן הדיגיטלי החכם מצלמה, בסיוע מיקרוסקופ אור (LM) עבור סקירה מהירה שטח גדול, או מיקרוסקופ פלורסצנטיות שדה רחב (קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ אור (הצילומים)) לאחר תיוג עם fluorophores. לאחר פוסט-צביעת מתכות כבדות, מערכים הם צילמו במיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (SEM). הבחירה של מטרות אפשרי שחזורים תלת-ממד שנוצר על ידי הצילומים או שחזורים תלת-ממד מסיבים של אוספי תמונות SEM ברזולוציה ביניים אם אין סמני פלורסנט זמינים. ניתוח ultrastructural, יעדים נבחרים נרשמים לבסוף בעוד SEM ברזולוציה (כמה ננומטר פיקסלים בתמונה). כלי טיפול רצועת הכלים יכולה שרשומים על כל ultramicrotome הוא הפגין. היא מסייעת עם מערך ייצור המצע להסרת מהסירה הסכין אופטים. נדון פלטפורמת תוכנה המאפשרת הדמיה אוטומטית של מערכים ב- SEM. לעומת שיטות אחרות ליצירת נפח גדול EM נתונים, כגון לחסום טורי-פרצוף SEM (SBF-SEM) או יון ממוקדת קרן SEM (שיקרתי-SEM), גישה זו יש שני יתרונות חשובים: (1) חוק המדגם שרף-מוטבע, אם כי בגרסה פרוסים-up. זה יכול להיות מוכתם בדרכים שונות, עם תמונה עם רזולוציות שונות. (2) כפי הסעיפים יכול להיות מוכתם פוסט, אין צורך להשתמש דגימות שהוכתמו בלוק בחוזקה מתכות כבדות כדי להציג את הניגודיות עבור הדמיה SEM או למסור את הרקמה בלוקים מוליך. זה הופך את השיטה החלים על מגוון רחב של חומרים, השאלות הביולוגיות. חומרים במיוחד כנסיעה למשל, בנקים ביופסיה, מעבדות פתולוגיות, יכול להיות מוטבע באופן ישיר משוחזר ב- 3D.

Introduction

לשחזור כמויות גדולות של רקמות ברזולוציה ultrastructural מספר גישות הדמיה שונות בהתבסס על SEM היה בשימוש1: מקיף הדעת הינם זמינים למשל., SBF-SEM2, שיקרתי-SEM3של מערך טומוגרפיה (ב)4. בזמן עבור פעולת השירות השנייה דגימת החומר נשמר כמערך של מקטעים טורית על מצע, SBF-SEM, שיקרתי-SEM הם שיטות הרסני, עובד על הרחוב דגימה לצרוך אותו במהלך דימות. עקב ההטענה של השרף בעוד SEM, הם גם תלוי מדגם מחלקמסוים חריפה בלוקים5.

מצד שני, זיהוי תאים או מבנים של עניין בתוך דגימת רקמה מסוימים יכולים להרוויח במיוחד אור correlative ומיקרוסקופ אלקטרונים (קלם)6,7,8. באמצעות הצילומים עבור מיקוד מונע את היישום של כמויות גדולות של מתכת כבדה מאז זה להרוות את האות של קרינה פלואורסצנטית9. לקבלת דוגמאות מחלקמסוים מעט, רק כאלה AT היא שיטת הבחירה מכיוון במערכים ייתכן שלאחר ויטראז'ים עם מטאל בקלות לאחר LM הדמיה. יתר על כן, כמעט כל סוג הדגימה עשוי לשמש AT, אפילו שגרתית דגימות של הפתולוג אוצר החזה10.

יתרון גדול נוסף של AT הוא הפוטנציאל הירארכי11 או הדמיה ברזולוציה מרובה12: זה לא הכרחי כדי התמונה הכל ברזולוציה, כמו מטרות שייתכן שייבחר מודאליות שונים (למשל, הצילומים) או ב תמונות SEM ברזולוציה נמוכה. הדמיה רק את האזורים מעניין של אוכלוסיה רקמות או תא ברזולוציה חוסכת שטח אחסון נתונים דיגיטליים ומייצרת קטנים יותר ערכות נתונים תמונה, אשר קל יותר להתמודד. כאן, שזרימת העבודה AT הוכח באמצעות דגימת די חלש מחלקמסוים: בלחץ גבוה קפוא שורשי צמחים (תודרנית לבנה) המוטבעות שרף הידרופילית.

כיצד מערכי מוכן, צבעונית, עם תמונה הצילומים והן SEM, וכיצד אוספי תמונות רשומים מוסברים. כמו כן, כיצד ניתן להשתמש על שחזור תלת-ממד של אמצעי האחסון הצילומים כדי לבחור תאים ספציפיים עבור הדמיה SEM ברזולוציה הננומטרי מודגם.

Protocol

הערה: בלוקים מדגם צריך להיות polymerized ומכילים כמה מתכות כבדות. קיבוע והטבעה פרוטוקולים בשתי הדגימות המוצגים איור 1A-B כבר תיאר במקום11. בקיצור, הדוגמה באיור איור 1A היה כימי קבוע, צבעונית en bloc הראשון עם 1% OsO4, ואז עם 1% uranyl אצטט, ומוטבעים שרף של Spurr. הדגימה המוצגים ב איור 1B קפאה בלחץ גבוה, להקפיא שהוחלפו עם 0.4% אצטט uranyl ב אצטון, ומוטבעים שרף Lowicryl HM20. השתמש אבקה כפפות חינם עבור הכנה לשלבים.

1. יצירת מערכים

  1. קיצוץ של הרחוב דגימה
    הערה: תמיד את הברגים טוב בעת הוספת חלקים.
    1. להכניס בעל מדגם של ultramicrotome הרחוב דגימה, למקם את המחזיק הבלוק זמירה ולאחר למקומו השלב התחתון של ultramicrotome.
    2. לקצץ משם שרף סביב הרקמה מוטבעים עם סכין גילוח עוזב רק שפה קטן של שרף סביב המדגם. חתוך מההתחלה עד היעד.
      הערה: הצורה של הבלוק-הפנים עשוי להיות טרפז או מלבני (אנחנו משתמשים בהצלחה לשתי הצורות). חשוב להשתמש בצדדים ארוכים של המלבן וגם מוביל בקצה כדי להבטיח כי שטח גדול מכוסה על ידי תערובת דבק ייצוב הסרטים.
    3. להכניס את בעל הזרוע של ultramicrotome ולהחליף את הבלוק זמירה בשלב התחתון על ידי המחזיק סכין. הכנס סכין חיתוך יהלום (בדרך כלל 45°), המחזיק סכין. יישר את הבלוק-פרצוף בדיוק מקביל קצה הסכין לחיתוך.
      הערה: כדי לייצר בדיוק מקביל (למטה), מובילות נגררים קצוות (העליון), להפעיל או להעביר רק את הסכין לחתוך צדדים מנוגדים. עבור אמצעי אחסון גדולים (יותר ממספר מאות סעיפים), סכין חיתוך ב- 90° יש יתרון.
    4. חלקה בכל ארבעת הצדדים ולאחר מכן לסובב את בעל מדגם כך בקצה, מובילות נמצאים כעת המיקום האופקי.
    5. בזהירות מעיל המובילים, נגררים צידי הרחוב עם תערובת דבק. להשתמש במברשת קטנה של כמה שערות קבוע עם קיסם13. לבצע שלב זה במהירות מכיוון הממיס של תערובת זו מתאדה תוך שניות. לא לזהם את הבלוק-הפנים עם תערובת זו. תן הרחוב דגימה מצופה יבש למשך 5-10 דקות.
      הערה: עבור מספרים גדולים יותר של מקטעים (> 200), זה יכול להיות טוב יותר מעיל בחוד החנית בלבד, כי עם הזמן, בליטה של דבק עשוי לבנות בקצה נגרר, פוטנציאל לסגת מקטעים מעל הכי קשה.
  2. הכנת המצע
    1. חותכים פיסות סיליקון לגודל שמתאים לתוך הספינה הסכין (בערך 2 x 2.5 ס מ2 על הסכין ג'מבו). אם יש צורך, לסמן את חתיכות וופל (מספרים או אותיות) גם יהלום לפני ניקוי, או עם טוש שלא יורד לאחר הניקוי. לנקות את פרוסות סיליקון באופן ידני עם אלכוהול איזופרופיל ורקמות נטולת מוך.
      הערה: עבור הדמיה correlative להשתמש אינדיום-פח-אוקסיד (ITO)-מצופה coverslips זכוכית דקה. הם חייבים להיות מטופלים היטב, ניקוי נוסף אינה נחוצה.
    2. לתקן את המצע בקצה אחד של הלוח המוביל באמצעות דבק נשלף.
      הערה: לחלופין, הקצוות המצע עשוי להיסגר במקביל הכי קשה באמצעות שני פסים של סרט דביק.
    3. פלזמה להפעיל (זוהר פריקה) המצע באוויר כדי לקבל משטח הידרופילית. זה צריך להיעשות בצורה כזאת, כי טיפת מים להציב על גבי בכפולות המצע על סרט דק מאוד (נמוך זווית מגע, איור 2C, יח). פרמטרים hydrophilization תלויים המכשיר פלזמה בשימוש; עבור הפרמטרים המשמש כאן, ראה טבלה של חומרים.
      הערה: הפעלת פלזמה היא מאוד לא יציבה, אז לבצע את זה מיד לפני השימוש המצע.
    4. הכנס המוביל המלחציים של בעל המצע, עם המצע הנטען קרוב ל הכי קשה להשיג הרטבה אופטימלית של המצע על הסירה את הסכין.
      הערה: תיאור מפורט של בעל המצע, כולל הציורים של תכנון בעזרת מחשב (CAD), הוא נתון וואקר ואח. 11
  3. הכנה אופטים
    1. להכניס סכין יהלום ג'מבו המחזיק סכין, לקבוע את זווית סיווג (0° עבור הסכין ג'מבו), ולמלא את הסירה את הסכין עם מים מזוקקים. הגישה את הסכין למרחק של 1-2 מ"מ עד המדגם.
    2. . תוריד את המצע לתוך המים באמצעות הברגים 1 – 3 (איור 2 א) של בעל המצע. בדוק כי לקו המים ממוקם בשליש העליון של המצע.
      הערה: בדוק כי הדבק בין הצלחת המצע, מנשא טוב נרפא על ידי הצמדת המצע עם מלקחיים נקי. זה לא צריכים לזוז
    3. כי זה קשה לראות את סיווג הקרקע בעת שימוש רקיק סיליקון, את המצע התחתון עד שאתה מרגיש זה נוגעות ברצפה. עכשיו מעלים את המצע כמות קטנה. ודא כי לא המצע ולא הספק נוגע הסירה הסכין בעת גזירה.
    4. השתמש מזרק או פיפטה כדי להתאים את רמת המים על הסירה. תוך כדי צפייה דרך התאום, להוסיף או להסיר מים עד אזור מלא של פני המים מראה השתקפות הומוגנית של איור אור העליון ultramicrotome.
    5. לעבור על אור התחתון ultramicrotome. ודא כי הזרוע במצב האמצעי ולא הכחשה באמצעות ההגה יד ultramicrotome. הגישה הסכין הדגימה עד השתקפות הכי קשה יהיה גלוי על פני בלוק.
    6. השתמש באפשרויות התאמה של ultramicrotome כדי ליישר את הדגימה לסכין. ראשית לסובב את הסכין, ואז לסובב, להטות את הדגימה.
      הערה: זה כראוי מיושרת אם הפס אור, אשר ניתן לראות את הפער בין הדגימה את הסכין, מראה הקצוות המקביל (קווים מקבילים ישר, לא טריז בצורת).
    7. לבדוק את הנטייה של המדגם: ודא כי הפס אור לא להיות עבה או דק יותר תוך כדי תנועה מעלה ומטה את הדגימה. אם יש צורך, להשתמש הבורג התאמת הקשת כדי לתקן זאת. להעביר את הסכין קרוב הדגימה עד שזה ממש מעל פני הבלוק (אבל לא לגעת בו).
    8. הגדרת סעיף עובי (להאכיל), חיתוך מהירות והחלון חיתוך-יחידת הבקרה.
    9. התחל חלוקתה. במידת הצורך, המתן עד הקטע המלא הראשון נחתך. לחתוך קטעים מסוימים כדי להיות בטוח כי הן נשארות מחוברות לרצועות טופס (אחרת הדבק יש להחיל שוב). להתחיל עם הזנת ערך גבוה (מרבי, 200 ננומטר על הסכין אולטרה) עד הקטע המלא הראשון נחתך. לאחר מכן, הגדר את הערך הרצוי הזנה. ליציבות רצועת הכלים נאותה, עובי סעיף של 100 ננומטר ומהירות חיתוך של 1 מ מ/s הוא נקודת התחלה טובה. עובי סעיף השגה הנמוך הוא כ- 60 ננומטר, תלוי באיכות הדגימה.
    10. לעצור את חלוקתה. להסיר כל המקטעים (לחתוך חלקית) מיותרת החקלאיים וסירה באמצעות השיער של חתול/עפעף. אם יש כאן הרבה שפוכת קטן מרחפת, להסיר את המים לחלוטין עם פיפטה ולמלא את הסירה עם מים מתוקים. כעת התהליך הוא מוכן הכלים פרודוקטיבי הראשון.
  4. חלוקתה
    1. התחל חלוקתה. לאחר מספר קטעים (המספר הממשי תלוי בגודל של סעיפים ו המצע) נחתך, לעצור את התהליך אופטים ולשחרר ברצועת הכלים של הכי קשה על ידי ללטף בעדינות מעל הכי קשה עם עפעף של14 או יותר טוב, מאוד שיער רך של הפרווה של החתול.
    2. מניפולציות (הדחיפה/משיכה) הסרט עם עפעף לכיוון המצע ולצרף במקטע הראשון המצע.
      הערה: יש צורך דחף בעדינות את הסרט עד שזה יתפוס את החלק היבש של המצע.
    3. המשך חלוקתה הצמדת הסרטים המצע. מתחילים בצד אחד ולעבור בהדרגה מעל האחר עם כל הכלים החדשה.
      הערה: הימנעו מתנועות מים מסיבית כדי להימנע ויסירו את הסרטים שכבר צורף. אותו דבר נכון לגבי זרמי אוויר. השתמש המגן נשימה הנכללת את ultramicrotome. בתנאים סביבתיים שלילי, מומלץ זיווד עבור ultramicrotome15.
    4. כאשר המצע מכוסה לגמרי עם סרטים (בדרך כלל 4-5 סרטים הם ריאלי), בעדינות הרמת-אאוט המצע מהסירה הסכין באמצעות הברגים micromanipulator של בעל המצע.
      הערה: מתאים התנועות: להרים אנכית (בורג 1), סיבוב/הטיית החוצה (בורג 3), או שילוב של שניהם.
    5. תן את מערך הכלים להתייבש לפני אחסונם בסביבה נטולת אבק. לאחר הייבוש, הסר את המצע הנטען דבק בהקדם האפשרי המוביל (ביום ההוא, אחרת המצע עשויה להיות קשה מדי להסיר או אולי אפילו יפצע במהלך demounting).

2. צביעת עבור ההדמיה LM

הערה: שיטות שונות מכתים/תיוג אפשריים, לרבות פרוטוקולים immunofluorescence. כאן כתם ישירה, מעדיף לא ספציפי נבחר להתוות את קירות התא.

  1. Propidium מכתים יודיד
    1. מכסה בתחתית כוס גדולה פטרי (קוטר 30 ס מ) עם מצלמות-מיקרוסקופים, קו הקצה של המנה עם רקמת רטוב כדי לבנות תא לח.
    2. השתמש בערך 300-500 µL של פתרון לכל coverslip. במקום טיפה אחת עבור כל coverslip על מצלמות-מיקרוסקופים, לשים את הכוס במהופך על הטיפה, כך הסעיפים נמצאים בקשר עם הנוזל מוכתמים. מכסים את הכלי, לעטוף את זה עם רדיד אלומיניום על הדגימות מפני אור. דגירה הדגימות עבור 16 h-4 מעלות צלזיוס.
    3. להסיר את coverslip עם מלקחיים ולשטוף אותו על-ידי הזזתה למעלה ולמטה בתוך 100-mL מלא 80 מ ל מים מזוקקים. חזור על שלב זה בתוך אחר עם מים מתוקים. יבש את coverslip בזהירות עם אוויר דחוס.

3. רישום של אוסף התמונות בבסוף הצילומים

  1. מניחים את coverslip על השלב של הצילומים רחב-שדה משותף.
  2. בחר את ערכת הסינון המתאימה (טבלה של חומרים) ידי קרינה פלואורסצנטית שחלים.
  3. עם עדשה המטרה מתאימים, קח תמונה של האובייקט בכל מקטע: לנסות למלא את שדה הראייה ולשמור את הכיוון קבוע. על הטיפ שורש, שימש מטרה אוויר X 40.
    הערה: אם הסרטים אינם ישר לגמרי, במה מסתובבת יסייעו לארגון מחדש של הסעיפים תוך לקיחת תמונות. במידת האפשר, מרכז התמונה על תכונה מסוימת, או לשמור תכונה כגון בקצה המקטע במרחק שווה על קצה התמונה המוקלט.
  4. במידת האפשר, השתמש 16 סיביות להגביל רווי פיקסלים ולשמור הזמן חשיפה מתמדת.

4. רישום אוסף התמונות של הצילומים

  1. לייבא את סדרת תמונות פיג'י16 כמו ערימה וירטואלי.
  2. פתח חדש TrakEM17 (ריק) מתוך תפריט קובץ.
  3. קליק ימני לתוך שדה התמונה, ולייבא את המחסנית לתוך TrakEM כמו "פרוסה אחת לכל שכבה".
  4. ליישר שכבות (קליק ימני לתוך שדה התמונה), להגדיר את הטווח (תמונה ראשונה מעמד), ובחר אף כהפניה. עבור כל ההגדרות, להשתמש בערכי ברירת המחדל ובחר נוקשה כמו השינוי הרצוי.
  5. כאשר הרישום הוא סיים ומשביע, שמור הנתונים (dataset) מסודרים על ידי קליק ימני ולבחור ייצוא. להפוך תמונה שטוחה, להגדיר את הטווח מן הראשון לתמונה האחרונה, והנח את התוכנה להראות את המחסנית וכתוצאה מכך. לשמור בה את המחסנית בתבנית-tif.

5. צביעת והרכבה עבור הדמיה SEM

הערה: עבור הכנת פתרונות מכתימים ראה טבלה של חומרים. פתרונות ניתן לאחסן ב 4 ° C עד 12 חודשים, מוגן מפני אור ואוויר.

התראה: עופרת אצטט ציטראט ו uranyl מכילים מתכות כבדות, אשר הם רעילים. יש ללבוש כפפות, להשליך את הפסולת על פי ההוראות של הרשויות המקומיות.

  1. מכסה בתחתית כוס גדולה פטרי (קוטר 30 ס מ) עם מצלמות-מיקרוסקופים, קו הקצה של המנה עם רקמת רטוב כדי לבנות תא לח.
    הערה: חשוב כי מספר החבילות של NaOH ממוקמים בתוך הפטרי ליד הטיפות מכתימים למניעת משקעים מוגזמת של עופרת ציטראט.
  2. Uranyl אצטט מכתים
    1. Centrifuge הפתרון אצטט uranyl ב 2,680 x g לכמה שניות לחלקיקים קטנים משקעים.
    2. השתמש בערך 300 – 500 µL של פתרון לכל coverslip. במקום טיפה אחת עבור כל coverslip על מצלמות-מיקרוסקופים, לשים את הכוס במהופך על הטיפה, כך הסעיפים נמצאים בקשר עם הנוזל מוכתמים.
    3. תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר, מכסים את הכלי במהלך מכתים.
    4. הסר coverslip עם מלקחיים, שטיפת על-ידי הזזתה למעלה ולמטה בתוך מלא מים מזוקקים (ראה שלב 2.1.3).
  3. להוביל ציטראט מכתים
    1. במהלך uranyl אצטט, להכין את הפתרון ציטראט עופרת.
      הערה: עופרת ציטראט תמיד לסנן מיד לפני השימוש כדי להסיר כל פוחת משקעים. גם centrifuge את הפתרון ציטראט עופרת ב 2,680 x g לכמה שניות כמו שלב 5.2.1.
    2. השתמש בערך 300 – 500 µL של פתרון לכל coverslip. במקום טיפה אחת עבור כל coverslip על מצלמות-מיקרוסקופים מיד לפני נטילת על coverslips לאחר ההכתמה אצטט uranyl, לשים את הכוס במהופך על הטיפה, כך הסעיפים נמצאים בקשר עם הנוזל מוכתמים. מניחים את הטיפות (300 – 500 µL) על מצלמות-מיקרוסקופים מיד לפני נטילת על coverslips לאחר ההכתמה אצטט uranyl.
      הערה: כדי למנוע היווצרות פוחת משקעים, אינם נושמים אל טיפות ציטראט עופרת.
    3. מניחים את coverslip שטף במהופך על הירידה (שאין צורך לייבש את זה).
    4. תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר, מכסים את הכלי במהלך צביעה.
    5. להסיר את coverslip עם מלקחיים ולשטוף אותה כמתואר לעיל בתוך עם מים מתוקים (שלב 5.2.4).
  4. יבש את coverslip בזהירות עם אוויר דחוס.
  5. הרכבה הדוגמאות עבור ההדמיה SEM
    1. הר של סיליקון על הספחים אלומיניום עם כרית פחמן דביק.
      הערה: מצופה איטו coverslips עשוי גם להיות מותקן באמצעות צבע כסף ואת Cu-הסרט — ודא כי השטח מוליך מחובר ל- stub של — או עם רפידות פחמן כמפורט לעיל. במקרה זה, ניתן לבצע חיבור מוליך מהמשטח איטו ל- stub של טיפת צבע כסף.

6. הירארכי הדמיה בעוד SEM

הערה: פליטה שדה SEM, בחר אנרגיה נמוכה (3 kV או פחות), קרן הנוכחי בטווח מ-50 עד 800 הרשות הפלסטינית כדי למנוע טעינה, ומרחק עבודה מתאים לאוסף יעיל של אלקטרונים משניים או מפוזרים בחזרה. הבחירה של הזרם קרן תלוי במאפיינים מדגם (למשל., הטבעה שרף); המינון אלקטרון יהיה גם פשרה בין זרם קטן (פחות מזיק לדגימת) זרם גבוהה, אשר ייטיב עם הדמיה מהירות, ולכן מוריד את הזמן רכישת התמונה הכוללת. גלאי ייעודי עבור אלקטרונים מפוזרים הגב מספקים קונטרסט טוב, פחות רגישים טעינה של המדגם, להראות פחות של חפצים משטח של המדגם (קפלי, סימני סכין). הניגודיות והבהירות צריך להיות מותאם כך ההיסטוגרמה ממורכזת.

  1. הדמיה SEM
    1. תחילה להגדיר את ארבע הפינות של המערך על ידי גרירה תמונה של כל פינה בהגדלה נמוכה, על 100 x. ליצור אזור בעל עניין (ROI) תוחמת את המערך כולו. להקצות פרוטוקול הדמיה עם הפרמטרים הבאים: להשתמש גלאי משני אלקטרונים (SE), מה שמאפשר עבור מהירות גבוהה הדמיה-גודל פיקסל תמונה גדולה (עבור דוגמה 1,000 ננומטר) ולאחר זמן קצר להתעכב (למשל, 0.2 µs).
      הערה: כדי להתגבר על מגבלות אופטי אלקטרון-סריקה שדות של תצוגה גדולה (FOV), אשר עלול לגרום לעיוותים בפריפריה של התמונות, השתמש מצבי הגדלה נמוכה ייעודי (שסופק על-ידי רוב היצרנים SEM) או להשתמש בינוני, 1 ל 2 k סריקה שדות עבור תמונות יחיד.
    2. צור מקטע מוגדר על-ידי יצירה של רועי בהתוויית רק הרקמה בסעיף הראשון. לשכפל את זה על כל הסעיפים הבאים באמצעות הכלי חותמת. לסובב את ROIs בעת הצורך כדי להתאים סרטים כפופות.
    3. להקליט את הסדרה תמונות באמצעות גודל של פיקסל ביניים (בסביבות 50 ננומטר), להתעכב זמן מספיק זמן כדי לזהות את מבנה היעד. השתמש FOV לתמונות יחיד בטווח של 6-10 k פיקסלים.
      הערה: התוכנה אטלס 5 באופן אוטומטי לאסוף פסיפס המורכב תמונות סמוכים לכיסוי שטחים נרחבים של רועי/מקטע על-פני הסעיפים טורי.
    4. צור אתר בתוך ההגדרה בסעיף, המכיל את מבנה היעד עבור הדמיה ברזולוציה SEM גבוה יותר. לבצע את רועי גדול מספיק חשבון עבור דיוק הבמה. בדוק והתאם את העמדות של האתרים.
      הערה: חשוב למקם את ROIs בצורה כזאת, כי המרכז, איפה יש לבצע פוקוס אוטומטי של autostigmation, לא לשבת על חומר "ריק" עם שום. פרט מבניים, למשל., וקואלות.
    5. תורדגהה פוקוס אוטומטי, ואבדוק את הביצועים שם לפחות אורך סרט (קרי, המרחק הארוך ביותר הבמה יש לנסוע) על רועי קטן קרוב באתר שבו ידומה.
    6. הגדרת פרוטוקול הדמיה לרכישת SEM ברזולוציה גבוהה. כדי לראות את קרום תאים, בחר גודל פיקסל תמונה של 3-5 ננומטר. בחר זמן להתעכב בהתאם הגלאי כך התמונה לא רועש מדי.
    7. לפני תחילת הרכישה, להגדיר את הערכים המוקד לפחות החלק הראשון של כל הכלים באמצעות האפשרות פרוטוקול הסימון.
    8. להתחיל הדמיה SEM אוטומטית את מחדש כל הסדרה של היעד ROIs.
    9. לייצא את הנתונים שהושגו סדרת תמונות, רצוי בפורמט tif.

7. רישום של הערימה במיקרוסקופ אלקטרוני סורק

  1. לייבא תמונה סדרת פיג'י כמו ערימה וירטואלי.
    הערה: הם יהיו קובצי נתונים גדולים בטווח של כמה ג'יגה-בתים בהתאם מספר קטעים והגודל של רועי.
  2. חיתוך התמונה SEM מחסנית עיבוד נוסף לאזור קרוב המבנה של הריבית ככל האפשר, לכוונן את הבהירות והניגודיות.
  3. פתח חדש TrakEM17 (ריק) מתוך תפריט קובץ.
  4. קליק ימני לתוך שדה התמונה, ולייבא את המחסנית לתוך TrakEM כמו "פרוסה אחת לכל שכבה".
  5. יישור השכבות (קליק ימני לתוך שדה התמונה), בחר שיטת הריבועים הפחותים כמצב, להגדיר את הטווח (תמונה ראשונה מעמד), ובחר אף כהפניה. עבור ההגדרות, להשתמש בערכי ברירת המחדל ובחר נוקשה כמו השינוי הרצוי.
  6. כאשר הרישום הושלמה ומשביע, שמור הנתונים (dataset) מסודרים על ידי קליק ימני ולבחור ייצוא. להפוך תמונה שטוחה, להגדיר את הטווח מן הראשון לתמונה האחרונה, והנח את התוכנה להראות את המחסנית וכתוצאה מכך. לשמור בה את המחסנית בתבנית-tif.

Representative Results

זרימת העבודה המתוארת כאן (איור 1) מתחיל עם מדגם מוטבע בתוך גוש שרף. במהלך הכנת המדגם, צריך להכיר כמה מתכות כבדות לתוך הרקמה, אבל זה לא הכרחי כדי להשתמש בפרוטוקולים ממוטב לציפוי חזק למדי. איור 1A מציג שורש הצמח (אכלתי) בלוק שהוכתמו כמקובל עם 1% OsO4 ו- 1% uranyl אצטט, בעוד לשורש תודרנית איור 1B הוא רק חלש metalized באמצעות אצטט uranyl 0.5%. סוג הדגימה השנייה היא המתאימה ביותר עבור גישות correlative כמו מתכות כבדות מסוימים נוטים להרוות זריחה. עם בעל המצע ייעודי (איור 2), מערכים של כמה מאות מקטעים יכול להיות מיוצר (איור 1C). לאחר תיוג פלורסנט, מערכים כאלה עם תמונה ב הצילומים שדה רחב סטנדרטיים (איור 1D), ולאחר מכן צבעונית עם פתרונות מתכת כבדה, עם תמונה בעוד SEM ברזולוציות שונות (איור 1E–G).

כלים חשובים לדור לשחזור של מערכים, במיוחד כאשר הצבת מספר סרטים מן הסירה האזמל הקטן של סכין על גבי מצע, הינם בעל המצע (איור 2 א, אישית מעוצבת במעבדה של המחברים) יהלום ג'מבו הסכין עם סירה גדול דיו כדי להתאים שקופיות מיקרוסקופ (איור 2B). מניסקוס שטוח, המאפשר התבוננות טובה של הסרטים, הכרחי, יכולה להיות מושגת על ידי פלזמה ניקוי של המצע: droplet קטן של מים מזוקקים לא יוצרות מבנה דמוי עדשה על המצע כמו דמות 2C (המצע ללא טיפול). אבל סרט דק (איור דו-ממדי, המצע פלזמה מופעל). בתנאים אלה, סרטים המצורפת החלק היבש של coverslip מצופים איטו הן בקלות דמיינו (איור 2E), ניתן להקליט ולצפות במעשיהם מבוקרים במהלך הרמת-out של המצע מן המים.

לדוגמה, מערכים מוכתם propidium יודיד לתייג לחומות תא צמח היו עם תמונה עם שדה רחב סטנדרטיים הצילומים (איור 3 א). מאז הסעיפים הם רק 100 ננומטר עבה, אפילו יתר מכתים כמוצג כאן מציג טשטוש מעט. לאחר ההרשמה, שני התאים סגורים לחלוטין באמצעי האחסון המשוחזרת נבחרו מתוך אוסף תמונות (איור 3B) עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה ב- 3D (ראה גם משלימה סרט S1). בעקבות נוספים מכתים עם uranyl אצטט ולהוביל ציטראט, מערכי היו עם תמונה ב- SEM. איור 3 ג' מציג סקירה, הקליט עם 60 ננומטר פיקסלים בתמונה; הכיכר כהה במרכז התמונה מציין את המיקום שבו הפונקציות פוקוס אוטומטי הוצאו להורג, המינון נוספים הובילו זיהום קלה. מתאים ROIs בסעיפים האלה טורי (פרוסות 51 עד 248 פרוסות 435 סה כ) המכיל תאי היעד שני שנבחרו באוסף הצילומים נרשמו אז עם גודל פיקסל תמונה 5 nm (דמות תלת-ממד; ראה גם משלימה סרט S2).

הדמיה הירארכי אוטומטיות של המערכים בעוד SEM המתוארים כאן נעשה עם הפתרון פלטפורמת חומרה ותוכנה ZEISS אטלס 5. ראשית, סקירה כללית של המערך כולו נוצר באמצעות גלאי SE, גדולים מאוד (1,000 ננומטר) תמונה פיקסלים וזמן להתעכב נמוך מאוד (איור 4A). רועי חלוקה לרמות בלבד הרקמה היה דגש על החלק הראשון, הם מופצים כל המקטעים של המערך. זו מוגדרת בסעיף הוקלט אז עם 60 ננומטר פיקסלים בתמונה באמצעות זמן להתעכב זמן רב יותר (איור 4B). לבסוף, מערכת האתר, המכיל תאי היעד שני פלוס אחד "שכבה" של תאים המקיפים אותם כדי להסביר במה דיוקים, הוקם עם הפרמטרים הבאים: גלאי ESB (Backscatter סלקטיבי אנרגיה), התמונה nm 5 פיקסלים, ארוך מאוד (40 µs) להתעכב זמן ( איור 4C). התקרבות לתמונה כזו מציגה פרטים subcellular (איור 4D) כגון וקואלות (V), המיטוכונדריה (ז), גרעין (N) (חיצים) רשתית תוך-פלזמית. ראה גם משלימה סרט S3 עבור התקרבות מתוך ראייה כוללת של המערך כולו עד הפרט subcellular של אחד תא היעד.

המערך המוצגת כאן (סעיפים 200) פלוס נוסף אחד סעיפים 250 לקח כ- 8 שעות כדי לייצר, לילה אחד כתם של LM ולאחר יום אחד להקליט (ידנית) בסוף הצילומים. פוסט-צביעת לוקח בערך 1-2 שעות בסך הכל, בהתאם למספר מערכים בודדים. עבור הקלטה SEM, נדרשים כמה שעות כדי להגדיר הפעלה אטלס, הקלטה אוטומטית היה h 3-4 פתרון ביניים (60 ננומטר גודל פיקסל) מקטע ערכת (סעיפים 200, 450 x 200 מיקרומטר2), כ- 5 ימים עבור ברזולוציה גבוהה (5 nm pixel גודל) רועי המכיל תאי היעד שני (סעיפים 200, 55 x 30 מיקרומטר2). שימו לב כי בשל תכולת המתכת נמוכה של הדוגמה המוצג כאן, מהירות סריקה מאוד איטית חייבת לשמש כדי להגיע של זיהוי האות לרעש טוב, ומזה משתמע (עבור גלאי זמין כרגע) זמן להתעכב של 40 µs עבור רועי ברזולוציה גבוהה.

קיימים מספר שלבים בזרימת העבודה כולו נוטה החסרונות: באופן אידיאלי סרטים צריך להיות פחות או יותר ישר, ולהניחו בסדר הנכון (איור 5A). עם זאת, בנט (איור 5B), עקומים (איור 5D) או סרטים שבור אפילו לעיתים קרובות מיוצרים. זה יכול לגרום עקב חיתוך שגוי (המובילים וקצוות נגרר לא בדיוק מקביל), או דבק יישומית שאינו אחיד, אלא גם דוגמה אסימטרי או הסתנן לצר. בעייתי במיוחד הן דוגמאות המכיל רכיבים רך וקשה מאוד. הרכיבים האחרון עשוי להיות קשה לחדור כמו קיר התא של שורשי הצמח המוצגת כאן (איור 5C). במקרה כזה, הקפלים (חץ) יכול להיגרם בקלות על ידי דחיסה משתנים ורוגע במהלך חלוקתה. אוטומטיות הדמיה בעוד SEM, סרטים מעוקל הם לא בעיה גדולה, מאז ניתן לסובב את ROIs כדי להכיל את העקמומיות של רצועת הכלים.

עוד צעד קריטי בפרוטוקול מכתימה: כביסה לקוי יכול להוביל משקעים מעל המקטע (איור 5E, F), במקרה הגרוע ביותר, לכסות את האזור המעניין ביותר (עיגול על אחד של תאי היעד שני ב- 5F איור). כמו כן, אבק (איור 5D, פיזור אור חזק חלקיקים) הציגו לתוך הספינה סכין, למשל, עם הספק המצע מלוכלך, עלול לגרום לבעיות חמורות: בסוף הצילומים, אבק יכול להיות מאוד פלורסנט (cf. כמה פרוסות משלימה את הסרט S1) במידה כזו מספר אלגוריתמים רישום שלא יפעל. הפונקציה "יישר" TrakEM17 . עם זאת, יכול להתמודד עם כזה ערימות כפי שמתואר ב S1 הסרט משלים.

Figure 1
איור 1: זרימת עבודה עבור ההדמיה הירארכי correlative. החל מ מדגם מוטבע בתוך גוש שרף (A, מדגם מחלקמסוים חריפה), הדוגמה הראשונה החתוך (B, בחולשה מחלקמסוים לדוגמה), ואז מערכים המורכב סרטים מספר סעיפים טורי (C), כאן מונחת מצופים איטו coverslip, מיוצרים בטכניקה של ultramicrotome. לאחר צביעת עם הפלורסנט, ערימות של תמונות נרשמות על הצילומים שדה רחב (D). לאחר עוד יותר מכתימה עיגול עם מטאל זלץ, ערימות הם צילמו בעוד SEM (E–G) ברזולוציות שונות (מידות פיקסלים בתמונה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: כלים עבור הכנת מערכי. המצע מחזיק התכנסו from micromanipulators עם שבע צירי תנועה המצורפת ultramicrotome רגיל (א): הברגים, מודגש עם עיגולים, הן עבור אנכי (1) ו- (2) תנועה אופקית עבור הטיית (3) של המוביל המצע . סכין יהלום ג'מבו הסירה ענקיות כדי להתאים מצעים גדול (חץ), כאן עם פיסת הסיליקון מופעל פלזמה וופל רכוב על גבי נשא אלומיניום בגודל שקופית (B). µL 20, טיפות מים מזוקקים להציב על גבי מצע וופל של הסיליקון אינו מטופל (C) או על מצע מופעל פלזמה (D). ארבעה סרטים צפה סירה הסכין, המצורפת של coverslip מצופים איטו מאת הקצוות שלהם נמוכה יותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: המתאם של LM הנתונים עם נתוני SEM. בתצפיות (, ג) עם התאים היעד (B, D) הקליט עם הצילומים (, B) ו- SEM (C, D). (B) היא תוכנת זום, הנתונים המקוריים נרשמו עם עדשה המטרה X 40 על שבב המצלמה פיקסל 1,388 x 1,040, (ג) הוא הקליט עם 60 ננומטר פיקסל, וגודל תמונה (D) עם 5 nm pixel גודל תמונה, הממחישות את האמיתית לודיג רזולוציה ב- SEM אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: היררכית הדמיה בעוד SEM באמצעות ZEISS אטלס 5 ב סקירה של מערך הקליטה עם 1000 פיקסלים בתמונה של nm, באמצעות גלאי SE (A). הסעיף מגדיר עם רועי הניח על רקמות בכל מקטע והקליט עם פיקסלים בתמונה 60 ננומטר (B). אתר מגדיר עם רועי טורי מניחים על התאים היעד והקליט עם פיקסלים בתמונה 5 nm (C). בעת התקרבות אל כאלה תמונות ברזולוציה גבוהה (D), תאי ממברנה תאיים כגון וקואלות (V), גרעין (N), המיטוכונדריה (ז) ו- (חיצים) רשתית תוך-פלזמית הופכים לגלויים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: בעיות טיפוסיות. 1. הנובעים מתהליך אופטים: סרטים על coverslips מצופים איטו דחיסה אידיאלי ישר (A), אבל לא סדירות במהלך חלוקתה עלול לגרום בנט (B) או מעוקל סרטים (D), או אפילו קיפולים (C). 2. הנגרמת על ידי טיפול המצע וסרטים במים, למשלבמהלך חלוקתה, צביעת: אור פיזור חלקיקי על המצע (D), רים של טיפות על סעיף (עיגול ב- E), או לכלוך מרוח החוצה רקמות עקב לקוי כביסה לאחר צביעת (F). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

S1 הסרט משלים: אוסף תמונות הצילומים. תמונות 435 מיושר ב פיג'י16 באמצעות TrakEM17 ונשמר כקובץ סרט (.avi). אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

משלימה את הסרט S2: אוסף תמונות SEM. תמונות 210 המיושר פיג'י16 באמצעות TrakEM17. המחסנית המקורית (300 תמונות) של ערכת נתונים זו היה 15 ג'יגה-בתים. לצמצם את המחסנית של 3.3 ג'יגה-בתים (לאחר יישור וחיתוך כדי רק השניים היעד תאים), זה המידה ב- x ו y לפי פקטור של 0.2 באמצעות פיג'י ולאחר מכן לשמור בתור סרט .avi. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

S3 הסרט משלים: התקרבות עם רמות רזולוציה אחרת ב- SEM. הסרט יצר וייצא מתוך התוכנה אטלס 5 בתבנית .mp4. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Discussion

זרימת עבודה עבור מיקוד תאים ספציפיים בתוך רקמה על ידי AT הירארכי ומשולבות הודגם: מדגם שרף-מוטבע הוא חילקו לתוך מערכים של מקטעים סדרתי, אשר ממוקמות על מצע מוליך באמצעות בעל המצע אישית מעוצבת. לאחר תיוג עם fluorophore דימות in בסוף הצילומים, האחסון ששוחזר משמש לבחירת תאי היעד. לאחר צביעת נוספים סיבובים עם מתכות כבדות להציג ניגודיות, היעדים הללו הם צילמו לאורך מספר איזורים מאות ברזולוציה הננומטרי בעוד SEM באמצעות פלטפורמת תוכנה אוטומטיות.

להפקת מערכים בצפיפות עם מספר סרטים ארוכים, בעל מצע דומה לזו המתוארת כאן היא הכרחית. אדם מיומן וסבלני תוכל לצרף מספר סרטים מצע הסיליקון, שקוע למחצה סירה הסכין, ולאחזר את המערך על-ידי בהדרגה הנמכת מפלס המים עד הסרטים יושבים על המצע. עם זאת, לנוכח הניסיון שלנו, יש נטייה לנפץ היווצרות כאשר המצע נוגעת בכל חלק של הסירה את הסכין (cf. שים לב ב 1.3.2 בפרוטוקול). בנוסף, ההליך זה הרבה יותר קשה עם מצעים מצופים איטו: (1) בשל השקיפות של הזכוכית איטו, קשה לראות את הקצה של המים שבו הקצוות של הסרטים צריך להיות מחובר; 2) בגלל פני השטח מצופים איטו היא הרבה יותר קשה מאשר פרוסות הסיליקון המבריקה, הסרטים נוטים לשבור במהלך מעלית ו שברים קטנים יותר בהיקף של כמה חלקים עשויים לצוף, ובכך להרוס את סדר המקטעים.

כל זרימת העבודה היא גם אפשרית ללא מתאם הצילומים נתונים. במקרה זה, של ה-SEM איסוף נתונים, ייתכן שיהיה עליך להתבצע תוך מספר מפגשים. באמצעות עבודות שיקום 3D הראשונית או לפחות הערכה של נתונים ברזולוציה נמוכה או בינונית עשוי להיות נחוץ לזהות מטרות. בנוסף, ניתן להחיל קונבנציונאלי היסטולוגית כתמים על brightfield LM (לא דרישת הצילומים). כמובן, אחרים אפשרויות6,7,8 הם נוגדנים תיוג על המערכים, כפי שהוכח כבר בעיתון הראשונית על18, או גנטית המקודדים חלבונים פלורסנט (XFPs) או טרום הטבעה תיוג עם שימור פלורסצנטיות במהלך הכנת הדוגמא.

מגבלה כללית של השיטה דנו הוא השימוש של מקטעים של עובי מסוים ואת הדוגמאות דיסקרטית וכתוצאה מכך של הגוף התלת-ממדי: רזולוציה ב- Z רק יכול להיות טוב כמו העובי של הסעיפים מאז ה-SEM אוספת נתונים רק מפני השטח בסעיף (ד epending על האנרגיה האנרגיה העיקרי/הנחיתה שנבחרו). משמעות הדבר היא כי הגוף התלת-ממדי וכתוצאה מכך יש voxels אנאיזוטרופי, למשל., 5 x 5 x 100 ננומטר3 אם 100 ננומטר ומקטעים גודל פיקסל תמונה של 5 nm משמשים. עבור ישויות קטן מאוד בטווח גודל מתחת 1 מיקרומטר, לא ייתכן מספיק לתיאור ultrastructural אמיתי. מגבלה טכנית יותר הוא הדיוק של השלב בשימוש ה-SEM אוטומטיות הדמיה. בגלל זה, יש צורך לבחור רועי גדול יותר המפרטים של דיוק הבמה כדי להבטיח כי הוא עם תמונה של אזור היעד מלא.

לעומת SBF-SEM, שיקרתי-SEM כמו בשיטות הדמיה בלוק-פרצוף, correlative AT יש החיסרון סופית של voxels אנאיזוטרופי, כמפורט לעיל. עם שיקרתי-SEM, איזוטרופיות voxels של 5 x 5 x 5 nm3 ניתן להשיג כאשר תיקון להיסחף נכונה במקום.

פערים האחסון המשוחזרת עקב אובדן חלקים במהלך הכנת מערכי ייתכן גם חשש כי הוא לא נתקל עם SBF-SEM או שיקרתי-ב-SEM. עם סרט טוב ייצוב על ידי דבק, זה בדרך כלל רק עניין עבור המקטע האחרון של סרט: שהוא ניזוק בעת שחרור אותו מן הכי קשה באמצעות את הריס. עם זאת, מניסיוננו, האובדן של מקטע אחד בסעיפים 20 – 50 כל לא להשפיע התמונה רישום.

מצד שני, האפשרות שלאחר כתם מערכים מקנה איתות טוב והחדות עבור הדמיה SEM, אפילו על דגימות בחולשה מחלקמסוים כגון לחץ גבוה קפוא טיפים שורש המוצג כאן. לכן, אין צורך להתפשר אופטימלית שימור ultrastructural על ידי רבים קיבוע כימי והשלבים metallization. כמו כן, שגרתית דגימות למעבדה פתולוגיה עם דרגות ביניים של metallization מספקים נתונים מצוינים10. כזה שיפור חדות לאחר ההטבעה אינה אפשרית עבור SBF-SEM, שיקרתי-SEM באופן כללי. יתר על כן, מאז שיטות אלה הם הרסניים, קרי, לצרוך את הדגימה במהלך ההדמיה, הירארכי הדמיה ב רזולוציות שונות ואתרים או הדמיה חוזר ונשנה בשלבים מאוחרים יותר בזמן בלתי אפשרי. בעקרון, אמצעי אחסון ללא הגבלה, המורכב FOVs גדולים (למשל, עד כמה מילימטרים עבור מוח העכבר כל ב- connectomics) נוצר על ידי תפרים פסיפסים, מספרים עצומים של מקטעים ניתן לרכוש באמצעות AT, בעוד שיקרתי-SEM, FOVs מעבר 100 מיקרומטר x 100 מיקרומטר הם קשים להשגה עם מכשירים שגרתי.

אוטומציה נוספת של AT-זרימת העבודה המתוארת יהיה יתרון מובהק, מאחר השיטות הנ ל SBF-SEM, שיקרתי-SEM לבצע חלוקתה והן הדמיה בתוך מכשיר זהה באופן אוטומטי לחלוטין. קיים סוג אחד של אוטומציה של חלוקתה: ATUMtome12 יכול לייצר ולאסוף אלפי סעיפים, אבל השימוש Kapton סרט כמו מצע עושה כאלה מערכים קשה התמונה הצילומים. על coverslips מצופים איטו המשמש כאן, הדמיה סופר-ברזולוציה אפילו צריך להיות אפשרי. מטרה נוספת, רצוי מאוד לאוטומציה תהיה ההקלטה של אוספים נתונים הצילומים. מצד שני, אוטומציה יכול להיות יקר וכן למעט המחזיק המצע, זרימת העבודה המוצגת כאן (מבחינת חומרה) רק על מכשור ניתן בדרך כלל במתקן שגרתית EM מעבדה או ליבה, שהופך אותו נמוך רמת גישה.

Disclosures

ערכת קיבלה החזר על ידי מכשירי Boeckeler אספקה של מודל פונקציונלי של בעל המצע. מרלן Thaler הוא עובד של צייס מיקרוסקופ GmbH, יצרן של המערכות מיקרוסקופ שהוזכרו במאמר זה. בנוסף, ZEISS מציעה פתרונות מסוימים כגון אטלס ZEISS חבילות פתרון למגוון רחב של יישומים בתחום ההדמיה שטח גדול, 3D של כלי SEM, שיקרתי-SEM. כל המחברים האחרים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי גרנט 13GW0044 FKZ מהמשרד הפדרלי הגרמני לחינוך ולמחקר, פרוייקט MorphiQuant-3D. אנו מודים ברטל קרולין לקבלת תמיכה טכנית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instrumentation
Ultramicrotome RMC PT-PC Alternative: Leica UC7
Substrate holder RMC ASH-100 Alternative: home built
Plasma cleaner Diener Zepto 40kHz Alternatives: Ted Pella Pelco or other benchtop plasma cleaner
Example Parameters for Diener Zepto with 40kHz generator (0-100W); 0.5 mbar, 5 sccm (Air), 10% performance 
Widefield fluorescence light microscope Zeiss Axio Observer.Z1 Alternatives:
Leica, Nikon, Olympus
Fluorescence filter set Zeiss 43 HE (Cy3/DsRed)
Objective lens Zeiss Zeiss Neofluar 40x  0.75 NA
Decent workstation able to handle GB-sized image data
FESEM Zeiss Ultra 55 Alternatives: FEI, Jeol, Hitachi, TESCAN
Name Company Catalog Number Comments
Sectioning
Razor blades Plano T585-V
Diamond knife for trimming 45° Diatome DTB45
Diamond knife for trimming 90° Diatome DTB90
Jumbo diamond knife for sectioning Diatome DUJ3530
Silicon wafer (pieces) Si-Mat Custom Made Doping: P/Bor, orientation: <100>, thickness: 525 ± 25 µm, resistivity: 1-30 Ω-cm
http://si-mat.com/silicon-wafers.html
ITO-coated coverslips Balzers Type Z 22 × 22 × 0.17 mm
https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html
Aluminium carrier Custom Made 76 × 26 mm
Wafer forceps Ideal-tek 34A.SA
Stubs forceps Dumont 0103-2E1/2-PO-1 Dumoxel-H 2E 1/2
Diamond scriber Plano T5448
Eyelash/very soft cat's hair Selfmade Alternative: Plano
Brush Selfmade
Pattex contact adhesive Pattex PCL3C Kraftkleber Classic (the yellowish one)
Fixogum Marabu 290110001 for fixing substrate to carrier
Adhesive tape 3M 851 for fixing substrate to carrier
Isopropanol Bernd Kraft 07029.4000
Xylene Carl Roth 4436 thinner for glue mixture
Rotihistol Carl Roth 6640 alternative, limonene based thinner
Name Company Catalog Number Comments
Software
Image processing Open source Fiji (http://fiji.sc/#download)
Image acquisition Zeiss Atlas 5 AT
(module for Zeiss SEM)		 Alternative for automated image acquisition: WaferMapper: https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html
Name Company Catalog Number Comments
Staining
Propidiumiodide Sigma-Aldrich P4170 Stock solution: 1.5 mM in 0.1 % sodium azide
Uranylacetate Science Services E22400
Lead(II) Nitrate Merck 107398
Tri Sodium Citrate Dihydrate Merck 106448
NaOH pellets Merck 106469
1M NaOH solution Bernd Kraft 01030.3000
Glass petri dish Duran 23 755 56
Name Company Catalog Number Comments
Mounting
Stubs Plano G301F
Carbon pads Plano G3347
Copper tape Plano G3397 double-sided adhesive, conductive
Silver paint Plano G3692 Acheson Elektrodag 1415M
Name Company Catalog Number Comments
Solutions/mixtures
Adhesive mixture for coating blocks Pattex contact adhesive /xylene as thinner, ratio 1:3.
(Alternative for xylene: Rotihistol)
Reynolds lead citrate 50 mL:
Dissolve 1.33 g of lead(II) nitrate in 10 mL of dH2O.
Dissolve 1.76 g of tri-sodium citrate dihydrate in 10 ml dH2O.
Mix both and add 1 M sodium hydroxide until the solution is clear.
Fill up with dH2O to 50 mL.
Propidium iodide staining solution Prepare 1:1500 dilution from stock in dH2O.
Vortex for adequate mixing.
Aqueous uranyl acetate Dissolve 3 % uranyl acetate in dH2O (mix thoroughly).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  2. Wanner, A. A., Kirschmann, M. A., Genoud, C. Challenges of microtome-based serial block-face scanning electron microscopy in neuroscience. J Microsc. 259 (2), 137-142 (2015).
  3. Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. J Microsc. 254 (3), 109-114 (2014).
  4. Wacker, I., Schröder, R. R. Array tomography. J Microsc. 252 (2), 93-99 (2013).
  5. Tapia, J. C., Kasthuri, N., Hayworth, K. J., Schalek, R., Lichtman, J. W., Smith, S. J., Buchanan, J. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nat protoc. 7 (2), 193-206 (2012).
  6. Lucas, M. S., Günthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. Bridging Microscopes: 3D Correlative Light and Scanning Electron Microscopy of Complex Biological Structures. Methods Cell Biol. 111, 325-356 (2012).
  7. De Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrasructure lights up! Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
  8. Verkade, P., Müller-Reichert, T. Methods in Cell Biology Correlative Light and Electron Microscopy III. 140, 1st ed, Elsevier. 1-352 (2017).
  9. Gibson, K. H., Vorkel, D., Meissner, J., Verbavatz, J. -M. Fluorescing the Electron: Strategies in Correlative Experimental Design. Methods Cell Biol. 124, 23-54 (2014).
  10. Wacker, I., Schröder, R. R., Schroeder, J. A. Pathology goes 3D: Exploring the potential of array tomography versus FIB nanotomography for a CADASIL sample. Ultrastruct Pathol. 41 (1), 114-115 (2017).
  11. Wacker, I., Spomer, W., Hofmann, A., Thaler, M., Hillmer, S., Gengenbach, U., Schröder, R. R. Hierarchical imaging: a new concept for targeted imaging of large volumes from cells to tissues. BMC Cell Biol. 17 (1), 38 (2016).
  12. Hayworth, K. J., Morgan, J. L., Schalek, R., Berger, D. R., Hildebrand, D. G. C., Lichtman, J. W. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Front Neural Circuits. 8, Article 68 (2014).
  13. Micheva, K. D., O'Rourke, N., Busse, B., Smith, S. J. Array Tomography: Production of Arrays. Cold Spring Harb Protoc. 11, 1267-1269 (2010).
  14. Fahrenbach, W. H. Continuous serial thin sectioning for electron microscopy. J. Elec. Microsc. Tech. 1 (4), 387-398 (1984).
  15. Harris, K. M., et al. Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy. J Neurosci. 26 (47), 12101-12103 (2006).
  16. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., Preibisch, S., Rueden, C., Saalfeld, S., Schmid, B., Tinevez, J. -Y., White, D. J., Hartenstein, V., Eliceiri, K., Tomancak, P., Cardona, A. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  17. Cardona, A., Saalfeld, S., Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Preibisch, S., Longair, M., Tomancak, P., Hartenstein, V., Douglas, R. J. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS ONE. 7 (6), e38011 (2012).
  18. Micheva, K. D., Smith, S. J. Array Tomography: A new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 133 מערך טומוגרפיה מיקרוסקופ אלקטרונים נפח גדול מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה מיקרוסקופ אור זריחה אור מתואם ואלקטרון קלם הירארכי הדמיה אוטומטית הדמיה מיקוד
הדמיה הירארכי עם מודאלים מרובים סעיפים טורי למציאת מטרות תאיות ספציפיים בתוך כמויות גדולות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wacker, I. U., Veith, L., Spomer,… More

Wacker, I. U., Veith, L., Spomer, W., Hofmann, A., Thaler, M., Hillmer, S., Gengenbach, U., Schröder, R. R. Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes. J. Vis. Exp. (133), e57059, doi:10.3791/57059 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter