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Developmental Biology

बड़ी मात्रा में विशिष्ट सेलुलर लक्ष्य खोजने के लिए धारावाहिक वर्गों के Multimodal पदानुक्रमित इमेजिंग

Published: March 20, 2018 doi: 10.3791/57059
Automatic Translation
1,2, 3, 2,4, 2,4, 5, 6, 2,4, 1,2,3
1Cryo Electron Microscopy, Centre for Advanced Materials, Universität Heidelberg, 2Heidelberg Karlsruhe Research Partnership (HEiKA), 3Cryo Electron Microscopy, BioQuant, Universitätsklinikum Heidelberg, 4Institute for Automation and Applied Computer Science, Karlsruhe Institute of Technology (KIT), 5Carl Zeiss Microscopy GmbH, 6Electron Microscopy Core Facility, Universität Heidelberg

Summary

यह प्रोटोकॉल एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM) का उपयोग नेनो संकल्प पर इमेजिंग के लिए ऊतक में विशिष्ट कोशिकाओं को लक्षित करता है । राल से धारावाहिक वर्गों की बड़ी संख्या में एंबेडेड जैविक सामग्री पहले एक प्रकाश माइक्रोस्कोप में छवि के लिए लक्ष्य की पहचान और फिर SEM में एक पदानुक्रमित तरीके से कर रहे हैं ।

Abstract

एक मिश्रित कोशिका जनसंख्या या एक ऊतक के भीतर ultrastructural संकल्प पर विशिष्ट कोशिकाओं को लक्षित पदानुक्रमित इमेजिंग प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के संयोजन का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है । राल में एंबेडेड नमूनों ultrathin वर्गों के सैकड़ों के रिबन से मिलकर arrays में खोदी और सिलिकॉन वेफर या conductively लेपित coverslips के टुकड़ों पर जमा कर रहे हैं । arrays कम संकल्प में छवि smartphone कैमरा या प्रकाश माइक्रोस्कोप की तरह एक डिजिटल उपभोक्ता का उपयोग कर रहे है (एल एम) एक तेजी से बड़े क्षेत्र सिंहावलोकन, या एक व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (प्रतिदीप्ति प्रकाश माइक्रोस्कोपी (FLM) के लिए fluorophores के साथ लेबल के बाद) । पोस्ट के बाद भारी धातुओं के साथ धुंधला, arrays एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM) में imaged हैं । लक्ष्य का चयन FLM द्वारा उत्पंन 3 डी पुनर्निर्माण से या 3 डी पुनर्निर्माण SEM छवि स्टैक्स से मध्यवर्ती संकल्प पर बनाया से संभव है अगर कोई फ्लोरोसेंट मार्करों उपलब्ध हैं । ultrastructural विश्लेषण के लिए, चयनित लक्ष्य अंततः उच्च संकल्प में SEM में दर्ज कर रहे है (कुछ नैनोमीटर छवि पिक्सल) । रिबन-हैंडलिंग उपकरण जो किसी भी ultramicrotome करने के लिए retrofitted किया जा सकता है दिखाया गया है । यह सरणी उत्पादन और खोदी चाकू नाव से हटाने सब्सट्रेट के साथ मदद करता है । एक सॉफ्टवेयर मंच है कि SEM में arrays के स्वचालित इमेजिंग की अनुमति देता है पर चर्चा की है । बड़ी मात्रा EM डेटा जनरेट कर रहा है अन्य विधियों की तुलना में, इस तरह के रूप में धारावाहिक ब्लॉक-चेहरा sem (SBF-sem) या केंद्रित आयन बीम sem (मिथ्या-sem), इस दृष्टिकोण के दो प्रमुख लाभ है: (1) राल-एंबेडेड नमूना है, हालांकि एक कटा हुआ संस्करण में संरक्षित है । यह विभिन्न तरीकों से सना हुआ हो सकता है और विभिन्न प्रस्तावों के साथ छवि । (2) के रूप में वर्गों के बाद दाग हो सकता है, यह आवश्यक नहीं है के लिए नमूने जोरदार ब्लॉक-भारी धातुओं के साथ सना हुआ SEM इमेजिंग के लिए इसके विपरीत परिचय या ऊतक ब्लॉकों प्रवाहकीय प्रदान करते हैं । यह विधि सामग्री और जैविक प्रश्नों की एक विस्तृत विविधता के लिए लागू करता है । बायोप्सी बैंकों और पैथोलॉजी प्रयोगशालाओं से उदाविशेष रूप से निर्धारित सामग्री, सीधे एंबेडेड और 3 डी में खंगाला जा सकता है ।

Introduction

ultrastructural संकल्प पर ऊतक की बड़ी मात्रा के पुनर्निर्माण के लिए विभिंन इमेजिंग SEM पर आधारित दृष्टिकोण के एक नंबर का इस्तेमाल किया गया है1: व्यापक समीक्षा उपलब्ध है उदा, SBF के लिए-sem2, मिथ्या-sem3, और सरणी टोमोग्राफी (AT)4। जबकि बाद विधि नमूना सामग्री एक सब्सट्रेट पर धारावाहिक वर्गों की एक सरणी के रूप में संरक्षित है के लिए, SBF-sem और मिथ्या-sem विनाशकारी तरीके हैं, नमूना ब्लॉक पर काम कर रहे हैं और यह इमेजिंग के दौरान खपत. कारण SEM में राल के चार्ज करने के लिए, वे भी दृढ़ता से धातु का नमूना5ब्लॉकों पर निर्भर हैं ।

दूसरी ओर, कुछ कोशिकाओं या एक ऊतक नमूने के भीतर ब्याज की संरचनाओं की पहचान correlative प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (भूखों)6,7,8से विशेष रूप से लाभ कर सकते हैं । भारी धातु की बड़ी मात्रा के आवेदन precludes लक्ष्यीकरण के लिए FLM का उपयोग कर के बाद से यह प्रतिदीप्ति संकेत9बुझाना होगा । इस तरह केवल थोड़ा धातु के नमूनों के लिए, पर पसंद की विधि के बाद से arrays आसानी से पोस्ट किया जा सकता है, LM इमेजिंग के बाद भारी धातु के साथ सना हुआ । इसके अलावा, लगभग किसी भी नमूना प्रकार पर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, यहां तक कि पैथोलॉजिस्ट खजाना छाती10से नियमित नमूने.

का एक और बड़ा लाभ पदानुक्रमिक11 या बहु संकल्प इमेजिंग12के लिए क्षमता है: यह उच्च संकल्प पर सब कुछ छवि के लिए आवश्यक नहीं है, लक्ष्य एक अलग तरीके में चुना जा सकता है के रूप में (जैसे, FLM) या में कम संकल्प SEM छवियां । इमेजिंग केवल उच्च संकल्प पर एक ऊतक या कोशिका जनसंख्या के दिलचस्प क्षेत्रों डिजिटल डेटा भंडारण अंतरिक्ष बचाता है और छोटे छवि डेटा सेट है, जो संभाल करने के लिए आसान कर रहे है पैदा करता है । यहां, कार्यप्रवाह में एक बल्कि कमजोर धातु नमूने का उपयोग कर प्रदर्शन किया है: उच्च दबाव जमे हुए संयंत्र जड़ें (Arabidopsis थालियाना) हाइड्रोफिलिक राल में एंबेडेड ।

कैसे arrays, तैयार दाग रहे हैं, और दोनों FLM और SEM में छवि बनाई है, और कैसे छवि स्टैक पंजीकृत है समझाया जाता है । इसके अलावा, कैसे FLM मात्रा के 3 डी पुनर्निर्माण के लिए नेनो संकल्प में SEM में इमेजिंग के लिए विशिष्ट कोशिकाओं का चयन किया जा सकता है सचित्र है ।

Protocol

नोट: नमूना ब्लॉकों बहुलक किया जाना चाहिए और कुछ भारी धातु होते हैं । चित्र 1a-B में दर्शाए गए दो नमूनों के लिए निर्धारण और एंबेडिंग प्रोटोकॉल11कहीं वर्णित किए गए हैं । संक्षेप में, चित्रा 1a में दिखाया नमूना रासायनिक तय किया गया था, 1% OsO4के साथ पहले ब्लॉक दाग, तो 1% uranyl एसीटेट के साथ, और Spurr राल में एंबेडेड । नमूना आंकड़ा 1b में दिखाया उच्च दबाव जम गया था, एसीटोन में 0.4% uranyl एसीटेट के साथ प्रतिस्थापित फ्रीज, और Lowicryl HM20 राल में एंबेडेड । अगले तैयारी चरणों के लिए पाउडर मुक्त दस्ताने का प्रयोग करें ।

1. arrays बनाना

  1. नमूना ब्लॉक की ट्रिमिंग
    नोट: हमेशा शिकंजा अच्छी तरह से जब भागों डालने कस ।
    1. ultramicrotome के नमूना धारक में नमूना ब्लॉक डालें, धारक को ट्रिमिंग ब्लॉक में रखें, और उसे ultramicrotome के निचले चरण में स्लाइड करें ।
    2. एक उस्तरा केवल नमूने के आसपास राल के एक छोटे से रिम जा ब्लेड के साथ एंबेडेड ऊतक चारों ओर राल ट्रिम । लक्ष्य तक पहुंच गया है जब तक ऊपर से ट्रिम कर दीजिए ।
      नोट: ब्लॉक-फ़ेस का आकार चतुर्भुज या आयताकार हो सकता है (हमने सफलतापूर्वक दोनों आकृतियों का उपयोग किया है) । यह महत्वपूर्ण है के लिए प्रमुख और पीछे बढ़त के रूप में आयत के अब पक्षों का उपयोग सुनिश्चित करें कि एक बड़े क्षेत्र गोंद रिबन स्थिर मिश्रण से कवर किया जाता है ।
    3. ultramicrotome के हाथ में नमूना धारक डालें और चाकू धारक द्वारा निचले चरण में ट्रिमिंग ब्लॉक की जगह । एक हीरा ट्रिम चाकू डालें (सामांय रूप से 45 °), चाकू धारक में । ब्लॉक-चेहरा बिल्कुल समानांतर ट्रिम चाकू किनारे करने के लिए संरेखित करें ।
      नोट: बिल्कुल समानांतर अग्रणी (नीचे) और पीछे (ऊपर) किनारों का उत्पादन करने के लिए, बारी या केवल चाकू विपरीत पक्षों ट्रिम करने के लिए कदम । बड़ी मात्रा के लिए (कई सौ से अधिक वर्गों), एक 90 ° ट्रिम चाकू लाभप्रद है ।
    4. सभी चार पक्षों को चिकना करें, तो नमूना धारक को घुमाएं ताकि अग्रणी और पीछे की ओर किनारे क्षैतिज स्थिति में अब कर रहे हैं ।
    5. ध्यान से चिपकने वाला मिश्रण के साथ ब्लॉक के प्रमुख और पीछे की ओर कोट । एक छोटे से गठित कुछ बाल एक दंर्तखोदनी13के लिए तय ब्रश का प्रयोग करें । इस मिश्रण के विलायक सेकंड के भीतर लुप्त हो जाता है क्योंकि जल्दी से इस कदम का प्रदर्शन । इस मिश्रण से ब्लॉक-फ़ेस को दूषित न करें । 5-10 मिनट के लिए लेपित नमूना ब्लॉक सूखी चलो ।
      नोट: वर्गों की बड़ी संख्या के लिए (> 200), यह कोट करने के लिए बेहतर हो सकता है प्रमुख बढ़त ही है, क्योंकि समय के साथ, गोंद का एक उभार पीछे किनारे पर निर्माण हो सकता है, और संभावित चाकू बढ़त पर वापस वर्गों खींच ।
  2. सब्सट्रेट की तैयारी
    1. एक आकार है कि चाकू नाव में फिट बैठता है के लिए सिलिकॉन वेफर्स के टुकड़े काट (लगभग 2 x 2.5 cm जंबो चाकू के लिए2 ) । यदि आवश्यक हो, सफाई से पहले एक हीरे की scriber के साथ वेफर टुकड़े (संख्या या पत्र) के निशान, या सफाई के बाद स्थाई मार्कर के साथ । isopropanol और एक प्रकार का वृक्ष-मुक्त ऊतक के साथ स्वयं सिलिकॉन वेफर साफ ।
      नोट: correlative इमेजिंग उपयोग इंडियम-टिन-ऑक्साइड (इतो)-लेपित ग्लास coverslips के लिए । वे बहुत सावधानी से नियंत्रित किया जाना चाहिए, और अतिरिक्त सफाई आवश्यक नहीं है ।
    2. एक हटाने योग्य चिपकने का उपयोग वाहक थाली के एक छोर करने के लिए सब्सट्रेट फिक्स.
      नोट: वैकल्पिक रूप से, सब्सट्रेट किनारों चिपकने वाला टेप की दो धारियों का उपयोग कर चाकू किनारे के समानांतर नीचे पिन किया जा सकता है.
    3. प्लाज्मा को सक्रिय (चमक निर्वहन) एक हाइड्रोफिलिक सतह को प्राप्त करने के लिए हवा के साथ सब्सट्रेट । यह इस तरह से किया जाना चाहिए कि सब्सट्रेट पर रखा पानी की एक बूंद एक बहुत पतली फिल्म के लिए फैलता है (कम संपर्क कोण, चित्र 2c, डी). Hydrophilization पैरामीटर्स उपयोग किए गए प्लाज्मा डिवाइस पर निर्भर करते हैं; यहां उपयोग किए गए पैरामीटर्स के लिए, सामग्री की तालिकादेखें ।
      नोट: प्लाज्मा सक्रियण बहुत अस्थिर है, तो सब्सट्रेट उपयोग करने से पहले यह तुरंत प्रदर्शन.
    4. एक सब्सट्रेट धारक के दबाना में वाहक डालें, घुड़सवार सब्सट्रेट चाकू के करीब के साथ-किनारे चाकू नाव में सब्सट्रेट के इष्टतम गीला प्राप्त करने के लिए.
      नोट: कंप्यूटर सहायता प्राप्त डिजाइन (सीएडी) चित्र सहित सब्सट्रेट धारक की एक विस्तृत विवरण, Wacker एट अलमें दिया जाता है । 11
  3. खोदी तैयारी
    1. चाकू धारक में एक जंबो हीरे चाकू डालें, मंजूरी कोण सेट (बरा चाकू के लिए 0 °), और आसुत पानी के साथ चाकू नाव भरें । नमूना करने के लिए 1-2 मिमी की दूरी के लिए चाकू दृष्टिकोण ।
    2. सब्सट्रेट धारक के शिकंजा 1 – 3 (चित्रा 2a) का उपयोग कर पानी में सब्सट्रेट कम. जांच करें कि waterline सब्सट्रेट के ऊपरी तीसरे में स्थित है ।
      नोट: जांच करें कि सब्सट्रेट और वाहक प्लेट के बीच गोंद अच्छी तरह से स्वच्छ संदंश के साथ सब्सट्रेट परोक्ष दबाव डाल द्वारा ठीक हो जाता है । यह नहीं बढ़ना चाहिए ।
    3. क्योंकि यह जमीन की मंजूरी देखना मुश्किल है जब एक सिलिकॉन वेफर का उपयोग कर, कम सब्सट्रेट जब तक आप यह महसूस मंजिल को छूने । अब सब्सट्रेट एक छोटी राशि बढ़ा । सुनिश्चित करें कि न सब्सट्रेट और न ही वाहक चाकू नाव छू जबकि काटने ।
    4. नाव में जल स्तर को समायोजित करने के लिए एक सिरिंज या पिपेट का प्रयोग करें । जबकि दूरबीन के माध्यम से देख, जोड़ें या पानी की सतह के पूर्ण क्षेत्र तक पानी निकालने के ultramicrotome के शीर्ष प्रकाश रोशनी की एक समरूप प्रतिबिंब से पता चलता है ।
    5. ultramicrotome की निचली रोशनी पर स्विच करें । सुनिश्चित करें कि हाथ के बीच की स्थिति में है और ultramicrotome के हाथ पहिया का उपयोग कर कर्षण में नहीं है । चाकू का प्रतिबिंब जब तक नमूना को चाकू-बढ़त ब्लॉक चेहरे पर दिखाई देता है दृष्टिकोण ।
    6. चाकू से नमूने को संरेखित करने के लिए ultramicrotome के समायोजन विकल्पों का उपयोग करें । पहले चाकू घुमाएं, फिर घुमाएं और नमूना झुकाएं ।
      नोट: यह ठीक से गठबंधन किया है अगर प्रकाश धारी, जो नमूना और चाकू के बीच अंतर में देखा जा सकता है, समानांतर किनारों (सीधे समानांतर लाइनें और आकार कील नहीं) से पता चलता है ।
    7. नमूने के झुकाव की जांच करें: सुनिश्चित करें कि प्रकाश धारी मोटा या पतले नहीं हो, जबकि नमूना ऊपर और नीचे ले जा । यदि आवश्यक हो, तो यह सही करने के लिए arc समायोजन पेंच का उपयोग करें । जब तक यह सिर्फ ब्लॉक चेहरे के ऊपर है चाकू के करीब ले जाएं (लेकिन यह स्पर्श नहीं करता है) ।
    8. सेट अनुभाग मोटाई (फ़ीड), काटने की गति, और नियंत्रण इकाई में खिड़की काटने ।
    9. अनुभागण प्रारंभ करें । यदि आवश्यक हो, तो पहले पूर्ण अनुभाग की कटौती की जा रही प्रतीक्षा करें । कुछ वर्गों में कटौती करने के लिए सुनिश्चित करें कि वे एक साथ छड़ी के लिए रिबन फार्म (अंयथा गोंद को फिर से लागू किया जा सकता है) । एक उच्च फ़ीड मूल्य (अल्ट्रा चाकू के लिए अधिकतम, 200 एनएम) के साथ शुरू जब तक पहली पूर्ण अनुभाग काटा जा रहा है । उसके बाद, इच्छित फ़ीड मान सेट करें । पर्याप्त रिबन स्थिरता के लिए, 100 एनएम की एक खंड मोटाई और 1 mm/s की एक काटने की गति एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है । सबसे कम प्राप्त अनुभाग मोटाई के आसपास है 60 एनएम, नमूना गुणवत्ता पर निर्भर करता है ।
    10. रोक खोदी जाए । निकालें सभी अनहोनी (आंशिक रूप से कट) वर्गों चाकू से किनारे और नाव एक बरौनी का उपयोग/ अगर बहुत सारे छोटे मलबे के आसपास तैरते हैं, तो पानी को पूरी तरह से एक पिपेट के साथ निकालें और नाव को ताजे पानी से भरें । अब प्रक्रिया पहले उत्पादक रिबन के लिए तैयार है ।
  4. सेक्शनिंग
    1. अनुभागण प्रारंभ करें । एक बार वर्गों के एक नंबर (वास्तविक संख्या वर्गों और सब्सट्रेट के आकार पर निर्भर करता है) काट दिया गया है, अनुभागीय प्रक्रिया को रोकने के लिए और धीरे से चाकू-बढ़त से एक बरौनी के साथ एक-किनारे पर पथपाकर से रिबन जारी करने के लिए14 या बेहतर अभी तक, एक बहुत एक बिल्ली के फर से नरम बाल ।
    2. (पुश/खींचो) सब्सट्रेट की ओर बरौनी के साथ रिबन और सब्सट्रेट करने के लिए पहले खंड देते हैं ।
      नोट: यह सब्सट्रेट के शुष्क भाग से चिपक जाती है जब तक यह धीरे रिबन धक्का करने के लिए आवश्यक है.
    3. अनुभाग जारी रखने और सब्सट्रेट करने के लिए रिबन संलग्न. एक तरफ से शुरू करें और प्रत्येक नए रिबन के साथ दूसरे के लिए धीरे-धीरे आगे बढ़ना ।
      नोट: पहले से ही संलग्न रिबन ढीला से बचने के लिए बड़े पैमाने पर पानी की गतिविधियों से बचें । एक ही हवा धाराओं के लिए सच है । ultramicrotome के साथ दिया सांस ढाल का प्रयोग करें । प्रतिकूल पर्यावरणीय परिस्थितियों में, ultramicrotome के लिए एक बाड़े की सिफारिश की है15।
    4. जब सब्सट्रेट पूरी तरह से रिबन के साथ कवर किया जाता है (आमतौर पर 4-5 रिबन संभव हैं), धीरे से लिफ्ट सब्सट्रेट धारक के micromanipulator शिकंजा का उपयोग चाकू नाव से सब्सट्रेट.
      नोट: उपयुक्त आंदोलनों रहे हैं: खड़ी लिफ्ट (पेंच 1) और घूर्णन/झुकाव बाहर (पेंच 3), या दोनों का एक संयोजन ।
    5. इसे धूल-मुक्त वातावरण में संग्रहीत करने से पहले रिबन सरणी को सूखने दें. सुखाने के बाद, चिपकने वाला घुड़सवार सब्सट्रेट दूर वाहक से जितनी जल्दी हो सके (उसी दिन, अन्यथा सब्सट्रेट भी हटाने के लिए मुश्किल हो सकता है या भी डिसing के दौरान टूट सकता है).

2. LM इमेजिंग के लिए धुंधला

नोट: इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल सहित विभिंन धुंधलान/लेबलिंग विधियां संभव हैं । यहां एक सीधा, बल्कि विशिष्ट दाग के लिए सेल दीवारों रूपरेखा चुना है ।

  1. Propidium आयोडाइड दाग
    1. parafilm के साथ एक बड़े गिलास पेट्री डिश (30 सेमी व्यास) के नीचे कवर और एक आर्द्र चैंबर का निर्माण करने के लिए गीला ऊतक के साथ पकवान के किनारे लाइन ।
    2. coverslip प्रति समाधान के लगभग 300-500 µ l का उपयोग करें । parafilm पर प्रत्येक coverslip के लिए एक बूंद प्लेस और कांच डाल ड्रॉप पर उल्टा, ताकि वर्गों दाग द्रव के साथ संपर्क में हैं । पकवान कवर और यह एल्यूमीनियम पंनी के साथ लपेटो को प्रकाश से नमूनों की रक्षा करना । 4 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए नमूनों की मशीन ।
    3. coverslip को संदंश के साथ निकालें और इसे ऊपर की ओर ले जाकर धो लें और ऊपर से 100 मिलीलीटर में आसुत पानी के 80 मिलीलीटर से भरे यूरिन में डालें । ताजे पानी के साथ एक और चोंच में इस कदम को दोहराएं । coverslip को संकुचित हवा से सावधानीपूर्वक सुखा लें ।

3. FLM में छवि स्टैक रिकॉर्डिंग

  1. coverslip को एक आम चौड़ा क्षेत्र FLM के मंच पर रखें ।
  2. प्रतिदीप्ति के लिए उपयुक्त फ़िल्टर सेट (सामग्री तालिका) का चयन करें ।
  3. एक उपयुक्त उद्देश्य लेंस के साथ, प्रत्येक अनुभाग में वस्तु की एक छवि ले: देखने के क्षेत्र को भरने और अभिविन्यास लगातार रखने के लिए प्रयास करें. रूट टिप के लिए, एक 40X एयर उद्देश्य का इस्तेमाल किया गया था ।
    नोट: रिबन पूरी तरह से सीधे नहीं कर रहे हैं, एक घूर्णन चरण छवियों लेने जबकि वर्गों को फिर से उंमुख करने में मदद कर सकते हैं. यदि संभव हो, तो छवि को किसी विशिष्ट सुविधा पर केंद्रित करें या रिकॉर्ड की गई छवि के किनारे के बराबर दूरी पर अनुभाग के किनारे जैसी सुविधा रखें.
  4. यदि संभव हो, 16 बिट का उपयोग करने के लिए संतृप्त पिक्सल सीमा और जोखिम समय लगातार रहते हैं ।

4. FLM छवि स्टैक का पंजीकरण

  1. एक आभासी ढेर के रूप में फिजी16 में छवि श्रृंखला आयात करें ।
  2. फ़ाइल मेनू से कोई नया TrakEM17 (रिक्त) खोलें ।
  3. छवि क्षेत्र में दायां क्लिक करें, और आयात के रूप में TrakEM में ढेर "परत प्रति एक टुकड़ा" ।
  4. लेयर्स संरेखित करें (छवि फ़ील्ड में दायां क्लिक), श्रेणी सेट करें (अंतिम छवि पहले), और संदर्भ के रूप में कोई नहीं चुनें । सभी सेटिंग्स के लिए, डिफ़ॉल्ट मान का उपयोग करें, और इच्छित परिवर्तन के रूप में कठोर चुनें ।
  5. पंजीकरण समाप्त होने और संतोषजनक होने पर, दाएं क्लिक करके संरेखित dataset सहेजें और निर्यात करें चुनें । फ्लैट छवि बनाओ, पहले से अंतिम छवि के लिए सीमा निर्धारित करते हैं, और सॉफ्टवेयर आने वाले ढेर दिखाने के लिए । tif-स्वरूप में स्टैक सहेजें ।

5. धुंधला और SEM इमेजिंग के लिए बढ़ते

नोट: धुंधला समाधान तैयार करने के लिए सामग्री की तालिकादेखें । समाधान प्रकाश और हवा से संरक्षित, 12 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है ।

चेतावनी: सीसा साइट्रेट और uranyl एसीटेट भारी धातुओं जो विषाक्त कर रहे है होते हैं । दस्ताने पहनें और कचरे को स्थानीय अधिकारियों के निर्देशों के अनुसार निपटाना.

  1. parafilm के साथ एक बड़े गिलास पेट्री डिश (30 सेमी व्यास) के नीचे कवर और एक आर्द्र चैंबर का निर्माण करने के लिए गीला ऊतक के साथ पकवान के किनारे लाइन ।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है कि NaOH के कई छर्रों दाग के पास पेट्री डिश के भीतर तैनात कर रहे है नेतृत्व साइट्रेट की अत्यधिक वर्षा को रोकने के लिए बूंदें ।
  2. Uranyl एसीटेट दाग
    1. uranyl एसीटेट समाधान २,६८० x g पर तलछट छोटे कणों के लिए कुछ सेकंड के लिए केंद्रापसारक ।
    2. लगभग 300 – 500 µ l का उपयोग coverslip प्रति समाधान. parafilm पर प्रत्येक coverslip के लिए एक बूंद प्लेस और कांच डाल ड्रॉप पर उल्टा, ताकि वर्गों दाग द्रव के साथ संपर्क में हैं ।
    3. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए मशीन, और धुंधला के दौरान पकवान कवर ।
    4. coverslip को संदंश के साथ निकालें और आसुत जल से भरे यूरिन में इसे ऊपर और नीचे ले जाकर धो लें (स्टेप 2.1.3 देखें).
  3. नेतृत्व साइट्रेट धुंधला
    1. uranyl एसीटेट गर्मी के दौरान, नेतृत्व साइट्रेट समाधान तैयार करते हैं ।
      नोट: लीड साइट्रेट हमेशा किसी भी हाला को दूर करने के लिए उपयोग करने से पहले तुरंत फ़िल्टर किया जाना चाहिए । भी कदम 5.2.1 में के रूप में कुछ सेकंड के लिए २,६८० x g पर नेतृत्व साइट्रेट समाधान केंद्रापसारक ।
    2. लगभग 300 – 500 µ l का उपयोग coverslip प्रति समाधान. parafilm पर प्रत्येक coverslip के लिए एक बूंद जगह तुरंत coverslips धोने से पहले uranyl एसीटेट धुंधला के बाद, और कांच डाल ड्रॉप पर उल्टा, ताकि वर्गों दाग द्रव के साथ संपर्क में हैं । बूंदें (300-500 µ l) को parafilm पर तुरंत धोने से पहले coverslips को uranyl एसीटेट दाग के बाद रखें ।
      नोट: हाला के गठन से बचने के लिए, लीड साइट्रेट बूंदों पर सांस न लें ।
    3. जगह धोया coverslip उल्टा ड्रॉप पर नीचे (कोई इसे सुखाने की जरूरत है) ।
    4. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन, और धुंधला के दौरान पकवान कवर ।
    5. coverslip को संदंश के साथ निकालें और इसे ताजे पानी (step 5.2.4) के साथ एक चोंच में ऊपर बताए गए अनुसार धो लें ।
  4. coverslip को संकुचित हवा से सावधानीपूर्वक सुखा लें ।
  5. SEM इमेजिंग के लिए बढ़ते नमूने
    1. एक चिपचिपा कार्बन पैड के साथ एल्यूमीनियम डिटेल पर सिलिकॉन वेफर्स माउंट ।
      नोट: इतो-लेपित coverslips या तो चांदी के रंग और घन-टेप का उपयोग कर घुड़सवार हो सकता है-सुनिश्चित करें कि प्रवाहकीय सतह ठूंठ से जुड़ा हुआ है-या ऊपर के रूप में कार्बन पैड के साथ । उस मामले में इतो-सरफेस से रिकंडक्टर कनेक्शन डिटेल को सिल्वर पेंट की एक बूंद के साथ बनाया जा सकता है ।

6. श्रेणीबद्ध इमेजिंग SEM में

नोट: एक क्षेत्र उत्सर्जन SEM में, एक कम प्राथमिक ऊर्जा (3 केवी या कम), एक सीमा में एक बीम वर्तमान 50 से 800 फिलीस्तीनी अथॉरिटी को चार्ज से बचने के लिए चुनते हैं, और माध्यमिक और/या वापस बिखरे इलेक्ट्रॉनों के कुशल संग्रह के लिए एक उपयुक्त काम की दूरी । बीम वर्तमान का चयन नमूना गुणों पर निर्भर करता है (उदा, राल embedding); इलेक्ट्रॉन खुराक भी एक छोटे से वर्तमान के बीच एक समझौता हो जाएगा (कम नमूने के लिए हानिकारक) और एक उच्च वर्तमान, जो इमेजिंग गति के लिए फायदेमंद है और इसलिए कुल छवि अधिग्रहण समय कम करती है । वापस बिखरे इलेक्ट्रॉनों के लिए समर्पित डिटेक्टरों अच्छा इसके विपरीत प्रदान करते हैं, नमूना के चार्ज करने के लिए कम संवेदनशील हैं, और नमूना सतह कलाकृतियों (परतों, चाकू के निशान) के कम दिखा. कंट्रास्ट और चमक समायोजित किया जाना चाहिए जैसे कि हिस्टोग्राम केंद्रित है ।

  1. SEM इमेजिंग
    1. पहले 100x के बारे में कम आवर्धन पर प्रत्येक कोने की एक छवि हथियाने के द्वारा सरणी के चार कोनों को परिभाषित । संपूर्ण सरणी को परिबद्ध करते हुए ब्याज का क्षेत्र बनाएं (ROI). निंनलिखित मापदंडों के साथ एक इमेजिंग प्रोटोकॉल निरुपित: एक माध्यमिक इलेक्ट्रॉन (एसई) डिटेक्टर, जो एक बड़ी छवि पिक्सेल आकार (उदाहरण के लिए 1,000 एनएम), और एक छोटी निवास समय (जैसे, 0.2 µs) पर उच्च गति इमेजिंग के लिए अनुमति देता है का उपयोग करें ।
      नोट: दृश्य (FOV), जो छवियों की परिधि में विकृतियों में परिणाम हो सकता है की एक बड़ी स्कैनिंग क्षेत्रों में इलेक्ट्रॉन ऑप्टिकल सीमाओं पर काबू पाने के लिए समर्पित कम आवर्धन मोड का उपयोग करें (सबसे SEM निर्माताओं द्वारा प्रदान की) या मध्यम, 1 से 2 k स्कैन के लिए खेतों का उपयोग एकल छवियां ।
    2. एक रॉय पहले खंड में सिर्फ ऊतक रूपरेखा बनाने के द्वारा निर्धारित अनुभाग उत्पंन करते हैं । यह सब बाद में स्टांप उपकरण का उपयोग कर वर्गों के लिए क्लोन । घुमाएं ROIs जब झुके रिबन को समायोजित करने की जरूरत है ।
    3. रिकॉर्ड छवि श्रृंखला एक मध्यवर्ती पिक्सेल आकार का उपयोग कर (लगभग 50 एनएम) और एक लंबे समय के लिए काफी लंबी पहचान और लक्ष्य संरचना पहचान । ६-१० k पिक्सेल की श्रेणी में एकल चित्रों के लिए FOV का उपयोग करें.
      नोट: एटलस 5 सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से संनिकट छवियों से बना मोज़ाइक इकट्ठा करने के लिए बड़े रॉय को कवर कर सकते है/
    4. इस अनुभाग सेट में कोई साइट सेट बनाएं, जिसमें उच्च रिज़ॉल्यूशन SEM इमेजिंग के लिए लक्ष्य संरचना हो । मंच परिशुद्धता के लिए खाते के लिए काफी बड़ा रॉय बनाओ । जांच करें और साइटों की स्थिति को समायोजित ।
      नोट: यह इस तरह है कि केंद्र, जहां ध्यान केंद्रित और autostigmation प्रदर्शन किया जाएगा में ROIs जगह महत्वपूर्ण है, नहीं संरचनात्मक विस्तार के साथ "खाली" सामग्री पर बैठना नहीं है, जैसे, रिक्तिकाएं ।
    5. फोकस सेटिंग्स को परिभाषित करने और प्रदर्शन की जांच पर एक रिबन (यानी, सबसे लंबी दूरी है कि मंच है यात्रा करने के लिए) की लंबाई से अधिक एक छोटे रॉय साइट है कि imaged जाएगा बंद पर ।
    6. उच्च संकल्प SEM अधिग्रहण के लिए एक इमेजिंग प्रोटोकॉल को परिभाषित करें । झिल्ली डिब्बों को देखने के लिए, 3-5 एनएम छवि पिक्सेल आकार चुनें । डिटेक्टर के आधार पर एक समय का चयन करें ताकि छवि भी शोर न हो ।
    7. प्राप्ति प्रारंभ करने से पहले, प्रत्येक रिबन के न्यूनतम पहले खंड पर फ़ोकस मान को प्रोटोकॉल जाँचें विकल्प का उपयोग करके परिभाषित करें.
    8. लक्ष्य ROIs की पूरी श्रृंखला पर स्वचालित SEM इमेजिंग प्रारंभ करें ।
    9. छवि श्रृंखला के रूप में अर्जित डेटा, अधिमानतः tif-प्रारूप में निर्यात करें ।

7. SEM छवि स्टैक का पंजीकरण

  1. एक आभासी ढेर के रूप में फिजी में छवि श्रृंखला आयात करें ।
    नोट: ये अनुभागों की संख्या और ROI के आकार के आधार पर कुछ GB की श्रेणी में बड़ी डेटा फ़ाइलें होंगी.
  2. फसल के रूप में संभव के रूप में ब्याज की संरचना के करीब एक क्षेत्र के लिए आगे की प्रक्रिया के लिए SEM छवि ढेर, और चमक और इसके विपरीत समायोजित करें ।
  3. फ़ाइल मेनू से कोई नया TrakEM17 (रिक्त) खोलें ।
  4. छवि क्षेत्र में दायां क्लिक करें, और आयात के रूप में TrakEM में ढेर "परत प्रति एक टुकड़ा" ।
  5. परतों (छवि क्षेत्र में दायां क्लिक करें) संरेखित, मोड के रूप में कम से वर्ग चुनते हैं, तो सीमा सेट (पहले छवि पिछले), और संदर्भ के रूप में कोई नहीं चुनें । सेटिंग्स के लिए, डिफ़ॉल्ट मान का उपयोग करें और इच्छित परिवर्तन के रूप में कठोर चुनें ।
  6. पंजीकरण पूर्ण और संतोषजनक होने पर, दाएं क्लिक करके संरेखित dataset सहेजें और निर्यात करें चुनें । एक फ्लैट छवि बनाओ, पहले से अंतिम छवि के लिए सीमा निर्धारित करते हैं, और सॉफ्टवेयर आने वाले ढेर शो । tif-स्वरूप में स्टैक सहेजें ।

Representative Results

कार्यप्रवाह यहां वर्णित (चित्र 1) एक राल ब्लॉक में एंबेडेड नमूने के साथ शुरू होता है । नमूना तैयारी के दौरान, कुछ भारी धातु ऊतक में पेश किया जाना चाहिए, लेकिन यह नहीं बल्कि मजबूत धातुरूप के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए आवश्यक है । चित्रा 1a एक संयंत्र जड़ (क्रेस) ब्लॉक-1% OsO4 और 1% uranyl एसीटेट के साथ पारंपरिक दाग से पता चलता है, जबकि आंकड़ा 1b में Arabidopsis रूट केवल कमजोर 0.5% uranyl एसीटेट का उपयोग कर धातु है । बाद नमूना प्रकार correlative दृष्टिकोण के लिए सबसे अच्छा अनुकूल है के रूप में कुछ भारी धातुओं प्रतिदीप्ति बुझाने के लिए करते हैं । एक समर्पित सब्सट्रेट धारक (चित्रा 2) के साथ, कई सौ वर्गों की arrays (चित्रा 1C) का उत्पादन किया जा सकता है । फ्लोरोसेंट लेबलिंग के बाद, इस तरह arrays एक मानक व्यापक क्षेत्र FLM (चित्रा 1 d), तो भारी धातु समाधान के साथ दाग और विभिंन प्रस्तावों (चित्रा 1E-जी) में एक SEM में imaged में imaged हैं ।

arrays के reproducible पीढ़ी के लिए महत्वपूर्ण उपकरण, विशेष रूप से जब एक सब्सट्रेट पर है microtome चाकू नाव से कई रिबन रखने, सब्सट्रेट धारक है (चित्रा 2a, कस्टम-' लेखक प्रयोगशाला में डिजाइन) और एक बरा हीरा एक नाव काफी बड़ी माइक्रोस्कोप स्लाइड (चित्रा बी) को समायोजित करने के साथ चाकू । एक फ्लैट meniscus, रिबन का अच्छा अवलोकन की अनुमति, आवश्यक है और सब्सट्रेट की सफाई प्लाज्मा द्वारा प्राप्त किया जा सकता है: आसुत जल की एक छोटी सी छोटी बूंद की संरचना की तरह चित्रा 2c (अनुपचारित सब्सट्रेट) में के रूप में सब्सट्रेट पर एक लेंस के रूप में नहीं होना चाहिए, लेकिन एक पतली फिल्म (चित्रा 2d, प्लाज्मा सक्रिय सब्सट्रेट) । इन शर्तों के तहत, एक इतो-लेपित coverslip के शुष्क भाग से जुड़े रिबन आसानी से कल्पना कर रहे है (चित्रा 2E) और देखा और लिफ्ट के दौरान नियंत्रित किया जा सकता है पानी से सब्सट्रेट के बाहर ।

एक उदाहरण के रूप में, propidium आयोडाइड के साथ दाग arrays संयंत्र सेल दीवारों लेबल के लिए एक मानक व्यापक क्षेत्र FLM (चित्रा 3) के साथ imaged थे । के बाद से वर्गों केवल 100 समुद्री मील दूर मोटी हैं, यहां तक कि अधिक धुंधला के रूप में यहां दिखाया छोटे धुंधली परिचय । पंजीकरण के बाद, दो कोशिकाओं को पूरी तरह से खंगाला मात्रा में संलग्न छवि स्टैक (चित्र3 डी) से 3d में उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए चयनित किया गया (यह भी पूरक फिल्म sदेखें). uranyl एसीटेट और सीसा साइट्रेट के साथ अतिरिक्त धुंधला के बाद, arrays SEM में imaged थे । चित्रा 3 सी एक सिंहावलोकन दिखाता है, 60 एनएम छवि पिक्सेल के साथ दर्ज; छवि के केंद्र में अंधेरे वर्ग जहां फोकस कार्य निष्पादित किया गया स्थिति इंगित करता है, और अतिरिक्त खुराक मामूली संदूषण के लिए नेतृत्व. उन धारावाहिक वर्गों में उपयुक्त ROIs (स्लाइस 51 कुल में 435 स्लाइस के 248) FLM स्टैक में चयनित दो लक्ष्य कोशिकाओं से युक्त तो एक 5 एनएम छवि पिक्सेल आकार के साथ दर्ज किया गया (चित्र 3d; यहभी देखें पूरक फिल्म S2) ।

स्वचालित पदानुक्रमित SEM में arrays के इमेजिंग यहां वर्णित सॉफ्टवेयर के साथ किया गया था/हार्डवेयर मंच समाधान जीस एटलस 5 । सबसे पहले, पूरे सरणी के एक सिंहावलोकन एसई डिटेक्टर का उपयोग कर बनाया गया था, बहुत बड़ी (1,000 एनएम) छवि पिक्सल और बहुत कम आवास समय (चित्रा 4a) के साथ । एक रॉय केवल ऊतक रूपरेखा पहले खंड पर रखा गया था और सरणी के अंय सभी वर्गों के लिए प्रचार किया । इस अनुभाग सेट तो 60 एनएम छवि पिक्सल के साथ दर्ज की गई एक लंबे समय तक रहने का उपयोग कर (चित्रा 4B) । अंत में, एक साइट सेट, दो लक्ष्य कोशिकाओं से अधिक एक "परत" आसपास के कक्षों के लिए चरण अशुद्धि के लिए खाते से युक्त, निंनलिखित मापदंडों के साथ स्थापित किया गया था: ESB (ऊर्जा चयनात्मक Backscatter) डिटेक्टर, 5 एनएम छवि पिक्सल, बहुत लंबा (40 µs) निवास समय ( चित्र 4c) । ऐसी किसी छवि में ज़ूम इन करने से रिक्तिकाएं (V), mitochondria (M), नाभिक (N), और endoplasmic जालिका (तीरों) जैसे सेलुलर विवरण (चित्र 4d) दिखाई देता है । पूरक चलचित्र S3 को पूरे सरणी के एक ओवरव्यू से एक लक्ष्य कक्ष के उपसेलुलर विवरण तक ज़ूम इन करने के लिए देखें ।

सरणी यहां दिखाया गया है (200 वर्गों) प्लस 250 वर्गों में से एक अतिरिक्त एक के बारे में 8 घंटे का उत्पादन, एक रात के लिए एल एम के लिए दाग, और एक दिन के रिकॉर्ड के लिए (मैंयुअल रूप से) FLM में ले लिया । पद धुंधला के बारे में कुल में 1-2 एच लेता है, व्यक्तिगत सरणियों की संख्या पर निर्भर करता है । SEM रिकॉर्डिंग के लिए, कुछ ही घंटों के लिए एटलस रन स्थापित करने के लिए आवश्यक हैं, और स्वचालित रिकॉर्डिंग मध्यवर्ती संकल्प (60 एनएम पिक्सेल आकार) अनुभाग सेट (200 वर्गों, 450 x 200 µm2) और उच्च संकल्प (5 एनएम पिक्सेल आकार) रॉय के लिए के बारे में 5 दिनों के लिए 3-4 ज था दो लक्ष्य कोशिकाओं से युक्त (200 वर्गों, 55 x 30 µm2) । ध्यान दें कि यहां दिखाए गए नमूने के कम धातु सामग्री के कारण, एक बहुत ही धीमी गति से स्कैनिंग के लिए एक अच्छा संकेत करने वाली शोर का पता लगाने, जो निहित (वर्तमान में उपलब्ध डिटेक्टर के लिए) उच्च संकल्प रॉय के लिए 40 µs का एक निवास समय तक पहुंचने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता था ।

पूरे नुकसान से ग्रस्त कार्यप्रवाह में कई कदम उठाए हैं: आदर्श रिबन अधिक या कम सीधे और सही क्रम में रखा जाना चाहिए (चित्र 5 ए) । हालांकि, तुला (चित्रा 5B), घुमावदार (चित्रा 5d), या यहां तक कि टूटे रिबन अक्सर उत्पादित कर रहे हैं । यह गलत trimming के कारण परिणाम कर सकते हैं (प्रमुख और पीछे किनारों बिल्कुल समानांतर नहीं), या गैर-समान रूप से चिपकने वाला लागू है, लेकिन यह भी एक असममित या असमान रूप से घुसपैठ नमूना. विशेष रूप से परेशानी दोनों नरम और बहुत मुश्किल घटकों युक्त नमूने हैं । बाद के घटकों के लिए इस तरह के संयंत्र की जड़ें यहां दिखाया (चित्रा 5C) के सेल दीवार के रूप में घुसपैठ मुश्किल हो सकता है । उस मामले में, परतों (ऐरोहेड) आसानी से परिच्छेदन के दौरान चर संपीड़न और विश्राम के कारण हो सकता है । SEM में स्वचालित इमेजिंग के लिए, घुमावदार रिबन एक बड़ी समस्या नहीं हैं, क्योंकि ROIs रिबन की वक्रता को समायोजित करने के लिए घुमाया जा सकता है ।

प्रोटोकॉल में एक और महत्वपूर्ण कदम धुंधला है: अपर्याप्त धोने खंड (चित्रा 5E, एफ) पर अवशेषों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, और सबसे खराब स्थिति में, सबसे दिलचस्प क्षेत्र कवर ( चित्रा 5Fमें दो लक्ष्य कोशिकाओं में से एक पर सर्कल) । इसके अलावा, धूल (चित्रा 5d, दृढ़ता से प्रकाश बिखरने कणों) चाकू नाव में पेश किया, उदाहरणके लिए, एक गंदा सब्सट्रेट वाहक के साथ, गंभीर समस्याओं का कारण बन सकती: FLM में, धूल अत्यधिक फ्लोरोसेंट हो सकता है (cf. पूरक फिल्म में कुछ स्लाइसें s) इस हद तक कि कुछ पंजीकरण एल्गोरिदम काम नहीं करते । TrakEM में "संरेखित करें" समारोह 17 तथापि, ऐसे ढेर संभाल सकता है के रूप में पूरक फिल्म एस1 में प्रदर्शन किया ।

Figure 1
आरेख 1: correlative पदानुक्रमिक इमेजिंग के लिए कार्यप्रवाह. एक राल ब्लॉक (एक, जोरदार धातु नमूना) में एंबेडेड एक नमूना से शुरू, नमूना पहले छंटनी की है (बी, कमजोर धातु नमूना) और फिर धारावाहिक वर्गों (ग) के कई रिबन से मिलकर arrays, यहां एक पर रखा इतो-लेपित coverslip, एक ultramicrotome का उपयोग कर उत्पादित कर रहे हैं । एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ दाग के बाद, छवियों के ढेर एक व्यापक क्षेत्र FLM (डी) में दर्ज कर रहे हैं । भारी धातु लवण के साथ आगे धुंधला दौर के बाद, ढेर विभिंन प्रस्तावों (छवि पिक्सेल आकार) में एक SEM (E-G) में imaged हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: arrays की तैयारी के लिए उपकरण । सब्सट्रेट धारक एक मानक ultramicrotome से जुड़ी आंदोलन के सात अक्षों के साथ micromanipulators से इकट्ठे हुए (ए): शिकंजा, हलकों के साथ प्रकाश डाला, ऊर्ध्वाधर के लिए कर रहे हैं (1) और क्षैतिज (2) आंदोलन और झुकने के लिए कर रहे हैं (3) सब्सट्रेट वाहक . एक oversize नाव के साथ जंबो हीरे चाकू बड़े सब्सट्रेट (तीर) को समायोजित करने के लिए, यहां प्लाज्मा का एक टुकड़ा के साथ-सिलिकॉन वेफर सक्रिय एक स्लाइड पर चढ़कर एल्यूमीनियम वाहक आकार (ख) । आसुत जल के 20 µ एल बूंदें एक अनुपचारित सिलिकॉन वेफर सब्सट्रेट (सी) पर या एक प्लाज्मा सक्रिय सब्सट्रेट (डी) पर रखा । चाकू नाव में तैरते चार रिबन, उनके निचले सिरों से एक इतो-लेपित coverslip से जुड़ी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: SEM डेटा के साथ LM डेटा का सहसंबंध. FLM (ए, बी) और SEM (c, D) के साथ दर्ज की गई (a, c) और लक्ष्य कक्षों (B, D) । (ख) एक सॉफ्टवेयर ज़ूम है, और मूल डेटा एक १,३८८ x १,०४० पिक्सेल कैमरा चिप पर एक 40X उद्देश्य लेंस के साथ दर्ज किए गए थे, जबकि (ग) 60 एनएम छवि पिक्सेल आकार के साथ दर्ज की गई है, और (डी5 एनएम छवि पिक्सेल आकार के साथ), illustrating सच में संकल्प में वृद्धि SEM. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: जीस एटलस का उपयोग कर SEM में पदानुक्रमिक इमेजिंग 5 पर. एक सरणी का अवलोकन 1,000 एनएम छवि पिक्सल के साथ दर्ज की SE वेक्षक (A) का उपयोग कर । अनुभाग हर अनुभाग में ऊतक पर रखा रॉय के साथ सेट और 60 एनएम छवि पिक्सल (ख) के साथ दर्ज की गई । साइट एक सीरियल रॉय लक्ष्य कोशिकाओं पर रखा और 5 एनएम छवि पिक्सल (ग) के साथ दर्ज के साथ सेट । इस तरह के उच्च संकल्प छवियों (घ) में ज़ूम, intracellular झिल्ली डिब्बों जैसे रिक्तिकाएं (वी), नाभिक (एन), mitochondria (एम), और endoplasmic जालिका (तीर) दिखाई बन जाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5: विशिष्ट समस्याएँ. 1. से उत्पंन होने वाली प्रक्रिया: रिबन इतो-लेपित coverslips पर रखा आदर्श रूप में सीधे (A) हैं, लेकिन अनुभागीकरण के दौरान अनियमित संपीड़न तुला (B) या घुमावदार रिबन (D), या यहां तक कि परतों (C) का कारण हो सकता है । 2. पानी में सब्सट्रेट और रिबन हैंडलिंग की वजह से, जैसे, अनुभाग और दाग के दौरान: सब्सट्रेट (डी) पर प्रकाश बिखरने कणों, खंड पर बूंदों के रिम ( ईमें), या गंदगी अपर्याप्त के कारण ऊतक पर बाहर धब्बा धुंधला के बाद धुलाई (च) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

पूरक मूवी s: FLM छवि स्टैक. 435 छवियों फिजी में गठबंधन16 TrakEM17 का उपयोग कर और चलचित्र फ़ाइल (. avi) के रूप में सहेजा गया । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

पूरक फिल्म S2: SEM छवि ढेर । 210 छवियां फिजी में गठबंधन16 TrakEM17का उपयोग कर । इस डेटा सेट की मूल स्टैक (300 छवियां) 15 GB थी । स्टैक को 3.3 GB से का आकार घटाने करने के लिए (केवल दो लक्ष्य कक्षों में संरेखण और क्रॉप करने के बाद), इसे x और y में 0.2 का उपयोग कर एक कारक द्वारा स्केल किया गया था और फिर. avi चलचित्र के रूप में सहेजा गया था । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

पूरक मूवी S3: SEM में विभिन्न रिज़ॉल्यूशन स्तरों के साथ ज़ूमिंग. फिल्म में बनाया गया है और. mp4 प्रारूप में एटलस 5 सॉफ्टवेयर से निर्यात किया । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Discussion

बहु-मोडल पदानुक्रमित पर एक ऊतक के भीतर विशिष्ट कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए एक कार्यप्रवाह का प्रदर्शन किया गया था: एक राल-एम्बेडेड नमूना एक कस्टम डिजाइन सब्सट्रेट धारक का उपयोग कर एक प्रवाहकीय सब्सट्रेट पर रखा जाता है, जो धारावाहिक वर्गों के arrays में कटा हुआ है. एक fluorophore और FLM में इमेजिंग के साथ लेबल करने के बाद, पुनर्निर्माण खंड लक्ष्य कोशिकाओं का चयन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । भारी धातुओं के साथ अतिरिक्त दाग दौर के बाद इसके विपरीत परिचय, इन लक्ष्यों को एक SEM में नेनो संकल्प पर कई सौ वर्गों से अधिक छवि एक स्वचालित सॉफ्टवेयर मंच का उपयोग कर रहे हैं ।

कई लंबे रिबन के साथ घनी पैक arrays के उत्पादन के लिए, एक सब्सट्रेट यहां वर्णित एक के समान धारक आवश्यक है । एक कुशल और रोगी व्यक्ति को एक सिलिकॉन सब्सट्रेट करने के लिए कई रिबन संलग्न करने में सक्षम हो सकता है, अर्द्ध चाकू नाव में डूबे, और धीरे से रिबन सब्सट्रेट पर बैठे हैं जब तक पानी के स्तर को कम करने के द्वारा सरणी निकालते हैं. हालांकि, हमारे अनुभव में, वहां के गठन टूटता है जब सब्सट्रेट चाकू नाव (cf. 1.3.2 में प्रोटोकॉल में नोट) के किसी भी हिस्से को छू रहा है की प्रवृत्ति है । इसके अलावा, यह प्रक्रिया बहुत अधिक कठिन है इतो-लेपित सब्सट्रेट्स के साथ: (१) इतो-काँच की पारदर्शिता के कारण, जहाँ रिबन के सिरों को संलग्न करना होता है, वहाँ पानी के किनारे देखना मुश्किल होता है; और (2) क्योंकि इतो लेपित सतह अत्यधिक पॉलिश सिलिकॉन वेफर से ज्यादा मोटा है, रिबन लिफ्ट के दौरान तोड़ने के लिए करते है और छोटे कुछ वर्गों से मिलकर टुकड़े फ्लोट कर सकतेहैं, इस प्रकार वर्गों के आदेश को नष्ट ।

पूरे कार्यप्रवाह भी FLM डेटा के संबंध के बिना व्यवहार्य है । इस मामले में, SEM में डेटा संग्रह कई सत्रों में किया जा करने के लिए हो सकता है । एक प्रारंभिक 3 डी पुनर्निर्माण या कम या मध्यम संकल्प डेटा के कम से मूल्यांकन लक्ष्य की पहचान करने के लिए आवश्यक हो सकता है । इसके अलावा, brightfield LM (FLM की आवश्यकता नहीं) के लिए पारंपरिक ऊतकवैज्ञानिक दाग लागू किया जा सकता है । बेशक, अंय विकल्प6,7,8 arrays पर लेबल एंटीबॉडी हैं, के रूप में पहले से ही पर प्रारंभिक कागज में प्रदर्शन पर18, या आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन (XFPs) या पूर्व एंबेडिंग लेबल नमूना तैयारी के दौरान प्रतिदीप्ति के संरक्षण के साथ ।

चर्चा की विधि का एक सामांय सीमा एक निश्चित मोटाई के वर्गों के उपयोग और 3 डी मात्रा के परिणामस्वरूप असतत नमूना है: जेड में संकल्प SEM केवल अनुभाग सतह से डेटा एकत्र के बाद से वर्गों की मोटाई के रूप में के रूप में अच्छा हो सकता है (डी प्राथमिक ऊर्जा/लैंडिंग ऊर्जा पर epending चयनित) । इसका मतलब यह है कि जिसके परिणामस्वरूप 3 डी खंड अनिसोट्रोपिक voxels है, उदा, 5 x 5 x 100 एनएम3 अगर 100 एनएम वर्गों और 5 एनएम के एक छवि पिक्सेल आकार का उपयोग किया जाता है । 1 µm के नीचे आकार श्रेणी में बहुत छोटी एंटिटी के लिए, यह एक सच्चे ultrastructural वर्णन के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है । एक और तकनीकी सीमा स्वचालित इमेजिंग के लिए SEM में इस्तेमाल मंच की सटीकता है । इस के कारण, यह एक लाभ के लिए मंच सटीकता के विनिर्देशों से बड़ा है कि पूरा लक्ष्य क्षेत्र की छवि है गारंटी का चयन करने के लिए आवश्यक है ।

SBF-sem और मिथ्या-ब्लॉक के रूप में sem-चेहरा इमेजिंग तरीकों की तुलना में, correlative अनिसोट्रोपिक voxels के निश्चित नुकसान है, जैसा कि ऊपर वर्णित है । मिथ्या-SEM के साथ, आइसोट्रोपिक voxels 5 x 5 x 5 एनएम3 प्राप्त किया जा सकता है जब एक उचित बहाव सुधार जगह में है ।

arrays की तैयारी के दौरान वर्गों के नुकसान की वजह से खंगाला मात्रा में अंतराल भी एक चिंता का विषय है कि SBF-sem या मिथ्या-sem के साथ सामना नहीं है हो सकता है । गोंद द्वारा अच्छा रिबन स्थिरीकरण के साथ, यह आमतौर पर केवल एक रिबन के अंतिम खंड के लिए एक मुद्दा है: यह क्षतिग्रस्त हो सकता है जब यह चाकू से रिहा-धार बरौनी का उपयोग कर । हालांकि, हमारे अनुभव में, हर 20 में एक खंड के नुकसान-50 वर्गों छवि पंजीकरण को प्रभावित नहीं करता है ।

दूसरी ओर, संभावना के बाद दाग arrays अच्छा संकेत और SEM इमेजिंग के लिए इसके विपरीत, यहां तक कि उच्च दबाव जमे हुए रूट युक्तियां के रूप में कमजोर धातु के नमूनों पर यहां दिखाया । इसलिए, यह आवश्यक नहीं है कई रासायनिक निर्धारण और धातुरूप कदम द्वारा इष्टतम ultrastructural संरक्षण समझौता । इसके अलावा, धातुरूप के मध्यवर्ती डिग्री के साथ पैथोलॉजी लैब से नियमित नमूने उत्कृष्ट डेटा10उद्धार । इस तरह के बाद एक एंबेडिंग इसके विपरीत वृद्धि SBF-sem और मिथ्या-sem सामांय में के लिए संभव नहीं है । इसके अलावा, के बाद से इन तरीकों विनाशकारी हैं, यानी, इमेजिंग के दौरान नमूना लेने, विभिंन प्रस्तावों और साइटों या समय में बाद में बिंदुओं पर दोहराया इमेजिंग पर पदानुक्रमित इमेजिंग असंभव है । सिद्धांत रूप में, असीमित मात्रा, बड़े FOVs से मिलकर (जैसे, connectomics में पूरे माउस दिमाग के लिए कई मिलीमीटर तक) सिलाई मोज़ाइक द्वारा बनाई गई, और वर्गों की भारी संख्या में द्वारा अधिग्रहीत किया जा सकता है, जबकि मिथ्या-SEM, FOVs परे 100 µm x 100 µm नित्य साधनों से प्राप्त करना कठिन होता है.

पर वर्णित के आगे स्वचालन-कार्यप्रवाह एक निश्चित लाभ होगा, उपर्युक्त तरीकों SBF-sem और मिथ्या-sem दोनों एक ही साधन के भीतर और इमेजिंग प्रदर्शन के बाद से एक पूरी तरह से स्वचालित तरीके से । अनुभाग के स्वचालन के एक प्रकार मौजूद है: ATUMtome12 उत्पंन और वर्गों के हजारों इकट्ठा कर सकते हैं, लेकिन एक सब्सट्रेट के रूप में Kapton टेप का उपयोग ऐसे arrays एक FLM में छवि के लिए मुश्किल बनाता है । पर इतो-लेपित coverslips यहां इस्तेमाल किया, यहां तक कि सुपर संकल्प इमेजिंग संभव होना चाहिए । स्वचालन के लिए एक और, बहुत वांछनीय लक्ष्य FLM डेटा स्टैक की रिकॉर्डिंग होगी । दूसरी ओर, स्वचालन महंगा हो सकता है और सब्सट्रेट धारक के लिए छोड़कर, यहाँ प्रस्तुत कार्यप्रवाह (हार्डवेयर के मामले में) केवल आमतौर पर एक नियमित EM प्रयोगशाला या कोर सुविधा में उपलब्ध इंस्ट्रूमेंटेशन पर, यह निम्न स्तर का उपयोग कर निर्भर करता है.

Disclosures

किट सब्सट्रेट धारक की एक कार्यात्मक मॉडल की आपूर्ति के लिए Boeckeler उपकरणों द्वारा प्रतिपूर्ति प्राप्त हुआ है । मार्लिन Thaler जीस माइक्रोस्कोपी GmbH, माइक्रोस्कोप सिस्टम के निर्माता इस लेख में उल्लेख के कर्मचारी है । इसके अलावा, जीस बड़े क्षेत्र, sem और मिथ्या-sem उपकरणों के लिए 3 डी इमेजिंग में आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए जीस एटलस समाधान संकुल के रूप में कुछ समाधान प्रदान करता है । अंय सभी लेखकों को कुछ भी खुलासा नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम ग्रांट FKZ 13GW0044 ने जर्मन फेडरल मिनिस्ट्री फॉर एजुकेशन ऐंड रिसर्च, प्रोजेक्ट MorphiQuant-3d से सपोर्ट किया था । हम तकनीकी सहायता के लिए Carolin Bartels धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instrumentation
Ultramicrotome RMC PT-PC Alternative: Leica UC7
Substrate holder RMC ASH-100 Alternative: home built
Plasma cleaner Diener Zepto 40kHz Alternatives: Ted Pella Pelco or other benchtop plasma cleaner
Example Parameters for Diener Zepto with 40kHz generator (0-100W); 0.5 mbar, 5 sccm (Air), 10% performance 
Widefield fluorescence light microscope Zeiss Axio Observer.Z1 Alternatives:
Leica, Nikon, Olympus
Fluorescence filter set Zeiss 43 HE (Cy3/DsRed)
Objective lens Zeiss Zeiss Neofluar 40x  0.75 NA
Decent workstation able to handle GB-sized image data
FESEM Zeiss Ultra 55 Alternatives: FEI, Jeol, Hitachi, TESCAN
Name Company Catalog Number Comments
Sectioning
Razor blades Plano T585-V
Diamond knife for trimming 45° Diatome DTB45
Diamond knife for trimming 90° Diatome DTB90
Jumbo diamond knife for sectioning Diatome DUJ3530
Silicon wafer (pieces) Si-Mat Custom Made Doping: P/Bor, orientation: <100>, thickness: 525 ± 25 µm, resistivity: 1-30 Ω-cm
http://si-mat.com/silicon-wafers.html
ITO-coated coverslips Balzers Type Z 22 × 22 × 0.17 mm
https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html
Aluminium carrier Custom Made 76 × 26 mm
Wafer forceps Ideal-tek 34A.SA
Stubs forceps Dumont 0103-2E1/2-PO-1 Dumoxel-H 2E 1/2
Diamond scriber Plano T5448
Eyelash/very soft cat's hair Selfmade Alternative: Plano
Brush Selfmade
Pattex contact adhesive Pattex PCL3C Kraftkleber Classic (the yellowish one)
Fixogum Marabu 290110001 for fixing substrate to carrier
Adhesive tape 3M 851 for fixing substrate to carrier
Isopropanol Bernd Kraft 07029.4000
Xylene Carl Roth 4436 thinner for glue mixture
Rotihistol Carl Roth 6640 alternative, limonene based thinner
Name Company Catalog Number Comments
Software
Image processing Open source Fiji (http://fiji.sc/#download)
Image acquisition Zeiss Atlas 5 AT
(module for Zeiss SEM)		 Alternative for automated image acquisition: WaferMapper: https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html
Name Company Catalog Number Comments
Staining
Propidiumiodide Sigma-Aldrich P4170 Stock solution: 1.5 mM in 0.1 % sodium azide
Uranylacetate Science Services E22400
Lead(II) Nitrate Merck 107398
Tri Sodium Citrate Dihydrate Merck 106448
NaOH pellets Merck 106469
1M NaOH solution Bernd Kraft 01030.3000
Glass petri dish Duran 23 755 56
Name Company Catalog Number Comments
Mounting
Stubs Plano G301F
Carbon pads Plano G3347
Copper tape Plano G3397 double-sided adhesive, conductive
Silver paint Plano G3692 Acheson Elektrodag 1415M
Name Company Catalog Number Comments
Solutions/mixtures
Adhesive mixture for coating blocks Pattex contact adhesive /xylene as thinner, ratio 1:3.
(Alternative for xylene: Rotihistol)
Reynolds lead citrate 50 mL:
Dissolve 1.33 g of lead(II) nitrate in 10 mL of dH2O.
Dissolve 1.76 g of tri-sodium citrate dihydrate in 10 ml dH2O.
Mix both and add 1 M sodium hydroxide until the solution is clear.
Fill up with dH2O to 50 mL.
Propidium iodide staining solution Prepare 1:1500 dilution from stock in dH2O.
Vortex for adequate mixing.
Aqueous uranyl acetate Dissolve 3 % uranyl acetate in dH2O (mix thoroughly).

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References

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बड़ी मात्रा में विशिष्ट सेलुलर लक्ष्य खोजने के लिए धारावाहिक वर्गों के Multimodal पदानुक्रमित इमेजिंग
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Wacker, I. U., Veith, L., Spomer, W., Hofmann, A., Thaler, M., Hillmer, S., Gengenbach, U., Schröder, R. R. Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes. J. Vis. Exp. (133), e57059, doi:10.3791/57059 (2018).

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