Multimodal hierarkisk billeddannelse af serielle sektioner for at finde specifikke cellulære mål inden for store mængder

Summary

Denne protokol er rettet mod bestemte celler i vævet til billedbehandling på nanoskala opløsning ved hjælp af en scanning elektron mikroskop (SEM). Stort antal serielle sektioner fra harpiks-embedded biologisk materiale er først afbildet i en lys mikroskop til at identificere målet og derefter i en hierarkisk måde i SEM.

Abstract

Rettet mod specifikke celler på ultrastrukturelle beslutning inden for en blandet celle population eller en væv kan opnås ved hierarkisk imaging ved hjælp af en kombination af lys og elektronmikroskopi. Prøver indkapslet i harpiks er opdelt i arrays bestående af bånd af hundredvis af ultratynde sektioner og deponeret på stykker af silicium wafer eller conductively belagt coverslips. Arrays er afbildet med lav opløsning ved hjælp af en digital forbruger som din smartphone kameraet eller lysmikroskop (LM) for en hurtig stort område oversigt eller et bredt felt fluorescens mikroskop (Fluorescens lysmikroskopi (FLM)) efter mærkning med fluorophores. Efter efter farvning med tungmetaller, er arrays afbildet i en scanning elektron mikroskop (SEM). Udvælgelse af mål er muligt fra 3D rekonstruktioner genereret af FLM eller 3D rekonstruktioner fremstillet af SEM billedstakke på mellemliggende opløsning, hvis ingen fluorescerende markører er tilgængelige. Ultrastrukturelle analyse, valgte mål er endelig optaget i SEM ved høj opløsning (nogle få nanometer billedpixel). En bånd-håndtering værktøj, der kan eftermonteres til enhver ultramicrotome er påvist. Det hjælper med array produktion og substrat fjernelse fra skære kniv båden. En softwareplatform, der tillader automatiseret billedbehandling af arrays i SEM'EN er diskuteret. Sammenlignet med andre metoder, generere store bind EM data, såsom seriel blok-ansigt SEM (SBF-SEM) eller fokuseret ion beam SEM (FIB-SEM), denne tilgang har to store fordele: (1) harpiks-embedded prøven er bevaret, omend i en skåret version. Det kan være farvet på forskellige måder og afbildet med forskellige opløsninger. (2) som afsnittene kan farves post, er det ikke nødvendigt at bruge prøver stærkt blok-farves med tungmetaller til at indføre kontrast til SEM imaging eller gøre vævet blokke ledende. Dette gør metoden anvendes til en bred vifte af materialer og biologiske spørgsmål. Især lovbefalede materialer fx, fra biopsi banker og patologi labs, kan direkte være indlejret og rekonstrueret i 3D.

Introduction

Rekonstruere store mængder af væv ultrastrukturelle opløsning på en række forskellige Billeddannende metoder baseret på SEM har været brugt¹: omfattende anmeldelser er tilgængelige fx., SBF-SEM², FIB-SEM³og Array Tomografi (AT)⁴. Mens for sidstnævnte metode prøvematerialet er bevaret som en matrix af serielle sektioner på et substrat, er SBF-SEM og FIB-SEM destruktive metoder, arbejder på prøve blok og indtager under imaging. På grund af opladning af harpiks i SEM, afhænger de også kraftigt metalliseret prøve blokke⁵.

På den anden side kan at identificere bestemte celler eller strukturer af interesse inden for en vævsprøve drage særlig fra korrelationsmaalinger lys og elektronmikroskopi (CLEM)^6,7,8. Ved hjælp af FLM for målretning udelukker anvendelsen af store mængder tungmetal da dette ville slukke fluorescens signal⁹. Til prøverne kun lidt metalliseret er på den foretrukne metode da arrays kan nemt være post farves med heavy metal efter LM billeddannelse. Desuden næsten alle prøvetypen kan bruges til AT, selv rutinemæssige prøver fra patologs treasure chest¹⁰.

En anden stor fordel ved AT er potentialet for hierarkisk¹¹ eller multi-resolution imaging¹²: det er ikke nødvendigt at billedet alt i høj opløsning, da mål kan vælges i en anden modalitet (fxFLM) eller i billeder i lav opløsning SEM. Imaging kun de interessante områder i en vævs- eller befolkning på høj opløsning gemmer digitale data opbevaringsplads og producerer mindre billede datasæt, som er lettere at håndtere. Her, AT arbejdsprocessen er påvist ved hjælp af en temmelig svagt metalliseret prøve: højtryk frosne planternes rødder (Arabidopsis thaliana) indlejret i hydrofile harpiks.

Hvordan arrays er forberedt, farves, og afbildet i både FLM og SEM, og hvordan billedstakke er registreret er forklaret. Også, hvordan den 3D rekonstruktion af FLM volumen kan bruges til at vælge specifikke celler for billeddannelse i SEM på nanoskala opløsning er illustreret.

Protocol

Bemærk: Prøve blokke bør være polymeriserede og indeholder nogle heavy metal. Fiksering og indlejring protokoller for de to prøver, vist i figur 1A-B har været beskrevet andetsteds¹¹. Kort sagt, var den prøve, der er vist i figur 1A kemisk fast, farves blokoverførslen første med 1% OsO₄, derefter med 1% uranyl acetat, og indlejret i Spurrs harpiks. Eksemplet vist i figur 1B var højtryk frosset, lamme substitueret med 0,4% uranyl acetat i acetone, og indlejret i Lowicryl HM20 harpiks. Brug pulver gratis handsker for de næste præparationstrin.

1. at skabe Arrays

1. Trimning af prøven blok
   Bemærk: Altid spænd skruerne godt når du indsætter dele.
   1. Indsæt prøven blok i prøveholderen af ultramicrotome, Sæt holderen ind i trimning blok, og skub det ind i den nederste fase af ultramicrotome.
   2. Trim væk harpiks omkring den indlejrede væv med et barberblad, forlader kun en lille kant af harpiks omkring prøven. Trim fra toppen, indtil målet er nået.
      Bemærk: Figuren af blok-ansigt kan være trapez eller rektangulære (vi har med held brugt begge figurer). Det er vigtigt at bruge rektanglets længere sider som den førende og bagkant skal sikre, at et stort område er dækket af lim blandingen stabiliserende bånd.
   3. Indsæt prøveholderen i arm af ultramicrotome og erstatte trimning blok i den nederste fase af knivholderen. Indsæt en trim diamantkniven (normalt 45°), i knivholderen. Juster blok-ansigt nøjagtigt parallelt med trim knivsæg.
      Bemærk: For at producere præcis parallelle førende (nederst) og bagud (top) kanter, drej eller Flyt kun kniven til at trimme modsatte sider. For store mængder (mere end flere hundrede sektioner) er en 90° trim kniv fordelagtigt.
   4. Glat alle fire sider, så du dreje prøveholderen så linjeafstand og forkanten er nu i den vandrette placering.
   5. Forsigtigt coat de foranstillede og efterstillede sider af blok med selvklæbende blanding. Brug en lille børste dannet fra et par hår fast med en tandstikker¹³. Udføre dette trin hurtigt, fordi denne blanding opløsningsmiddel fordamper i løbet af sekunder. Forurene blok-ansigt med denne blanding. Lad belagt prøve blok tørre i 5-10 min.
      Bemærk: For et større antal sektioner (> 200), kan det være bedre at belægge forkant kun, fordi med tiden, måske en bule lim opbygge på bagkanten, og potentielt trække tilbage sektioner over knivsæg.
2. Forberedelse af substratet
   1. Udskårne stykker af silicium wafers til en størrelse, der passer ind i kniv båd (ca 2 x 2,5 cm² for Jumbo kniv). Hvis det er nødvendigt, markere wafer stykkerne (tal eller bogstaver) med en diamant scriber før rengøring eller permanent markør efter rengøring. Ren silicium wafer manuelt med isopropanol og fnugfri væv.
      Bemærk: For korrelationsmaalinger imaging bruge indium-tin-oxid (ITO)-belagt glas coverslips. De skal behandles meget omhyggeligt, og ekstra rengøring er ikke nødvendigt.
   2. Fix substrat til den ene ende af carrier plade ved hjælp af et aftageligt klæbemiddel.
      Bemærk: Alternativt substrat kanter kan være fastgjort ned parallelt med knivsæg med to striber af selvklæbende tape.
   3. Plasma aktivere (glød decharge) substrat med luft til at opnå en hydrofil overflade. Dette bør ske på en sådan måde, at en dråbe vand placeret på substrat breder sig til en meget tynd film (lav kontakt vinkel, figur 2 c, D). Hydrophilization parametre afhænger af plasma enheden bruges; for de parametre, der anvendes her, se Tabel af materialer.
      Bemærk: Plasma aktivering er meget flygtigt, så udføre dette umiddelbart før substrat skik.
   4. Indsæt Flyselskabet i klemme af et substrat indehaveren med monteret substratet tættere til knivsæg at opnå optimal befugtning af substrat i kniv båd.
      Bemærk: En detaljeret beskrivelse af indehaveren af substrat, herunder tegninger computerstøttet design (CAD) er givet i Wacker mfl. ¹¹
3. Skæring forberedelse
   1. Indsæt en Jumbo diamantkniven i knivholderen, angive frivinkel (0° for Jumbo kniv) og fylde kniv båd med destilleret vand. Tilgang kniven til en afstand af 1 – 2 mm til prøven.
   2. Lavere underlaget i vandet ved hjælp af skruerne 1 – 3 (figur 2A) af indehaveren af substrat. Check at vandlinjen er placeret i den øverste tredjedel af underlaget.
      Bemærk: Kontroller, at lim mellem substrat og transportør pladen godt helbredt ved nudging bærematerialet med ren pincet. Det bør ikke flytte.
   3. Fordi det er svært at se frihøjde, når du bruger en silicium wafer, sænke underlaget, indtil du føler det røre gulvet. Nu hæve substrat en lille mængde. Sørg for at hverken underlaget eller Flyselskabet berører kniv båden mens der skæres.
   4. Brug en sprøjte eller pipette til at regulere vandstanden i båden. Mens du ser gennem kikkerten, tilføje eller fjerne vand, indtil området fuld af vandoverfladen viser en homogen afspejling af den øverste lys belysning af ultramicrotome.
   5. Tænd den nederste lampe af ultramicrotome. Sikre, at armen i den midterste position og ikke i retraktion ved hjælp af hånd rattet i ultramicrotome. Tilgang kniven til prøven, indtil afspejling af knivsæg er synlige på blok ansigt.
   6. Bruge indstillingerne tilpasning af ultramicrotome til at justere prøven til kniven. Først dreje kniven, så rotere og vippe prøven.
      Bemærk: Det er korrekt justeret hvis den lys stribe, som kan ses i mellemrummet mellem prøve og kniv, viser parallelle kanter (lige parallelle linjer og ikke kileformet).
   7. Tjekke hældningen af stikprøven: Sørg for, at de lys stribe ikke bliver tykkere eller tyndere mens du flytter prøven op og ned. Hvis det er nødvendigt, skal du bruge arc justeringsskrue for at rette dette. Flytte kniven tættere til prøven, indtil det er lige over blok-ansigt (men ikke røre det).
   8. Indstillet snittykkelse (foder), opskæring hastighed og skære vindue på styreenheden.
   9. Starte skæring. Hvis det er nødvendigt, vente, indtil den første fuld afsnit er skæres. Skær nogle sektioner være sikker på at de holder sammen til form bånd (ellers limen har anvendes igen). Start med en høj feed værdi (højst 200 nm for den Ultra kniv) indtil den første fuld afsnit er skæres. Angiv derefter det ønskede feed værdi. For passende bånd stabilitet, en snittykkelse på 100 nm og en skærehastighed af 1 mm/s er et godt udgangspunkt. Den lavest opnåelige snittykkelse er omkring 60 nm, afhængigt af prøven kvalitet.
   10. Stop skæring. Fjerne alle unødvendige (delvis afskårne) afsnit fra knivsæg og båd ved hjælp af en øjenvipper/kattens hår. Hvis der er en masse små vragrester flyder rundt, fjerne vandet helt med en pipette og fylde båden med frisk vand. Processen er nu klar til den første produktive bånd.
4. Skæring
   1. Starte skæring. Når en række afsnit (det faktiske antal afhænger af størrelsen af sektioner og substrat) er blevet skåret, stoppe skæreprocessen og frigive bånd fra knivsæg af forsigtigt strøg over knivsæg med en øjenvipper¹⁴ eller endnu bedre, med en meget bløde hår fra en kats pels.
   2. Manipulere (push/pull) bånd med øjenvipper mod underlaget og vedhæfte den første sektion til underlaget.
      Bemærk: Det er nødvendigt at forsigtigt skubbe båndet, indtil det holder sig til den tørre del af underlaget.
   3. Fortsætte afsnitsinddeling og knytter bånd til underlaget. Start på den ene side og flytte gradvist over til den anden med hver ny bånd.
      Bemærk: Undgå massive vand bevægelser for at undgå at løsne de allerede knyttet bånd. Det samme gælder for luftstrømme. Bruge den ånde skærme leveres med ultramicrotome. I ugunstige miljøforhold anbefales et aflukke for ultramicrotome¹⁵.
   4. Når substratet er helt dækket med bånd (normalt 4 – 5 bånd er muligt), forsigtigt lift-out substratet fra kniv båden ved hjælp af micromanipulator skruer af indehaveren af substrat.
      NOTE: Egnet bevægelser er: løft lodret (skrue 1) og dreje/vippe ud (skrue 3), eller en kombination af begge.
   5. Lad bånd arrayet tørre, før du gemmer det i et støvfrit miljø. Efter tørring, fjerne den klæbende monteret substrat hurtigst muligt fra flyselskabet (på den samme dag, ellers substrat kan være for svært at fjerne eller kan endda bryde under afmontering).

2. farvning for LM Imaging

Bemærk: Forskellige farvning/mærkning metoder er muligt, herunder immunofluorescens protokoller. Her er et direkte, temmelig uspecifik pletten valgt at skitsere cellevægge.

1. Propidium Iodid farvning
   1. Dække bunden af et stort glas petriskål (30 cm diameter) med parafilm og linje kanten af fadet med våde væv til at bygge et fugtigt kammer.
   2. Bruge ca 300-500 µL opløsning pr. coverslip. Anbring en dråbe for hver coverslip på parafilm og sætte glasset op og ned på drop, således at afsnittene er i kontakt med den farvning væske. Dæk fadet og wrap den med alufolie at beskytte prøverne fra lys. Inkuber prøver til 16 h ved 4 ° C.
   3. Fjerne coverslip med pincet og vask det ved at flytte det op og ned i et 100 mL bægerglas fyldt med 80 mL destilleret vand. Gentag dette trin i et andet bægerglas med frisk vand. Tørre coverslip forsigtigt med trykluft.

3. registrering af billedstak i FLM

1. Sted coverslip på scenen i en fælles wide-felt FLM.
2. Vælg det ønskede filtersæt (Table of Materials) til fluorescens skal overholdes.
3. Med et passende mål linse, tage et billede af objektet i hver sektion: forsøge at fylde synsfelt og holde retningen konstant. For root tip, blev en 40 X luft mål brugt.
   Bemærk: Hvis båndene ikke er helt lige, en roterende fase kan bidrage til at nyorientere afsnittene mens du tager billeder. Hvis det er muligt, centrere billedet på en bestemt funktion eller holde en funktion som kanten af afsnittet på en lige stor afstand til kanten af det optagede billede.
4. Hvis det er muligt bruge 16-bit til at begrænse mættet pixels og holde eksponeringstiden konstant.

4. registrering af FLM billedstak

1. Importere billede serie til Fiji¹⁶ som en virtuel stak.
2. Åbne en ny TrakEM¹⁷ (tom) fra menuen filer.
3. Højreklik i billedfeltet, og importere stakken i TrakEM som "En skive pr. lag".
4. Juster lag (højre klik i billedfelt), indstille intervallet (første billede til sidste), og vælg ingen som reference. Bruge standardværdierne for alle indstillinger, og vælg stiv som den ønskede transformation.
5. Når registreringen er færdig og tilfredsstillende, gemme det justerede datasæt ved højreklik og vælg Eksporter. Gøre flad billede, ligger intervallet fra første til sidste billede, og lad softwaren viser den resulterende stak. Gem stakken i tif-format.

5. farvning og montering til SEM Imaging

Bemærk: For at forberede farvning løsninger Se Tabel af materialer. Løsninger kan opbevares ved 4 ° C i op til 12 måneder, beskyttet mod lys og luft.

Forsigtig: Citrat og uranyl blyacetat indeholder tungmetaller, som er giftige. Bære handsker og bortskaffe affald ifølge de lokale myndigheders instrukser.

1. Dække bunden af et stort glas petriskål (30 cm diameter) med parafilm og linje kanten af fadet med våde væv til at bygge et fugtigt kammer.
   Bemærk: Det er vigtigt, at flere pellets af NaOH er placeret i petriskålen nær de farvning dråber til at forhindre overdreven nedbør af bly citrat.
2. Uranyl acetat farvning
   1. Der centrifugeres uranyl acetate løsning på 2,680 x g i et par sekunder at sediment små partikler.
   2. Bruge ca 300-500 µL opløsning pr. coverslip. Anbring en dråbe for hver coverslip på parafilm og sætte glasset op og ned på drop, således at afsnittene er i kontakt med den farvning væske.
   3. Der inkuberes i 10 min. ved stuetemperatur, og Dæk fadet under farvning.
   4. Fjern coverslip med pincet og vask ved at flytte det op og ned i et bægerglas fyldt med destilleret vand (Se trin 2.1.3).
3. Føre citrat farvning
   1. Under uranyl acetat inkubation, forberede citratopløsning bly.
      Bemærk: Bly citrat bør altid være filtreret umiddelbart før brugen for at fjerne enhver bundfald. Også centrifugeres bly citratopløsning på 2,680 x g i et par sekunder i trin 5.2.1.
   2. Bruge ca 300-500 µL opløsning pr. coverslip. Anbring en dråbe for hver coverslip på parafilm umiddelbart før vask coverslips efter uranyl acetat farvning, og sætte glasset op og ned på drop, således at afsnittene er i kontakt med den farvning væske. Sted dråber (300-500 µL) på parafilm umiddelbart før vask coverslips efter uranyl acetat farvning.
      Bemærk: For at undgå dannelse af bundfald, Indånd ikke på bly citrat dråber.
   3. Læg de vaskede coverslip op og ned på drop (der er ingen grund til at tørre det).
   4. Inkuber i 5 min. ved stuetemperatur, og Dæk fadet under farvning.
   5. Fjerne coverslip med pincet og vask det som beskrevet ovenfor i et bægerglas med ferskvand (trin 5.2.4).
4. Tørre coverslip forsigtigt med trykluft.
5. Montering af prøver til SEM imaging
   1. Montere silicium wafers på aluminium stubbe med en klæbrig carbon pad.
      Bemærk: ITO-belagt coverslips kan enten monteres ved hjælp af sølv maling og Cu-tape — Sørg for den ledende overflade er forbundet til Stubben — eller med carbon puder som ovenfor. I så fald kan en ledende forbindelse fra ITO-overflade til halsstarrig gøres med en dråbe af sølv maling.

6. hierarkisk Imaging i SEM

Bemærk: I en field emission SEM, vælge en lav primær energi (3 kV eller lavere), fjernlys aktuelle i en spænder fra 50 til 800 pA at undgå opladning, og en passende arbejde afstand for effektiv indsamling af sekundære og/eller back-spredt elektroner. Udvalg af beam aktuelle afhænger af egenskaberne prøven (fx., embedding harpiks); elektron dosis vil også være et kompromis mellem en lille strøm (mindre skadelige for stikprøven) og en høj strøm, som er til gavn for imaging hastighed og derfor sænker det samlede billede erhvervelse tid. Dedikeret detektorer til back-spredt elektroner giver god kontrast, er mindre følsomme over for opladning af prøven og vis mindre af den prøve overflade artefakter (folder, kniv mærker). Kontrast og lysstyrke bør justeres, således at histogrammet er centreret.

1. SEM imaging
   1. Først definere de fire hjørner af matrixen ved at snuppe et billede af hvert hjørne på lav forstørrelse, omkring 100 x. Oprette en region af interesse (ROI) omslutter hele rækken. Tildele en billeddannelse protokol med følgende parametre: bruge en sekundær elektron (SE) detector, som giver mulighed for høj hastighed billedbehandling på et stort billede pixelstørrelse (for eksempel 1.000 nm), og en kort hviletid (fx 0.2 µs).
      Bemærk: For at overvinde elektron optiske begrænsninger på en stor scanning felterne of view (FOV), der kan medføre forvridninger i periferien af billederne, bruger dedikeret lav forstørrelse tilstande (leveres af de fleste SEM producenter) eller bruge medium, 1 til 2 k scan felter for enkelt billeder.
   2. Generere et afsnit, der er angivet ved at oprette en ROI skitserer bare væv i den første sektion. Klone det til alle efterfølgende sektioner ved hjælp af stempelværktøjet. Rotere ROIs når skulle rumme bøjet bånd.
   3. Optage billedet serien ved hjælp af en mellemliggende pixelstørrelse (ca. 50 nm) og en gang længe nok til at identificere og anerkende målstrukturen dvæle. Bruge en FOV for enkelt billeder i et område med 6-10 k pixel.
      Bemærk: Atlas 5 software kan automatisk indsamle mosaik bestående af tilstødende billeder til at dække store ROI/afsnit områder på tværs af afsnittene serie.
   4. Oprette et websted, der er angivet i dette afsnit sæt, der indeholder målstrukturen for højere opløsning SEM imaging. Gøre den stor nok ROI konto for fase præcision. Kontrollere og justere holdninger af websteder.
      Bemærk: Det er vigtigt at placere ROIs på en sådan måde, at det centrum, hvor autofokus og autostigmation vil blive udført, ikke sidde på "tomme" materiale med ingen strukturelle detaljer, fx., vacuoles.
   5. Definer indstillingerne for autofokus og kontrollere ydeevnen mindst længden på et bånd (dvs., den længste distance, at scenen skal rejse) på en lille ROI tæt på det websted, der vil blive afbildet.
   6. Definere en billeddannelse protokol for høj opløsning SEM erhvervelse. Se membran rum, vælge 3 – 5 nm billede pixelstørrelse. Vælg en hviletid afhængigt af detektoren, så billedet ikke er støjende.
   7. Før du starter erhvervelse, definere fokus værdier på mindst den første del af hver bånd ved hjælp af indstillingen check protokol.
   8. Start den automatiske SEM imaging over hele serien af target ROIs.
   9. Eksportere de indsamlede data som billede serie, helst i tif-format.

7. registrering af SEM billedstak

1. Importere billede serie til Fiji som en virtuel stak.
   Bemærk: Disse vil være store datafiler i rækken af et par GB afhængig af antallet afsnit og størrelsen af ROI.
2. Afgrøde SEM billede stak til yderligere forarbejdning til et område så tæt på strukturen af interesse som muligt, og justere lysstyrken og kontrasten.
3. Åbne en ny TrakEM¹⁷ (tom) fra menuen filer.
4. Højreklik i billedfeltet, og importere stakken i TrakEM som "En skive pr. lag".
5. Juster lag (højre klik i billedfeltet), vælger mindste kvadraters som mode, indstille intervallet (første billede til sidste), og vælg ingen som reference. Indstillinger, bruge standardværdierne og vælge stiv som den ønskede transformation.
6. Når registreringen er afsluttet og tilfredsstillende, gemme det justerede datasæt ved højreklik og vælg Eksporter. Gøre en flad billede, ligger intervallet fra første til sidste billede, og lad softwaren viser den resulterende stak. Gem stakken i tif-format.

Representative Results

Arbejdsgangen beskrives her (figur 1) starter med en prøve, der er indlejret i en harpiks blok. Under prøveforberedelse, nogle heavy metal bør indføres i væv, men det er ikke nødvendigt at bruge protokoller optimeret til temmelig stærke metallization. Figur 1A viser en plante rod (karse) blok-farvede konventionelt med 1% OsO₄ og 1% uranyl acetat, mens Arabidopsis roden i figur 1B er kun svagt metalliseret ved hjælp af 0,5% uranyl acetat. Sidstnævnte prøvetype er bedst egnet til korrelationsmaalinger tilgange, som nogle tungmetaller har tendens til at slukke fluorescens. Med en dedikeret substrat indehaveren (figur 2), arrays af flere hundrede sektioner kan være produceret (figur 1 c). Efter fluorescerende mærkning, er sådan arrays afbildet i en standard wide-felt FLM (fig. 1 d), derefter farves med heavy metal løsninger og afbildet i en SEM på forskellige opløsninger (figur 1E-G).

Vigtige redskaber for den reproducerbare generation af arrays, er især når du placerer flere bånd fra af mikrotomet kniv båd på et substrat, indehaveren af substrat (figur 2A, custom-designet i forfatternes laboratorium) og en Jumbo diamant kniv med en båd, der er stor nok til at rumme objektglas (figur 2B). En flad menisk, giver god observation af bånd, er nødvendig og kan opnås ved plasma rengøring af substratet: en lille dråbe af destilleret vand bør ikke danne en linse-lignende struktur på substrat som i figur 2 c (ubehandlet substrat), men en tynd film (figur 2D, plasma aktiveret substrat). Disse betingelser bånd knyttet til den tørre del af en ITO-belagt coverslip er let visualiseres (figur 2E) og kan observeres og kontrollerede under lift-out af substrat fra vandet.

Som et eksempel, blev arrays farves med propidium Iodid til at mærke plante cellevægge afbildet med en bred standardfelterne FLM (figur 3A). Da sektionerne er kun 100 nm tykke, selv over farvning som vist her introducerer lidt sløring. Efter registrering, de to celler helt omsluttet af den rekonstruerede volumen blev udvalgt fra billedstak (figur 3B) for høj opløsning imaging i 3D (Se også Supplerende film S1). Efter yderligere farvning med uranyl acetat og bly citrat, arrays blev afbildet i SEM. figur 3 C viser en oversigt, indspillet med 60 nm billedpixel; den mørke firkant i midten af billedet angiver positionen hvor autofokus funktioner blev henrettet, og den ekstra dosis førte til mindre forurening. Fald ROIs i disse serielle sektioner (skiver 51 til 248 af 435 skiver i alt) indeholdende to målcellerne valgt i FLM stakken blev derefter registreret med en 5 nm billede pixelstørrelse (figur 3D; Se også Supplerende film S2).

Automatiseret hierarkisk billeddannelse af arrays i SEM beskrevet her blev gjort med software/hardware platformsløsning ZEISS Atlas 5. Først, en oversigt over hele rækken blev oprettet ved hjælp af SE-detektor, med meget store (1.000 nm) billede pixels og meget lav hviletid (figur 4A). En ROI skitserer kun væv var placeret på den første sektion og overført til alle andre dele af matrixen. Dette afsnit sæt blev derefter registreret med 60 nm billedpixel ved hjælp af en længere hviletid (figur 4B). Endelig, et websted sæt, der indeholder to target-cellerne plus én "lag" af omkringliggende celler at tage højde for fase unøjagtighed, blev oprettet med følgende parametre: ESB (energi selektiv Backscatter) detektor, 5 nm billede pixels, meget lang (40 µs) dvæle tid ( Figur 4 c). Zoome ind på sådan et billede viser subcellulært detaljer (figur 4D) som vacuoles (V), mitokondrier (M), nucleus (N) og endoplasmatiske reticulum (pile). Se også Supplerende film S3 for zoome ind fra en oversigt over hele rækken til subcellulært detalje af en målcelle.

Matrixen vist her (200 sektioner) plus yderligere et af 250 afsnit tog omkring 8 timer at producere, en nat til at pletten for LM, og en dag til at registrere (manuelt) på FLM. Efter farvning tager omkring 1-2 timer i alt, afhængigt af antallet af individuelle arrays. For SEM optagelse, et par timer er forpligtet til at oprette Atlas run, og automatiske optagelse var 3-4 h for mellemliggende løsning (60 nm pixelstørrelse) afsnit sæt (200 sektioner, 450 x 200 µm²) og ca 5 dage til den med høj opløsning (5 nm pixelstørrelse) ROI indeholdende to target-cellerne (200 sektioner, 55 x 30 µm²). Bemærk at på grund af den lave metalindhold i eksemplet vist her, en meget langsom scanningshastighed havde skal anvendes til at nå en god signal-støj afsløring, som indebar (for den foreliggende detektor) en hviletid 40 µs for høj opløsning ROI.

Der er flere trin i hele arbejdsprocessen tilbøjelige til faldgruber: ideelt bånd bør være mere eller mindre lige og placeret i den rigtige rækkefølge (figur 5A). Men bent (figur 5B), buede (fig. 5 d), eller endda brudt bånd er ofte fremstillet. Dette kan medføre på grund af forkert trimning (førende og bagkanten ikke ligefrem parallelle), eller ikke-ensartet anvendt lim, men også fra en asymmetrisk eller ujævnt infiltreret prøve. Særdeles generende er prøver der indeholder meget hårde og bløde komponenter. De sidstnævnte komponenter kan være vanskeligt at infiltrere som cellens væg af planternes rødder vist her (figur 5 c). I så fald kan folder (pilespidser) nemt være forårsaget af variabel kompression og afslapning under skæring. Til automatiseret billedbehandling i SEM, er buede bånd ikke et stort problem, da ROIs kan drejes for at rumme krumning af båndet.

En anden kritisk trin i protokollen farvning: utilstrækkelig vask kan medføre restkoncentrationer på afsnittet (figur 5E, F), og i værste fald kan dække den mest interessante område (cirkel på en af to target-cellerne i figur 5F). Også, støv (figur 5 d, stærkt lysspredning partikler) indført i kniv båd, fxmed en beskidt substrat carrier, kan forårsage alvorlige problemer: FLM, støv kan være stærkt fluorescerende (jf. nogle skiver i supplerende film S1) til sådan grad, at nogle registrering algoritmer ikke fungerer. Funktionen "justere" i TrakEM¹⁷ dog kan håndtere sådanne stakke som demonstreret i Supplerende film S1.

Figur 1: arbejdsgang for den korrelationsmaalinger hierarkisk imaging. Start fra en stikprøve indlejret i en harpiks blok (A, stærkt metalliseret prøve), prøven er første trimmet (B, svagt metalliseret prøve) og derefter arrays bestående af flere bånd af serielle sektioner (C), her placeres på en ITO-belagt coverslip, er fremstillet ved hjælp af en ultramicrotome. Efter farvning med et fluorescerende farvestof, registreres stakkevis af billeder i et wide-felt FLM (D). Efter yderligere farvning runder med tungmetal salte, er stakke afbildet i en SEM (E-G) på forskellige opløsninger (billede pixel størrelser). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: værktøjer til udarbejdelse af arrays. Substrat indehaveren samles fra micromanipulators med syv akser bevægelighed er knyttet til en standard ultramicrotome (A): skruer, fremhæves med cirkler, er til lodret (1) og vandret (2) bevægelse og vippe (3) af substrat carrier . Jumbo diamantkniven med en oversize båd til at rumme store substrater (pil), her med et stykke af plasma-aktiveret silicium wafer monteret på en slide-sized aluminium carrier (B). 20 µL dråber destilleret vand placeret på en ubehandlet silicium wafer substrat (C) eller på en plasma-aktiveret substrat (D). Fire bånd flyder i båden kniv knyttet til en ITO-belagt coverslip af deres nedre ende. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: korrelation af LM-data med SEM data. Oversigter (A, C) og target-cellerne (B, D) registreres med FLM (A, B) og SEM (C, D). (B) er en software zoom, og de oprindelige data var registreret med en 40 X mål linse på en 1,388 x 1.040 pixel kamera chip, mens (C) registreres med 60 nm billede pixelstørrelse, og (D) med 5 nm billedets pixelstørrelse, illustrerer sandt stigning i opløsning i SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: hierarkisk imaging i SEM ved hjælp af ZEISS Atlas 5 på Oversigt over en række indspillet med 1.000 nm billedpixel bruger SE detektoren (A). Afsnit sætter med ROI placeres på væv i hvert afsnit og indspillet med 60 nm billedpixel (B). Site angiver med en seriel ROI placeres på target-cellerne og indspillet med 5 nm billedpixel (C). Når du zoomer ind i sådanne højopløselige billeder (D), bliver intracellulære membran rum såsom vacuoles (V), nucleus (N), mitokondrier (M) og endoplasmatiske reticulum (pile) synlige. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: typiske problemer. 1. som følge af skæreprocessen: bånd placeret på ITO-belagt coverslips er ideelt straight (A), men uregelmæssig kompression ved skæring kan forårsage bent (B) eller buede bånd (D) eller endda folder (C). 2. forårsaget af håndtering af substrat og bånd i vand, fxunder skæring og farvning: lys spredning partikler på substrat (D), rand af dråber på afsnit (cirkel i E), eller snavs smurt ud over væv på grund af utilstrækkelig vask efter farvning (F). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende film S1: FLM billedstak. 435 billeder justeret i Fiji¹⁶ ved hjælp af TrakEM¹⁷ og gemt som filmfil (.avi). Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende film S2: SEM billedstak. 210 billeder justeret i Fiji¹⁶ ved hjælp af TrakEM¹⁷. Den oprindelige stack (300 billeder) af dette datasæt var 15 GB. For at downsize stak fra 3.3 GB (efter justering og beskæring til kun de to målrette celler), var det skaleres i x og y med en faktor på 0,2 ved hjælp af Fiji og derefter gemt som .avi film. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende film S3: zoome med forskellige beslutningsforslag niveauer i SEM. Film lavet i og eksporteret fra Atlas 5 software i .mp4-format. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Discussion

En arbejdsproces til at målrette specifikke celler i et væv af multimodale hierarkisk på blev demonstreret: en resin integreret prøve er skåret i arrays af serielle sektioner, som er placeret på en ledende substrat ved hjælp af en specialdesignet substrat indehaveren. Efter mærkning med en fluorophore og imaging i FLM, bruges den rekonstruerede volumen for at vælge target-cellerne. Efter yderligere farvning runder med tungmetaller at indføre kontrast, er disse mål afbildet i løbet flere hundrede sektioner på nanoskala opløsning i en SEM ved hjælp af en automatiseret softwareplatform.

For at producere tætpakkede matrixer med flere lange bånd, er et substrat indehaveren svarende til den, der er beskrevet her nødvendige. En dygtig og tålmodig person kan muligvis tillægger en silicium substrat, semi-nedsænket i båden kniv flere bånd og hente vifte af gradvist sænke vandstanden indtil båndene sidder på underlaget. Men i den erfaring, der er en tendens til at splintre dannelse når substratet er at røre ved nogen del af kniv båd (jf. note i 1.3.2 i protokollen). Denne procedure er derudover meget vanskeligere med ITO-belagt substrater: (1) som følge af gennemsigtigheden af ITO-glas, det er svært at se kanten af vandet hvor enderne af båndene skal knyttes; og (2) fordi den ITO-belagt overflade er meget grovere end den blankpolerede silicium wafer, bånd har tendens til at bryde under lift-out og mindre fragmenter bestående af et par sektioner kan flyde, dermed ødelægger rækkefølgen af sektionerne.

Den hele arbejdsproces er også mulig uden korrelation til FLM data. I dette tilfælde kan dataindsamling i SEM skulle udføres i flere sessioner. En indledende 3D rekonstruktion eller i det mindste evalueringen af lav eller medium opløsning data kan være nødvendigt at identificere mål. Derudover kan konventionelle histologiske pletter for brightfield LM (ikke kræver FLM) anvendes. Andre indstillinger for^6,7,8 er naturligvis antistof mærkning på arrays, som allerede demonstreret i den oprindelige papir på kl¹⁸, eller genetisk kodet fluorescerende proteiner (XFPs) eller pre indlejring mærkning med bevarelse af fluorescens under forberedelse af prøver.

En generel begrænsning af den omtalte metode er brugen af dele af visse tykkelse og deraf følgende diskrete prøveudtagning af 3D-versionen: opløsning i Z kan kun være så god som tykkelsen af sektionerne, da SEM indsamler kun data fra afsnit overflade (d epending på den primære energi/landing energi valgt). Det betyder, at den resulterende 3D volumen anisotrope voxels, fx., 5 x 5 x 100 nm³ hvis 100 nm sektioner og et billede pixelstørrelse af 5 nm anvendes. For meget små enheder i en størrelsesområde under 1 µm, kan dette ikke være tilstrækkeligt for en ægte ultrastrukturelle beskrivelse. En mere teknisk begrænsning er nøjagtigheden af stadiet anvendes i SEM'EN til automatiseret billedbehandling. På grund af dette er det nødvendigt at vælge en ROI større end specifikationerne for fase nøjagtighed at sikre, at fuld målområdet er afbildet.

Sammenlignet med SBF-SEM og FIB-SEM som blok-ansigt Billeddannende metoder, har korrelationsmaalinger AT den endelige ulempe af anisotrope voxels, som beskrevet ovenfor. Med FIB-SEM, kan isotropic voxels 5 x 5 x 5 nm³ opnås ved en ordentlig drift korrektion er på plads.

Huller i den rekonstruerede volumen på grund af tab af dele under forberedelse af arrays kan også være et anliggende, der ikke er stødt på med SBF-SEM eller FIB-SEM. Med god bånd stabilisering af lim, dette er normalt kun et problem for det sidste afsnit af et bånd: det kan blive beskadiget, når frigiver det fra knivsæg ved hjælp af øjenvipper. Imidlertid vores erfaring påvirke tabet af én sektion i hver 20 – 50 sektioner ikke billede registrering.

På den anden side giver mulighed for at post pletten arrays godt signal og kontrast for SEM imaging, selv om svagt metalliseret prøver såsom højtryk frosne roden tips vist her. Det er derfor ikke nødvendigt at kompromittere optimal ultrastrukturelle bevarelse af talrige kemisk fiksering og metallization trin. Også, rutinemæssige prøver fra patologi laboratorium med mellemliggende grader af metallization levere fremragende data¹⁰. Sådan en post indlejring kontrastforbedring er ikke muligt for SBF-SEM og FIB-SEM i almindelighed. Desuden, da disse metoder er destruktiv, dvs, forbrugende prøven under imaging, hierarkisk imaging på forskellige opløsninger og websteder eller gentagne imaging på senere punkter i tid er umuligt. I princippet ubegrænset diskenheder, bestående af store FOVs (f.eks.op til flere millimeter for hele musen hjerner i connectomics) lavet af syninger mosaikker og enorme antal sektioner kan erhverves af på, mens i FIB-SEM, FOVs ud over 100 µm x 100 µm er vanskelige at nå med rutinemæssig instrumenter.

Yderligere automatisering af arbejdsprocessen til beskrevet AT ville være en klar fordel, da de ovennævnte metoder SBF-SEM og FIB-SEM udføre både skæring og imaging inden for samme instrument i en fuldt automatiseret måde. En form for automatisering af skæring eksisterer: The ATUMtome¹² kan generere og indsamle tusindvis af sektioner, men brugen af Kapton tape som et substrat gør sådan arrays vanskeligt at billedet i en FLM. På den ITO-belagt coverslips anvendes her, bør endda super-resolution imaging være muligt. Et yderligere, meget ønskeligt mål for automation ville være optagelse af datastakke FLM. På den anden side automation kan være dyrt og er bortset fra indehaveren substrat arbejdsprocessen præsenteres her afhængig (for hardware) kun instrumentation normalt tilgængelige i en rutinemæssig EM laboratorium eller core facilitet, hvilket gør det lave niveau adgang.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrumentation
Ultramicrotome	RMC	PT-PC	Alternative: Leica UC7
Substrate holder	RMC	ASH-100	Alternative: home built
Plasma cleaner	Diener	Zepto 40kHz	Alternatives: Ted Pella Pelco or other benchtop plasma cleaner Example Parameters for Diener Zepto with 40kHz generator (0-100W); 0.5 mbar, 5 sccm (Air), 10% performance
Widefield fluorescence light microscope	Zeiss	Axio Observer.Z1	Alternatives: Leica, Nikon, Olympus
Fluorescence filter set	Zeiss	43 HE (Cy3/DsRed)
Objective lens	Zeiss	Zeiss Neofluar 40x	0.75 NA
Decent workstation able to handle GB-sized image data
FESEM	Zeiss	Ultra 55	Alternatives: FEI, Jeol, Hitachi, TESCAN
Name	Company	Catalog Number	Comments
Sectioning
Razor blades	Plano	T585-V
Diamond knife for trimming 45°	Diatome	DTB45
Diamond knife for trimming 90°	Diatome	DTB90
Jumbo diamond knife for sectioning	Diatome	DUJ3530
Silicon wafer (pieces)	Si-Mat	Custom Made	Doping: P/Bor, orientation: <100>, thickness: 525 ± 25 µm, resistivity: 1-30 Ω-cm http://si-mat.com/silicon-wafers.html
ITO-coated coverslips	Balzers	Type Z	22 × 22 × 0.17 mm https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html
Aluminium carrier	Custom Made		76 × 26 mm
Wafer forceps	Ideal-tek	34A.SA
Stubs forceps	Dumont	0103-2E1/2-PO-1	Dumoxel-H 2E 1/2
Diamond scriber	Plano	T5448
Eyelash/very soft cat's hair	Selfmade		Alternative: Plano
Brush	Selfmade
Pattex contact adhesive	Pattex	PCL3C	Kraftkleber Classic (the yellowish one)
Fixogum	Marabu	290110001	for fixing substrate to carrier
Adhesive tape	3M	851	for fixing substrate to carrier
Isopropanol	Bernd Kraft	07029.4000
Xylene	Carl Roth	4436	thinner for glue mixture
Rotihistol	Carl Roth	6640	alternative, limonene based thinner
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Image processing	Open source	Fiji (http://fiji.sc/#download)
Image acquisition	Zeiss	Atlas 5 AT (module for Zeiss SEM)	Alternative for automated image acquisition: WaferMapper: https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html
Name	Company	Catalog Number	Comments
Staining
Propidiumiodide	Sigma-Aldrich	P4170	Stock solution: 1.5 mM in 0.1 % sodium azide
Uranylacetate	Science Services	E22400
Lead(II) Nitrate	Merck	107398
Tri Sodium Citrate Dihydrate	Merck	106448
NaOH pellets	Merck	106469
1M NaOH solution	Bernd Kraft	01030.3000
Glass petri dish	Duran	23 755 56
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mounting
Stubs	Plano	G301F
Carbon pads	Plano	G3347
Copper tape	Plano	G3397	double-sided adhesive, conductive
Silver paint	Plano	G3692	Acheson Elektrodag 1415M
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions/mixtures
Adhesive mixture for coating blocks			Pattex contact adhesive /xylene as thinner, ratio 1:3. (Alternative for xylene: Rotihistol)
Reynolds lead citrate			50 mL: Dissolve 1.33 g of lead(II) nitrate in 10 mL of dH2O. Dissolve 1.76 g of tri-sodium citrate dihydrate in 10 ml dH2O. Mix both and add 1 M sodium hydroxide until the solution is clear. Fill up with dH2O to 50 mL.
Propidium iodide staining solution			Prepare 1:1500 dilution from stock in dH2O. Vortex for adequate mixing.
Aqueous uranyl acetate			Dissolve 3 % uranyl acetate in dH2O (mix thoroughly).