Multimodale hiërarchische beeldvorming van seriële secties voor het vinden van specifieke cellulaire doelen binnen grote Volumes

Summary

Dit protocol is gericht op specifieke cellen in weefsels voor beeldvorming op de nanoschaal resolutie met behulp van een Scannende Elektronen Microscoop (SEM). Groot aantal seriële secties uit biologisch materiaal hars-embedded zijn eerste beeld in een lichte Microscoop te identificeren van het doel, waarna in een hiërarchische wijze in de SEM.

Abstract

Gericht op specifieke cellen op ultrastructureel resolutie binnen een populatie van gemengde cel of een weefsel kan worden bereikt door de hiërarchische geschikt zijn met behulp van een combinatie van de licht- en elektronenmicroscopie. Monsters in de hars ingesloten zijn gesegmenteerd in arrays bestaande linten van honderden uiterst dunne secties en gestort op stukken van silicium wafer of conductively gecoate coverslips. Arrays zijn beeld met een lage resolutie met behulp van een digitale consument zoals smartphone camera of lichte Microscoop (LM) voor een overzicht van de snelle groot gebied, of een breed veld fluorescentie Microscoop (fluorescentie lichte microscopie (FLM)) na het labelen met fluorophores. Na na kleuring met zware metalen, zijn matrices beeld in een Scannende Elektronen Microscoop (SEM). Selectie van de doelen is mogelijk vanuit 3D-reconstructies gegenereerd door FLM of vanuit 3D-reconstructies gemaakt van de SEM-afbeeldingsstapels op tussenliggende resolutie als geen fluorescente markeringen beschikbaar zijn. Ultrastructurele p.a., geselecteerde doelen worden uiteindelijk opgenomen in de SEM op hoge resolutie (een paar nanometer afbeeldingspixels). Een lint-handling tool die kan worden ingebouwd om eventuele ultramicrotome wordt aangetoond. Het helpt met matrix productie en verwijdering van het substraat vanaf de vectorafbeeldingsbestanden mes boot. Een softwareplatform waarmee geautomatiseerde beeldvorming van matrices in de SEM wordt besproken. Vergeleken met andere methoden voor het genereren van grote hoeveelheden EM gegevens, zoals seriële blok-gezicht SEM (SBF-SEM) of gerichte ion beam SEM (FIB-SEM), deze aanpak heeft twee grote voordelen: (1) het hars-embedded monster wordt behouden, zij het in een gesneden-up versie. Het kan op verschillende manieren gekleurd en beeld met verschillende resoluties. (2) zoals de secties post kunnen worden gekleurd, is het niet nodig om monsters sterk blok-gekleurd met zware metalen te introduceren contrast voor SEM imaging of maken het weefsel blokken geleidende. Dit maakt de methode die van toepassing zijn op een grote verscheidenheid van materialen en biologische vragen. Met name vastgestelde materialen b.v.uit biopsie banken en pathologie labs, kunnen direct worden ingesloten en gereconstrueerd in 3D.

Introduction

Voor de wederopbouw van grote hoeveelheden weefsel bij ultrastructurele resolutie zijn een aantal verschillende beeldvormende benaderingen gebaseerd op SEM gebruikte¹: uitgebreide reviews zijn beschikbaar bv., voor de SBF-SEM², FIB-SEM³en Array Tomografie (AT)⁴. Terwijl voor de laatste methode is het monstermateriaal bewaard als een matrix van seriële secties op een substraat, zijn SBF-SEM en FIB-SEM destructieve methoden, bezig met het monster blok en consumeert tijdens imaging. Als gevolg van het in rekening brengen van de hars in de SEM, hangen zij ook sterk gemetalliseerde monster blokken⁵.

Aan de andere kant, kan identificatie van bepaalde cellen of structuren van belang binnen een weefsel monster profiteren met name van oereenstemming licht- en elektronenmicroscopie (CLEM)^6,7,8. Met behulp van FLM voor targeting sluit de toepassing van grote hoeveelheden van heavy metal aangezien dit zou de fluorescentie signaal⁹doven. Voor deze enige enigszins gemetalliseerde monsters is AT de methode van keuze omdat arrays mogelijk gemakkelijk na gebeitst en heavy metal na LM imaging. Bovendien, bijna elk type van de steekproef kan worden gebruikt voor AT, zelfs routine monsters van de patholoog van schat borst¹⁰.

Een ander groot voordeel van AT is het potentieel voor hiërarchische¹¹ of multi-resolutie beeldvormende¹²: het is niet nodig om het imago van alles in hoge resolutie, zoals doelstellingen kunnen worden geselecteerd in een verschillende modaliteit (bijvoorbeeldFLM) of in lage SEM resolutiebeelden. Imaging alleen de interessante regio's van de bevolking van een weefsels of cellen op hoge resolutie digitale data-opslag ruimtebesparing en produceert kleinere datasets van de afbeelding, die gemakkelijker te hanteren. Hier, de AT-werkstroom wordt aangetoond door middel van een nogal zwak gemetalliseerde monster: hogedruk bevroren plantenwortels (Arabidopsis thaliana) ingebed in de hydrofiele hars.

Hoe de arrays worden voorbereid, gekleurd, en beeld in zowel FLM en SEM, en hoe de afbeeldingsstapels worden geregistreerd worden toegelicht. Ook, hoe de 3D reconstructie van het FLM-volume kan worden gebruikt voor het selecteren van bepaalde cellen voor beeldvorming in de SEM op nanoschaal resolutie wordt geïllustreerd.

Protocol

Opmerking: Monster blokken moeten worden polymeervorm en sommige zware metalen bevatten. Fixatie en insluiten van protocollen voor de twee monsters weergegeven in figuur 1A-B zijn beschreven elders¹¹. Kortom, is afgebeeld in figuur 1A chemisch vastgesteld, gekleurd en bloc eerste met 1% OsO₄, vervolgens met 1% uranyl acetaat, en ingesloten in Spurr de hars. Afgebeeld in figuur 1B was hogedruk bevroren, bevriezen gesubstitueerd met 0,4% uranyl acetaat in aceton, en ingesloten in Lowicryl HM20 hars. Gebruik poeder gratis handschoenen voor de volgende stappen voor de voorbereiding.

1. het creëren van Arrays

1. Trimmen van het monster blok
   Opmerking: Draai altijd schroeven goed bij het invoegen van onderdelen.
   1. Het monster blok invoegen de monsterhouder van de ultramicrotome, plaats de houder in het blok trimmen en schuif het in de lagere fase van de ultramicrotome.
   2. Trim weg hars rond het ingesloten weefsel met een scheermesje verlaten van slechts een kleine rand van hars rond het monster. Bijsnijden vanaf de bovenkant totdat het doel is bereikt.
      Opmerking: De vorm van de blok-gezicht wellicht trapezium of rechthoekig (we hebben met succes gebruikt beide shapes). Het is belangrijk om het gebruik van de lange zijden van de rechthoek als de toonaangevende en achterrand om ervoor te zorgen dat een groot gebied wordt bestreken door het mengsel van de lijm de linten te stabiliseren.
   3. Invoegen van de monsterhouder in de tak van de ultramicrotome en vervang het blok trimmen in de lagere fase door de meshouder. Een diamant trim mes (normaal gesproken 45°), in de meshouder invoegen. Hiermee lijnt u de blok-face precies parallel aan de rand van de trim mes.
      Opmerking: Om te produceren precies parallel leiden (onderkant) en achterstand (bovenrand), draai of Verplaats alleen het mes om trim tegenover elkaar gelegen zijden. Voor grote volumes (meer dan enkele honderden secties) is een 90° trim mes voordelig.
   4. Alle vier de zijden glad, en draai daarna aan de monsterhouder zodat de toonaangevende en achterrand nu in de horizontale positie zijn.
   5. Zorgvuldig jas de voorloop- en volgspaties zijkanten van het blok met zelfklevende mengsel. Gebruik een kleine borstel gevormd uit een paar haren vast aan een tandenstoker¹³. Voer deze stap snel omdat het oplosmiddel van dit mengsel binnen seconden verdampt. Het blok-gezicht met dit mengsel niet vervuilen. Laat het blok van de gecoate monster gedurende 5-10 min. drogen.
      Opmerking: voor grotere aantallen secties (> 200), het kan beter zijn om de voorrand alleen, jas, omdat met de tijd een verdikking van de lijm kan op de achterrand opbouwen, en potentieel secties over het scherp van de snede terugtrekken.
2. Bereiding van het substraat
   1. Gesneden stukjes van silicium wafers tot een formaat dat in de mes-boot (ongeveer 2 x 2.5 cm² voor de Jumbo-mes past). Indien nodig, de wafer stukken (cijfers of letters) met een diamant scriber voordat u gaat schoonmaken of markeren met permanente marker na reiniging. Reinig de silicium wafer handmatig met isopropanol en pluisvrije weefsel.
      Opmerking: Gebruik voor oereenstemming imaging indium-tin-oxide (ITO)-gecoat glas coverslips. Ze moeten zeer voorzichtig worden omgegaan, en extra schoonmaak is niet nodig.
   2. Het substraat op één uiteinde van de draagplaat geleverd met een verwijderbare lijm vast te stellen.
      Opmerking: Als alternatief, de randen van het substraat kunnen worden gespeld neer parallel aan het scherp van de snede met behulp van twee strepen van plakband.
   3. Plasma activeren (gloed kwijting) het substraat met lucht te verkrijgen van een hydrofiele oppervlak. Dit moet gebeuren op een zodanige wijze dat een druppel water op het substraat uitspreidt aan een zeer dunne film (lage contacthoek, figuur 2C, D) geplaatst. Hydrophilization parameters is afhankelijk van het apparaat van de plasma gebruikt; Zie Tabel van materialenvoor de hier gebruikte parameters.
      Opmerking: Plasma activering is zeer volatiel, dus dit uit te voeren vóór het gebruik van substraat.
   4. Plaats de vervoerder in de klem van een substraat houder, met een gemonteerde substraat dichter op het scherp van de snede te bereiken optimale bevochtiging van de coating in de mes-boot.
      Opmerking: Een gedetailleerde beschrijving van de houder van de ondergrond, met inbegrip van de computer-aided design (CAD) tekeningen, wordt gegeven in Wacker et al. ¹¹
3. Afdelen voorbereiding
   1. Invoegen van een Jumbo diamant mes in de meshouder, instellen van de hoek van de klaring (0° voor Jumbo mes), en vul de mes-boot met gedestilleerd water. Aanpak het mes tot een afstand van 1 – 2 mm aan het monster.
   2. Lager het substraat in het water met behulp van schroeven 1 – 3 (figuur 2A) van de houder van het substraat. Controleer dat de waterlijn zich in het bovenste derde van het substraat bevindt.
      Opmerking: Controleer dat de lijm tussen de ondergrond en vervoerder plaat goed genezen is door het verschuiven van het substraat met schone pincet. Het moet niet verplaatsen.
   3. Want het is moeilijk om te zien de bodemvrijheid bij het gebruik van een silicium wafer, lager het substraat totdat je voelt dat het raken de vloer. Nu verhogen het substraat een klein bedrag. Zorg ervoor dat het substraat noch de vervoerder de mes-boot terwijl snijden raakt.
   4. Gebruik een spuit of pipet om het waterniveau in de boot. Terwijl u door de verrekijker kijkt, toevoegen of verwijderen van water totdat het volledige gebied van het wateroppervlak een homogene weerspiegeling van de bovenste lichte verlichting van de ultramicrotome toont.
   5. Schakel in het licht van de onderkant van de ultramicrotome. Zorg ervoor dat de arm in de middelste positie en niet in retractie met behulp van het handwiel van de ultramicrotome. Aanpak het mes van het monster tot de reflectie van het scherp van de snede is zichtbaar op het gezicht van het blok.
   6. Gebruik de opties voor aanpassing van de ultramicrotome voor het uitlijnen van het monster, tot het mes. Ten eerste draaien van het mes, dan draaien en kantelen van het monster.
      Opmerking: Het is de juiste manier uitgelijnd als de lichte streep, die kan worden gezien in de kloof tussen het monster en het mes, parallelle randen (rechte parallelle lijnen en niet wig toont-vormige).
   7. Controleer de helling van het monster: ervoor te zorgen dat de lichte streep niet dikker worden of dunner terwijl het bewegen van het monster op en neer. Indien nodig, gebruik de stelschroeven boog om dit te corrigeren. Verplaats het mes dichter naar het monster totdat het is net boven de blok-face (maar niet voldoet).
   8. Sectie dikte (feed), snijden van snelheid en snijden venster bij de controle-eenheid instellen.
   9. Afdelen starten Indien nodig, wachten tot de eerste volledige sectie is ingekrompen. Sommige secties gesneden om er zeker van te zijn dat ze elkaar aan formulier linten vasthouden (anders de lijm moet opnieuw worden toegepast). Beginnen met een hoogwaardige diervoeders (maximaal 200 nm voor de Ultra mes) totdat het eerste volledige sectie is ingekrompen. Vervolgens stelt u de gewenste feed waarde. Voor voldoende lint stabiliteit, een sectie dikte van 100 nm en een snijsnelheid van 1 mm/s is een goed uitgangspunt. De laagste haalbare sectie dikte is ongeveer 60 nm, afhankelijk van de kwaliteit van de steekproef.
   10. Stop segmenteren. Verwijder alle overbodige (gedeeltelijk geslepen) secties uit het scherp van de snede en boot met behulp van een wimper/kat van haar. Als er een heleboel kleine puin rondzweven, verwijder het water compleet met een pipet en de boot vullen met vers water. Het proces is nu klaar voor het eerste productieve lint.
4. Afdelen
   1. Afdelen starten Zodra een aantal secties (het werkelijke aantal is afhankelijk van de grootte van de secties en substraat) heeft verlaagd, stoppen met het vectorafbeeldingsbestanden proces en het lint van het scherp van de snede vrij door zachtjes strelen over het scherp van de snede met een wimper¹⁴ of beter nog, met een zeer zachte haren van de vacht van een kat.
   2. Manipuleren (push-/ pull) het lint met de wimper richting het substraat en het eerste gedeelte hechten op de ondergrond.
      Opmerking: Het is nodig om het lint zachtjes duwen totdat het houdt zich aan het droge deel van het substraat.
   3. Blijven afdelen en de linten te koppelen aan de ondergrond. Beginnen aan de ene kant en geleidelijk over naar de andere met elke nieuwe lint.
      Opmerking: Vermijd massale water bewegingen om te voorkomen dat het losdraaien van de al toegevoegde linten. Hetzelfde geldt voor luchtstromen. Het adem-shield geleverd met de ultramicrotome gebruiken. In ongunstige omgevingsfactoren verdient een behuizing voor de ultramicrotome¹⁵.
   4. Wanneer het substraat is volledig bedekt met linten (meestal 4 – 5 linten zijn haalbaar), zachtjes lift-out het substraat vanaf de boot van de mes met behulp van de schroeven van de micromanipulator van de houder van het substraat.
      Opmerking: Geschikt bewegingen zijn: verticaal verheffen (1 schroef) en draaien/kantelen uit (schroef 3), of een combinatie van beide.
   5. Laat de lint-matrix drogen alvorens het op te slaan in een stofvrije omgeving. Na het drogen, verwijderen de zelfklevende gemonteerde substraat zo spoedig mogelijk van de vervoerder (op dezelfde dag, anders het substraat kan ook moeilijk te verwijderen of zelfs kan breken tijdens de demontage).

2. kleuring voor de beeldvorming LM

Opmerking: Verschillende kleuring/labeling methoden zijn mogelijk, met inbegrip van immunofluorescentie protocollen. Hier is een directe, tamelijk aspecifieke vlek gekozen te schetsen van de celwanden.

1. Propidium jodide kleuring
   1. Bedek de bodem van een groot glas petrischaal (diameter 30 cm) met parafilm en lijn van de rand van de schotel met vochtige tissues om te bouwen van een vochtige kamer.
   2. Gebruik ongeveer 300-500 µL van oplossing per dekglaasje aan. Plaats één druppel voor elke dekglaasje aan op de parafilm en zet het glas ondersteboven op de daling, zodat de secties in contact met de kleuring vloeistof zijn. Dekking van de schotel en wikkel het met aluminiumfolie om de monsters te beschermen tegen licht. Incubeer de monsters gedurende 16 uur bij 4 ° C.
   3. Verwijder het dekglaasje aan met een tang en wassen door het omhoog en omlaag te verplaatsen in een bekerglas van 100 mL gevuld met 80 mL gedestilleerd water. Herhaal deze stap in een andere bekerglas met vers water. Droog het dekglaasje aan zorgvuldig met perslucht.

3. het vastleggen van de afbeeldingsstapel in de DLM

1. Plaats het dekglaasje aan op het podium van een gemeenschappelijk breed-gebied FLM.
2. Kies de gewenste filter set (Tabel of Materials) voor de fluorescentie in acht moeten worden genomen.
3. Met een geschikte objectief, nemen een afbeelding van het object in elke sectie: probeer te vullen van het gezichtsveld en de afdrukstand constant te houden. Voor de root-tip, werd een 40 X lucht doelstelling gebruikt.
   Opmerking: Als de linten niet perfect recht zijn, een roterende fase kan helpen om dit te heroriënteren in de secties terwijl het nemen van beelden. Indien mogelijk, centreren in het beeld op een specifieke functie of een functie zoals de bovenrand van de sectie op een gelijke afstand te houden tot aan de rand van het opgenomen beeld.
4. Gebruik, indien mogelijk, 16 bit te beperken van verzadigde pixels en de blootstellingstijd constant te houden.

4. registratie van de DLM afbeeldingsstapel

1. Importeer de afbeelding serie in Fiji¹⁶ als een virtuele stapel.
2. Open een nieuwe TrakEM¹⁷ (lege) in het bestandsmenu.
3. Klik met de rechtermuisknop in het afbeeldingsveld, en importeer de stack in TrakEM als "Één segment per laag".
4. Uitlijnen van lagen (rechts klikken in de afbeeldingsveld), de reeks (eerste beeld naar de laatste), en kies ' geen ' als referentie. Gebruik de standaardwaarden voor alle instellingen, en kies stijf als de gewenste transformatie.
5. Wanneer de registratie voltooid en bevredigend is, sla de uitgelijnde dataset door Klik met de rechtermuisknop en kies exporteren. Maken van installatiekopieën, de reeks van de eerste tot de laatste afbeelding, en laat de software weergeven van de resulterende stack. De stack in tif-indeling opslaan.

5. kleuring en montage voor de beeldvorming van SEM

Opmerking: Zie Tabel van materialenvoor voorbereiding van kleuring oplossingen. Oplossingen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C voor maximaal 12 maanden, beschermd tegen licht en lucht.

Let op: Loodacetaat citraat en uranyl bevatten zware metalen die giftig zijn. Draag handschoenen en gooi het afval volgens de instructies van de lokale autoriteiten.

1. Bedek de bodem van een groot glas petrischaal (diameter 30 cm) met parafilm en lijn van de rand van de schotel met vochtige tissues om te bouwen van een vochtige kamer.
   Opmerking: Het is belangrijk dat verschillende pellets van NaOH zijn gepositioneerd binnen de petrischaal in de buurt van de kleuring druppels om te voorkomen dat buitensporige neerslag van lood citraat.
2. Uranyl acetaat kleuring
   1. Centrifugeer de uranyl acetaat oplossing bij 2680 x g voor een paar seconden aan sediment kleine deeltjes.
   2. Gebruik ongeveer 300-500 µL van oplossing per dekglaasje aan. Plaats één druppel voor elke dekglaasje aan op de parafilm en zet het glas ondersteboven op de daling, zodat de secties in contact met de kleuring vloeistof zijn.
   3. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, en betrekking hebben op de schotel tijdens kleuring.
   4. Verwijder het dekglaasje aan met pincet en wassen door omhoog en omlaag verplaatsen in een bekerglas gevuld met gedestilleerd water (zie stap 2.1.3).
3. Leiden citraat kleuring
   1. Tijdens de uranyl acetaat incubatie, bereiden de citraatoplossing lood.
      Opmerking: Lood citraat moet altijd onmiddellijk vóór gebruik om eventuele precipitaten worden gefilterd. Ook de lood citraatoplossing 2680 x g centrifugeren voor een paar seconden als in stap 5.2.1.
   2. Gebruik ongeveer 300-500 µL van oplossing per dekglaasje aan. Plaats één druppel voor elke dekglaasje aan op de parafilm onmiddellijk vóór het wassen van de coverslips na de uranyl acetaat kleuring, en zet het glas ondersteboven op de daling, zodat de secties in contact met de kleuring vloeistof zijn. Plaats de druppels (300 – 500 µL) op de parafilm onmiddellijk vóór het wassen van de coverslips na de uranyl acetaat kleuring.
      Opmerking: Om te voorkomen dat de vorming van precipitaten, niet inademen op de voorsprong citraat druppels.
   3. Plaats de gewassen dekglaasje aan ondersteboven op de daling (er is geen behoefte om te drogen).
   4. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, en betrekking hebben op de schotel tijdens de kleuring.
   5. Verwijder het dekglaasje aan met een tang en wassen zoals hierboven beschreven in een bekerglas met zoet water (stap 5.2.4).
4. Droog het dekglaasje aan zorgvuldig met perslucht.
5. Montage van de monsters voor de beeldvorming van SEM
   1. Monteer de silicium-wafels op aluminium categorie: met een kleverige koolstof-zeem.
      Opmerking: Coverslips ITO beklede kan ofwel worden gemonteerd met behulp van zilver verf en Cu-tape — Controleer of het geleidende oppervlak is aangesloten op de stub — of met koolstof pads als hierboven. In dat geval kan een geleidende verbinding van het ITO-oppervlak naar de stub gemaakt worden met een daling van zilver verf.

6. hiërarchische beeldvorming in de SEM

Opmerking: Kies In een veld emissie SEM, een lage primaire energie (3 kV of lager), een stroom in een bereik van 50 tot 800 pA te vermijden opladen, en een redelijke afstand van de werken voor het efficiënt verzamelen van secundaire en/of voor de back-verstrooid elektronen lichtbundel. Selectie van de bundelstroom hangt af van de eigenschappen van het monster (bv., hars inbedding); de elektron dosis zullen ook een compromis tussen een kleine stroom (minder schadelijk voor het monster) en een hoge stroom, die gunstig is voor imaging-snelheid en daarom verlaagt de totale beeld Acquisitietijd. Speciale detectoren voor achterwaarts-verstrooid elektronen goed contrast bieden, zijn minder gevoelig voor het opladen van het monster en Toon minder van het monster de oppervlakte artefacten (plooien, mes merken). Contrast en helderheid moeten worden aangepast, zodanig dat het histogram wordt gecentreerd.

1. SEM imaging
   1. Eerst de vier hoeken van de matrix te definiëren door een afbeelding van elke hoek op lage vergroting, over 100 x grijpen. Een gebied van belang (ROI) bijvoeging van de hele array maken. Toewijzen van een imaging protocol met de volgende parameters: een secundaire elektron (SE)-detector, waarmee een hoge snelheid beeldvorming op een grote afbeelding pixelgrootte (voor voorbeeld 1.000 nm) en een korte Nadruktijd (bijvoorbeeld 0.2 µs) gebruiken.
      Opmerking: Om de optische beperkingen van de elektron op een grote scannen gezichtsveld (FOV), die kan leiden tot verstoringen in de periferie van de beelden, gebruik speciale lage vergroting modi (verstrekt door de meeste fabrikanten van SEM) of medium, 1 tot 2 k scan velden voor gebruiken enkele beelden.
   2. Een sectie instellen door het creëren van een overzicht alleen het weefsel in de eerste sectie ROI te genereren. Kloon voor alle volgende secties met behulp van het gereedschap stempel. De ROIs wanneer nodig voor gebogen linten roteren.
   3. Opnemen van de reeks van de afbeelding met behulp van een tussenliggende pixelgrootte (ongeveer 50 nm) en een tijd lang genoeg om te identificeren en te herkennen van de structuur van de target wonen. Gebruik een FOV voor afzonderlijke afbeeldingen in een bereik van 6-10 k pixels.
      Opmerking: De Atlas 5 software kan automatisch verzamelen mozaïeken samengesteld uit aangrenzende beelden ter dekking van grote gebieden van de ROI/sectie over de seriële secties.
   4. Maak een site instellen binnen deze sectie set, met het doel structuur voor hogere resolutie SEM beeldvorming. De ROI groot genoeg maken account voor fase precisie. Controleren en aanpassen van de standpunten van de sites.
      Opmerking: Het is belangrijk om de ROI op zodanige wijze dat het centrum, waar de autofocus en de autostigmation zal worden uitgevoerd, niet op "leeg" materiaal met geen structurele detail, bijv zit., vacuolen.
   5. Instellingen voor de autofocus en de prestaties ten minste de controle over de lengte van een lint (dat wil zeggen, de langste afstand die het werkgebied moet reizen) op een kleine ROI dicht bij de site die zal worden beeld.
   6. Definieer een imaging protocol voor de verwerving SEM met een hoge resolutie. Om te zien membraan compartimenten, kiest u de grootte van de pixel van de afbeelding van 3 – 5 nm. Selecteer een Nadruktijd afhankelijk van de detector, zodat het beeld niet te lawaaierig is.
   7. Voordat u begint de verwerving, definieert u de waarden van de focus op ten minste het eerste gedeelte van elk lint met behulp van het selectievakje protocoloptie.
   8. Start de geautomatiseerde SEM beeldvorming over de hele reeks van target ROIs.
   9. De verworven gegevens exporteren als afbeelding serie, bij voorkeur in de tif-formaat.

7. registratie van het SEM-beeld-Stack

1. Importeer foto serie in Fiji als een virtuele stapel.
   Opmerking: Deze zullen grote gegevensbestanden in het bereik van een paar GB afhankelijk van het aantal secties en de grootte van de ROI.
2. Gewas het SEM-beeld stapelen voor verdere verwerking naar een gebied zo dicht mogelijk bij de structuur van belang mogelijk en de helderheid en het contrast aanpassen.
3. Open een nieuwe TrakEM¹⁷ (lege) in het bestandsmenu.
4. Klik met de rechtermuisknop in het afbeeldingsveld, en importeer de stack in TrakEM als "Één segment per laag".
5. Lijn de lagen (Klik met de rechtermuisknop in het afbeeldingsveld), kleinste kwadraten Kies als mode, de reeks (eerste beeld naar de laatste), en kies ' geen ' als referentie. Voor de instellingen, de standaardwaarden gebruiken en kies stijf als de gewenste transformatie.
6. Wanneer de registratie voltooid en bevredigend is, sla de uitgelijnde dataset door Klik met de rechtermuisknop en kies exporteren. Maken van een installatiekopie zonder submappen, de reeks van de eerste tot de laatste afbeelding, en laat de software weergeven van de resulterende stack. De stack in tif-indeling opslaan.

Representative Results

De workflow beschreven hier (Figuur 1) begint met een steekproef ingebed in een blok hars. Tijdens de bereiding van de monsters, sommige zware metalen moet worden ingevoerd in het weefsel, maar het is niet nodig te gebruiken protocollen geoptimaliseerd voor vrij sterke metallisatie. Figuur 1A blijkt een wortel van de plant (tuinkers) blok gebeitste conventioneel met 1% OsO₄ en 1% uranyl acetaat, terwijl de Arabidopsis wortel in figuur 1B slechts zwak is gemetalliseerde met behulp van 0,5% uranyl acetaat. Het laatste voorbeeld type is geschikt voor oereenstemming benaderingen zoals sommige zware metalen hebben de neiging om quench fluorescentie. Met een speciaal substraat houder (Figuur 2), matrices van verschillende honderden punten kunnen worden geproduceerd (Figuur 1 c). Na tl labelen, zijn dergelijke arrays beeld in een standaard breed-gebied FLM (Figuur 1 d), en vervolgens gekleurd met heavy metal oplossingen en beeld in een SEM bij verschillende resoluties (figuur 1E--G).

Belangrijke instrumenten voor de reproduceerbare generatie van arrays, zijn met name bij het plaatsen van diverse linten vanaf van de microtoom mes boot op een substraat, de substraat houder (figuur 2A, douane-ontworpen in de auteurs laboratorium) en een Jumbo-diamant mes met een boot groot genoeg is voor Microscoop dia's (figuur 2B). Een platte meniscus, waardoor goede observatie van de linten, noodzakelijk is en kan worden bereikt door het plasma reinigen van de ondergrond: een kleine druppel gedestilleerd water moet niet vormen een lens-achtige structuur op het substraat zoals in figuur 2C (onbehandeld substraat), maar een dunne film (figuur 2D, plasma geactiveerd substraat). Onder deze omstandigheden, linten aangesloten op het droge deel van een dekglaasje ITO beklede aan zijn gemakkelijk gevisualiseerd (figuur 2E) en kan worden waargenomen en gecontroleerd tijdens het lift-out van het substraat vanaf het water.

Als voorbeeld, werden matrices gekleurd met propidium jodide aan het label van de celwanden van planten beeld met een brede standaardveld FLM (figuur 3A). Aangezien de secties alleen 100 zijn nm dik, zelfs overdreven kleuring zoals hier introduceert weinig vervagen. Na registratie, werden de twee cellen volledig ingesloten in het gereconstrueerde volume geselecteerd uit de afbeeldingsstapel (figuur 3B) voor hoge resolutie imaging in 3D (Zie ook Aanvullende film S1). Extra vlekken met uranyl acetaat en lood citraat, naar aanleiding van de arrays zijn beeld in de SEM. Figuur 3 C toont een overzicht, opgenomen met 60 nm afbeeldingspixels; de donkere plein in het midden van de afbeelding geeft de positie waar de autofocus functies zijn geëxecuteerd, en de extra dosis leidde tot lichte verontreiniging. Passende ROIs in deze seriële secties (segmenten 51 tot en met 248 van 435 segmenten in totaal) met de twee Doelcellen geselecteerd in de stack FLM vervolgens werden opgenomen met een 5 nm pixel Afbeeldingsgrootte (figuur 3D; Zie ook Aanvullende film S2).

Geautomatiseerde hiërarchische beeldvorming van de matrices in de SEM hier beschreven werd gedaan met de software/hardware platformoplossing ZEISS Atlas 5. Ten eerste, een overzicht van de hele array is gemaakt met behulp van de SE detector, met zeer groot (1000 nm) afbeelding pixels en zeer lage Nadruktijd (figuur 4A). Een ROI waarin alleen het weefsel was geplaatst op de eerste sectie en doorgegeven aan alle andere secties van de matrix. Deze sectie set werd vervolgens opgenomen met 60 nm afbeeldingspixels met behulp van een langere Nadruktijd (figuur 4B). Tot slot, een set van de site, met de twee doelcellen plus een "laag" van de omringende cellen ter verantwoording voor fase onnauwkeurigheid, opgericht met de volgende parameters: ESB (energie selectieve Backscatter) detector, 5 nm afbeelding pixels, zeer lange (40 µs) wonen tijd ( Figuur 4C). Inzoomen op een dergelijke afbeelding toont subcellular detail (Figuur 4 d) zoals vacuolen (V), mitochondriën (M), nucleus (N) en endoplasmatisch reticulum (pijlen). Zie ook de Aanvullende film S3 voor het inzoomen van een overzicht van de hele array voor de subcellular detail aan één van de doelcel.

De array die hier weergegeven (200 punten) plus een extra een van 250 secties nam ongeveer 8 h tot het produceren, één nacht om vlek voor LM, en een dag om te registreren (handmatig) op de FLM. Na kleuring duurt ongeveer 1-2 h in totaal, afhankelijk van het aantal afzonderlijke matrices. Voor SEM-opname, een paar uur zijn verplicht om in te stellen naar de Atlas-run, en geautomatiseerde opname was 3-4 h voor de tussenliggende resolutie (60 nm pixelgrootte) sectie set (200 secties, 450 x 200 µm²) en ongeveer 5 dagen voor de hoge resolutie (5 nm pixelgrootte) ROI die bevatten de twee doelcellen (200 secties, 55 x 30 µm²). Merk op dat als gevolg van de lage metalen inhoud van hiernaast afgebeeld, een zeer langzame scanner vaart moest worden gebruikt om te bereiken van een goede detectie van signal-to-noise, die (voor de momenteel beschikbare detector) een Nadruktijd 40 µs voor de hoge ROI impliciet.

Er zijn verschillende stappen in de hele workflow vatbaar voor valkuilen: idealiter linten moet min of meer rechte en geplaatst in de juiste volgorde (figuur 5A). Echter, gebogen (figuur 5B), gebogen (figuur 5D) of zelfs gebroken linten worden vaak geproduceerd. Hierdoor kunnen als gevolg van onjuiste trimmen (toonaangevende en trailing randen niet precies parallel), of niet-eenvormige wijze worden toegepast lijm, maar ook uit een asymmetrische of ongelijk geïnfiltreerde monster. Bijzonder lastig zijn monsters die zowel zeer harde als zachte componenten bevatten. De laatste onderdelen kunnen moeilijk te infiltreren zoals de celwand van de plantenwortels hier weergegeven (figuur 5C). In dat geval kunnen plooien (pijlpunten) gemakkelijk worden veroorzaakt door variabele compressie en ontspanning gedurende het segmenteren. Voor geautomatiseerd beeldvorming in de SEM, zijn gebogen linten niet een groot probleem, aangezien de ROI kunnen worden gedraaid om de kromming van het lint aan te passen.

Een andere belangrijke stap in het protocol is kleuring: onvoldoende wassen kan leiden tot residuen op de sectie (figuur 5E, F), en in het ergste geval, bestrijken de meest interessante gebied (cirkel op een van de twee doelcellen in figuur 5F). Ook, stof (figuur 5D, sterk lichtverstrooiing deeltjes) geïntroduceerd in de mes boot, bijvoorbeeldmet een vuile substraat vervoerder, kan ernstige problemen veroorzaken: In de DLM, stof kunnen zeer TL (vgl. sommige segmenten in aanvullende film S1) tot dermate dat sommige registratie-algoritmen niet werken. De functie "align" in TrakEM¹⁷ is echter dergelijke stapels zoals aangetoond in Aanvullende film S1aankan.

Figuur 1: Workflow voor de oereenstemming hiërarchische beeldvorming. Een steekproef vanaf ingebed in een blok hars (A, sterk gemetalliseerde monster), het monster is eerste bijgesneden (B, zwak gemetalliseerde monster) en vervolgens arrays hier bestaande uit verschillende linten van seriële secties (C), geplaatst op een ITO-gecoate dekglaasje aan, zijn geproduceerd met behulp van een ultramicrotome. Na kleuring met een fluorescente kleurstof, stapels van beelden geregistreerd in een breed-gebied FLM (D). Na verdere kleuring rondes met zware metalen zouten, zijn stapels beeld in een SEM (E--G) bij verschillende resoluties (grootte van de pixel van de afbeelding). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: hulpmiddelen voor de bereiding van arrays. Substraat houder samengesteld uit micromanipulators met zeven assen van verkeer aangesloten op een standaard ultramicrotome (A): de schroeven, gemarkeerd met cirkels, zijn verticaal (1) en horizontale (2) beweging en kantelen (3) van de vervoerder substraat . De jumbo diamant mes met een oversize boot voor grote substraten (pijl), hier met een stuk van plasma-activated silicium wafer gemonteerd op een dia en middelgrote aluminium drager (B). 20 µL druppels gedestilleerd water op een onbehandelde silicium wafer substraat (C) of op een substraat van plasma-activated (D) gelegd. Vier linten drijvend in de mes-boot, aangesloten op een dekglaasje ITO beklede aan door hun lagere doeleinden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: correlatie van de LM-gegevens met gegevens van de SEM. Overzichten (A, C) en doelcellen (B, D) opgenomen met FLM (A, B) en SEM (C, D). (B) is een software-zoom, en de oorspronkelijke gegevens werden geregistreerd met een 40 X-objectief op een 1,388 x 1,040 pixel camera chip, terwijl (C) wordt geregistreerd met 60 pixelgrootte van de afbeelding van nm, en (D) met 5 nm pixel beeldgrootte, ter illustratie van de ware toename van de resolutie in de SEM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4: hiërarchische beeldvorming in de SEM met ZEISS Atlas 5 te Overzicht van een array opgenomen met 1.000 nm afbeeldingspixels met behulp van de SE detector (A). Sectie wordt ingesteld met de ROI op weefsel in elke sectie geplaatst en opgenomen met 60 nm afbeeldingspixels (B). Site wordt ingesteld met een seriële ROI op doelcellen geplaatst en opgenomen met 5 nm afbeeldingspixels (C). Bij het inzoomen in dergelijke hoge resolutie beelden (D), membraan van intracellulaire compartimenten zoals vacuolen (V), nucleus (N), mitochondriën (M) en endoplasmatisch reticulum (pijlen) zichtbaar worden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 5: typische problemen. 1. als gevolg van de vectorafbeeldingsbestanden proces: linten geplaatst op ITO beklede coverslips zijn ideaal rechte (A), maar onregelmatige compressie tijdens afdelen gebogen (B) of gebogen linten (D), of zelfs plooien (C) kunnen veroorzaken. 2. veroorzaakt door behandeling van substraat en linten in water, bijvoorbeeldtijdens het segmenteren en kleuring: licht verstrooiing deeltjes op substraat (D), rand van druppels op sectie (cirkel in E), of het vuil besmeurd uit over weefsel als gevolg van onvoldoende het wassen na kleuring (F). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Aanvullende film S1: DLM afbeeldingsstapel. 435 afbeeldingen uitgelijnd in Fiji¹⁶ met behulp van TrakEM¹⁷ en als filmbestand (AVI) opgeslagen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende film S2: SEM afbeeldingsstapel. 210 afbeeldingen uitgelijnd in Fiji¹⁶ met behulp van TrakEM¹⁷. De oorspronkelijke stapel (300 afbeeldingen) deze gegevensset was 15 GB. Om te krimpen de stack van 3,3 GB (na uitlijning en bijsnijden om alleen de twee cellen target), deze werd aangepast in x en y met een factor van 0,2 met behulp van Fiji en vervolgens opgeslagen als AVI-film. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende film S3: inzoomen met de resolutie van de verschillende niveaus in de SEM. Film in gemaakt en geëxporteerd vanuit de Atlas 5-software in .mp4 formaat. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Een workflow voor het richten van specifieke cellen binnen een weefsel door multimodale hiërarchische AT bleek: een monster hars-embedded is gesneden omhoog in arrays van seriële secties, die in een geleidende substraat met behulp van een speciaal ontworpen substraat-houder worden gebracht. Na labelen met een fluorophore en beeldvorming in de DLM, wordt het gereconstrueerde volume gebruikt voor het selecteren van de doelcellen. Na kleuring van extra rondes met zware metalen om contrast, zijn deze doelstellingen beeld over meerdere honderd secties op nanoschaal resolutie in een SEM met behulp van een geautomatiseerde softwareplatform.

Voor de productie van dichtbevolkte verpakt arrays met verschillende lange linten, is een vergelijkbaar is met de hier beschreven substraat-houder nodig. Een bekwame en geduldige persoon mogelijk verschillende linten hechten aan een ondergrond van silicium, semi-ondergedompeld in de mes-boot, en de matrix op te halen door de waterstand geleidelijk te verlagen totdat de linten op de drager vervagen zitten. Echter, in de onze ervaring, er is een neiging om te verbrijzelen vorming wanneer het substraat is aanraakt de boot mes (cf. nota in 1.3.2 in protocol). Deze procedure is bovendien veel moeilijker met ITO-gecoate ondergronden: (1) door de transparantie van de ITO-glas, is het moeilijk om te zien de rand van het water waar de uiteinden van de linten hebben moeten worden gevoegd; en (2) omdat het ITO-gecoate oppervlak veel ruwer dan de zeer gepolijst silicium wafer is, de linten hebben de neiging te breken tijdens lift-out en kleinere fragmenten uit een paar secties kunnen zweven, dus het vernietigen van de volgorde van de secties.

De hele workflow is ook mogelijk zonder correlatie met FLM gegevens. In dit geval wellicht verzamelen van de gegevens in de SEM in meerdere sessies worden uitgevoerd. Een eerste 3D reconstructie of op zijn minst evaluatie van gegevens met lage of middelgrote resolutie kunnen nodig zijn ter specificatie van de doelen. Daarnaast kunnen conventionele histologische vlekken voor helderveld LM (niet vereisen FLM) worden toegepast. Natuurlijk zijn andere opties^6,7,8 antilichaam etiketten op de arrays, zoals al blijkt in het eerste papier op in¹⁸, genetisch gecodeerd fluorescerende eiwitten (XFPs) of vooraf te embedding labeling met behoud van fluorescentie tijdens de bereiding.

Een algemene beperking van de besproken methode is het gebruik van secties van een bepaalde dikte en de resulterende discrete bemonstering van het 3D-volume: resolutie in Z kan alleen worden zo goed als de dikte van de secties aangezien de SEM alleen gegevens van de oppervlakte van de sectie (d verzamelt epending op de energie van de primaire energie/landing geselecteerd). Dit betekent dat het resulterende 3D-volume anisotrope voxels, bijv heeft., 5 x 5 x 100 nm³ als 100 nm secties en een afbeelding pixelgrootte van 5 nm worden gebruikt. Voor zeer kleine entiteiten in een grootte onder 1 µm, dit kan niet voldoende moeten zijn voor een echte ultrastructurele beschrijving. Een meer technische beperking is de nauwkeurigheid van de etappe in de SEM gebruikt voor geautomatiseerde imaging. Wegens dit is het noodzakelijk om te kiezen een ROI groter is dan de specificaties van de stadium nauwkeurigheid te garanderen dat de volledige doelgebied is beeld.

Vergeleken met de SBF-SEM en FIB-SEM als blok-gezicht beeldvormende methoden, heeft oereenstemming AT het definitieve nadeel van anisotrope voxels, zoals hierboven beschreven. Met FIB-SEM, kan isotrope voxels van 5 x 5 x 5 nm³ worden verkregen wanneer een juiste drift correctie op zijn plaats is.

Hiaten in het gereconstrueerde volume als gevolg van verlies van secties tijdens voorbereiding van arrays mogelijk ook een bron van zorg die niet wordt aangetroffen met SBF-SEM of FIB-SEM. Met goede lint stabilisatie door lijm, dit is meestal alleen een probleem voor het laatste gedeelte van een lint: het is mogelijk beschadigd wanneer het vrijgeven van het uit het scherp van de snede met behulp van de wimpers. Echter in onze ervaring, heeft het verlies van één sectie in elke 20 – 50 secties geen invloed op beeldregistratie.

Aan de andere kant, verleent de mogelijkheid om post vlek matrices goed signaal en het contrast voor SEM imaging, zelfs op zwak gemetalliseerde monsters zoals de hogedruk bevroren wortel tips hieronder. Daarom is het niet nodig om optimale ultrastructurele behoud door talrijke chemische fixatie en metallisatie stappen compromissen te sluiten. Routine monsters van de pathologie lab met tussenliggende graden van metallisatie leveren ook uitstekende gegevens¹⁰. Dergelijke een post inbedden contrastverbetering is niet mogelijk voor SBF-SEM en FIB-SEM in het algemeen. Bovendien, aangezien deze methoden destructieve zijn, dat wil zeggen, consumeren van het monster tijdens imaging, hiërarchische beeldvorming bij verschillende resoluties en sites of herhaalde imaging op latere tijdstippen in tijd is onmogelijk. In principe, onbeperkt volumes, bestaande uit grote FOVs (b.v., tot enkele millimeters voor hele muis hersenen in connectomics) gemaakt door stiksels mozaïeken en massaal secties kunnen worden verworven door AT, terwijl in FIB-SEM, FOVs dan 100 µm x 100 µm zijn moeilijk te bereiken met de gebruikelijke instrumenten.

Verdere automatisering van de beschreven AT-werkstroom zou een duidelijk voordeel, aangezien de bovengenoemde methodes SBF-SEM en FIB-SEM zowel afdelen en beeldvorming in hetzelfde instrument in een volledig geautomatiseerde wijze uitvoeren. Een soort van automatisering van afdelen bestaat: de ATUMtome¹² kunt genereren en verzamelen duizenden secties, maar het gebruik van Kapton tape als een substraat dergelijke maakt arrays moeilijk naar afbeelding in een FLM. Op de ITO-gecoate coverslips hier gebruikt, moet zelfs Super resolutie beeldvorming mogelijk. Een verdere, zeer wenselijk doel voor automatisering zou de opname van het FLM gegevensstacks. Aan de andere kant, automatisering kan duur en met uitzondering van de houder van de ondergrond, de werkstroom gepresenteerde afhankelijk (in termen van hardware) alleen instrumentatie meestal beschikbaar in een routine EM laboratorium of core faciliteit, waardoor het lage niveau van toegang.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrumentation
Ultramicrotome	RMC	PT-PC	Alternative: Leica UC7
Substrate holder	RMC	ASH-100	Alternative: home built
Plasma cleaner	Diener	Zepto 40kHz	Alternatives: Ted Pella Pelco or other benchtop plasma cleaner Example Parameters for Diener Zepto with 40kHz generator (0-100W); 0.5 mbar, 5 sccm (Air), 10% performance
Widefield fluorescence light microscope	Zeiss	Axio Observer.Z1	Alternatives: Leica, Nikon, Olympus
Fluorescence filter set	Zeiss	43 HE (Cy3/DsRed)
Objective lens	Zeiss	Zeiss Neofluar 40x	0.75 NA
Decent workstation able to handle GB-sized image data
FESEM	Zeiss	Ultra 55	Alternatives: FEI, Jeol, Hitachi, TESCAN
Name	Company	Catalog Number	Comments
Sectioning
Razor blades	Plano	T585-V
Diamond knife for trimming 45°	Diatome	DTB45
Diamond knife for trimming 90°	Diatome	DTB90
Jumbo diamond knife for sectioning	Diatome	DUJ3530
Silicon wafer (pieces)	Si-Mat	Custom Made	Doping: P/Bor, orientation: <100>, thickness: 525 ± 25 µm, resistivity: 1-30 Ω-cm http://si-mat.com/silicon-wafers.html
ITO-coated coverslips	Balzers	Type Z	22 × 22 × 0.17 mm https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html
Aluminium carrier	Custom Made		76 × 26 mm
Wafer forceps	Ideal-tek	34A.SA
Stubs forceps	Dumont	0103-2E1/2-PO-1	Dumoxel-H 2E 1/2
Diamond scriber	Plano	T5448
Eyelash/very soft cat's hair	Selfmade		Alternative: Plano
Brush	Selfmade
Pattex contact adhesive	Pattex	PCL3C	Kraftkleber Classic (the yellowish one)
Fixogum	Marabu	290110001	for fixing substrate to carrier
Adhesive tape	3M	851	for fixing substrate to carrier
Isopropanol	Bernd Kraft	07029.4000
Xylene	Carl Roth	4436	thinner for glue mixture
Rotihistol	Carl Roth	6640	alternative, limonene based thinner
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Image processing	Open source	Fiji (http://fiji.sc/#download)
Image acquisition	Zeiss	Atlas 5 AT (module for Zeiss SEM)	Alternative for automated image acquisition: WaferMapper: https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html
Name	Company	Catalog Number	Comments
Staining
Propidiumiodide	Sigma-Aldrich	P4170	Stock solution: 1.5 mM in 0.1 % sodium azide
Uranylacetate	Science Services	E22400
Lead(II) Nitrate	Merck	107398
Tri Sodium Citrate Dihydrate	Merck	106448
NaOH pellets	Merck	106469
1M NaOH solution	Bernd Kraft	01030.3000
Glass petri dish	Duran	23 755 56
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mounting
Stubs	Plano	G301F
Carbon pads	Plano	G3347
Copper tape	Plano	G3397	double-sided adhesive, conductive
Silver paint	Plano	G3692	Acheson Elektrodag 1415M
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions/mixtures
Adhesive mixture for coating blocks			Pattex contact adhesive /xylene as thinner, ratio 1:3. (Alternative for xylene: Rotihistol)
Reynolds lead citrate			50 mL: Dissolve 1.33 g of lead(II) nitrate in 10 mL of dH2O. Dissolve 1.76 g of tri-sodium citrate dihydrate in 10 ml dH2O. Mix both and add 1 M sodium hydroxide until the solution is clear. Fill up with dH2O to 50 mL.
Propidium iodide staining solution			Prepare 1:1500 dilution from stock in dH2O. Vortex for adequate mixing.
Aqueous uranyl acetate			Dissolve 3 % uranyl acetate in dH2O (mix thoroughly).