Multimodal hierarkiska avbildning av seriell avsnitt för att hitta specifika cellulära mål inom stora volymer

Summary

Detta protokoll riktar särskilda celler i vävnad för avbildning i nanoskala upplösning använder ett svepelektronmikroskop (SEM). Stort antal seriella sektioner från harts-embedded biologiskt material är först avbildas i ett ljusmikroskop att identifiera mål och sedan i hierarkiskt i SEM.

Abstract

Inriktning på specifika celler på ultrastrukturella upplösning inom en blandad cell befolkningen eller en vävnad kan uppnås genom hierarkiska bildåtergivning med en kombination av ljus- och elektronmikroskopi. Prover som inbäddade i harts sektioneras till arrayer bestående av band av hundratals ultrathin sektioner och deponeras på bitar av kisel wafer eller konduktivt belagda coverslips. Arrayer är avbildade i låg upplösning med en digital konsumenten som smartphone kamera eller ljusmikroskop (LM) för en snabb stort område översikt eller ett brett fält fluorescens Mikroskop (fluorescens ljusmikroskopi (FLM)) efter märkning med fluorophores. Efter efter färgning med tungmetaller, är matriser avbildade i ett svepelektronmikroskop (SEM). Val av mål är möjligt från 3D rekonstruktioner genereras av FLM eller 3D rekonstruktioner gjort från de SEM bildstaplar mellanliggande upplösningen om ingen fluorescerande markörer är tillgängliga. För ultrastrukturella analys, valda målen redovisas slutligen i SEM på högupplösta (några nanometer bildpixlar). Ett band-hantering-verktyg som kan eftermonteras på alla ultramicrotome demonstreras. Det hjälper med array produktion och substrat borttagning från snittningen kniv båten. En mjukvaruplattform som tillåter automatiserad avbildning av matriser i SEM diskuteras. Detta synsätt jämfört med andra metoder som genererar stor volym EM data, till exempel seriell block-face SEM (SBF-SEM) eller fokuserad ion beam SEM (FIB-SEM), och har två stora fördelar: (1) harts-embedded provet är bevarad, om än i en skivad upp version. Det kan vara målat på olika sätt och avbildas med olika upplösningar. (2) eftersom avsnitten kan färgas efter, är det inte nödvändigt att använda prover starkt block-färgade med tungmetaller att införa kontrast för SEM avbildning eller återge vävnaden block konduktiv. Detta gör metoden tillämpas på en mängd olika material och biologiska frågor. Särskilt lagstadgade material t.ex., från biopsi banker och patologi labs, kan direkt inbäddade och rekonstrueras i 3D.

Introduction

För att rekonstruera stora volymer av vävnad på ultrastrukturella upplösning har ett antal olika bildgivande metoder som bygger på SEM används¹: omfattande recensioner är tillgängliga t.ex., för SBF-SEM², FIB-SEM³och Array Tomografi (AT)⁴. Medan för den senare metoden bevaras provmaterialet som en matris av seriell avsnitt på ett substrat, är SBF-SEM och FIB-SEM destruktiva metoder, arbetar på prov blocket och konsumerar det under imaging. På grund av uttag av kådan i SEM, beror de också på starkt metalliserad prov block⁵.

Däremot, kan att identifiera vissa celler eller strukturer av intresse inom ett vävnadsprov gagna bestämt från korrelat ljus- och elektronmikroskopi (CLEM)^6,7,8. Använda FLM för inriktning hindrar tillämpningen av stora mängder tungmetaller eftersom detta skulle släcka fluorescens signal⁹. För dessa bara något metalliserad prover är AT metoden för val eftersom arrayer kan enkelt efter färgade med tungmetall efter LM imaging. Dessutom nästan alla Provtyp kan användas för AT, även rutin prover från patologens treasure chest¹⁰.

En annan stor fördel av AT är potentialen för hierarkiska¹¹ eller flera resolution imaging¹²: det är inte nödvändigt att bilden allt på högupplösta, som mål kan väljas i en annan modalitet (t.ex., FLM) eller i SEM-bilder med låg upplösning. Imaging bara intressanta regioner i en vävnads- eller befolkning på högupplösta sparar digitala data lagringsutrymme och producerar mindre datamängder i bilden, som är lättare att hantera. Här, vid arbetsflödet är visat ganska svagt metalliserad prov: högtryck fryst växternas rötter (Arabidopsis thaliana) inbäddad i hydrofil harts.

Här förklaras hur arrayer är beredd, målat och avbildas både FLM och SEM och hur bildstaplar registreras. Också, hur den 3D rekonstruktionen av FLM volymen kan användas att välja specifika celler för avbildning i SEM på nanoskala upplösning illustreras.

Protocol

Obs: Urvalet block bör vara polymeriseras och innehåller några tungmetaller. Fixering och inbäddning protokoll för de två prover som visas i figur 1A-B har varit beskrivs på annan plats¹¹. Kort sagt, var provet visas i figur 1A kemiskt fast, målat i klump första med 1% OsO₄, därefter med 1% uranyl acetat, och inbäddade i Spurrs kåda. Provet i figur 1B var högtryck frusen, frysa substituerade med 0,4% uranyl acetat i aceton, och inbäddade i Lowicryl HM20 kåda. Använd pulver gratis handskar för nästa gång sedan stegen.

1. att skapa matriser

1. Putsning av provet blocket
   Obs: Alltid dra åt skruvar väl när du infogar delar.
   1. Infoga prov blocket i provhållaren av ultramicrotome, placera hållaren i kvarteret trimning och skjut in det i det nedersta steget i ultramicrotome.
   2. Trimma bort kåda runt inbäddade vävnaden med ett rakblad som lämnar endast en liten kant av harts runt provet. Klipp från toppen tills målet är nått.
      Obs: Formen på blocket-ansiktet vara trapetsform eller rektangulära (vi har framgångsrikt använt båda former). Det är viktigt att använda längre sidorna på rektangeln som ledande och bakkant för att säkerställa att ett stort område är täckt av lim blandningen stabilisera band.
   3. Sätt in provhållaren i armen av ultramicrotome och ersätta trimning blocket i lägre scenen av knivhållaren. Infoga en trim diamantkniven (normalt 45°), i knivhållaren. Justera block-ansiktet exakt parallellt med trim kniv kant.
      Obs: För att producera exakt parallella ledande (nederst) och avslutande (överkanter), vrid eller flytta bara kniven för att trimma motsatta sidor. För stora volymer (mer än flera hundra avsnitt) är en 90° trim kniv fördelaktigt.
   4. Smörj alla fyra sidor, och rotera sedan provhållaren så att de ledande och bakkant är nu i horisontellt läge.
   5. Noggrant belägga de inledande och avslutande sidorna av block med självhäftande blandning. Använd en liten pensel som bildas från några hårstrån fast till en tandpetare¹³. Utföra detta steg snabbt eftersom lösningsmedlet blandningens avdunstar inom sekunder. Förorena inte block-ansiktet med denna blandning. Låt blocket belagda prov torka i 5-10 min.
      Obs: för större antal sektioner (> 200), kan det vara bättre att bestryka framkant bara, eftersom med tiden en utbuktning av lim kan bygga upp på biskäret, och potentiellt dra tillbaka sektioner över knivsegg.
2. Förberedelse av underlaget
   1. Skär bitar av kiselskivor till en storlek som passar in i båtens kniv (cirka 2 x 2,5 cm² för Jumbo kniven). Om det behövs, markera wafer bitar (siffror eller bokstäver) med en diamant scriber före rengöring eller med permanent spritpenna efter rengöring. Ren kisel rånet manuellt med isopropanol och luddfri vävnad.
      Obs: För korrelat imaging använder indium-tin-oxid (ITO)-belagda glas coverslips. De måste hanteras mycket noggrant, och extra städning är inte nödvändigt.
   2. Fixa underlaget till ena änden av transportören plattan med hjälp av ett flyttbart klister.
      Obs: Alternativt substrat kanterna kan nålas ner parallellt med den knivsegg som använder två ränder av tejp.
   3. Plasma aktivera (glöd urladdning) underlaget med luft för att få en hydrofil yta. Detta bör göras på ett sådant sätt att en droppe vatten placeras på de substrat sprider till en mycket tunn film (låg kontaktvinkel, figur 2 c, D). Hydrofilisering parametrar beror på plasma enheten används; för de parametrar som används här, se Tabell för material.
      Obs: Plasma aktiveringen är mycket flyktiga, så utför detta omedelbart före substrat användning.
   4. Infoga flygbolaget i klämman i ett substrat hållare, med monterade substratet närmare till den skör att uppnå optimal vätning av substratet i båtens kniv.
      Obs: En detaljerad beskrivning av innehavaren av substrat, inklusive datorstödd konstruktion (CAD) ritningar, ges i Wacker et al. ¹¹
3. Snittning förberedelse
   1. Infoga en Jumbo diamantkniven i knivhållaren, släppningsvinkeln (0° för Jumbo kniv), och fyller båtens kniv med destillerat vatten. Syn kniven på ett avstånd av 1 – 2 mm till provet.
   2. Lägre substratet i vattnet med skruvarna 1 – 3 (figur 2A) av innehavaren av substrat. Kontrollera att vattenlinjen är beläget i den övre tredjedelen av substratet.
      Obs: Kontrollera att limmet mellan substratet och carrier plattan är väl botad genom att puffa substratet med ren pincett. Den bör inte gå.
   3. Eftersom det är svårt att se markfrigången när du använder en silicon wafer, lägre substratet tills du känner att den kontakt med golvet. Nu Höj substratet en liten mängd. Kontrollera att varken substratet eller transportören vidrör kniv båten medan skära.
   4. Använd en spruta eller pipett för att justera vattennivån i båten. Medan du tittar genom kikaren, lägga till eller ta bort vatten tills hela området av vattenytan visar topp ljus belysning av ultramicrotome homogen speglar.
   5. Slå på ultramicrotome botten ljus. Se till att armen är i mittläget och inte i returgående fas med hjälp av inställningsratten av ultramicrotome. Strategi kniven för provet tills reflektion av knivsegg syns i block ansiktet.
   6. Använd alternativen justering av ultramicrotome för att justera provet med kniven. Först rotera kniven, och sedan rotera och luta provet.
      Obs: Det justeras korrekt om den ljusa rand, som kan ses i klyftan mellan provet och kniven, visar parallella kanter (raka parallella linjer och inte kilformade).
   7. Kontrollera lutningen på provet: se till att ljus rand inte blir tjockare eller tunnare samtidigt flytta provet upp och ner. Om det behövs, använda arc justeringsskruven för att korrigera detta. Flytta kniven närmare till provet tills den är precis ovanför blocket-ansiktet (men inte röra den).
   8. Ställ in snittjocklek (feed), styckning hastighet och skära fönster på styrenheten.
   9. Starta snittningen. Om nödvändigt, vänta tills den första fullständiga delen skärs. Skär några avsnitt vara säker på att de håller ihop för att bilda band (annars limmet har tillämpas igen). Börja med ett högt flöde värde (maximal, 200 nm för Ultra kniven) tills den första fullständiga delen skärs. Ange sedan önskat foder värde. För adekvat menyfliksområdet stabilitet, ett snittjocklek 100 nm och en skärhastighet på 1 mm/s är en bra utgångspunkt. Den lägsta uppnåbara snittjockleken är runt 60 nm, beroende på provets kvalitet.
   10. Stoppa snittning. Ta bort alla onödiga (delvis avskurna) sektioner från skör och båt med en ögonfrans/kattens hår. Om det finns en massa små skräp flyter runt, ta bort vattnet helt med en pipett och fylla båten med färskvatten. Processen är nu redo för första produktiva menyfliksområdet.
4. Snittning
   1. Starta snittningen. När ett antal sektioner (det faktiska antalet beror på storleken på sektioner och substrat) har skurits ned, stoppa snittningen och släppa menyfliken från knivsegg av försiktigt strök över skör med en ögonfrans¹⁴ eller ännu bättre, med en mycket mjukt hår från en kattens päls.
   2. Manipulera (push/pull) i menyfliksområdet med ögonfrans mot underlaget och bifoga det första avsnittet till substratet.
      Obs: Det är nödvändigt att tryck försiktigt i menyfliksområdet tills det fastnar på den torra delen av substratet.
   3. Fortsätt snittning och fästa banden till substratet. Börja på ena sidan och flytta gradvis över till den andra med varje nytt menyfliksområde.
      Obs: Undvik massiva vatten rörelser för att undvika tandlossning redan bifogade band. Samma sak gäller för luftströmmar. Använd den andedräkt sköld levereras med ultramicrotome. I ogynnsamma miljöförhållanden rekommenderas en inhägnad för ultramicrotome¹⁵.
   4. När underlaget är helt täckt med band (vanligtvis 4 – 5 band är genomförbart), försiktigt lyft ut underlaget från kniv båten med micromanipulator skruvarna av innehavaren av substrat.
      Obs: Lämpliga rörelser är: lyft upp vertikalt (skruv 1) och roterande/luta ut (skruv 3), eller en kombination av båda.
   5. Låt matrisen menyfliksområdet torka innan du förvarar den i en dammfri miljö. Efter torkning, ta bort självhäftande monterade substratet så snart som möjligt från transportören (på samma dag, annars substratet kan vara alltför svårt att ta bort eller ens kan bryta under demontering).

2. färgning för LM bildtagning

Obs: Olika färgning/märkning metoder är möjliga, inklusive immunofluorescens protokoll. Här är en direkt, ganska ospecifikt fläck valt att beskriva cellväggarna.

1. Propidium jodid färgning
   1. Täcka botten av ett stort glas petriskål (30 cm diameter) med parafilm och linje i utkanten av skålen med våt vävnad att bygga en fuktkammare.
   2. Använd ca 300-500 µL av lösning per täckglas. Placera en droppe för varje täckglas på parafilm och sätta glaset upp och ner på droppa, så att avsnitten är i kontakt med färgning vätskan. Täck skålen och vira den med aluminiumfolie ljuskänsligt proverna. Inkubera proverna för 16 h vid 4 ° C.
   3. Ta bort täckglaset med pincett och tvätta genom att flytta den upp och ner i en 100 mL-bägare fylld med 80 mL destillerat vatten. Upprepa detta steg i en annan bägare med färskvatten. Torka täckglaset noggrant med tryckluft.

3. inspelning av bildstapel i FLM

1. Placera täckglaset på scenen av en gemensam wide-fältet FLM.
2. Välja att lämpliga filter (Tabell för material) för fluorescensen observeras.
3. Med en passande objektiv, ta en bild av objektet i varje avsnitt: försök att fylla synfältet och hålla orienteringen konstant. För root tipset användes ett 40 X-objektiv för luft.
   Obs: Om banden inte är helt rak, en roterande scenen kan hjälpa för att omorientera avsnitten när du tar bilder. Om möjligt, centrera bilden på en specifik funktion eller hålla en funktion såsom kanten av avsnittet på lika avstånd till kanten av den lagrade bilden.
4. Använd om möjligt 16 bit att begränsa mättade pixlar och hålla exponeringstiden konstant.

4. registrering av FLM bild stacken

1. Importera bild serien till Fiji¹⁶ som en virtuell stack.
2. Öppna en ny TrakEM¹⁷ (tomt) från Arkivmenyn.
3. Högerklicka i fältet image, och importera stacken till TrakEM som ”en bit per lager”.
4. Justera lager (rätt klick till bildfält), ställa in omfång (första bilden till senaste), och välj ingen som referens. Använd standardvärdena för alla inställningar, och välj styv som vilken transformering.
5. När registreringen är klar och tillfredsställande, Spara anpassade datamängden av högerklicka och välj Exportera. Göra platt bild, ange intervallet från första till sista bilden och låta programmet Visa resulterande stacken. Spara fästisarna i tif-format.

5. färgning och fäste för SEM bildtagning

Obs: För att förbereda färgning lösningar se Tabell för material. Lösningar kan lagras vid 4 ° C i upp till 12 månader, skyddas från ljus och luft.

Försiktighet: Blyacetat citrat och uranyl innehåller tungmetaller som är giftiga. Använd handskar och avyttra avfallet enligt de lokala myndigheternas anvisningar.

1. Täcka botten av ett stort glas petriskål (30 cm diameter) med parafilm och linje i utkanten av skålen med våt vävnad att bygga en fuktkammare.
   Obs: Det är viktigt att flera pelletar av NaOH är placerade inom petriskål nära färgning dropparna att förhindra överdriven nederbörd av bly citrat.
2. Uranyl acetat färgning
   1. Centrifugera uranyl acetat lösningen vid 2.680 x g i ett par sekunder att sediment små partiklar.
   2. Använd ca 300 – 500 µL av lösning per täckglas. Placera en droppe för varje täckglas på parafilm och sätta glaset upp och ner på droppa, så att avsnitten är i kontakt med färgning vätskan.
   3. Inkubera i 10 min i rumstemperatur och täcker skålen under färgningen.
   4. Ta bort täckglaset med pincett och tvätta genom att flytta den upp och ner i en bägare fylld med destillerat vatten (se steg 2.1.3).
3. Leda citrat färgning
   1. Under uranyl acetat ruvning, förbereda bly citratlösningen.
      Obs: Bly citrat bör alltid filtreras omedelbart före användning för att ta bort några fällningar. Också Centrifugera bly citratlösningen vid 2.680 x g i ett par sekunder som i steg 5.2.1.
   2. Använd ca 300 – 500 µL av lösning per täckglas. Placera en droppe för varje täckglas på parafilm omedelbart innan du tvättar coverslips efter uranyl acetat färgningen och sätta glaset upp och ner på droppa, så att avsnitten är i kontakt med färgning vätskan. Placera droppar (300 – 500 µL) på parafilm omedelbart innan du tvättar coverslips efter uranyl acetat färgningen.
      Obs: För att undvika bildandet av fällningar, andas inte in på bly citrat droppar.
   3. Placera det tvättade täckglaset uppochner på rullgardinsmenyn (det finns ingen anledning att torka det).
   4. Inkubera i 5 min i rumstemperatur och täcker skålen under färgningen.
   5. Ta bort täckglaset med pincett och tvätta det som beskrivs ovan i en bägare med sötvatten (steg 5.2.4).
4. Torka täckglaset noggrant med tryckluft.
5. Montering av prover för SEM bildtagning
   1. Montera kiselskivor på aluminium stubbar med en klibbig kol pad.
      Obs: ITO-belagd coverslips kan antingen monteras med silver färg och Cu-band — kontrollera den ledande yta är ansluten till stub — eller med kol pads som ovan. I så fall kan en ledande förbindelse från ITO-ytan till stub göras med en droppe av silver färg.

6. hierarkiska Imaging i SEM

Obs: I ett fält utsläpp SEM, välja en låg primärenergi (3 kV eller lägre), en balk som är aktuella i intervallet från 50 till 800 pA att undvika laddning, och en lämplig arbetsavstånd för effektiv insamling av sekundär eller bakåtspritt elektroner. Valet av beam aktuell beror på provets egenskaper (t.ex., inbäddning harts); electron dosen blir också en kompromiss mellan en liten ström (mindre skadliga för provet) och en hög ström som är fördelaktigt för imaging hastighet och därför sänker de totala bild förvärv, tid. Dedikerad detektorer för bakåtspritt elektroner ger bra kontrast, är mindre känsliga för laddning av provet och Visa mindre av provets yta artefakter (veck, kniv märken). Kontrast och ljusstyrka justeras så att histogrammet är centrerad.

1. SEM imaging
   1. Först definiera de fyra hörnen av matrisen genom att gripa en bild av varje hörn på låg förstoring, om 100 x. Skapa en region av intresse (ROI) omsluter hela utbud. Tilldela en tänkbar protokoll med följande parametrar: använda en sekundär elektron (SE) detektor, vilket möjliggör hög hastighet imaging på en stor bild pixelstorlek (till exempel 1 000 nm) och en kort uppehållstid (t.ex. 0.2 µs).
      Obs: För att övervinna elektron optiska begränsningar på en stor skanning synfält (FOV), som kan leda till snedvridningar på peripheryen av bilder, använda dedikerade låg förstoring lägen (tillhandahålls av de flesta tillverkare av SEM) eller använda medium, 1 till 2 k scan fält för enstaka bilder.
   2. Skapa ett avsnitt genom att skapa en ROI beskriver bara vävnaden i det första avsnittet. Klona den till alla efterföljande avsnitten med stämpelverktyget. Rotera ROIs när behövs för att rymma vridna band.
   3. Spela in bild serien använder en mellanliggande pixelstorlek (cirka 50 nm) och en dwell time tillräckligt länge för att identifiera och känna igen målstrukturen. Använda en FOV för enstaka bilder i en rad 6-10 k pixlar.
      Obs: Atlas 5 programvaran kan automatiskt samla mosaik består av intilliggande bilder att täcka stora ROI/avsnitt områden över avsnitten följetong.
   4. Skapa en webbplats i detta avsnitt set innehållande målstrukturen för högre upplösning SEM avbildning. Gör ROI tillräckligt stor konto för scenen precision. Kontrollera och justera positionerna för webbplatser.
      Obs: Det är viktigt att placera ROIs på ett sådant sätt att den center, där de autofokus och autostigmation kommer att utföras, inte sitta på ”tomma” material med inga strukturella detaljer, t.ex., vakuoler.
   5. Definiera autofokus inställningarna och kontrollera prestanda minst längden på ett band (dvs.det längsta avståndet som scenen har att resa) på en liten ROI nära den plats som ska avbildas.
   6. Definiera en tänkbar protokoll för högupplösta SEM förvärvet. Att se membran fack, Välj 3 – 5 nm bilden pixelstorlek. Välj en uppehållstid beroende på detektorn så att bilden inte är för bullrig.
   7. Innan förvärvet, definiera värdena som fokus på åtminstone den första delen av varje band med alternativet Kontrollera protokollet.
   8. Starta den automatiska SEM imaging över hela serien av målet ROIs.
   9. Exportera förvärvade som bild-serien, företrädesvis i tif-format.

7. registrering av SEM-bild stacken

1. Importera bild serie till Fiji som en virtuell stack.
   Obs: Dessa kommer att vara stora datafiler i spänna av några GB beroende på antalet sektioner och storleken på ROI.
2. Beskär bilden SEM stapla för vidare bearbetning till ett område så nära strukturen av intresse som möjligt och justera ljusstyrka och kontrast.
3. Öppna en ny TrakEM¹⁷ (tomt) från Arkivmenyn.
4. Högerklicka i fältet image, och importera stacken till TrakEM som ”en bit per lager”.
5. Justera lager (Högerklicka i fältet image), välja minsta kvadratmetoden som läge, ställa in omfång (första bilden till senaste), och välj ingen som referens. För inställningar, Använd standardvärden och välj styv som vilken transformering.
6. När registreringen är slutförd och tillfredsställande, Spara anpassade datamängden av högerklicka och välj Exportera. Göra en platt avbildning, ange intervallet från första till sista bilden och låta programmet Visa resulterande stacken. Spara fästisarna i tif-format.

Representative Results

Arbetsflödet beskrivs här (figur 1) startar med ett prov som är inbäddade i ett harts block. Under provpreparering, vissa tungmetaller bör införas i vävnaden, men det är inte nödvändigt att använda protokoll optimerad för ganska stark metallisering. Figur 1A visar en växt rot (krasse) block-fläckade konventionellt 1% OsO₄ och 1% uranyl acetat, medan Arabidopsis roten i figur 1B är endast svagt metalliserad med 0,5% uranyl acetat. Den sistnämnda provtypen är bäst lämpad för korrelat metoder som vissa tungmetaller tenderar att släcka fluorescens. Med en dedikerad substrat hållare (figur 2), arrayer flera hundra avsnitt kan vara producerade (figur 1 c). Efter fluorescerande märkning, är sådana matriser avbildas i en standard wide-fältet FLM (figur 1 d), sedan färgas med tungmetall lösningar och avbildas i ett SEM på olika upplösningar (figur 1E–G).

Viktiga verktyg för reproducerbara generation av matriser, är särskilt när du placerar flera band från mikrotomens kniv båt på ett substrat, innehavaren av substrat (figur 2A, specialdesignade i författarnas laboratorium) och en Jumbo-diamant kniv med en båt som är stor nog att rymma objektglas (figur 2B). En platt menisk, så att bra observation på band, är nödvändigt och kan uppnås genom plasma rengöring av substratet: en liten droppe destillerat vatten bör inte utgöra en objektiv-liknande struktur på underlaget som i figur 2 c (obehandlade substrat), men en tunn film (figur 2D, plasma aktiveras substrat). Under dessa förhållanden är band som bifogas den torra delen av en ITO-belagd täckglas enkelt visualiseras (figur 2E) och kan observeras och kontrollerade under hiss-out-of-substratet från vattnet.

Som ett exempel, var matriser som färgas med propidium jodid att märka växternas cellväggar avbildas med ett brett standardfältet FLM (figur 3A). Eftersom sektionerna är endast 100 nm tjock, även över färgning som visas här introducerar lite oskärpa. Efter registrering, valdes de två cellerna helt inneslutna i rekonstruerade volymen från bildstapel (figur 3B) för högupplöst avbildning i 3D (se även Kompletterande film S1). Efter ytterligare färgning med uranyl acetat och bly citrat, arrayer var avbildade i SEM. figur 3 C visar en översikt, inspelad med 60 nm bildpixlar; en mörk ruta i mitten av bilden anger positionen där funktionerna autofokus avrättades, och den extra dosen ledde till smärre kontaminering. Lämpliga ROIs i de seriella delar (skivor 51 – 248 av 435 skivor totalt) som innehåller två målceller valts i FLM stack sedan spelades in med en 5 nm pixel Bildstorlek (figur 3D; Se även Kompletterande film S2).

Automatiska hierarkiskt avbildning av arrayer i SEM beskrivs här var klar med mjukvara/hårdvara plattform lösningen ZEISS Atlas 5. Först en översikt över hela matrisen skapades med SE detektorn, med mycket stora (1 000 nm) bild pixlar och mycket låg uppehållstid (figur 4A). En ROI beskriver endast vävnaden var placerat på det första avsnittet och sprids till alla andra delar av matrisen. Detta avsnitt set spelades sedan med 60 nm bildpixlar med en längre uppehållstid (figur 4B). Slutligen en webbplats uppsättning, som innehåller två målceller plus ett ”lager” av omgivande celler att redovisa etapp felaktighet, inrättades med följande parametrar: ESB (energi selektiv Backscatter) detektor, 5 nm bilden pixlar, mycket lång (40 µs) dwell time ( Figur 4 c). Zooma in till sådan bild visar subcellulära detalj (figur 4 d) såsom vakuoler (V), mitokondrierna (M), kärna (N) och endoplasmatiska nätverket (pilar). Se även Kompletterande film S3 för inzoomning från en översikt över hela utbud i subcellulär detalj av en målcell.

Matrisen visas här (200 avsnitt) plus en ytterligare 250 avsnitt tog ca 8 h att producera, en natt att färga för LM, och en dag att registrera (manuellt) på FLM. Efter färgning tar ca 1-2 h totalt, beroende på antalet enskilda matriser. För SEM inspelning, några timmar krävs för att ställa upp Atlas körningen, och automatisk inspelning var 3 – 4 h för mellanliggande upplösning (60 nm pixelstorlek) avsnitt uppsättningen (200 sektioner, 450 x 200 µm²) och ca 5 dagar för högupplöst (5 nm pixelstorlek) ROI innehållande två målcellerna (200 sektioner, 55 x 30 µm²). Observera att på grund av låg metall innehållet i provet visas här, en mycket långsam skanningshastighet tvingats användas för att nå en bra signal-brus-identifiering, som underförstått (för närvarande tillgängliga detektorn) en uppehållstid på 40 µs för högupplösta ROI.

Det finns flera steg i hela arbetsflödet benägna att fallgropar: helst band bör vara mer eller mindre raka och placeras i rätt ordning (figur 5A). Dock produceras ofta böjd (figur 5B), böjd (figur 5 d) eller även trasiga band. Följden kan på grund av felaktiga trimning (ledande och avslutande kanter inte exakt parallell) eller icke-enhetligt tillämpad lim, men också från en asymmetrisk eller ojämnt infiltrerade provet. Särskilt besvärande är prover som innehåller både mjuka och mycket hårda komponenter. De sistnämnda komponenterna kan vara svårt att infiltrera såsom cellväggen av växternas rötter visas här (bild 5 c). I så fall kan enkelt veck (pilspetsar) orsakas av variabel kompression och avkoppling vid snittning. För automatiserad imaging i SEM, är böjda band inte ett stort problem, eftersom ROIs kan roteras för att rymma krökning av menyfliksområdet.

Ett annat viktigt steg i protokollet färgning: otillräcklig tvättning kan leda till rester på avsnittet (figur 5E, F), och i värsta fall får täcka de mest intressanta området (cirkel på en av två målceller i figur 5F). Också, damm (figur 5 d, starkt ljusspridande partiklar) införas kniv båten, t.ex., med en smutsig substrat bärare, kan orsaka allvarliga problem: I FLM, damm kan vara starkt fluorescerande (jfr några skivor i kompletterande film S1) till den grad att vissa registrering algoritmer inte fungerar. Funktionen ”anpassa” i TrakEM¹⁷ kan dock hantera sådana stackar visade i Kompletterande film S1.

Figur 1: arbetsflöde för den korrelativa hierarkiska imaging. Start från ett prov inbäddade i ett harts block (A, starkt metalliserad prov), ett prov första trimmade (B, svagt metalliserad prov) och sedan kedjor bestående av flera band av seriell avsnitt (C), här placeras på en ITO-belagd täckglas, produceras med hjälp av en ultramicrotome. Efter färgning med ett fluorescerande färgämne, registreras travar av bilder i en wide-fältet FLM (D). Efter ytterligare färgning rundor med tung metall salter, är stackar avbildade i ett SEM (E–G) i olika upplösningar (bild pixel storlekar). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: verktyg för beredning av arrayer. Substratet hållare monteras från micromanipulators med sju axlar rörlighet bifogas en standard ultramicrotome (A): skruvarna, markerade med cirklar, är för vertikal (1) och horisontella (2) rörelse och tiltning (3) av substrat transportören . Jumbo diamond kniven med en oversize båt att rymma stora substrat (pil), här med en bit av plasma-aktiverat kisel wafer monteras på en bild-storlek aluminium bärare (B). 20 µL droppar destillerat vatten placeras på en obehandlad kisel wafer substrat (C) eller på en plasma-aktiverat substrat (D). Fyra band flytande i kniv båten, bifogas en ITO-belagd täckglas av deras nedre ändar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: korrelationen av de LM-datan med SEM. Översikter (A, C) och målceller (B, D) registreras med FLM (A, B) och SEM (C, D). (B) är en programvara zoom och ursprungliga data spelades in med ett 40 X-objektiv på en 1 388 x 1 040 pixel kamera chip, medan (C) registreras med 60 nm bilden pixelstorlek, och (D) med 5 nm bilden pixelstorlek, som illustrerar sanna öka i resolution i SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figur 4: hierarkisk imaging i SEM med ZEISS Atlas 5 vid Översikt över en matris in med 1000 nm bildpixlar med SE detektorn (A). Avsnitt uppsättningar med ROI placeras på vävnad i varje avsnitt och inspelade med 60 nm bildpixlar (B). Webbplats sätter med en seriell ROI placeras på målceller och spelat in med 5 nm bildpixlar (C). När du zoomar in sådana högupplösta bilder (D), blir intracellulära membran fack som vakuoler (V), kärna (N), mitokondrierna (M) och endoplasmatiska nätverket (pilar) synliga. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5: typiska problem. 1. uppkommer snittningen: band som placeras på ITO-belagd coverslips är idealiskt raka (A), men oregelbunden komprimering vid snittning kan orsaka bent (B) eller böjda band (D), eller jämn veck (C). 2. orsakas av hantering av substrat och band i vatten, t.ex., under snittning och färgning: ljus spridning partiklar på substrat (D), rim av vattendroppar på avsnittet (cirkel i E) eller smuts smetade ut över vävnad på grund av otillräcklig tvätt efter färgning (F). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande film S1: FLM bildstapel. 435 bilder anpassas i Fiji¹⁶ med TrakEM¹⁷ och sparas som filmfil (.avi). Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande film S2: SEM bildstapel. 210 bilder justerad på Fiji¹⁶ med TrakEM¹⁷. Den ursprungliga bunten (300 bilder) med denna datauppsättning var 15 GB. Om du vill trappa ner stacken från 3,3 GB (efter justering och beskärning till bara de två rikta celler), var det skalas i x och y med en faktor på 0,2 med Fiji och sedan sparas som .avi-film. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande film S3: Zooma med olika upplösning nivåer i SEM. Filmen skapades i och exporteras från Atlas 5 mjukvaran i .mp4-format. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Discussion

Ett arbetsflöde för att rikta specifika celler i en vävnad av multimodala hierarkiska AT visades: en harts-embedded provet är skivade i matriser av seriell avsnitt, som är placerade på ett ledande substrat med hjälp av en specialdesignad substrat hållare. Efter märkning med en fluorophore och imaging i FLM, används rekonstruerade volymen för att välja målceller. Efter ytterligare färgning rundor med tungmetaller att införa kontrast, är dessa mål avbildade över flera hundra avsnitt på nanoskala upplösning i en SEM med hjälp av en automatiserad programvaruplattform.

För att producera tätt packade matriser med flera långa band, krävs en substrat hållare liknar den som beskrivs här. En kunnig och tålmodig person kan kunna bifoga flera band till en kisel substrat, delvis nedsänkt i kniv båten, och hämta matrisen genom att gradvis sänka vattennivån tills banden sitter på substratet. Men i den vår erfarenhet, det finns en tendens att splittras bildas när underlaget är att röra någon del av båtens kniv (jfr not i 1.3.2 i protokollet). Detta förfarande är dessutom mycket svårare med ITO-coated underlag: (1) på grund av insyn i ITO-glas, det är svårt att se kanten av vattnet där ändarna av banden har skall bifogas, och (2) eftersom ITO-belagda ytan är mycket grövre än blankpolerade kisel rånet, band tenderar att bryta under lyft och mindre fragment som består av några sektioner kan flyta, därmed förstöra ordningen på avsnitten.

Hela arbetsflödet är också möjlig utan korrelation till FLM data. I det här fallet kan datainsamling i SEM behöva utföras i flera sessioner. En inledande 3D rekonstruktion eller åtminstone utvärdering av låg eller medelhög upplösning data kan vara nödvändigt att identifiera mål. Dessutom kan konventionella histologiska fläckar för brightfield LM (inte kräver FLM) tillämpas. Andra alternativ^6,7,8 är naturligtvis antikropp märkning på arrayer, som redan visats i inledande papperet på¹⁸, eller genetiskt kodade fluorescerande proteiner (XFP) eller pre inbäddning märkning med bevarande av fluorescens under provberedning.

En allmän begränsning för metoden diskuteras är användningen av delar av en viss tjocklek och resulterande diskret provtagning av 3D-volymen: upplösning i Z kan bara vara lika bra som tjockleken på avsnitten eftersom SEM samlar endast data från avsnitt ytan (d beroende på den primära energi/landning energi valt). Detta innebär att den resulterande 3D-volymen har Anisotrop voxlar, t.ex., 5 x 5 x 100 nm³ om 100 nm sektioner och en pixel bildstorlek 5 nm används. För mycket små enheter i en storlekar nedan 1 µm, kan detta inte vara tillräckligt för en sann ultrastrukturella beskrivning. En mer teknisk begränsning är noggrannheten i den fasen som används i SEM för automatiserad imaging. På grund av detta är det nödvändigt att välja en ROI som är större än specifikationerna på scenen exaktheten att garantera att hela målområdet är avbildade.

Jämfört med SBF-SEM och FIB-SEM som block-face avbildningsmetoder, har korrelativaj slutgiltig nackdelen med anisotropisk voxlar, som beskrivits ovan. Med FIB-SEM, kan isotrop voxlar av 5 x 5 x 5 nm³ erhållas när en korrekt drift korrigering är på plats.

Luckor i rekonstruerade volymen på grund av förlust av sektioner under beredning av matriser kan också vara en oro som inte påträffas med SBF-SEM eller FIB-SEM. Med bra band stabilisering av lim, detta är vanligtvis endast en fråga för den sista delen av ett band: det kan skadas när frigöra den från den knivsegg som använder ögonfrans. Dock i vår erfarenhet påverkar förlusten av ett avsnitt i varje 20 – 50 avsnitt inte bildregistrering.

Möjlighet att efter fläcken matriser ger däremot, bra signal och kontrast för SEM imaging, även på svagt metalliserad prover, såsom det höga trycket fryst roten tips visas här. Därför är det inte nödvändigt att kompromissa optimal ultrastrukturella bevarandet av många kemiska fixering och metallisering steg. Också, rutinprover från patologi labbet med mellanliggande grader av metallisering leverera utmärkta data¹⁰. En sådan post inbäddning kontrastförstärkning är inte möjligt för SBF-SEM och FIB-SEM i allmänhet. Dessutom eftersom dessa metoder är destruktiva, dvskonsumerar provet under imaging, hierarkiska imaging på olika upplösningar och platser eller upprepade imaging vid senare tidpunkter i tid är omöjligt. I princip obegränsade volymer, bestående av stora FOVs (t.ex., upp till flera millimeter för hela musen hjärnor i connectomics) skapad av sömmar mosaiker och stort antal sektioner kan förvärvas genom AT, medan i FIB-SEM, FOVs utöver 100 µm x 100 µm är svåra att uppnå med rutinmässiga instrument.

Ytterligare automatisering av beskrivs AT-arbetsflödet skulle vara en klar fördel, eftersom de ovannämnda metoderna SBF-SEM och FIB-SEM utföra både snittning och imaging inom samma instrument på ett helt automatiserat sätt. Ett slags automatisering av sektionering föreligger: The ATUMtome¹² kan generera och samla tusentals sektioner, men användningen av Kapton tejp som substrat gör sådana kedjor svårt att bilden i en FLM. På den ITO-belagd coverslips används här, bör även super-upplösning imaging. Ett mer ytterligare, mycket önskvärt mål för automation vore inspelningen av FLM datastackar. Däremot, automation kan vara dyrt och med undantag för innehavaren av substrat, arbetsflödet presenteras här beroende (när det gäller hårdvara) endast instrumentation vanligtvis tillgängliga i en rutinmässig EM laboratorium eller core facility, gör det låg nivå tillgång.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrumentation
Ultramicrotome	RMC	PT-PC	Alternative: Leica UC7
Substrate holder	RMC	ASH-100	Alternative: home built
Plasma cleaner	Diener	Zepto 40kHz	Alternatives: Ted Pella Pelco or other benchtop plasma cleaner Example Parameters for Diener Zepto with 40kHz generator (0-100W); 0.5 mbar, 5 sccm (Air), 10% performance
Widefield fluorescence light microscope	Zeiss	Axio Observer.Z1	Alternatives: Leica, Nikon, Olympus
Fluorescence filter set	Zeiss	43 HE (Cy3/DsRed)
Objective lens	Zeiss	Zeiss Neofluar 40x	0.75 NA
Decent workstation able to handle GB-sized image data
FESEM	Zeiss	Ultra 55	Alternatives: FEI, Jeol, Hitachi, TESCAN
Name	Company	Catalog Number	Comments
Sectioning
Razor blades	Plano	T585-V
Diamond knife for trimming 45°	Diatome	DTB45
Diamond knife for trimming 90°	Diatome	DTB90
Jumbo diamond knife for sectioning	Diatome	DUJ3530
Silicon wafer (pieces)	Si-Mat	Custom Made	Doping: P/Bor, orientation: <100>, thickness: 525 ± 25 µm, resistivity: 1-30 Ω-cm http://si-mat.com/silicon-wafers.html
ITO-coated coverslips	Balzers	Type Z	22 × 22 × 0.17 mm https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html
Aluminium carrier	Custom Made		76 × 26 mm
Wafer forceps	Ideal-tek	34A.SA
Stubs forceps	Dumont	0103-2E1/2-PO-1	Dumoxel-H 2E 1/2
Diamond scriber	Plano	T5448
Eyelash/very soft cat's hair	Selfmade		Alternative: Plano
Brush	Selfmade
Pattex contact adhesive	Pattex	PCL3C	Kraftkleber Classic (the yellowish one)
Fixogum	Marabu	290110001	for fixing substrate to carrier
Adhesive tape	3M	851	for fixing substrate to carrier
Isopropanol	Bernd Kraft	07029.4000
Xylene	Carl Roth	4436	thinner for glue mixture
Rotihistol	Carl Roth	6640	alternative, limonene based thinner
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Image processing	Open source	Fiji (http://fiji.sc/#download)
Image acquisition	Zeiss	Atlas 5 AT (module for Zeiss SEM)	Alternative for automated image acquisition: WaferMapper: https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html
Name	Company	Catalog Number	Comments
Staining
Propidiumiodide	Sigma-Aldrich	P4170	Stock solution: 1.5 mM in 0.1 % sodium azide
Uranylacetate	Science Services	E22400
Lead(II) Nitrate	Merck	107398
Tri Sodium Citrate Dihydrate	Merck	106448
NaOH pellets	Merck	106469
1M NaOH solution	Bernd Kraft	01030.3000
Glass petri dish	Duran	23 755 56
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mounting
Stubs	Plano	G301F
Carbon pads	Plano	G3347
Copper tape	Plano	G3397	double-sided adhesive, conductive
Silver paint	Plano	G3692	Acheson Elektrodag 1415M
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions/mixtures
Adhesive mixture for coating blocks			Pattex contact adhesive /xylene as thinner, ratio 1:3. (Alternative for xylene: Rotihistol)
Reynolds lead citrate			50 mL: Dissolve 1.33 g of lead(II) nitrate in 10 mL of dH2O. Dissolve 1.76 g of tri-sodium citrate dihydrate in 10 ml dH2O. Mix both and add 1 M sodium hydroxide until the solution is clear. Fill up with dH2O to 50 mL.
Propidium iodide staining solution			Prepare 1:1500 dilution from stock in dH2O. Vortex for adequate mixing.
Aqueous uranyl acetate			Dissolve 3 % uranyl acetate in dH2O (mix thoroughly).