Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En letkøbt protokol til at generere Site-Specifically acetyleret proteiner i Escherichia Coli

Published: December 9, 2017 doi: 10.3791/57061
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 1, 1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Arkansas, 2Cell and Molecular Biology Program, University of Arkansas, 3Department of Biological Sciences, University of Arkansas, 4Fayetteville High School

Summary

Genetiske kode ekspansion fungerer som et effektivt redskab til at studere en bred vifte af biologiske processer, herunder protein acetylation. Her viser vi en letkøbt protokol til at udnytte denne teknik til at generere administrationsprocedurerne acetyleret proteiner på bestemte steder i Escherichia coli celler.

Abstract

Posttranslationelle modifikationer, der finder sted på specifikke positioner af proteiner har vist sig at spille en vigtig rolle i en række forskellige cellulære processer. Blandt dem er Vendbar lysin acetylation en af de mest udbredte distribueret i alle områder af livet. Selv om talrige massespektrometri-baseret acetylome undersøgelser har været udført, har yderligere karakterisering af disse formodede acetylation mål været begrænset. En mulig årsag er, at det er vanskeligt at generere rent acetyleret proteiner på ønskede positioner ved de fleste klassiske biokemiske metoder. For at overvinde denne udfordring, er den genetiske kode ekspansion teknik blevet anvendt til at bruge par en manipuleret pyrrolysyl-tRNA syntetase variant, og dens beslægtet tRNA fra Methanosarcinaceae arter, til direkte cotranslational indarbejdelse af acetyllysine på det specifikke websted i protein af interesse. Efter første anvendelse i studiet af Histon acetylation, har denne tilgang lettet acetylation studier på en række proteiner. I dette arbejde viste vi en letkøbt protokol for at producere site-specifically acetyleret proteiner ved hjælp af model bakterien Escherichia coli som vært. Malat-dehydrogenase blev brugt som en demonstration eksempel i dette arbejde.

Introduction

Posttranslationelle modifikationer (PTMs) af proteiner opstår efter oversættelsesprocessen og opstå fra kovalente tilsætning af funktionelle grupper til aminosyrerester, spiller vigtige roller i næsten alle de biologiske processer, herunder gen transskription, stressrespons, Celledifferentiering og metabolisme1,2,3. Til dato, omkring 400 markante er PTMs blevet identificeret4. Indviklet i genomet og proteomet forstærkes i stor udstrækning af protein PTMs, da de regulere protein aktivitet og lokalisering, og påvirke samspillet med andre molekyler som proteiner, nukleinsyrer, lipider og cofaktorer5.

Protein acetylation har været på forkant med PTMs undersøgelser i de sidste to årtier6,7,8,9,10,11,12. Lysin acetylation blev først opdaget i histonerne mere end 50 år siden13,14, har været godt undersøgt, og er kendt for at eksistere i mere end 80 transkriptionsfaktorer, lovgivere og forskellige proteiner15, 16,17. Undersøgelser på protein acetylation har ikke kun givet os en dybere forståelse af sin reguleringsmekanismer, men også guidet behandlinger for en række sygdomme forårsaget af dysfunktionelle acetylation18,19, 20 , 21 , 22 , 23. man mente at lysin acetylation kun sker i eukaryoter, men nylige undersøgelser har vist, at protein acetylation også spiller vigtige roller i bakteriel fysiologi, herunder chemotaxis, syre modstand, aktivering og stabilisering af sygdomsfremkaldende evne øer og andre virulens relaterede proteiner24,25,26,27,28,29.

En almindeligt anvendt metode til biokemisk karakterisere lysin acetylation bruger site-directed mutagenese. Glutamin er brugt som en efterligner af acetyllysine på grund af dens lignende størrelse og polaritet. Arginin er udnyttet som en ikke-acetyleret lysin efterligner, da den bevarer sin positive ladning fysiologiske betingelser, men kan ikke være acetyleret. Men begge efterligner er ikke rigtig isosteres og altid give ikke de forventede resultater30. Den mest stringent tilgang er at generere administrationsprocedurerne acetyleret proteiner på specifikke lysin rester, som er vanskeligt eller umuligt for mest klassiske metoder på grund af den lave støkiometrisk af lysin acetylation i naturen7,11. Denne udfordring har været bragt i orden af den genetiske kode ekspansionsstrategi, som beskæftiger en manipuleret pyrrolysyl-tRNA syntetase variant fra Methanosarcinaceae arter at oplade tRNAPyl med acetyllysine, udnytter værten Translationel maskiner til at undertrykke UAG stop codon i mRNA, og dirigerer indarbejdelse af acetyllysine i positionen designet af target protein31. For nylig har vi optimeret dette system med en forbedret EF-Tu-bindende tRNA32 og en opgraderet acetyllysyl-tRNA syntetase33. Derudover har vi anvendt denne forbedrede vedtægter system i acetylation undersøgelser af malat dehydrogenase34 og tyrosyl-tRNA syntetase35. Heri, vise vi protokol til at generere rent acetyleret proteiner fra de molekylære kloning til biokemiske identifikation ved hjælp af malat-dehydrogenase (MDH), som vi har grundigt undersøgt som en demonstrativ eksempel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. site-Directed mutagenese af Target gen

Bemærk: MDH udtrykkes T7 promotor i pCDF-1 vektor med CloDF13 oprindelse og en kopi antallet af 20-4034.

  1. Indføre rav stop-codon på position 140 i genet af primere (videresende primer: GGTGTTTATGACTAGAACAAACTGTTCGGCG og vende primer: GGCTTTTTTCAGCACTTCAGCAGCAATTGC), efter instruktion af site-directed mutagenese kit.
  2. Forstærke den skabelon plasmid indeholdende vildtype malat dehydratase-genet, og Indsæt stop codon mutation ved polymerase kæde reaktion (PCR) reaktion. I reaktionsblandingen, omfatter 12,5 µL af 2 X DNA polymerase enzym mix, 1,25 µL af 10 µM fremad primer, 1,25 µL af 10 µM omvendt primer, 1 µL af DNA-template (20 ng/µL) (pCDF-1 plasmid indeholder genet af vildtype MDH), og 9 µL nukleasen-gratis vand.
    1. Bruge PCR reaktion parametre som følger: indledende denaturering på 98 ° C til 30 s; 25 cyklusser af 10 s på 98 ° C, 30 s på 55 ° C, og 3 min. ved 72 ° C; endelige udvidelse ved 72 ° C i 3 min. Efter PCR, tilføje den forstærkede materiale direkte til Kinase-Ligase-DpnI enzym mix fra kit i 1 time ved stuetemperatur til fjernelse af circularization og skabelon.
      Bemærk: Reaktionsblandingen indeholder 1 µL PCR produkt, 5 µL af 2 X reaktion Buffer, 1 µL af 10 X Kinase-Ligase-DpnI enzym mix og 3 µL nukleasen-gratis vand.
  3. Tilføj 5 µL af mastermix til rør af 25 µL optøet kompetente E. coli DH5α celler fra sættet. Omhyggeligt svirp røret til mix, og læg blandingen på is i 30 min. Heat shock blanding på 42 ° C til 30 s og sted på is i yderligere 5 min.
    1. Afpipetteres 600 µL af stuetemperatur Super Optimal bouillon med Catabolite undertrykkelse (SOC) medier fra kit i blandingen, der inkuberes ved 37 ° C i 60 min. med rysten på 250 rpm, sprede 100 µL på en lysogeny bouillon (LB) agar plade med det tilsvarende antibiotikum , og der inkuberes natten over ved 37 ° C under omrystning ved 250 omdrejninger i minuttet.
  4. Pick 4-6 enkelt kolonier i 6 mL frisk LB medier med det tilsvarende antibiotikum, og der inkuberes ved 37 ° C natten over med rysten på 250 rpm. Uddrag plasmider fra hver overnight kultur af plasmid rensning kit, efter producentens manual, så send plasmider for DNA-sekventering i henhold til protokollen af tjenesteyderen at bekræfte stop codon mutation på korrekte positioner.
  5. Gemme stamme med den korrekte rækkefølge på-80 ° C ved at blande 1 mL overnight kultur og 300 µL 100% DMSO.

2. angivelse af den acetyleret Protein

  1. Indsæt gener af optimeret acetyllysyl-tRNA syntetase33 og optimeret tRNAPyl 32 i pTech plasmid. Placere tRNA syntetase gen konstitutiv lpp promotor. Placere tRNA gen under konstitutiv proK promotor34.
    1. Co omdanne udtryk vektor34 indeholdende det muterede TAG-holdige gen af malat-dehydrogenase, og plasmid husly optimeret acetyllysine indarbejdelse system, i 25 µL optøede kompetente E. coli BL21(DE3) celler ved Heat shock på 42 ° C i 10 s og sted på is i yderligere 5 min.
    2. Afpipetteres 600 µL af stuetemperatur SOC medier i blandingen, der inkuberes ved 37 ° C i 60 min. med rysten på 275 rpm, sprede 100 µL på en plade med 100 µg/mL streptomycin og 50 µg/mL chloramphenicol og inkuberes natten over ved 37 ° C under omrystning på 275 rpm.
  2. Afhente en enkelt koloni fra pladen, og podes i 15 mL frisk LB medier med 100 µg/mL streptomycin og 50 µg/mL chloramphenicol i en 50 mL tube natten over ved 37 ° C under omrystning med 250 rpm hastighed. Overføre 15 mL overnight kultur til 300 mL frisk LB medier med antibiotika i en 1 L målekolbe, og der inkuberes ved 37 ° C under omrystning ved 250 omdrejninger i minuttet.
  3. Opløse acetyllysine med vand at gøre 100 mM stamopløsning, opbevares ved 4 ° C. Tilføj 5 mM acetyllysine og 20 mM nicotinamid (hæmmer af deacetyltransferase) til vækst medier, når absorbansen når 0,5 på 600 nm.
    1. Vokser celler i en yderligere 1 timer ved 37 ° C, rysten på 250 rpm, derefter tilføje 0,5 mM IPTG for protein udtryk, og dyrke celler ved 25 ° C natten over, med rysten på 180 rpm.
      Bemærk: Udtrykket betingelser muligvis optimering for forskellige proteiner.
  4. Indsamle celler ved centrifugering ved 3.000 x g ved 4 ° C i 15 min, supernatanten fjernes, og vaske celle pellets med phosphat bufferet saltvand (PBS) buffer (10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl). Indsamle vasket celler på 10.000 x g ved 4 ° C i 5 min, supernatanten og gemme celle pellets ved-80 ° C.

3. rensning af acetyleret Protein

  1. Optø frosne celle pellets på isen, og genopslæmmes med 15 mL lysisbuffer (50 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) pH 7,8, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol og 20 mM nicotinamid), 5 µL af β-mercaptoethanol og 1 µL Benzonase nukleasen (250 enheder).
  2. Bryde celler ved hjælp af 40 kHz sonikering på 70% effekt med 10 cyklusser af 10 s korte byger, efterfulgt af intervaller af 30 s til køling til form rå ekstrakt. Centrifuge rå ekstrakt på 20.000 x g i 25 min. ved 4 ° C. Filtrer supernatanten med 0,45 µm membranfilter, og læg i en kolonne, der indeholder 1 mL af nikkel-nitrilotrieddikesyre syre (Ni-NTA) harpiks ekvilibreres med 20 mL vand og 20 mL af lysisbuffer.
    Bemærk: Celler kan også blive brudt af milde rengøringsmidler, hvis sonikering ikke er tilgængelig.
  3. Kolonnen udvaskes med 20 mL af vaskebuffer (50 mM Tris pH 7,8, 300 mM NaCl, 50 mM imidazol og 20 mM nicotinamid), og derefter elueres med 2 mL af eluering buffer (50 mM Tris pH 7,8, 300 mM NaCl, 150 mM imidazol og 20 mM nicotinamid).
  4. Desalt eluering brøkdel med afsaltning buffer (25 mM Tris pH 7,8 og 10 mM NaCl) af kolonnen PD-10, efter producentens manual. Mål koncentrationen af det eluted protein ved at følge instruktionen af Bradford protein assay reagens. De afsaltede protein er klar til yderligere forsøg.
    Bemærk: Gøre 50% glycerol bestand af protein, og holde i-80 ° C til opbevaring.

4. biokemiske karakterisering af den acetyleret Protein

  1. SDS-PAGE og masse massespektrometri analyser.
    1. Denaturerer proteiner med sodium dodecyl sulfat (SDS) prøvebuffer (5 µL protein prøve med 2 µL 4 X SDS prøvebuffer) i et 2 mL rør ved 105 ° C i 5 min, centrifugeres blandingen på 2000 x g i 10 s, belastning op på 4-20% sodium dodecyl sulfat polyacrylamid gel electroph oresis (SDS-PAGE) gel, og Kør på 200 V i 30 min.
    2. Vaske gel med destilleret vand og omrystes forsigtigt i 5 min, gentage processen 3 gange. Kassér vandet og plette gel med Coomassie blå plet i 1 time med blid ryster. De-pletten gel med destilleret vand, omrystes forsigtigt i 30 min, og Gentag dette fjerne pletten 3 gange.
    3. Skære bandet på 33 kDa på Coomassie blå-farvede SDS-PAGE gel, og send det til massespektrometri faciliteter eller virksomheder til at bekræfte acetyllysine var indarbejdet den designede startposition.
      Bemærk: Protokollen af massespektrometri analyse fulgte de tidligere eksperiment34.
  2. Western Blotting
    1. Køre SDS-PAGE gel med den samme protokol i trin 4.1. Efter gelen køre, blød gel med overførsel buffer (25 mM Tris, 192 mM glycin, pH 8.3 og 20% methanol) i 15 min.
    2. Aktivere en 0,2 µm, 7 cm x 8,5 cm polyvinylidene xenondifluorid (PVDF) membran med methanol i 1 min., og skyl med overførsel buffer før forberede overførsel sandwich.
      Bemærk: Methanol er sundhedsskadeligt ved hudkontakt, øjenkontakt, indtagelse eller indånding. Svær overeksponering kan resultere i dødsfald.
    3. Lav overførslen sandwich fra katoden at anoden (svamp, filtrerpapir, SDS-PAGE gel, PVDF membran, filtrerpapir og svamp). Læg stakken i overførsel tank, køre på konstant strøm af 350 mA i 45 min.
      Bemærk: Overførsel tid muligvis optimering.
    4. Vaske PVDF membran med 25 mL Tris-bufferet saltvand, 0,1% Tween 20 (TBST) (137 mM NaCl, 20 mM Tris, 0,1% Tween-20, pH 7,6) buffer for 5 min med blid ryster. Blokere membran med 5% bovint serumalbumin (BSA) i TBST buffer i 1 time ved stuetemperatur.
    5. Inkuber membran med HRP-konjugerede acetyllysine-antistof med en endelig koncentration på 1 µg/mL fortyndet med 5% BSA i TBST ved 4 ° C natten over med blid ryster.
      Bemærk: Til hurtigere resultater, kunne dette trin udføres i stuetemperatur i 1 time. Fortynding af antistof muligvis optimering.
    6. Vask membran med 20 mL TBST buffer for 5 min med blid ryster, gentage trinnet 4 gange. Anvende kemiluminescens substrat til membranen ved at følge producentens anvisninger. Fange signalet med en afgift - sammen enhed (CCD) kamera-baserede imager.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Udbyttet af acetyleret MDH protein var 15 mg per 1 L kultur, mens der i wild-type MDH var 31 mg per 1 L kultur. Renset proteiner blev analyseret af SDS-PAGE som vist i figur 1. Wild-type MDH blev brugt som en positiv kontrol34. Protein renset fra celler husly acetyllysine (AcK) iblanding system og mutant mdh gen, men uden AcK i vækst medier, blev brugt som en negativ kontrol. Lysin acetylation af renset proteiner blev opdaget ved western blotting hjælp acetyllysine-antistof som vist i figur 2. Acetylation af lysin rest 140 i malat-dehydrogenase blev bekræftet af tandem massespektrometri analyse som vist i figur 3.

Protein sekvens af MDH protein (fragment for tandem MS analyse er med fed skrift):

MKVAVLGAAGGIGQALALLLKTQLPSGSELSLYDIAPVTPGVAVDLSHIPTAVKIKGFSGEDAT
PALEGADVVLISAGVARKPGMDRSDLFNVNAGIVKNLVQQVAKTCPKACIGIITNPVNTTVAIAA
EVLKKAGVYDKNKLFGVTTLDIIRSNTFVAELKGKQPGEVEVPVIGGHSGVTILPLLSQVPGV
SFTEQEVADLTKRIQNAGTEVVEAKAGGGSATLSMGQAAARFGLSLVRALQGEQGVVECAY
VEGDGQYARFFSQPLLLGKNGVEERKSIGTLSAFEQNALEGMLDTLKKDIALGEEFVNK

Protein sekvens af optimeret acetyllysyl-tRNA syntetase33:

MDKKPLDVLISATGLWMSRTGTLHKIKHYEISRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSCRPARAFRYHKY
RKTCKRCRVSDEDINNFLTRSTEGKTSVKVKVVSEPKVKKAMPKSVSRAPKPLENPVSAKAST
DTSRSVPSPAKSTPNSPVPTSASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRR
KKDLQQIYAEERENYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERMGIDNDTELSKQIFRVDKN
FCLRPMMAPNLLNYARKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFFQMGSGCTRE
NLESIITDFLNHLGIDFKIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGAGF
GLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL

Gensekvens af optimeret tRNAPyl 32:

GGAAACGTGATCATGTAGATCGAATGGACTCTAAATCCGTTCAGTGGGGTTAGATTCCCC
ACGTTTCCGCCA

Figure 1
Figur 1 : The Coomassie blå-farvede SDS-PAGE gel renset fuld længde MDH og dens AcK-holdige variant. De samme mængder af eluering fraktioner var læsset på SDS-PAGE gel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Den western blotting renset vildtype MDH og dens AcK-holdige variant. De samme mængder af eluering fraktioner blev indlæst. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : LC-MS/MS analyse af AcK-holdige MDH variant. Tandem masse spektret af peptid (restprodukter fra 135-142) AGVYDKACNK fra renset acetyleret MDH variant. KAC betegner AcK indarbejdelse. Delsekvens af peptid indeholdende AcK kan læses fra kommenteret b eller y ion serien. Matchede toppe var i rød. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den genetiske indarbejdelse af noncanonical aminosyrer (ncAAs) er baseret på undertrykkelse af en tildelt codon, for det meste rav stop codon UAG36,37,38,39, af den ncAA-opkrævet tRNA indeholdende den tilsvarende anticodon. Som det er kendt, UAG-codon er anerkendt af release faktor-1 (RF1) i bakterier, og det kan også være undertrykt af nær beslægtet tRNAer fra værter opkrævet af canonical aminosyrer (CAA) såsom Lysin og tyrosin40,41. Så afhænger effektiviteten af ncAA indarbejdelse på UAG-codon af konkurrencen mellem ncAA-opkrævet tRNAer og RF1, mens renhed ncAA vedtægter er baseret på konkurrence mellem ncAA-opkrævet tRNAer og cAA-opkrævet nær beslægtet tRNAer. Lavt udbytte og renhed af target acetyleret protein kan være forårsaget af lav indarbejdelse effektiviteten af ortogonale parret tilføres værtsceller. Dette problem kan løses ved at øge koncentrationen af acetyllysine i medierne, og ved hjælp af seneste optimeret acetyllysine indarbejdelse systemer, som steg UAG codon undertrykkelse af 58 gange32,33, begge effektivitet og renhed acetyllysine vedtægter vil blive forbedret. Som vist i figur 1 og sammenligne protein udbytter, effektivitet acetyllysine vedtægter var omkring 50%, og der var ingen påviselige protein renset fra celler husly AcK indarbejdelse system og det muterede gen af MDH, men uden AcK i vækst medier, som angivet af høj renhed acetyllysine vedtægter. Derudover viste massespektrometri analyse også ikke nogen luftfartsmyndigheders holdning 140 af MDH, der angiver homogenitet acetyllysine vedtægter.

Der er to vigtigste begrænsninger i denne tilgang. For det første på grund af konkurrencen fra acetyllysine-opkrævet tRNA med begge RF1 og cAA-opkrævet nær beslægtet tRNAer beskrevet ovenfor, i øjeblikket, det maksimale antal acetyllysine restprodukter, der samtidig kan indarbejdes i en enkelt protein er tre 33,42. For det andet har celler andre typer af deacetyltransferase, som modstå nicotinamid og kan deacetylate visse mål proteiner. Så disse proteiner kan ikke nå til 100% acetylation på bestemte websteder. For nylig har vi oprettet en thio-acetyllysine indarbejdelse system, der kan anvendes som en ikke-deacetylable analog af acetyllysine43, således dette system kunne være en god alternativ tilgang i dette tilfælde.

Som tidligere nævnt, bruger den klassiske tilgang til biokemisk karakterisere lysin acetylation site-directed mutagenese. Glutamin er brugt som en efterligner af acetyllysine, og arginin er udnyttet som en ikke-acetyleret lysin efterligner. Men begge efterligner er ikke egentlige isosteres, og altid give ikke de forventede resultater30. Den genetiske kode ekspansionsstrategi kunne generere administrationsprocedurerne acetyleret proteiner på specifikke lysin rester, som er den mest stringent måde at karakterisere acetyleret proteiner.

Genetiske indarbejdelse system for acetyllysine stammer fra par pyrrolysyl-tRNA syntetase varianter, og deres beslægtet tRNA fra Methanosarcinaceae arter, som også er kendt for at være ortogonale i eukaryoter44. Tidligere undersøgelser har vist, at dette system kan anvendes i pattedyrsceller og visse dyr til protein acetylation undersøgelser39, således den nuværende protokol kunne udvides til pattedyrceller og selv dyr for større programmer i medicinsk forskning og industri. Denne protokol er derudover også hovedsagelig den samme protokol, der bruges til at optage forskellige former for ncAAs, nødvendiggør en simpel ændring til ortogonale parret tilføres værtsceller.

Lysin deacetyltransferase (KDACs) fjerne acetyl gruppe fra acetyleret lysin rester i proteiner45. Sirtuin-type CobB er den kun kendte deacetylase i E. coli, som kan blive hæmmet af nicotinamid27. Så, for at forhindre deacetylation af acetyleret protein genereret under cellevækst og protein oprensning, 20 til 50 mM nicotinamid bør tilføjes i både vækst medier og rensning buffere. Når renset, er acetylation af lysin rester forholdsvis stabil på grund af manglende deacetylase. For det andet, for at sænke baggrund af uspecifikke acetylation på andre lysin restkoncentrationer i protein, BL21 (DE3) stamme blev brugt som udtryk stamme, på grund af dens betydeligt lavere niveau af protein acetylation end almindeligt anvendte K12-afledte stammer46 . Som vist i figur 2, havde wild-type MDH udtrykt fra BL21(DE3) celler ingen påviselig acetylation af western blotting. Dette er en anden vigtig faktor til at øge renheden af acetylation i target proteinet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIH (AI119813), opstart fra University of Arkansas, og prisen fra Arkansas Biosciences Institute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bradford protein assay Bio-Rad 5000006 Protein concentration
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747 SDS sample buffer
Coomassie G-250 Stain Bio-Rad 1610786 SDS-PAGE gel staining
4-20% SDS-PAGE ready gel Bio-Rad 4561093 Protein determination
Ac-K-100 (HRP Conjugate) Cell Signaling 6952 Antibody
IPTG CHEM-IMPEX 194 Expression inducer
Nε-Acetyl-L-lysine CHEM-IMPEX 5364 Noncanonical amino acid
PD-10 desalting column GE Healthcare 17085101 Desalting
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit NEB E0554 Introducing the stop codon
BL21 (DE3) cells NEB C2527 Expressing strain
QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN 27106 Extracting plasmids
Ni-NTA resin QIAGEN 30210 Affinity purification resin
nicotinamide Sigma-Aldrich N3376 Deacetylase inhibitor
β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250 Reducing agent
BugBuster Protein Extraction Reagent Sigma-Aldrich 70584 Breaking cells
Benzonase nuclease Sigma-Aldrich E1014 DNase
ECL Western Blotting Substrate ThermoFisher 32106 Chemiluminescence
Premixed LB Broth VWR 97064 Cell growth medium
Bovine serum albumin VWR 97061-416 western blots blocking

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krishna, R. G., Wold, F. Post-translational modification of proteins. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 67, 265-298 (1993).
  2. Lothrop, A. P., Torres, M. P., Fuchs, S. M. Deciphering post-translational modification codes. FEBS Lett. 587 (8), 1247-1257 (2013).
  3. Walsh, C. T. Posttranslational modification of proteins : expanding nature's inventory. , Roberts and Company Publishers. Englewood, Colorado. (2006).
  4. Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Sci Rep. 1, (2011).
  5. Grotenbreg, G., Ploegh, H. Chemical biology: dressed-up proteins. Nature. 446 (7139), 993-995 (2007).
  6. Arif, M., Selvi, B. R., Kundu, T. K. Lysine acetylation: the tale of a modification from transcription regulation to metabolism. Chembiochem. 11 (11), 1501-1504 (2010).
  7. Cohen, T., Yao, T. P. AcK-knowledge reversible acetylation. Science's STKE : signal transduction knowledge environment. (245), pe42 (2004).
  8. Drazic, A., Myklebust, L. M., Ree, R., Arnesen, T. The world of protein acetylation. Biochim Biophys Acta. 1864 (10), 1372-1401 (2016).
  9. Escalante-Semerena, J. C. Nε-acetylation control conserved in all three life domains. Microbe. 5, 340-344 (2010).
  10. Kouzarides, T. Acetylation: a regulatory modification to rival phosphorylation? The EMBO journal. 19 (6), 1176-1179 (2000).
  11. Soppa, J. Protein acetylation in archaea, bacteria, and eukaryotes. Archaea. , (2010).
  12. Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (4), 258-264 (2015).
  13. Allfrey, V. G., Faulkner, R., Mirsky, A. E. Acetylation and Methylation of Histones and Their Possible Role in the Regulation of Rna Synthesis. P Natl Acad Sci USA. 51, 786-794 (1964).
  14. Phillips, D. M. The presence of acetyl groups of histones. Biochem j. 87, 258-263 (1963).
  15. Sterner, D. E., Berger, S. L. Acetylation of histones and transcription-related factors. Microbiology and molecular biology reviews: MMBR. 64 (2), 435-459 (2000).
  16. Glozak, M. A., Sengupta, N., Zhang, X., Seto, E. Acetylation and deacetylation of non-histone proteins. Gene. 363, 15-23 (2005).
  17. Close, P., et al. The emerging role of lysine acetylation of non-nuclear proteins. Cell Mol Life Sci. 67 (8), 1255-1264 (2010).
  18. Iyer, A., Fairlie, D. P., Brown, L. Lysine acetylation in obesity, diabetes and metabolic disease. Immunol Cell Biol. 90 (1), 39-46 (2012).
  19. You, L., Nie, J., Sun, W. J., Zheng, Z. Q., Yang, X. J. Lysine acetylation: enzymes, bromodomains and links to different diseases. Essays Biochem. 52, 1-12 (2012).
  20. Bonnaud, E. M., Suberbielle, E., Malnou, C. E. Histone acetylation in neuronal (dys)function. Biomol Concepts. 7 (2), 103-116 (2016).
  21. Fukushima, A., Lopaschuk, G. D. Acetylation control of cardiac fatty acid beta-oxidation and energy metabolism in obesity, diabetes, and heart failure. Biochim Biophys Acta. 1862 (12), 2211-2220 (2016).
  22. Kaypee, S., et al. Aberrant lysine acetylation in tumorigenesis: Implications in the development of therapeutics. Pharmacol Ther. 162, 98-119 (2016).
  23. Tapias, A., Wang, Z. Q. Lysine Acetylation and Deacetylation in Brain Development and Neuropathies. Genomics Proteomics Bioinformatics. 15 (1), 19-36 (2017).
  24. Hu, L. I., Lima, B. P., Wolfe, A. J. Bacterial protein acetylation: the dawning of a new age. Molecular microbiology. 77 (1), 15-21 (2010).
  25. Jones, J. D., O'Connor, C. D. Protein acetylation in prokaryotes. Proteomics. 11 (15), 3012-3022 (2011).
  26. Bernal, V., et al. Regulation of bacterial physiology by lysine acetylation of proteins. New biotechnol. 31 (6), 586-595 (2014).
  27. Hentchel, K. L., Escalante-Semerena, J. C. Acylation of Biomolecules in Prokaryotes: a Widespread Strategy for the Control of Biological Function and Metabolic Stress. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 79 (3), 321-346 (2015).
  28. Ouidir, T., Kentache, T., Hardouin, J. Protein lysine acetylation in bacteria: Current state of the art. Proteomics. 16 (2), 301-309 (2016).
  29. Wolfe, A. J. Bacterial protein acetylation: new discoveries unanswered questions. Curr Genet. 62 (2), 335-341 (2016).
  30. Albaugh, B. N., Arnold, K. M., Lee, S., Denu, J. M. Autoacetylation of the histone acetyltransferase Rtt109. J Biol Chem. 286 (28), 24694-24701 (2011).
  31. Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. Genetically encoding Nε-acetyllysine in recombinant proteins. Nat chem biol. 4 (4), 232-234 (2008).
  32. Fan, C., Xiong, H., Reynolds, N. M., Soll, D. Rationally evolving tRNAPyl for efficient incorporation of noncanonical amino acids. Nucleic Acids Res. 43 (22), e156 (2015).
  33. Bryson, D., et al. Continuous directed evolution of aminoacyl-tRNA synthetases to alter amino acid specificity and enhance activity. Nat Chem Biol. , (2017).
  34. Venkat, S., Gregory, C., Sturges, J., Gan, Q., Fan, C. Studying the Lysine Acetylation of Malate Dehydrogenase. J Mol Biol. 429 (9), 1396-1405 (2017).
  35. Venkat, S., Gregory, C., Gan, Q., Fan, C. Biochemical characterization of the lysine acetylation of tyrosyl-tRNA synthetase in Escherichia coli. Chembiochem. 18 (19), 1928-1934 (2017).
  36. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  37. Mukai, T., Lajoie, M. J., Englert, M., Soll, D. Rewriting the Genetic Code. Annu Rev Microbiol. , (2017).
  38. O'Donoghue, P., Ling, J., Wang, Y. S., Soll, D. Upgrading protein synthesis for synthetic biology. Nat Chem Biol. 9 (10), 594-598 (2013).
  39. Chin, J. W. Expanding and reprogramming the genetic code of cells and animals. Annu Rev Biochem. 83, 379-408 (2014).
  40. O'Donoghue, P., et al. Near-cognate suppression of amber, opal and quadruplet codons competes with aminoacyl-tRNAPyl for genetic code expansion. FEBS Lett. 586 (21), 3931-3937 (2012).
  41. Aerni, H. R., Shifman, M. A., Rogulina, S., O'Donoghue, P., Rinehart, J. Revealing the amino acid composition of proteins within an expanded genetic code. Nucleic Acids Res. 43 (2), e8 (2015).
  42. Huang, Y., et al. A convenient method for genetic incorporation of multiple noncanonical amino acids into one protein in Escherichia coli. Mol Biosyst. 6 (4), 683-686 (2010).
  43. Venkat, S., et al. Genetically encoding thioacetyl-lysine as a nondeacetylatable analog of lysine acetylation in Escherichia coli. FEBS Open. , (2017).
  44. Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochim Biophys Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
  45. Gregoretti, I. V., Lee, Y. M., Goodson, H. V. Molecular evolution of the histone deacetylase family: functional implications of phylogenetic analysis. J Mol Biol. 338 (1), 17-31 (2004).
  46. Weinert, B. T., et al. Acetyl-phosphate is a critical determinant of lysine acetylation in E. coli. Mol cell. 51 (2), 265-272 (2013).

Tags

Immunologi spørgsmålet 130 Protein acetylation posttranslationel modifikation genetiske kode ekspansion noncanonical aminosyrer malat-dehydrogenase syntetisk biologi
En letkøbt protokol til at generere Site-Specifically acetyleret proteiner i <em>Escherichia Coli</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Venkat, S., Gregory, C., Meng, K.,… More

Venkat, S., Gregory, C., Meng, K., Gan, Q., Fan, C. A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli. J. Vis. Exp. (130), e57061, doi:10.3791/57061 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter