Summary
マウスの脳からプライマリ ミクログリアの隔離のためのプロトコルが表示されます。この手法は、神経学的な条件の現在の理解の促進に役立ちます。密度勾配遠心法と磁気分離は、純度の高いサンプルの十分な収量を生成する結合されます。さらに、ミクログリアの特性評価のための手順をまとめました。
Abstract
ミクログリア、脳内の居住者の免疫細胞は、炎症や中枢神経系に傷害の最初の反応です。最近の研究は、動的、プロ炎症性と抗炎症の表現型を想定しての対応するミクログリアを明らかにしました。M1 (炎症) と M2 (pro 修復) 表現型プレイ アミロイド条件周産期の脳損傷など展示異なる重要な役割機能ある特定の環境刺激に応答します。ミクログリア活性化の変調は神経保護ミクログリアが脳損傷の治療の可能性あるかもしれませんが示唆を与えるに指摘されています。しかしより多くの研究は病気におけるミクログリアの役割を理解するために必要なこのプロトコルを容易にします。プロトコルは下記を組み合わせた磁気分離、体外実験のために使用できる主要な小グリア細胞の純度の高いサンプルの生産と細胞の残骸を減らすために密度勾配の遠心分離プロセス、2-3 週間培養の必要があります。さらに、評価手順は、ミクログリア、偏光の私達の理解を改善するための研究を支援し、これらの細胞のプライミング再生医療の分野で強力な影響を持っている情報の堅牢な機能を得られます。
Introduction
炎症、低酸素虚血および出血から周産期の期間中に取得した損傷は長期的後遺症の配列を持つことができます。周産期の脳損傷の複雑な病態は炎症や虚血後の神経細胞と軸索の死1理論します。生得の免疫反応は、傷害2につながるイベントの連鎖で重要な役割を果たしています。
ミクログリア、中枢神経系 (CNS)、内居住者の免疫細胞は、傷害3の最初の反応です。ミクログリアは、4の環境保護や毒性、依存する容量を持つプラスチック電池種類です。走化性、食作用、抗原提示、サイトカインや活性酸素種4、5の生産に関与しています。老齢ミクログリアは常に環境を調査し、外国または有害物質4の存在によってアクティブ化されます。活性化は、中枢神経系の保護4で重要な炎症応答に します。これらの M1「炎症」表現型ミクログリア主に抗原提示と病原体4の死に関与しています。にもかかわらず、神経保護の炎症反応の重要な役割は、自由なまたは長期の炎症が神経損傷4につながる有害なにできます。ただし、特定の環境の刺激にさらされると、ミクログリアは抗炎症の表現型を表わすことができます。これら pro 修復 M2 ミクログリア創傷治癒と修復6各種のサイトカインを放出する重要な役割があるし、他の溶性メディエーター レセプター炎症、貪食能を増加し、促進する修復4, 7. ミクログリアの役割は多様であり、再髄鞘化8、脳卒中モデル9で酸素とグルコース枯渇中に神経細胞を保護して神経突起を推進運転オリゴデンドロ サイト分化脊髄損傷は、10をモデル化します。
これらのグリア細胞の研究を理解および neuroinflammation への応答の処理で重要な側面を表します。記述のプロトコル アミロイド疾患におけるミクログリアの変調方式の治療の可能性をさらに調査できます。
ミクログリア活性化神経の役割への変調は、条件11,12,13の範囲で観察されています。したがって、現在の理解と活性化ミクログリアの変調をさらに勉強して改善は重要なin vitroとin vivoの両方を含むさまざまなモデルの使用を必要とします。In vitroの研究より効率、低いコストと能力孤立セル人口を調査するための重要なツールを表します。
ミクログリア マウス脳から効率的に良い生存率および高純度と高収率のサンプルを生成する課題の分離のための文献に記載されているプロトコルの範囲があります。プライマリ ミクログリアの分離の一般的に使用される方法は、磁気分離と混合培養の揺れです。個人的な経験を通して、磁気の列を妨げ細胞の残骸の高度があったことが分られました。したがって、次のプロトコルは、CD11b 磁気分離に続いて初期密度勾配遠心法手順を組み込んだに利用されました。下記プロトコルは、十分な量の非常に純粋なサンプルを生成する最適化されています。その高純度と短い期間のために有利である-1 つは、2-3 週間培養することがなく 2 日以内の試金を実行できます。このプロトコルは、プライマリ マウスアストロの隔離のため潜在的適応ことができます。
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Protocol
次の手順は、モナシュ大学の動物倫理委員会によって承認されています。代表的な結果を生成する健康的な未処理新生児 C57Bl6/J P3-6 マウスが使用されました。
1. 酵素の消化力
注: 不妊の分離及び初代培養細胞を培養するときを考慮する重要です。環境は可能な限り滅菌を確保しながら初期の郭清とマウス脳の収穫を亂流フード外完了して層流フード内で実行される後続のすべての手順をことができます。
- 滅菌器具を使用して、マウスを頚椎脱臼で安楽死、動物の首をはねる、100% エタノールでリンスします。小さな滅菌はさみを使用して、頭の右と左の両側に沿って小さな切開を作る。この歳で、皮膚が離れて簡単にはがれます。カーブタイプ鉗子の先端を使用して、ゆっくり前を含む頭蓋骨を公開する演壇に向かって組織をスライドさせます。
- 脊柱管の開口部にはさみの先端を挿入し、外耳道に横切開します。上向きの脳の損傷を防ぐためにはさみの先端をそっと指して前矢状縫合線に沿って切開を行います。前にはさみの先端を挿入し、冠状縫合に沿って頭の左右両側に横切開を加えます。
- 鉗子を使用して、そっとはがす脳を公開する頭蓋骨。横切開によって公開される頭蓋骨の端を把握し、頭蓋骨を横に軽く引いてください。頭蓋骨は簡単に離れて皮する必要があります。それを削除する脳スクープ カーブタイプ鉗子を使用して、優しく。
- 脳が、5 mL の滅菌コンテナー、冷たい洗浄メディア (低血糖ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 1% ペニシリン-ストレプトマイシンと)、洗浄、血液を削除するのにあたり約 5 mL メディアを 2-3 回を洗います。
- 層流フードの氷の上で休んでいる小さなシャーレ (35 mm) で 5 mL コンテナーの内容を配置します。生殖不能のメスの刃、または滅菌はさみを使用して、小脳および嗅球を削除します。別の 2 つの半球に正中線を作る。
- 皮質を損傷しないように注意を取って、微細鉗子での硬膜の層を慎重にはがします。目に見える血管と脳の表面の赤みと細胞の非常に薄い層として硬膜層を識別します。脳の寒さを維持し適切な髄膜の除去に不可欠です。硬膜の層が破損した場合は、それが完全に削除されるまでは、引き裂かれた断片を剥離を続行します。
- (氷上) 新しい小さいペトリ皿と洗ってメディアでいっぱいに半球を転送します。脳を滅菌メス刃/ハサミで細かく刻んでください。
注: これらは 〜 1 mm2のサイズをする必要があります、これは収量を減らすことができる、あまりにも小さな断片にそれらをカットには注意が必要があります。 - 100 μ L パパイン (17 U/mg 株式) と 150 μ L を追加 DNase I メディアを 37 ° C で 30 分間インキュベートし、
- 次の消化、カップ P1000 ピペットを使用して組織を刻んだ。組織部分が大きすぎて、ピペットを入力する場合、は、ピペット チップを広げるペアまたは滅菌はさみを使用することを検討します。この過程で、これはセル実行可能性を減らすことができるよう、メディアに気泡を導入すること注意してください。
2. 髄鞘の残骸の取り外し
- 層流フードの下で滅菌装置を使用して、それぞれの脳の 100 μ m の細胞ストレーナー付け 50 mL の円錐管を準備します。ストレーナーにダイジェスト中と脳の部分を含んでいるペトリ皿の内容を注ぐ。ないより多くの組織が表示されるまで研削モーションで 3 mL の滅菌注射器のプランジャーを使用して、脳の部分をプッシュします。次の消化、脳組織が簡単に離れて落ちる必要があります。
- 継続的にこのプロセスを通して細胞ストレーナーをトッピングして洗浄メディアでフィルターを洗ってください。これは、こし器に閉じ込められたセルを介して洗浄します。
注: このべき管にある約 〜 15 mL まで。これはストレーナーを十分に洗浄したことを確認して細胞の量を最大化します。 -
4 ° C で 5 分間 500 x g で単一細胞懸濁液を遠心分離します。この時間の間に密度勾配媒体を準備しています。
- 使用密度勾配媒体である株式等張 percoll (SIP) を準備します。密度勾配媒体の比率は 9:1 を無菌ハンクス平衡塩溶液 (HBSS) x 10 に追加することによってこれを行います。
- 30 としてグラデーションを準備 1 x HBSS で SIP %dmem で SIP と 70%。たとえば、30 の 10 mL を準備する %、SIP は、7 mL DMEM に SIP の 3 mL を加えます。
- 円錐管と再懸濁します 8 ml の 30% の細胞ペレットは DMEM で SIP から上清を吸引します。新鮮な 15 mL の円錐管にフル ・ ボリュームを転送します。
- 70% の SIP ソリューションをアンダーレイします。これを行うには、70% と SIP 慎重に円錐形の管の底に転送ピペットをプッシュ転送ピペットを入力します。先端が底に近いと、転送ピペットの内容をゆっくり。
注: これを行うにゆっくり 30/70 インターフェイスを混乱させるようにします。明確なラインを 2 つの層を分離する必要があります。 - 遠心ブレーキ 0 と室温で 25 分の 4、加速度 650 x g で、細胞を含む SIP レイヤー。
注意: ブレーキをオフにスピンを完了し、遠心ブレーキのアプリケーションは相間を妨害し、SIP 層間細胞採取を大幅に削減、停止に来てゆっくりするが重要です。 - 吸引チューブの先頭に細胞の残骸、上部から約 4 mL メディアを取り外します。次の手順で単核細胞の除去が容易になります。中間期に向かってピペット チップを下げる P1000 ピペットを使用して、慎重に。30/70 密度勾配媒体インタ フェースから単核球を分離します。新しい 15 mL の円錐管に曇りインタ フェースと転送から約 3 mL を収集します。これに続いて、9 ml の密度勾配媒体の除去を支援するために HBSS の混合物を希釈します。
- 希釈密度勾配中間期を遠心、上清を吸引、1 mL 成長媒体 (10% 胎仔ウシ血清と 1% の抗生物質で DMEM) 再懸濁します 500 x g で 5 分間で単核細胞を含みます。次に、青いトリパン ブルーと再懸濁細胞を染色し、haemocytometer を使用してセル数を実行します。
3. 磁気活性化細胞選別
注: これらの手順は、メーカーのプロトコルから変更されます。
- 磁気分離ができなくなる成長培地を削除する 4 ° C で 10 分の 300 x g で収集した単核細胞を遠心します。セル/mL の PBS (Ca+ + および Mg ++無料) で核 1 x 10 の8で再懸濁しますステップ 2.8 から得られる同じセル数を使用して、0.1 から 2.5 のボリューム範囲内 2 %fbs と 1 mM EDTA を含む mL。
- 新鮮な 5 mL (12 × 75 mm) のポリスチレンの丸底チューブに PBS で前のステップからの有核細胞のフル ・ ボリュームを追加します。追加 50 μ L CD11b PE ラベリング試薬サンプルの 1 ミリリットルあたり。光から保護されて 15 分間室温でインキュベートします。
- (PBS での CD11b に対するモノクローナル抗体の組み合わせ) の選択カクテルのサンプルの 1 ミリリットルあたりに、70 μ を追加します。光から保護されて 15 分間室温でインキュベートします。
- 5 倍以上でピペッティングを上下で磁性粒子を混ぜます。50 μ L/mL をサンプルに追加します。光から保護された 10 分間室温でインキュベートします。
注: これらの粒子抗体と 4 量体の複合体を形成し、磁気列に接続を取得します。 - セルの混合物の合計量が 2.5 mL 未満の場合 PBS (Ca+ + および Mg ++無料) でこのボリュームまでトップ 2 %fbs と 1 mM EDTA を含むと 2-3 回を軽くピペッティングで混ぜます。磁石に (蓋) なしチューブを置き、5 分間室温でインキュベートします。
- 1 つの連続的な動き、上澄みを離れて注ぐ 2-3 s 用の管を含む磁石を完全に反転します。磁石を直立の位置に戻り、磁石からチューブを取り外します。列の残りのセルを洗い流すための準備します。
注: 上清には、磁石でチューブの反転によって削除されるラベルのない、不要な細胞が含まれています。チューブを含む添付 Cd11b+細胞。 - 3.5、3.6 倍の手順を繰り返すことによって、細胞を洗浄します。サンプル 1 mL よりも大きい場合、さらに 3.5、3.6 の手順の繰り返しはお勧め。
- 必要な培地に細胞を再懸濁します。同様にコレクションの容器の側面をリンス (e.g。 15 mL チューブ) チューブの側面から細胞を収集し、利回りを最大化します。
4. ミクログリア純度の検証
注: プライマリ ミクログリア由来の 3 L (n = 合計 5 匹の動物) 蛍光活性化セル (FACS) 代表的な結果を得るのための純度を決定するための並べ替えを介して確認しました。
- FBS は一晩、フラスコあたり 10 の6セル × 1-2 の密度で播種 10% を含んでいる成長媒体で T-25 フラスコで培養細胞。
- PBS 3、T-25 フラスコのセルを洗浄、trypsinization を妨げる可能性がある残りの成長メディアを削除する 5 分 x。
- 2 mL のフラスコから細胞をデタッチするのには 0.25% トリプシンを追加します。トリプシンのボリュームがフラスコの全体の表面をカバーするのに十分なことを確認します。穏やかな旋回フラスコ トリプシンの均一なカバレッジを確保するための次の 37 ° C で 5 分間インキュベートします。
- 2 mL の 10% を含んでいる成長媒体を追加することによって trypsinization プロセスを癒やすフラスコに FBS。
- トリプシンの細胞と細胞を収集するために 4 ° C で 5 分間 500 × g で遠心分離を含む上清を収集します。
- 培とトリプシンを含む上清を除去し、500 μ L FACS バッファーでペレットを再懸濁します。トリパン ブルー色素を使用してセル数を実行します。
- 500 x g で 4 ° C で 5 分間遠心Fc 受容体ブロックを実行するには、50 μ L FACS バッファー + 5 × 106セルあたり 1 μ L FcR ブロックを追加します。4 ° C で 15 分間インキュベートします。
注: Fc 受容体ブロックは免疫細胞群の Fc 受容体に非特異的免疫グロブリンの結合を防ぐために染色の手順で重要なステップです。この封鎖は、他の抗体の下流のバインディングには影響しません。 - 500 μ L の FACS バッファーで希釈することによって、ブロック中のプロセスを終了します。この後、4 ° C で 5 分間 500 x g で細胞を含んでいる混合物を遠心分離します。
- 新鮮な 500 μ L FACS バッファーに再懸濁します。
- サンプル チューブに細胞 (例えばFACS バッファー使用 400 μ L の 500 μ L のセルを再する場合) の大半を配置します。コントロール チューブの中で残りのセルを配布し、トップ コントロール チューブあたり最大 100 μ (例えば6 制御管我慢 16.67 μ L 各コントロール チューブとトップに 83.33 μ FACS バッファー)。Unstained, 単一の染色 (CD45、CD11b)、単一のライブ/死者の汚れ、FMOs、サンプル チューブとグループ (太字で制御管) を作る。
- 4 ° C で 5 分間 500 × g で遠心分離によってすべてのチューブの細胞をペレットします。
- 管内 5 x 10 の6セルあたり 100 μ L FACS バッファーあたり 1 μ L 抗体と細胞を染色します。4 ° C で 20 分間インキュベートします。
注: は、未満 2 x 10 の6セルを使用している場合、50 μ L 抗体カクテルを使用します。 - 500 μ L の FACS のバッファーを持つセルを洗います。4 ° C で 5 分間 500 x g で細胞を遠心分離します。
- 300 μ L FACS バッファーに細胞を再懸濁します。
注: は、細胞数がより少ない 2 x 106~ 100 μ l を使用します。 - フローサイトメトリー解析を使用して、CD45低CD11b 染色陽性細胞を定量化します。この割合は、孤立したプライマリ ミクログリアに対応します。
5. 免疫組織化学的染色プライマリ ミクログリアの
- 成長培地と 1 x 10 の5セルの密度で 96 ウェル プレートで細胞をプレートし、一晩インキュベートします。
- 上澄みを除去し、3 回を PBS で洗浄します。
- 15 分削除 P1000 ピペットと PFA の PBS で 4% パラホルムアルデヒドとセルを修正し、PBS + 0.1% で 3 回洗ってトリトン X。
- 室温で 1 時間 3% ウシ血清アルブミンの無指定の結合のブロックです。
- 4 ° C で 24 時間、Iba 1 (1: 100) ウサギと孵化します。次に、一次抗体の混合物を削除し、3 回を PBS で洗浄します。
- 二次抗家兎 GFP 共役 (レバレッジ) 室温で 1 時間インキュベートします。この後、二次抗体の混合物を削除し、3 回を PBS で洗浄します。
- 蛍光灯の蛍光顕微鏡を用いた中、キャプチャ イメージをマウント スライドをマウントします。
6. ミクログリアが pHrodo の試金を使用しての定量化
注: pHrodo アッセイは、培養細胞の貪食性レベルを識別するためことができます。エンドサイトーシスによる取り込み時に、酸性の環境に内面化 bioparticle 複合体の蛍光のレベルが上がります。FACS による蛍光レベルを定量化し、ことができます。次の手順は、メーカーのプロトコルから変更されます。
- 1-2x フラスコあたり 10 の6セルの密度で播種培地に T-25 フラスコ内のセルは一晩、文化。PBS 3 時間 5 分で T-25 フラスコのセルを洗浄します。
- 2 mL 0.25% トリプシンを使用してセルをデタッチします。37 ° C で 5 分間インキュベートします。
- 2 mL の 10% を含んでいる成長媒体を追加して trypsinisation プロセスを癒やすフラスコに FBS。
- 細胞のペレットへの 4 ° C で 5 分間 500 x g で細胞懸濁液を遠心します。
- 上澄みを除去し、細胞 10 6/mL の培地で培養におけるプライマリ ミクログリアを含むペレットを再懸濁します。
注: また、プレート細胞 96 ウェル プレートの少なくとも一日前に、ウェルあたり 1 x 105生菌分析が行われるべき日に目指します。 - 1 x 10 の5細胞/ウェルの 96 ウェル プレート、100 μ L/ウェル プレート細胞。プレート コントロールと 3 通、実験的井戸となしセル コントロール背景差分のポジティブ コントロールあたり 1 つの空井戸を残します。
- いいえセル背景差分を空のまま井戸に成長媒体の 100 μ L を追加します。
注: その他の in vitroアッセイのような適切なコントロール、リードアウトの正確さのために不可欠。いいえセルと一緒にコントロール (背景) を読んで、またよくネガティブ コントロールを含める (pHrodo 共役は追加が、氷の上に配置)。 - プレートをカバーし、37 ° C で 5% CO2インキュベーターで 1 時間インキュベート
- 実験井を準備するには、覚醒剤と治療を追加します。未処理井戸に車両のコントロール (成長メディアのみ) を追加します。
注: リポ多糖 1 μ g/mL [覚醒剤] とひと羊膜上皮細胞 (hAEC)-代表的な結果を生成するエアコン メディア [処理] を使用しました。 - 共役系色素のバイアルを解凍、2 mL 吸収バッファーと簡単に渦を追加します。きれいなガラス管に管の内容を転送し、粒子が均一に分散していることを確認するため、5 分間超音波。
- マイクロ プレートの井戸から培養液を吸引し、すぐに染料懸濁液 100 μ L を置き換えます。カバーし、37 ° C 1 時間で孵化させなさい。
注意: コントロール チューブなどを染色します。 - 流れフローサイトメトリーを用いた共役 pHrodo ビーズの肯定的な細胞を定量化し、ミクログリアを積極的に phagocytosing の (親) の割合として提示します。
7. ミクログリア アポートシス炎症性の侮辱の定量化
- 1-7「ミクログリアの純度検証」セクションから手順を繰り返します。
- サンプル チューブに細胞 (例えばFACS バッファー使用 400 μ L の 500 μ L のセルを再停止される場合) の大半を配置します。コントロール チューブの中で残りのセルを配布し、コントロール チューブ (例えば6 制御管、我慢 16.67 μ L 各コントロール チューブとトップに 83.33 μ FACS バッファー) あたり最大 100 μ L をトップします。グループ (太字で制御管): 無染色、単一の汚れ (AnnexinV、Propidium ヨウ化)、シングル ライブ/デッド ステイン, FMOs、サンプル チューブ。
- 5 分 500 × g で遠心分離によってすべての管の細胞をペレットします。
- 1 μ L 抗体/100 μ L FACS バッファー/5 x 10 の6セル 4 ° C で 20 分間インキュベートします。
注: より小さい場合に 50 μ L を使用して 2 x 10 の6セル。 - 5 分 500 x g で 500 μ L FACS バッファーと遠心分離機を追加することによって、細胞を洗ってください。
- 300 μ L FACS バッファー内細胞ペレットを再懸濁します。
注: ~ 100 μ L 細胞数がより小さい 2 × 106の場合。 - 各作業領域内のセルを数値化 (Q1: 壊死、Q2: 第 3 四半期後半アポトーシス: 実行可能な第 4 四半期: 早期アポトーシス)。
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Representative Results
ここで説明した方法を使用して、ミクログリアの純粋な人口は分離できるので、体外と FACS 解析を用いた特性評価のために準備することができます。そもそも、18 動物まで使用できます選別、約 450,000 600,000 ミクログリア細胞の期待利回りあたり。最初に単離細胞の純度を確認することが重要だし、CD45 と CD11b ミクログリアの同定、2 つのマーカーの染色で FACS 解析を行ったように証明できる面倒、ミクログリアによって表現される多くのマーカーはまた表明しました。大食細胞、およびこれらの 2 つのマーカーの使用は、正確かつ信頼性の高い定量をことができます。具体的には、ミクログリア CD45、中枢神経系と末梢のマクロファージで高発現と比較しての低表現し、CD11b 陽性があります (図 1)。この特定の分離から 89.3% の純度が報告されました。CD11b の汚損の後、我々 はことを注意してください私たちの主のミクログリアが (より小さいより多くとより分岐し、はっきりと unramified (大きい球状細胞体からほとんど、あるいは全くの拡張プロセスの) 形態の範囲で類似の形態学的特徴を共有楕円形の突起と第 2 優先順序プロセスまで通常)生体内で(図 2) を参照してくださいに期待どおりにアクティブ化の状態の範囲に相関します。
次に、ミクログリアの機能および生存のための 2 つの特性アッセイを実行しました。マイクログリアは中枢神経系の主要な貪食細胞と pHrodo 分析により、この特定の機能特性の定量化。蛍光 pHrodo 粒子の定量化による測定、貪食能 hAEC 24 h 共培養培地 (図 3) を調節された後でほぼ 3 倍向上が認められました。最後に、次の炎症性の侮辱ミクログリアの生存を識別するために AnnexinV-PI 染色次共培養を行った。ミクログリア アポトーシス馴化培地 (図 4) による治療が認められた後に削減。そのエアコン hAEC メディア ミクログリアを保護し、周産期脳障害とアミロイド疾患の治療があるかもしれない彼らの貪食能を高めることが示唆されました。
図 1: CD45 とミクログリアによって CD11b の発現。各ドットはラベル付きセルをでき、FACS 解析の独立した細胞集団の解明。ミクログリア末梢単球由来マクロファージと比較して CD45 抗原発現が低い、正 CD11b。 抗体のラベルの下の数字は親の人口の割合として表されるゲートの細胞の割合を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 隔離されたプライマリ ミクログリアの形態。この図でわかるように、ミクログリアは、球形の細胞体と明確な区分された構造を保持します。スケール バー = 20 μ m。
図 3: 隔離されたプライマリ ミクログリアの貪食能の定量化します。pHrodo ラベルの粒子だけ酸性環境では、次の貪食細胞のエンドソームのようなときに蛍光を発する。ここでは、エアコン hAEC 媒体で扱われるミクログリアの pHrodo 粒子摂取量の増加が観察されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 炎症性侮辱後ミクログリアの生存の解析。(A) 代表的な FACS 分離ミクログリアのプロット。AnnexinV と propidium のヨウ化物イオンの結合された染色には、LPS 刺激後アポトーシス、壊死、または生きているセルのいずれかに分類することができます。(B) hAEC エアコン コントロールは、この型のセルの保護のフォームを示唆を基準にして中の大幅に削減ミクログリア アポトーシス。* p を意味する < 0.05、スチューデントの t 検定。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 洗浄媒体 |
| 低血糖ダルベッコ変法イーグル培地 |
| 1 %v/v ペニシリン-ストレプトマイシン |
| (脳) あたり・ ダイジェスト培地 |
| 150 μ L DNase 私 |
| 100 μ L パパイン (17U/mg 株式) |
| 3 ml 洗浄中 |
| 成長培地 |
| 低血糖ダルベッコ変法イーグル培地 |
| 10% 胎児血清 |
| 1 %v/v ペニシリン-ストレプトマイシン |
表 1: ソリューションの表。
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Discussion
ミクログリアは、環境刺激によって変更両方 pro - と抗炎症、能力を持っています。前の研究は、ミクログリアの活性化の変調は神経保護を与えることができる示されています。ニューロンに保護を提供して損傷を修復する能力は、これらの複雑な細胞の現在の理解を促進するためのより多くの研究を必要とします。したがって、高純度プライマリ ミクログリアの分離は重要かつ有用な手法です。これは非常に純粋なプライマリ ミクログリア 2 日以内の in vitro実験の準備を取得する比較的簡単な方法です。
マウスの脳からプライマリ ミクログリアの分離のための文献に記載されているプロトコルの範囲があります。主な課題は十分なサンプル、生存率と純度の高いを効率的に生成します。このプロトコルの主な利点は、培養時間を必要とせず非常に純粋なサンプルの収量です。したがって、メソッドが 2 週間から 2 日間に短縮、これは容易に高速な結果。評価の手順は、ミクログリア、これらの複雑な細胞の現在の理解を向上させる情報の堅牢な機能を得られます。プロトコルは、2 つの現在のアプローチ - 密度勾配遠心法と磁気分離を組み合わせたものです。他の分離テクニック14,15,16に比べて比較的穏やかな方法で、磁気分離ミクログリアの隔離のための文学にも検証されています。上記開発アッセイにおけるミクログリアのプロパティに変更をもとにしながら間違いなく、本来生体内でに比べて分離プライマリ ミクログリアの機能特性に変更がある、後消化基準などがこの免疫のサブセットの直接変調の反射と。
プロトコルは比較的簡単です、しながら重要なステップ中のケアはよい収穫を保障を助けます。まず、グリア細胞の成長をサポートする低血糖メディアを使用することが重要です。さらに、マウスの脳保たれなければならない氷で冷たい常時隔離中。したがって、可能であれば、楽器と同様、すべての媒体を事前寒さし、氷の上の手順を実行することをお勧めします。重要なは、長時間分離時間が貧しい細胞の健康につながるし、収量、ことがすぐに仕事に重要です。また、硬膜層の適切な除去は、成体マウス使用されるそれ以外の場合、線維芽細胞成長の面でグリア細胞を引き起こしたり、重要なステップです。脳の酵素の消化力の間にそれは重要なない細胞死を増やすことができますこのように小さすぎる部分に脳をカットする、理想的な組織の 1 mm2個セットを目指します。メディアで徹底的にリンス セル ストレーナーを介して組織を研削するとき数分ごとにすべてのセルを確認を洗浄したこし器に閉じ込め得ることは、さらに 100 μ m セル ストレーナーを使用する勧めします、小さいフィルターは、低収量。もう一つの重要なステップは、慎重にこの手順を実行する、勾配媒体層 70% の密度のアンダーレイとゆっくりと明確な界面が見られていることを確認するために不可欠ですが、パスツール ピペットの使用は推奨します。また、50 mL の円錐管を利用していた場合、細胞の分離はより少なく有能だったと、15 mL の円錐管の使用は推奨します。最後に、密度勾配遠心法は、温度は密度勾配に影響を与える部屋の温度で実行されなければなりません。
このプロトコルでは、CD45 の高発現と (末梢単球に見られる低 CD45 表現) と比較すると Cd11b の肯定的な表現で示すように、非常に純粋なプライマリ ミクログリア細胞の生産の信頼性の高い方法について説明します。セルすることができます分離比較的迅速に、これらグリア細胞の有意な増加を理解するスコープになっています。病気/けが、健康な動物から分離されたミクログリアの違いを明らかにする研究を可能にするさまざまな背景から異なるミクログリア集団を識別するために使用できます。純粋なミクログリアの人口の分離によるこの免疫細胞人口の治療変調を評価できます。例えば、hAEC エアコン メディアは affording 治療効果17、炎症性の刺激の間にミクログリア生存を改善させただけでなく貪食能を増加するが分かった。相関これはアポトーシスの残骸を減らす、従ってこれらのデブリのクリアランスがあります神経保護効果を示唆しています。
プロトコルは、新生児やアダルト マウス、しかし古いマウスは低収量を生成に適用できます。さらに、それは新生児や大人のマウスからプライマリ アストロ サイトの分離に適応させること、再び、古いマウスは、減収になります。さらに、大きい細孔径 100 μ m の細胞ストレーナーとは対照的に特注のナイロン メッシュに機械的解離ステップの変更はセル収量18をさらに改善するかもしれない。
このプロトコルの制限には、低い収量およびこのプロトコルに必要な時間が含まれます。利回りは、細胞培養の週間を通じて得ることができる数百万対六つの動物の処分につき約 150,000-200,000 セルです。さらに、しながら 2 日間内のセルから取得できます、最初の日に手順はかなり時間がかかり、約 6 時間を取ってします。
それにもかかわらず、このメソッドは、病気、隔離し、2 日以内のセルを我国の対応におけるミクログリアの役割を理解する上で非常に有用なツールです。正確で効率的な研究を促進する高純度プライマリ ミクログリア細胞が生成されます。
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Disclosures
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Gibco | 11885084 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| DNaseI grade II from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Papain from papaya latex, buffered aqeuous solution | Sigma-Aldrich | P3125-100mg | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Gibco | 14175-103 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14185052 | |
| EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit | StemCell Technologies | 18770 | EasySep magnet variant |
| EasySep magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| EasySep Buffer | StemCell Technologies | 20144 | |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline | Gibco | 14040182 | |
| Trypsin (2.5%) (10X) | Gibco | 15090-046 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™) | BD Biosciences | 553141 | |
| Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, Sterile | Corning | 352063 | |
| 175cm² Angled Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 431080 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8 | Sigma-Aldrich | L5024 | |
| 96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottom | Corning | CLS3799 | |
| Paraformaldehyde (powder, 95%) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Rabbit Anti-Iba1 | Wako | 01919741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| FACS Antibodies | Company | Catalog Number | |
| V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO | BD Biosciences | 560501 | |
| PerCP-Cy5.5 CD11b | eBiosciences | 45-0112-82 | |
| ZombieNIR | Biolegend | 423105 | |
| pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate | Thermo Fisher Scientific | P35361 | |
| Annexin.V_FITC | Miltenyi Biotech | 130-093-060 | |
| Propodium Iodide solution | Miltenyi Biotech | 130-093-233 |
References
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