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Cancer Research

चिप आधारित डिजिटल पीसीआर द्वारा ताजा जमे हुए गैस्ट्रिक कैंसर ऊतकों में एक CDH1 दुर्लभ प्रतिलिपि संस्करण का पता लगाने

Published: February 5, 2018 doi: 10.3791/57066
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 2, 1
1Biosciences Laboratory, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, 2Department of Biology and Biotechnology, University of Pavia

Summary

पांडुलिपि का वर्णन एक चिप आधारित डिजिटल पीसीआर परख एक दुर्लभ CDH1 प्रतिलिपि प्रकार (CDH1a) ताजा जमे हुए सामांय और ट्यूमर गैस्ट्रिक कैंसर के साथ रोगियों से प्राप्त ऊतकों में पता लगाने के लिए ।

Abstract

CDH1a, एक गैर CDH1 जीन के विहित प्रतिलिपि, कुछ गैस्ट्रिक कैंसर में व्यक्त किया जा पाया गया है (जीसी) सेल लाइनों, जबकि यह सामांय गैस्ट्रिक म्यूकोसा में अनुपस्थित है । हाल ही में, हम नए सिरे से जमे हुए ट्यूमर के साथ GC रोगियों से प्राप्त ऊतकों में CDH1a प्रतिलिपि संस्करण का पता लगाया । ऊतक नमूनों में इस वैरिएंट की अभिव्यक्ति की जांच चिप आधारित डिजिटल पीसीआर (dPCR) के दृष्टिकोण से यहां प्रस्तुत की गई. dPCR न्यूक्लिक एसिड की एक सटीक, मजबूत, और अत्यधिक संवेदनशील माप के लिए क्षमता प्रदान करता है और तेजी से विभिन्न क्षेत्रों में कई अनुप्रयोगों के लिए उपयोग किया जाता है । dPCR दुर्लभ लक्ष्यों का पता लगाने में सक्षम है; इसके अलावा, dPCR औजार और मानक curves के लिए की आवश्यकता के बिना न्यूक्लिक एसिड की निरपेक्ष और सटीक ठहराव के लिए संभावना प्रदान करता है । वास्तव में, प्रतिक्रिया विभाजन पृष्ठभूमि है, जो प्रवर्धन क्षमता और अवरोधकों को सहिष्णुता में सुधार से लक्ष्य को समृद्ध करता है । इस तरह की विशेषताओं का पता लगाने के लिए dPCR एक इष्टतम उपकरण बनाने के CDH1a दुर्लभ प्रतिलिपि ।

Introduction

ई-cadherin, सेल आसंजन, अस्तित्व, प्रसार, और प्रवासन के विनियमन के माध्यम से सामांय गैस्ट्रिक उपकला के रखरखाव में शामिल एक प्रमुख कारक के लिए CDH1 जीन encodings1। बचके germline या CDH1 के दैहिक परिवर्तन का एक परिणाम के रूप में ई cadherin प्रोटीन की हानि जीसी2,3के विकास के साथ जुड़ा हुआ है । गैर विहित टेप जीन के 2 intron से उत्पंन भी गैस्ट्रिक कैंसरजनन4में एक भूमिका निभाने के लिए परिकल्पना की गई है,5। विशेष रूप से, एक ऐसी प्रतिलिपि, CDH1a, GC सेल लाइनों में व्यक्त किया जा दिखाया गया है, लेकिन सामांय पेट4से अनुपस्थित है । हमने हाल ही में gc रोगियों से जीसी ऊतक के नमूनों में चिप-आधारित dPCR5का उपयोग कर CDH1a का पता लगाया. dPCR का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, पहली बार के लिए, CDH1a जीन प्रतिलिपि के आंत्र GC में और सामांय ऊतक में उपस्थिति ।

सोने मानक विधि जीन अभिव्यक्ति का निर्धारण करने के लिए वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) है । हालांकि, परिणामी डेटा कभी भी चर और खराब गुणवत्ता का हो सकता है, खासकर जब नमूना में लक्ष्य का स्तर कम है । यह परिवर्तनशीलता दूषित होने की वजह से हो सकता है, जो पोलीमरेज़ गतिविधि और प्राइमरी एनीलिंग को बाधित करते हैं, गैर-विशिष्ट प्रवर्धन और प्रतिस्पर्धी पक्ष प्रतिक्रियाओं6के लिए अग्रणी ।

हालांकि dPCR के बुनियादी जैव रासायनिक सिद्धांतों qPCR के उन लोगों के समान हैं, dPCR कुछ लाभ से पता चलता है, जीनोमिक डीएनए (gDNA)/complementary डीएनए (सीडीएनए) अणुओं की बहुत सटीक माप के लिए अनुमति देता है । दरअसल, dPCR एक अंत बिंदु प्रतिक्रिया है कि कुओं के हजारों में एक नमूने के नपे विभाजन पर निर्भर करता है, ताकि प्रत्येक अच्छी तरह से शूंय या एक एकल लक्ष्य अणु शामिल है । प्रवर्धन तो केवल लक्ष्य की एक प्रति युक्त कुओं में होता है और एक फ्लोरोसेंट संकेत द्वारा संकेत दिया है । मूल नमूने में लक्ष्य अणुओं की निरपेक्ष संख्या तो कुल द्विपद Poisson सांख्यिकी7का उपयोग कर विभाजन के लिए सकारात्मक के अनुपात का निर्धारण करके गणना की जा सकती है ।

इसके अलावा, dPCR तकनीक एक मानक वक्र चलाने के लिए की जरूरत समाप्त और, इसलिए, संबद्ध पूर्वाग्रह और परिवर्तनशीलता, लक्ष्य8,9के एक प्रत्यक्ष ठहराव के लिए अनुमति; यह अवरोधकों के लिए अपनी उच्च सहिष्णुता के कारण संदूषणों और दक्षता के स्वतंत्र रूप से और अधिक सटीक और प्रतिलिपि परिणाम पैदा करता है10; यह अधिक संवेदनशील और qPCR से विशिष्ट है, और इस प्रकार एक दुर्लभ लक्ष्य का पता लगाने के लिए एक विश्वसनीय तरीका है । अंत में, कई प्रतिक्रियाओं में नमूने के विभाजन पृष्ठभूमि अणुओं के साथ प्रतिस्पर्धा को कम कर देता है और लक्ष्य का पता लगाने की सीमा में सुधार, प्रवर्धन संभव बनाने और gDNA/सीडीएनए 6 के एकल अणुओं का पता लगाने की सुविधा . पता लगाने और चिप आधारित dPCR द्वारा न्यूक्लिक एसिड की ठहराव तेजी से संख्या में भिन्नता, डीएनए टुकड़े की ठहराव, और उत्परिवर्तन विश्लेषणों के लिए लागू किया गया है11,12,13, दिया विधि की परिशुद्धता और कम सामग्री इनपुट की आवश्यकता । इसके अलावा, dPCR हाल ही में दोनों microRNAs14 और जीन टेप5,15के विश्लेषण में एकीकृत किया गया है ।

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Protocol

प्रोटोकॉल IRST ह्यूमन रिसर्च एथिक्स कमेटी के दिशानिर्देशों का पालन करता है ।

नोट: यह प्रक्रिया विशेष रूप से मानव ताजा जमे हुए ऊतकों में सीडीएनए अणुओं की एक कम संख्या का पता लगाने के लिए बनाया गया है । ऊतक वर्गों सूखी बर्फ पर काट दिया गया है, जबकि अभी भी जमे हुए, पहले से मांय रोगी-व्युत्पंन गैस्ट्रिक ट्यूमर या सामांय ऊतक के नमूनों ।

1. आरएनए अलगाव और शुद्धि

  1. आरएनए निष्कर्षण
    नोट: आरएनए अलगाव हुड के तहत एक विशिष्ट उत्पाद का उपयोग कर ( सामग्री की तालिकादेखें) किया जाता है । हालांकि, अलगाव किट की एक किस्म व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं ।
    1. Homogenize ५०-१०० मिलीग्राम बारीकी से एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में नए सिरे से जमे हुए ऊतक नमूना काट आरएनए अलगाव रिएजेंट और भंवर की 1 मिलीलीटर के साथ 15 एस के लिए जोरदार ट्यूब-८० डिग्री सेल्सियस रात भर ।
    2. 15 एस के लिए भंवर से 5 मिनट और मिश्रण के लिए कमरे के तापमान पर नमूना युक्त ट्यूब मशीन ।
    3. बर्फ पर ट्यूब रखो, क्लोरोफॉर्म के २०० µ एल जोड़ने के लिए, और भंवर जोरदार 15 एस के लिए ।
    4. ६० एस के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूबों की मशीन और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए १२,००० x g पर केंद्रापसारक ।
    5. एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में जलीय चरण हस्तांतरण और ग्लाइकोजन के 20 µ जी जोड़ें ।
      ध्यान दें: यह महत्वपूर्ण है ध्यान से किसी भी चरण या कार्बनिक परत के स्थानांतरण से बचने के क्रम में संदूषण को कम करने के लिए ।
    6. जोड़ें ५०० µ isopropanol के एल, मिश्रण करने के लिए ट्यूब औंधा, और 10 मिनट के लिए बर्फ पर गर्मी.
    7. 4 डिग्री सेल्सियस से कम 15 मिनट के लिए १२,००० x g पर ट्यूब केंद्रापसारक आरएनए ।
      नोट: आरएनए पक्ष और ट्यूब के नीचे पर एक जेल की तरह गोली में मौजूद हो जाएगा, अक्सर केंद्रापसारक के बाद अदृश्य.
    8. हाला परेशान बिना supernatant निकालें और यह pipetting द्वारा ७५% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर के साथ धो लो ।
    9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ७,५०० x g पर ट्यूब केंद्रापसारक और गोली परेशान बिना supernatant हटा दें ।
    10. जब तक छर्रों शुष्क हो जाता है पारदर्शी और RNase-मुक्त पानी के ५० µ एल में इसे भंग ।
    11. ठहराव से पहले कम-से-८० ° c रात में नमूने फ्रीज ।
  2. जीनोमिक डीएनए उन्मूलन और आरएनए शुद्धि
    नोट: एक DNase पाचन कदम, एक कॉलम आधारित आरएनए शुद्धि द्वारा पीछा किया, कम बहुतायत लक्ष्यों के विश्लेषण के लिए सिफारिश की है ताकि दूषित डीएनए को पचाने में ।
    1. lyophilized DNase मैं (१,५०० Kunitz इकाइयों) को भंग RNase के ५५० µ l में-मुक्त एक सिरिंज का उपयोग कर पानी, शीशी पलटने से धीरे मिश्रण, और aliquots में पुनर्गठन शेयर समाधान विभाजित ।
    2. १.५ एमएल ट्यूब में स्थानांतरण 15 आरएनए के µ जी के साथ नमूना की गणना की मात्रा, किट से DNase पाचन बफर के 10 µ एल ( सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध), २.५ DNase मैं शेयर समाधान के µ एल, और RNase-10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर १०० µ एल मशीन के लिए मुफ्त पानी ।
    3. ऊतक lysis बफर के ३५० µ एल जोड़ें (किट से, सामग्री की तालिकादेखें) और pipetting द्वारा मिश्रण.
    4. जोड़ें १००% इथेनॉल और pipetting द्वारा मिश्रण के २५० µ एल ।
    5. एक नया स्पिन कॉलम में पूरे खंड (७०० µ एल) स्थानांतरण और 15 एस के लिए १२,००० x g पर केंद्रापसारक ।
    6. एक नया संग्रह ट्यूब में फ़िल्टर स्थानांतरण, स्तंभ के लिए ८०% इथेनॉल के ५०० µ एल जोड़ने और 2 मिनट के लिए १२,००० x जी में केंद्रापसारक ।
    7. स्पिन कॉलम के ढक्कन खोलें और फ़िल्टर शुष्क करने के लिए एक नया संग्रह ट्यूब के साथ 5 मिनट के लिए १२,००० x g पर केंद्रापसारक; फिर एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए फिल्टर स्थानांतरण ।
    8. RNase के 14 µ एल जोड़ें-मुक्त पानी सीधे फिल्टर कॉलम करने के लिए और 1 मिनट के लिए १२,००० x g पर केंद्रापसारक ।
    9. नमूने बर्फ पर रखें और एक बेंच-टॉप spectrophotometer पर नमूना के 2 µ एल का उपयोग कर ठहराव के लिए आगे बढ़ना या उपयोग जब तक-८० डिग्री सेल्सियस पर आरएनए की दुकान ।

2. सीडीएनए संश्लेषण

  1. प्लेस १,००० आरएनए के एनजी, मास्टर मिक्स के 4 µ एल, रिवर्स transcriptase के 1 µ एल, और RNase-एक बाँझ पीसीआर ट्यूब में 20 µ एल के एक अंतिम मात्रा करने के लिए नि: शुल्क पानी. धीरे मिश्रण और नीचे स्पिन ।
  2. एक थर्मल साइकिल चालक में प्रतिक्रिया मिश्रण की मशीन, निंनलिखित शर्तों को लागू: 5 मिनट में 25 डिग्री सेल्सियस, 30 ४२ ° c पर मिनट, 5 मिनट में ८५ डिग्री सेल्सियस ।
  3. ट्यूबों संक्षेप में और dPCR विश्लेषण या स्टोर करने के लिए आगे बढ़ना-20 ° c जब तक की जरूरत है ।

3. डिजिटल पीसीआर प्रतिक्रिया सेट अप

  1. dPCR रिएक्शन मिक्स आणि नमुना वडा
    1. गल मास्टर मिक्स और परख कमरे के तापमान पर कम से कम 20 मिनट के लिए ।
    2. पानी की 6 µ l में एनजी ३०० की एकाग्रता के लिए सीडीएनए नमूनों को पतला ।
    3. धीरे मास्टर मिश्रण भंवर और मास्टर मिश्रण के ८.७ µ एल के साथ एक बाँझ ट्यूब में मिश्रण तैयार, ०.८७ µ एल के CDH1a कस्टम डिजाइन परख प्राइमर, और १.८३ µ एल के nuclease-मुफ्त पानी की एक अंतिम मात्रा के लिए ११.४ µ एल
      नोट: CDH1a कस्टम डिजाइन परख प्राइमर विवरण के लिए सामग्री की तालिकादेखें ।
    4. हस्तांतरण ११.४ µ तैयार मिश्रण के एल पतला सीडीएनए नमूना करने के लिए, धीरे मिश्रण, और संक्षेप में केंद्रापसारक ।
      नोट: खंड pipetting से मात्रा घटाने के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए 20% अधिक शामिल हैं । सभी नमूनों के लिए मिश्रण तैयार करें और कोई टेम्पलेट नियंत्रण (एनटीसी) ।
  2. चिप तैयारी
    नोट: इष्टतम परिणामों के लिए जितनी जल्दी हो सके चिप्स लोड ।
    1. चिप लोडर में प्लग और संकेतक प्रकाश हरे रंग बदल जाता है जब तक इंतजार ।
    2. धीरे वापस खींच सवार 1-2 mm द्वारा विसर्जन द्रव सिरिंज की टोपी निकालें और यह इस कदम की सुविधा के लिए जारी है, और यह एक टिप के साथ बदलें ।
    3. एक नया चिप ले लो और ढक्कन पर लिखा कोड के नोट लेने के लिए यह नमूना के साथ संबद्ध ।
    4. ढक्कन अपनी तरफ से ध्यान से पकड़ो, दूर सुरक्षात्मक फिल्म छील, और चिपचिपा चेहरा सही अभिविंयास में ऊपर के साथ ढक्कन जगह है ।
    5. ध्यान से एक चिप लेने, देखभाल के लिए आंतरिक भाग को छूने नहीं ले, और यह सही स्थिति में चिप घोंसला नीचे लीवर दबाकर दबाना खोलने के लिए लोड ।
    6. लोडर पर एक नया लोडिंग ब्लेड लोड और यह धीरे से यह सुनिश्चित करने के लिए कि यह दृढ़ता से जगह में है धक्का ।
    7. स्थानांतरण १४.५ µ हवा बुलबुले बनाने या ब्लेड से ध्यान हटाने के बिना लोड हो रहा है ब्लेड पर dPCR प्रतिक्रिया मिश्रण के एल, जिसके बाद काले लोड हो रहा है बटन दबाएँ करने के लिए चिप पर मात्रा वितरित.
    8. चिप सतह पर टिप के साथ सतह को छूने के लिए नहीं की देखभाल के बारे में 20 बूंदें हस्तांतरण करने के लिए विसर्जन द्रव सिरिंज का प्रयोग करें ।
      नोट: यह किनारों पर द्रव फैल बिना पूरी सतह को कवर करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
    9. ढक्कन चिप के साथ संपर्क में आते हैं और 15 एस के लिए नीचे प्रेस करने के लिए लोडर बांह घुमाएँ ।
    10. चिप रिलीज और अपनी स्थिति के लिए हाथ वापस करने के लिए ढक्कन बटन दबाएँ ।
    11. एक ४५ ° कोण पर इकट्ठे चिप पकड़ो और ध्यान से भरें बंदरगाह के माध्यम से सिरिंज के साथ विसर्जन द्रव वितरण, चिप थोड़ा घुमाने के लिए सुनिश्चित करें कि वहां कोई हवा बुलबुले हैं, और एक बाँझ पोंछ के साथ किसी भी अतिरिक्त तरल पदार्थ को हटा दें ।
    12. धीरे चिप ढक्कन के शीर्ष पर दूर लेबल छीलने और भरने के लिए बंदरगाह पर प्रेस से कम 5 के लिए एस के मामले सील ।
    13. जब तक थर्मल साइकिल चालक में लोड करने के लिए तैयार अंधेरे में चिप की दुकान ।
      नोट: तैयार चिप्स 2 एच के भीतर इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
  3. dPCR प्रतिक्रिया
    1. ढक्कन खोलें और दोनों ब्लॉकों के लिए एडाप्टर स्थापित करें, जब भी एक ही खंड का उपयोग किया जाता है ।
    2. सही स्थिति में नमूना ब्लॉक पर चिप्स रखें ।
      नोट: भरें बंदरगाह किसी भी हवा बुलबुले चिप की खिड़की परेशान बिना शीर्ष करने के लिए नाव करने के लिए अनुमति देने के लिए एक ऊंचा स्थिति में थर्मल साइकिल चालक के सामने की ओर उंमुख होना चाहिए । दो ब्लॉकों संतुलन के लिए खाली चिप्स का प्रयोग करें ।
    3. पूरी तरह से चिप्स को कवर करने के लिए नमूना ब्लॉक पर थर्मल पैड करना ।
    4. ढक्कन बंद करें और पीसीआर चलाने शुरू, निंनलिखित शर्तों को लागू: 10 मिनट के लिए ९६ ° c पर पकड़ो; 30 s के लिए 2 मिनट और ९८ ° c के लिए ६० ° c के ४५ चक्र; 2 मिनट के लिए ६० ° c पर पकड़ो; 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो । थर्मल साइकिल चालक को बंद करें और चिप्स को कमरे के तापमान पर न्यूनतम 10 मिनट के लिए पिघला दें ।
      नोट: चिप विश्लेषण एक घंटे के भीतर किया जाना चाहिए ।
  4. चिप विश्लेषण
    1. उपकरण के ढक्कन खोलें और थर्मल पैड को हटाने, तो एडाप्टर से चिप्स हटा दें ।
      नोट: विश्लेषण तक एक अंधेरे, साफ स्थान में चिप्स स्टोर.
    2. isopropanol और एक बाँझ पोंछ के साथ चिप सतह को साफ करें ।
      नोट: लीक या संभावित समस्याओं के लिए प्रत्येक चिप का निरीक्षण ।
    3. डेटा को सहेजने के लिए डिटेक्टर सिस्टम में यूएसबी डालें ।
    4. डिटेक्टर सिस्टम की चिप ट्रे खोलें, चिप फेस-अप को सही स्थिति में लोड करें और फिर ट्रे को बंद करें ।
    5. प्रसंस्करण के लिए 30 एस रुको, तो चिप को हटा दें और अगले एक डालें ।
    6. विश्लेषण के लिए रुको सभी संसाधित चिप्स के लिए पूरा हो तो एक कंप्यूटर में USB डालने के लिए फ़ाइलों को हस्तांतरण ।
      नोट: विश्लेषण के लिए कुल समय लगभग 2 से 3 मिनट/

4. डेटा विश्लेषण और व्याख्या

  1. सभी अनुप्रवाह विश्लेषणों को पूरा करने के लिए आवश्यक क्लाउड-आधारित सॉफ़्टवेयर प्लेटफ़ॉर्म से कनेक्ट करें ।
  2. एक परियोजना बनाएं और ब्याज की चिप्स के सभी डेटा फ़ाइलों को आयात करें ।
  3. नमूना नाम दर्ज करें; चुनें डाई और "चिप्स को परिभाषित" टैब में इस्तेमाल किया परख ।
  4. निर्धारित करें कि चिप यह "समीक्षा डेटा" टैब में visualizing द्वारा स्वीकार्य है, जांच कैसे अच्छी तरह से नमूना चिप पर लोड किया गया था और कितने डेटा बिंदुओं evaluable हैं ।
    नोट: १३,००० से कम evaluable डेटा बिंदुओं के साथ चिप्स अस्वीकार करें ।
  5. स्क्रीन के दाईं ओर पर चयनित चिप के तितर बितर भूखंड पर ले जाएं; सभी चिप्स के लिए fluorescein amidite (FAM) रिपोर्टर डाई संकेतों (Y-अक्ष) के लिए ६,००० की दहलीज पर लागू करें ।
    नोट: सेट की गई थ्रेशोल्ड का उपयोग परख के आधार पर भिंन हो सकता है ।
  6. कमंद उपकरण का उपयोग कर तितर बितर भूखंड पर रिश्तेदार की जगह का चयन करके झूठी सकारात्मक परिणाम को रोकने के लिए किसी भी संदिग्ध सकारात्मक संकेतों को निकालें और "अनिर्धारित" पर दबाकर । सभी शेष सकारात्मक स्थानों का संकेत दुर्लभ लक्ष्य की सीडीएनए प्रतियां की उपस्थिति का विश्लेषण किया ।

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Representative Results

यहां प्रस्तुत प्रक्रिया का प्रयोग, हम गैस्ट्रिक ताजा-जमे हुए ऊतकों में दुर्लभ प्रतिलिपि संस्करण CDH1a की अभिव्यक्ति के लिए जांच की । dPCR द्वारा विश्लेषण 21 पर प्रदर्शन किया था-सामांय और कैंसर के ऊतकों के नमूनों और 11 अतिरिक्त ट्यूमर के नमूनों में बनती । CDH1a ३२ में से 15 में detectable था (४७%) ट्यूमर, जबकि कोई सामांय ऊतक नमूने इस दुर्लभ प्रतिलिपि की उपस्थिति5दिखाया । हमारे विश्लेषण में, चिप्स से कम १३,००० डेटा अंक के साथ अस्वीकार कर दिया गया था, के रूप में गैर के साथ चिप्स सजातीय लोड हो रहा है । चित्रा 1 दोनों evaluable (चित्र 1a) और गैर evaluable (चित्रा 1b, सी) नमूने के लिए एक चिप देखने से पता चलता है । बाद के मामले में, चिप एकाधिक बुलबुले की उपस्थिति के कारण छोड़ दिया जाना चाहिए (आंकड़ा 1b), एक एकल बड़ा बुलबुला (चित्रा 1C), या दहलीज (आंकड़ा 1b) के ऊपर डेटा बिंदुओं की एक अपर्याप्त संख्या का एक परिणाम के रूप में । इन नमूनों को फिर से व्याख्यात्मक परिणाम प्राप्त करने के लिए चलाया जाना चाहिए । सॉफ्टवेयर (चित्रा 2) द्वारा प्रदान की कैटरिंग प्लॉट के संबंध में, यह आम तौर पर विक (निर्माता के मालिकाना) रिपोर्टर डाई (एक्स-एक्सिस) से संकेतों के खिलाफ FAM रिपोर्टर डाई (वाई-अक्ष) से संकेतों को दर्शाया गया है । तितर बितर भूखंड पर प्रस्तुत डेटा अंक रंग कोडित रहे हैं, और यहां, हम केवल FAM रिपोर्टर डाई संकेतों में नीले (चित्र 2a), जिस कुएं में लक्ष्य को परिलक्षित किया गया संकेत । इन संकेतों को Y-अक्ष के करीब स्थित हैं और साजिश के मूल से आगे । प्लॉट पर देखा गया दूसरा रंग पीला है और उस कुएँ का संकेत है जिसमें कोई प्रवर्धन नहीं हुआ. सकारात्मक संकेतों के लिए एक विश्वसनीय दहलीज सेट और कॉल पूर्वाग्रह को रोकने के लिए सभी चिप्स के लिए लागू किया गया था । यहां, इन प्रयोगों में विभिंन चिप्स के लिए मनाया संकेतों की सीमा के आधार पर चयनित दहलीज ६,००० था । CDH1a सीडीएनए प्रतियां (नीले संकेतों) ट्यूमर के नमूनों की एक संख्या में पाए गए, नकारात्मक संकेतों (चित्रा 2a) से आयाम में एक स्पष्ट अंतर दिखा । इसके विपरीत, चयनित दहलीज के ऊपर कोई संकेत CDH1a प्रतिलिपि के लिए नकारात्मक नमूनों में पाया गया, यानी, सभी सामान्य ऊतक के नमूनों और कुछ ट्यूमर के नमूने (चित्रा बीसी). इसी प्रकार एनटीसी में कोई सकारात्मक संकेत नहीं पाए गए जिनमें सीडीएनए के स्थान पर पानी जोड़ा गया था, अतएव dPCR प्रतिक्रिया (चित्र 2c) के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवारत.

एक ठीक चिप विश्लेषण के लिए कम गुणवत्ता वाले डेटा अंक फिल्टर और अस्पष्ट परिणामों के जोखिम को खत्म करने के लिए लागू किया जाना चाहिए । इस चिप को देखने के लिए इसी सकारात्मक संकेत के सटीक स्थान का निर्धारण करने के द्वारा किया गया था: नीले संकेत चिप (आंकड़ा 3ए) या बुलबुले के आसपास की बहुत सीमाओं पर स्थित है (आंकड़ा 1b), संकेत विश्लेषण से खारिज कर दिया है . आगे झूठी सकारात्मक के जोखिम को रोकने के लिए, FAM चैनल के लिए ६,००० से ऊपर का संकेत है और भूखंड के दूर सही पर शायद aspecific के रूप में माना जाता है और इस प्रकार बाहर फ़िल्टर्ड थे, भले ही वे अच्छी तरह से चिप के भीतर स्थानीयकृत थे (चित्र बी) । इस तरह, एक नमूना दुर्लभ प्रतिलिपि की अभिव्यक्ति के लिए सकारात्मक माना जाता है, CDH1a, भले ही यह एक प्रवर्धन संकेत से पता चलता है, जब तक कि संकेत aforementioned शर्तों के अनुरूप है ।

Figure 1
चित्र 1 . प्रतिनिधि evaluable और गैर evaluable चिप्स । नीले डॉट्स कुओं जिसमें CDH1a प्रतिलिपि परिलक्षित किया गया है; पीले बिंदु कुएँ हैं जिनमें कोई प्रवर्धन नहीं हुआ; सफेद डॉट्स खाली कुओं हैं । सीमा से ऊपर डेटा अंक प्रत्येक चिप के नीचे संकेत कर रहे हैं । (क) नीले संकेतों के साथ एक evaluable चिप चिप की सीमाओं के भीतर अच्छी तरह से स्थानीयकृत । (B) थ्रेशोल्ड से कम १३,००० डेटा बिंदुओं वाला एक नॉन-evaluable चिप । (ग) एक नॉन-evaluable चिप को बड़े बबल के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . प्रतिनिधि डिजिटल पीसीआर कैटरिंग के भूखंड CDH1a व्यंजक। कथानक विक रिपोर्टर डाई (X-अक्ष) से संकेतों के विरुद्ध FAM रिपोर्टर डाई (वाई-अक्ष) से संकेतों को चित्रित करते हैं. नीले डॉट्स CDH1a सकारात्मक अभिव्यक्ति संकेत हैं, जबकि पीले डॉट्स "कोई प्रवर्धन" संकेत कर रहे हैं । (क) CDH1a-सकारात्मक नमूना. (ख) CDH1a-नकारात्मक नमूना । (ग) शूंय CDH1a अभिव्यक्ति दिखा रहा है कोई टेंपलेट नियंत्रण (एनटीसी) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 . डिजिटल पीसीआर तितर बितर भूखंडों के प्रतिनिधि ठीक-चिप विश्लेषण। बाईं ओर ब्याज के संकेतों के साथ चिप देखने में ज़ूम-एक काला वर्ग में है, जबकि सही पर इसी तितर बितर साजिश है । (क) एक नीले रंग की साजिश के सही अंश पर स्थानीय संकेत है, लेकिन चिप की सीमा पर । (ख) तीन नीले रंग की साजिश के अधिकार पर दूर ग्रे स्थानीयकृत में प्रकाश डाला लेकिन चिप के भीतर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

dPCR मूल रूप से डीएनए के लिए विकसित किया गया था आणविक माप10,11,12,13 और समय में इस प्रौद्योगिकी microRNAs और आरएनए के ठहराव के लिए अनुकूलित किया गया था5, 14,15. इस प्रोटोकॉल में हम नए जमे हुए ऊतक नमूनों से व्युत्पंन दुर्लभ टेप का पता लगाने में शामिल करने के लिए आवेदनों की सूची बढ़ा दिया है । उस प्रयोजन के लिए हम सीडीएनए (३०० एनजी) की एक जगह उच्च राशि का उपयोग किया । हालांकि यह राशि dPCR में इस्तेमाल किया जा सकता है कि अधिकतम नहीं है, यह हमारे सभी नमूनों की तुलना करने के लिए मानकीकृत शर्तों की स्थापना के लिए पर्याप्त था. ६,००० पर florescence संकेत दहलीज की स्थापना और दोनों चिप और तितर बितर भूखंड पर सकारात्मक प्रवर्धन संकेतों के स्थानों को ध्यान में रखकर, हम सफलतापूर्वक गैस्ट्रिक ट्यूमर ऊतक के नमूनों में इस दुर्लभ लक्ष्य का पता लगाया.

dPCR द्वारा, हम बिल्कुल नहीं सकता है CDH1a, लक्ष्य की एक बहुत कम राशि के कारण, लेकिन हम मज़बूती से उपस्थिति का आकलन कर सकता/ दरअसल, इस तकनीक के मात्रात्मक प्रकृति विश्लेषण नमूनों में मौजूद लक्ष्य की प्रारंभिक संख्या के द्वारा सीमित है7. प्रासंगिकता की, तकनीक खुद को काफी महंगा है और गहन समय रहता है । इस प्रकार, जब कई नमूनों के विश्लेषण और/या अनेक लक्ष्यों की आवश्यकता है, वैकल्पिक तकनीक7,8विचार किया जाना चाहिए ।

यह कहा जा रहा है, dPCR निस्संदेह संवेदनशील माप और न्यूक्लिक एसिड के ठहराव के लिए अंतिम मंच प्रदान करता है, के रूप में यह परिशुद्धता और reproducibility के संबंध में सुधार के साथ qPCR7,8। इसके अलावा, यह केवल कम प्रचुर मात्रा में न्यूक्लिक एसिड की जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए उपलब्ध विधि के रूप में माना जा सकता है कि qPCR संवेदनशीलता6की सीमा के पास ।

यहां प्रोटोकॉल वर्णित किसी भी ऊतकों से RNAs के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, दुर्लभ लक्ष्य का पता लगाने को सक्षम करने, हमारे अध्ययन के रूप में । इसके अलावा, परख टेप के निरपेक्ष ठहराव पर बढ़ाया जा सकता है । ऐसे मामलों में, एक दिए गए नमूने के लिए यंत्र द्वारा रिपोर्ट की प्रतियां/µ एल की संख्या बस लोड प्रतिक्रिया मात्रा से गुणा किया जाना चाहिए और सीडीएनए की प्रारंभिक राशि से विभाजित । रिवर्स-प्रतिलेखन द्वारा उत्पादित परिवर्तनशीलता पर काबू पाने के लिए, जीन विशिष्ट औजार, जब संभव हो शामिल किया जाना चाहिए6. भविष्य के लिए खोज, dPCR न केवल दुर्लभ अनुक्रम का पता लगाने के लिए सोने के मानक मंच बनने में काफी क्षमता रखती है, लेकिन यह भी दुर्लभ उत्परिवर्तन का पता लगाने और सटीक प्रतिलिपि संख्या ठहराव7. यह आनुवंशिक मोज़ेक में विशेष रूप से प्रासंगिक है, साथ ही कैंसर अनुसंधान में जहां ट्यूमर विविधता एक रोगी के नैदानिक परिणाम और उपचार के लिए प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं ।

देखने के व्यावहारिक बिंदु से, जब dPCR प्रोटोकॉल की स्थापना वहां कई महत्वपूर्ण कदम है कि प्रकाश डाला जाना चाहिए रहे हैं । सबसे पहले, प्रतिक्रिया मिश्रण लक्ष्य अभिव्यक्ति स्तर की उंमीद के आधार पर सीडीएनए की उचित मात्रा में युक्त, लोड हो रहा है ब्लेड में बहुत ध्यान के साथ हस्तांतरित किया जाना चाहिए ताकि हवा बुलबुले, जो नमूना एकरूपता के साथ हस्तक्षेप कर सकता है नहीं बना । इसके अलावा, ब्लेड ही पहले उचित रूप से तैनात किया जाना चाहिए; अंयथा यह एक असमान नमूना वितरण में परिणाम सकता है । इसके अलावा, विसर्जन द्रव और ढक्कन के सटीक सील के साथ पर्याप्त कोटिंग हमेशा प्रदर्शन किया जाना चाहिए । चिप प्रसंस्करण और विश्लेषण के बारे में, यह चिप पर संघनित्र जमते की संभावना के बारे में पता होना जरूरी है; ऐसे परिदृश्य में, चिप isopropanol के साथ फिर से पोंछा और फिर से विश्लेषण किया जाना चाहिए । इसके अलावा, के रूप में dPCR Poisson आंकड़ों पर आधारित है, evaluable डेटा अंक (> 10, 000) की एक ंयूनतम संख्या चिप पर मौजूद होना चाहिए, अंयथा नमूना फिर से चलाया जाना चाहिए । अंत में, कम लक्ष्य की नकल का पता लगाने के प्रयोगों के लिए, एक महत्वपूर्ण विस्थापित कारक संकेत करने वाली शोर अनुपात हो सकता है, लेकिन एक विश्वसनीय दहलीज स्थिति वास्तविक सकारात्मक संकेतों की पहचान करने में मदद कर सकते हैं.

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Disclosures

लेखक इस कार्य के लिए रुचि का कोई विरोध रिपोर्ट नहीं करते हैं ।

Acknowledgments

लेखकों को संपादकीय सहायता के लिए Gráinne Tierney शुक्रिया अदा करना चाहता हूं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
TRIazol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596018
Glycogen 20 mg/ml ROCHE 10901393001
RNeasy MinElute Cleanup kit QIAGEN 74204
iScript cDNA Synthesis kit BioRad 1708891
QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix v2 Thermo Fisher Scientific A26358
CDH1a IDT custom designed assay Integrated DNA Technologies (IDT) NA F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG
(R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG
(P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/
[dPCR optimized assay concentrations: 900 nM (F),        900 nM (R), 250 nM (P)]
QuantStudio 3D Digital PCR 20K Chip Kit v2 Thermo Fisher Scientific A26316
Heraeus Biofuge Fresco Thermo  Scientific 75002402
Thermocycler (Labcycler) Sensoquest 011-103
GeneAmp PCR System 9700 Thermo Fisher Scientific N805-0200
Dual Flat Block Sample Module Thermo Fisher Scientific 4425757
QuantStudio 3D Tilt Base for Dual Flat Block GeneAmp PCR System 9700 Thermo Fisher Scientific 4486414
QuantStudio 3D Digital PCR Chip Adapter Kit for Flat Block Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific 4485513
QuantStudio 3D Digital PCR Chip Loader Thermo Fisher Scientific 4482592
QuantStudio 3D Digital PCR Instrument with power cord Thermo Fisher Scientific 4489084

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक १३२ CDH1a dPCR दुर्लभ प्रतिलिपि संस्करण गैस्ट्रिक कैंसर ताजा जमे हुए ऊतकों ट्यूमर ऊतक सामांय ऊतक
चिप आधारित डिजिटल पीसीआर द्वारा ताजा जमे हुए गैस्ट्रिक कैंसर ऊतकों में एक <em>CDH1</em> दुर्लभ प्रतिलिपि संस्करण का पता लगाने
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Molinari, C., Abou Khouzam, R.,… More

Molinari, C., Abou Khouzam, R., Salvi, S., Rossi, T., Ranzani, G. N., Calistri, D. Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR. J. Vis. Exp. (132), e57066, doi:10.3791/57066 (2018).

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