Summary
原稿では、新鮮凍結ノーマルに珍しいCDH1転写バリエーション (CDH1a) および胃癌患者から得られた腫瘍組織を検出するチップを使ったデジタル PCR 法について説明します。
Abstract
それは存在しないに対しいくつかの胃癌 (GC) セルの行で表されるに発見されましたCDH1a、 CDH1遺伝子の非正規コピー正常な胃粘膜に。最近では、GC 患者から得られた新鮮凍結腫瘍組織のCDH1a転写バリアントを検出しました。デジタル PCR (dPCR) のチップを使ったアプローチがここに提示してこの変形組織サンプルでの発現を調べた。dPCR は核酸の正確、堅牢で、高感度測定の可能性を提供しています、さまざまな分野で多くのアプリケーションの活用がますます。dPCR は珍しいターゲットを検出さらに、dPCR は、校正器、標準曲線を必要とせず核酸の絶対かつ正確な定量化のための可能性を提供しています。実際には、パーティション分割反応阻害剤耐性と増幅効率を向上させる背景からターゲットを富ませます。このような特徴は、dPCR CDH1aまれなトラン スクリプトの検出のための最適なツールを作る。
Introduction
CDH1遺伝子は、E-カドヘリン、細胞接着、生存、増殖、および移行1の規制による正常胃上皮の維持に関与する重要な要因のエンコードします。有害な生殖の結果として E-カドヘリン蛋白質の損失またはCDH1の身体の変化は、GC2,3の開発に関連付けられています。2 遺伝子のイントロンから生じる非正規議事録では、胃癌4、5の役割を果たすこともという仮説を立てた。特に、このようなコピーは、 CDH1a、GC セルラインで表現が示されているにはない通常胃4から。最近 GC 組織サンプル チップ ベースの dPCR5を使用して GC 患者からCDH1aを検出しました。 dPCR は、初めて、 CDH1a遺伝子転写腸 GC と正常組織でのプレゼンスの評価に使用されました。
遺伝子の発現を決定する金本位法は、リアルタイム定量 PCR (qPCR) です。ただし、結果のデータは、変数をすることができます時々、質の悪い、特に、サンプルでターゲットのレベルが低い。この変動は、ポリメラーゼ活性およびプライマーアニー リングを阻害する非特異的増幅と競争力のある側の反応6につながる、汚染物質によって引き起こされることができます。
DPCR の基本的な生化学的原則が qPCR のそれらに類似している dPCR がゲノム DNA (gDNA) の非常に精密な測定を可能にするいくつかの利点を示しています/相補的 dna (cDNA)。確かに、dPCR は、それぞれはよくゼロまたは単一のターゲット分子を含む何千もの井戸にサンプルの校正分割に依存するエンドポイント反応です。増幅はターゲットのコピーを含んでいる井戸でのみ発生し、蛍光信号によって示されます。元のサンプルのターゲット分子の絶対数は、二項分布のポアソン統計7を使用して合計パーティションに正の比を決定することによって計算できます。
また、dPCR 技術標準曲線を実行する必要があると、それゆえ、関連付けられたバイアスと変動、ターゲット8,9; の直接定量を可能にします。汚染物質とその耐力阻害剤10; による効率とは関係なくより正確で再現性のある結果を出すそれより敏感な qPCR より特定と珍しいターゲットを検出するための信頼性の高い方法は。最後に、背景の分子が付いている競争を減らす複数の反応に、試料の分割と増幅を可能と gDNA/cDNA6 の単一の分子の検出を促進するターゲット検出限界を向上させる.検出とチップを使った dPCR による核酸の定量化はますますコピー数多型に適用されている、DNA の定量化の断片、および突然変異分析11,12,13、与えられた、精度と低材料は入力メソッドの要件です。さらに、dPCR は最近両方マイクロ Rna 遺伝子と14成績証明書5,15の解析に統合されています。
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Protocol
プロトコルは、IRST 人間研究倫理委員会のガイドラインに従います。
注: この手順はひと新鮮凍結組織 cDNA 分子の数が少ないを検出するため設計します。以前に検証済みの患者由来の胃腫瘍や正常組織サンプルから、まだ凍結中、ドライアイス、ティッシュ セクションをカットされています。
1. RNA の分離及び精製
-
RNA の抽出
メモ: RNA の隔離は特定の製品を使用してフードの下で実行されます (材料の表を参照してください)。しかし、様々 な絶縁キット市販されています。- 均質化 RNA 分離試薬と渦の 1 mL と 1.5 mL チューブに細かく切られた新鮮凍結組織サンプルの 50 〜 100 mg 精力的に 15 s. 加温の-80 ° c 管一晩。
- 15 ボルテックスによって管内常温 5 分のミックス サンプルをインキュベート s。
- 氷の上の管を保つ、クロロホルム、および 15 は積極的に渦を 200 μ l 添加 s。
- 室温 60 s 管、4 ° C で 15 分間、12,000 × g で遠心分離を孵化させなさい
- 1.5 mL チューブの水相を転送し、グリコーゲンの 20 μ g を追加します。
注意: 慎重に汚染を減らすために中間期または有機層の転送を避けるために重要です。 - 500 μ L のイソプロパノール、ミックス、氷上で 10 分間インキュベートしてチューブを反転を追加します。
- RNA の沈殿物に 4 ° C で 15 分間 12,000 × g でチューブを遠心します。
注: RNA 側と遠心分離後はよく見えない、管の下部にゲル状のペレットになります。 - 沈殿物を乱すことがなく上澄みを除去し、ピペッティングで 75% エタノール 1 mL で洗います。
- 4 ° C で 5 分間 7,500 x g でチューブを遠心し、ペレットを乱すことがなく、上清を除去します。
- 沈殿物は透明になるまで乾燥し、RNase フリー水の 50 μ L に溶解、ペレットをしましょう。
- -80 ° c 少なくとも一晩定量化する前にサンプルを凍結します。
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ゲノム DNA と RNA の浄化
注: 列に基づく RNA 精製に続いて DNase 消化手順を汚染 DNA を消化するために低豊富なターゲットの分析にお勧め。- 凍結乾燥の DNase 私 (1,500 Kunitz 台) RNase フリー 550 μ L では水を注射すると、静か、バイアルを反転でミックスを使用して、再構成された原液を因数に分割を溶解します。
- 1.5 mL チューブでの転送の RNA の 15 μ g のサンプルの計算された容積、DNase 消化の 10 μ L はマイク在庫ソリューション キット (に記載されている材料の表)、DNase の 2.5 μ L からバッファー、100 μ L に水 RNase フリー室温で 10 分間加温。
- 組織換散バッファーの 350 μ L を追加 (キットの材料表を参照してください)、ピペッティングで混ぜます。
- ピペッティングで 250 μ L の 100% エタノールとミックスを追加します。
- 新しいスピン列および 15、12,000 × g で遠心分離にボリューム全体 (700 μ L) を転送 s。
- 新しいコレクションの管にフィルターを転送、列、12,000 × g で遠心する 2 分 80% エタノール 500 μ L を追加します。
- フィルターを乾燥する新しいコレクション チューブとスピン列、12,000 × g で 5 分間遠心するのふたを開けるフィルターを 1.5 mL チューブに転送します。
- [フィルター] 列、12,000 × g で 1 分間遠心に直接 RNase フリー水の 14 μ L を追加します。
- 氷のサンプルを保つとベンチトップ分光光度計で 2 μ L のサンプルを使用して定量化に進むか、使用するまで-80 ° C で RNA を保存します。
2. cDNA 合成
- RNA、マスター ミックスの 4 μ、1 μ L の逆転写酵素と RNase フリー水滅菌 PCR チューブで 20 μ L の最終巻の場所 1,000 ng。穏やかに混合し、スピンダウンします。
- サーマルサイクラー、次の条件を適用することで反応混合物を孵化させなさい: 25 ° C、42 ° C、85 ° C で 5 分で 30 分で 5 分
- 簡単にチューブを遠心、dPCR 解析に進むか、必要になるまでの-20 ° C で保存します。
3. デジタル PCR の反作用のセットアップ
-
dPCR 反応ミックス及び試料調製方法
- マスター ミックスと、少なくとも 20 分間室温でアッセイを解凍します。
- 300 の濃度に cDNA サンプルを希釈水の 6 μ L で ng。
- 優しく渦マスターはミックスし、11.4 μ L の最終巻のマスター ミックスの 8.7 μ L、 CDH1aカスタム設計されたアッセイ プライマー 0.87 μ ヌクレアーゼ フリー水の 1.83 μ L と生殖不能の管にミックスを準備します。
注: CDH1aカスタム設計された分析入門詳細は、材料表を参照してください。 - 希薄化後の cDNA サンプル準備ミックス 11.4 μ に転送、優しく、ミックス、簡潔に遠心分離機します。
注: ボリュームは、ピペッティングからボリュームの損失を補うため 20% 過剰を含まれます。すべてのサンプルとないのテンプレートのコントロール (NTC) のミックスを準備します。
-
チップの準備
注: 最適な結果を得るのためにチップをできるだけ早くロードします。- チップ ローダーをプラグインし、インジケータ ランプが緑色に点灯するまで待ちます。
- プランジャーを軽く引いて浸漬液シリンジのキャップを削除 1-2 mm とこの手順を容易にするため、チップと交換にそれを解放します。
- 新しいチップを取るし、サンプルに関連付ける蓋に書かれたコードのメモを取る。
- その側で慎重に蓋を保持、保護フィルムをはがすし、を正しい向きで粘着性がある顔をしてふたを配置します。
- 慎重に内部の部品に触れるように注意して、チップをピックアップし、クランプを開くにはレバーを押すことによって正しい位置にチップ巣積載します。
- ローダーに新しい読み込みブレードを読み込み、優しくしっかりと場所にあることを確認するそれをプッシュします。
- 空気の泡をせずに読み込みブレード dPCR 反作用の組合せの 14.5 μ L を転送またはチップ上のボリュームを配布するボタンの読み込み黒どのプレス後、ブレードを偏向します。
- 浸漬液の注射器を使用すると、先端の表面に触れないように世話チップ表面に約 20 滴を転送します。
注: エッジ上液をこぼさず全体の表面をカバーするために重要です。 - チップと接触し、15 の押しふたをするローダーのアームを回転させる s。
- チップをリリースし、その位置に腕を返すふたのボタンを押します。
- 45 ° の角度で組み立てられたチップを保持して慎重に充填ポートを通して注射器と浸漬液を分注、気泡がないかどうかを確認する少しのチップを回転させるし、滅菌ワイプで任意の余分な水分を削除します。
- 少なくとも 5 充填ポート上アウェイ チップふた押しの上にラベルが優しく剥離でチップの場合はシール s。
- 熱 cycler でロードする準備ができるまで、暗闇の中でチップを格納します。
注: 準備のチップは、2 時間以内使用する必要があります。
-
dPCR 反応
- 蓋を開き、1 つのブロックを使用した場合でも、両方のブロックにアダプターをインストールします。
- サンプル ブロックを正しい位置にチップを置きます。
注: 入力ポートはチップのウィンドウを乱すことがなく上部に浮動する空気の泡を許可する高い位置でサーマルサイクラーの前面に向かって指向になりません。空のチップを使用して、2 つのブロックをバランスします。 - チップを完全にカバーするサンプル ブロックにサーマル パッドを置きます。
- ふたを閉じるし、次の条件を適用する実行、PCR を開始: 10 分; 96 ° c を保持60 ° C 2 分の 98 ° C の 30 のサイクル 45 s;2 分の 60 ° C に保持します。4 ° C で保持します。熱 cycler の電源を切り、少なくとも 10 分間室温でチップを解凍します。
注: 1 時間以内チップ解析を実行する必要があります。
-
チップ解析
- 計測器のふたを開けてとサーマル パッドを削除し、アダプターからチップを削除します。
注: は、分析まで暗い、きれいな場所でチップを保存します。 - イソプロパノールと滅菌ワイプ チップ表面をきれいにします。
注: 各チップがリークまたは潜在的な問題を調べます。 - データを保存する検出器システムに USB を挿入します。
- 検出器システムのチップ トレイを開きロードの正しい位置にチップ フェイス アップ トレイを閉じてください。
- 30 を待つ処理 s チップを削除し、次のいずれかを挿入します。
- 分析処理のすべてのチップを完了し、ファイルを転送するコンピューターに USB を挿入するを待ちます。
注: 分析の所要時間は約 3 分/チップに 2 です。
- 計測器のふたを開けてとサーマル パッドを削除し、アダプターからチップを削除します。
4. データの解析と解釈
- すべての下流解析の実施に必要なクラウド ベースのソフトウェア プラットフォームに接続します。
- プロジェクトを作成し、目的のチップのすべてのデータ ファイルをインポートします。
- サンプル名を入力してください。染料と「チップの定義」タブで使用される測定を選択します。
- 「レビュー データ」タブで、チェック方法徹底的サンプル チップに読み込まれ、どのように多くのデータ ポイントが評価可能な可視化チップが許容できるかどうかを決定します。
注: は、評価可能なデータ ポイントを未満 13,000 チップを拒否します。 - 画面の右側にある選択されたチップの散布に移動します。すべてのチップにフルオレセイン amidite (FAM) レポーター色素信号 (y 軸) のための 6,000 のしきい値を適用します。
注: を設定するしきい値は使用法に基づいて異なる場合があります。 - 散布の相対的な場所を選択することにより偽陽性の結果を防ぐために怪しげな肯定的な信号をプロット「未定義」でを押すとなげなわツールを使用して削除います。残りのすべての肯定的なスポットは、まれなターゲット分析の cDNA コピーの存在を示します。
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Representative Results
ここに示す手順を使用して、我々 は胃新鮮凍結組織でまれな転写バリアントCDH1aの式のチェック。DPCR による解析を行った 21 ペア正常と癌組織サンプルその 11 追加腫瘍サンプル。CDH1aは、正常組織サンプルは、このまれなトラン スクリプト5の存在を示さなかったに対し 15 のうち 32 (47%) の腫瘍の検出でした。非均一荷重チップはあたかも我々 の分析に未満 13,000 のデータ ポイントを持つチップが、拒絶されました。図 1チップは評価 (図 1 a) と非評価 (図 1 bC) の両方のサンプルを表示します。後者の場合、複数の気泡 (図 1 b)、1 つの大きなバブル (図 1)、またはしきい値 (図 1 b) 上記のデータ点の数が不十分な結果としての存在のためにチップを捨てなければなりません。これらのサンプルは、解釈の結果を取得するもう一度実行する必要があります。について、散布図 (図 2) ソフトウェアによって提供される、それは通常ヴィック (製造元の独自仕様) レポーター色素 (x 軸) からの信号に対して、FAM レポーター色素 (y 軸) からの信号を表しています。散布図上に表示されるデータ ポイントが色分けされているとここでは、我々 は、のみ青 (図 2 a) で FAM レポーター色素信号を可視化, ターゲットが増幅された井戸を示します。これらの信号は、y 軸にプロットの原点から遠いと近い方にあります。プロットは、2 番目の色は黄色、増幅が発生しなかった井戸を示すものです。肯定的な信号のための信頼性の高いしきい値は設定され、呼び出しバイアスを防ぐためにすべてのチップに適用されます。ここでは、選択したしきい値は、これらの実験で様々 なチップの観測された信号の範囲に基づいて 6,000 だった。CDH1a cDNA コピー (青い信号) は、否定的な信号 (図 2 a) から振幅の明確な違いを示す腫瘍サンプルの数で発見されました。逆に、選択したしきい値より上の信号が見つかりませんでしたサンプルで陰性CDH1aトラン スクリプト、すなわち、すべての通常の組織サンプル、いくつかの腫瘍のサンプル (図 2 b)。同様に、dPCR 反応 (図 2) のネガティブ コントロールとして cDNA、代わりに水が追加されました NTC 内肯定的な信号が検出されなかった。
微細チップ解析フィルター低品質データ ポイントに適用する必要があり、あいまいな結果の危険性を排除します。これは、対応する肯定的な信号の正確な位置を決定するためのチップを表示する: 分析から信号を却下した青の信号の非常に国境のチップ (図 3 a) または泡 (図 1 b) のまわりである場合.偽陽性のリスクをさらに防ぐためには、FAM チャネルおよびプロットの右端に 6,000 の上の信号はおそらく特定として考慮された、従ってフィルターにより除外されました、にもかかわらず、彼らは、(図 3 b) チップ内でローカライズされました。このように、サンプルはその信号は、前述の条件に準拠している限り、それはシングル増幅信号を示している場合でもまれなトラン スクリプト、 CDH1a、発現陽性と見なされます。
図 1.代表的な評価と非評価可能なチップです。ブルーのドットが井戸をCDH1aトラン スクリプトが増幅されました。黄色のドットが井戸の増幅は発生しなかったです。白い点が空井戸です。各チップの下にしきい値を超えるデータ ポイントが表示されます。チップの境界線内でローカライズされた (A) 青で評価可能なチップを通知します。(B) A 未満 13,000 のデータ ポイントのしきい値を超えると非評価可能なチップ。(C) A 大きなバブルと非評価可能なチップ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.代表的なデジタル PCR 散布CDH1a式です。プロットは、ビクトリア州レポーター色素 (x 軸) からの信号に対して FAM レポーター色素 (y 軸) からの信号を表しています。青いドットは、黄色のドットが「増幅は」信号CDH1a正式信号です。(A) CDH1a-肯定的なサンプル。(B) CDH1a-否定的なサンプル。(C) ゼロのCDH1a式を示すテンプレート コントロール (NTC) なし。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.代表的な微細チップによるデジタル PCR 散布プロットされます。左は興味の信号をチップ表示ズームイン黒正方形、右は対応する散布。(A) 正しい端数チップの境界線でなくプロットの上に局在した青い信号。(B) 3 青い信号右端にプロットがチップ内でローカライズされた灰色で強調表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
dPCR は、DNA 分子測定10、11,12,13マイクロ Rna、RNA 転写産物5の定量化のためのこの技術は適応時間にもともと開発されました 14,15。このプロトコルでは、新鮮凍結組織サンプルから派生したまれな転写産物の検出機能を搭載するアプリケーションのリストを拡張した.その目的にではなく大量の cDNA の利用 (300 ng)。この金額は最大 dPCR で使用することができますが、私たちのすべてのサンプルを比較する標準化された条件の設定のために十分だった。6,000 で蛍光信号の閾値を設定し、チップとスキャッター プロット上の肯定的な増幅信号の位置を気に、正常に胃腫瘍組織サンプルでこの珍しいターゲットを検出しました。
DPCR、我々 は絶対にCDH1aターゲットの非常に低い量のためを定量化できるが、我々 は確実にこのまれな写しの有無を評価できます。確かに、このテクニックの計量的性質は、ターゲット分析サンプル7の存在の最初の数によって制限されます。関連の技術自体はかなり高価で、時間がかかると残っています。したがって、いくつかのターゲットのおよび/または多数のサンプルの分析が必要な場合、代替技術がある7,8します。
という、dPCR 間違いなくは、究極のプラットフォーム高感度測定及び核酸の定量化の精度と qPCR7,8に対する再現性を向上します。低豊富な核酸の遺伝子発現解析の唯一の方法とみなすことができることまた、qPCR 感度6の限界に近いこと。
ここで説明されているプロトコルは、我々 の研究と同様に、まれなターゲットの検出を有効にする任意の組織から Rna に対応できます。さらに、アッセイは、トラン スクリプトの絶対定量に拡張できます。このような場合は、コピー/μ L ある特定のサンプルの計測器によって報告された数する必要があります単に読み込まれた反応体積を掛けたするし、cDNA の初期量で割った値します。逆のトランスクリプションによって生成される変動を克服するために可能な場合に遺伝子特定校正する必要があります含まれる6。未来に見て、dPCR は、まれなシーケンスの検出が、またまれな突然変異の検出と正確なコピー番号定量化7だけではなく、ゴールド スタンダード プラットフォームになることに大きな可能性を保持しています。これはがん研究と同様に遺伝的モザイクと同様に特に関連する不均一性腫瘍が患者の予後と治療への反応を影響する可能性が。
実践の観点から、強調する必要があります複数の重要なステップがあります dPCR プロトコルを設定するとき。まず、予想されるターゲット式レベルに基づく cDNA の適切な量を含む反応混合物サンプルの均質性と干渉する空気泡を作成しないようにロードの刃で細心の注意を移送すべき。さらに、ブレード自体まず置かれるべき適切な;それ以外の場合それは不均一なサンプル配布される可能性があります。さらに、常に十分な流体、蓋のシール正確な浸漬コーティングを行ってください。チップの処理と分析、蓄積、チップ上の凝縮の可能性に注意することが重要です。このようなシナリオでは、チップをイソプロパノールで拭いて再し、再分析する必要があります。さらに、dPCR はポアソン統計に基づいて、評価可能なデータ数が最小ポイント (> 10,000)、サンプルを再度実行する必要がありますそれ以外の場合、チップ上に存在なりません。最後に、低ターゲット コピー検出心理実験、信号対雑音比ができる重要な交絡因子が、現実肯定的な信号の識別で助けることができる測位信頼性の高いしきい値。
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Disclosures
この作業のための利益相反報告なし。
Acknowledgments
著者編集者の支援のため Gráinne ティアニーを感謝したいです。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIazol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Glycogen 20 mg/ml | ROCHE | 10901393001 | |
| RNeasy MinElute Cleanup kit | QIAGEN | 74204 | |
| iScript cDNA Synthesis kit | BioRad | 1708891 | |
| QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix v2 | Thermo Fisher Scientific | A26358 | |
| CDH1a IDT custom designed assay | Integrated DNA Technologies (IDT) | NA | F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG (R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG (P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ [dPCR optimized assay concentrations: 900 nM (F), 900 nM (R), 250 nM (P)] |
| QuantStudio 3D Digital PCR 20K Chip Kit v2 | Thermo Fisher Scientific | A26316 | |
| Heraeus Biofuge Fresco | Thermo Scientific | 75002402 | |
| Thermocycler (Labcycler) | Sensoquest | 011-103 | |
| GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific | N805-0200 | |
| Dual Flat Block Sample Module | Thermo Fisher Scientific | 4425757 | |
| QuantStudio 3D Tilt Base for Dual Flat Block GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific | 4486414 | |
| QuantStudio 3D Digital PCR Chip Adapter Kit for Flat Block Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4485513 | |
| QuantStudio 3D Digital PCR Chip Loader | Thermo Fisher Scientific | 4482592 | |
| QuantStudio 3D Digital PCR Instrument with power cord | Thermo Fisher Scientific | 4489084 |
References
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