Summary
Manuskriptet beskriver en chip-baserade digitala PCR-test för att upptäcka en sällsynt CDH1 avskrift variant (CDH1a) i färskfryst normal och tumörvävnad från patienter med magsäckscancer.
Abstract
CDH1a, en icke-kanoniska avskrift av genen CDH1 , har konstaterats för att uttryckas i vissa ventrikelcancer (GC) cellinjer, det är frånvarande i normala magslemhinnan. Nyligen har upptäckt vi CDH1a avskrift variant i färskfryst tumörvävnad från patienter med GC. Ett uttryck för denna variant i vävnadsprover undersöktes av chip-baserade digitala PCR (dPCR) metoden presenteras här. dPCR erbjuder möjlighet till en noggrann, robust och mycket känsliga mätning av nukleinsyror och utnyttjas alltmer för många tillämpningar inom olika områden. dPCR är i stånd att upptäcka sällsynta mål; dPCR erbjuder dessutom möjligheten för absolut och exakt kvantifiering av nucleic syror utan behov av kalibratorer och standard kurvor. I själva verket berikar reaktion partitioneringen målet från bakgrunden, vilket förbättrar förstärkning effektivitet och tolerans-hämmare. Sådana egenskaper gör dPCR ett optimalt verktyg för detektion av CDH1a sällsynta avskriften.
Introduction
CDH1 genen kodar för E-cadherin, en nyckelfaktor som arbetar med underhåll av normal gastric epitel genom reglering av cell adhesion, överlevnad, spridning och migration1. Förlust av E-cadherin protein till följd av skadliga könsceller eller somatiska förändringar av CDH1 har associerats med utvecklingen av GC2,3. Icke-kanoniska avskrifter som härrör från intron 2 av genen har också antagit hypotesen för att spela en roll i gastric carcinogenes4,5. Särskilt en sådan avskrift, CDH1a, har visat att uttryckas i GC cellinjer men är frånvarande från den normala mage4. Vi har nyligen upptäckt CDH1a i GC vävnadsprover från GC patienter använder chip-baserade dPCR5. dPCR användes för att utvärdera, för första gången, förekomsten av CDH1a gen avskriften i intestinal GC och i normal vävnad.
Guld standard metod för att bestämma genuttryck är realtid kvantitativ PCR (qPCR). Men den resulterande data kan ibland vara variabel och av dålig kvalitet, speciellt när nivån på målet i provet är låg. Denna variation kan orsakas av föroreningar, som hämmar polymeras aktivitet och primer glödgning, leder till icke-specifik amplifiering och konkurrenskraftiga sida reaktioner6.
Även om biokemiska grundprinciperna för dPCR är liknande till de av qPCR, dPCR visar några fördelar, vilket möjliggör mycket exakta mätningar av genomisk DNA (gDNA) / kompletterande DNA (cDNA) molekyler. DPCR är faktiskt en slutpunkt reaktion som förlitar sig på en kalibrerad delning av ett prov till tusentals brunnar, så att varje väl innehåller noll eller en enda målmolekylen. Förstärkning sedan uppstår endast i brunnarna som innehåller en kopia av målet och indikeras av en fluorescerande signal. Det absoluta antalet målmolekyler i det ursprungliga provet kan sedan beräknas genom att bestämma förhållandet mellan positiva till totala partitioner använder binomiala Poisson statistik7.
Dessutom dPCR tekniken eliminerar behovet av kör en standardkurva och därmed den associerade bias och variabilitet, möjliggör en direkt kvantifiering av mål8,9. Det ger mer exakta och reproducerbara resultat oberoende av föroreningar och effektivitet på grund av dess höga tolerans-hämmare10. Det är mer känslig och specifik än qPCR, och är således en pålitlig metod för detektion av ett sällsynt mål. Slutligen av uppdelning av provet i flera reaktioner minskar konkurrensen med bakgrunden molekyler och förbättrar mål detektionsgränsen, möjliggöra förstärkning och underlätta upptäckt av enstaka molekyler av gDNA/cDNA6 . Detektering och kvantifiering av nukleinsyror av chip-baserade dPCR har tillämpats alltmer för att kopiera numret variation, kvantifiering av DNA fragment och mutation analyserar11,12,13, givet den precision och låg material ingång kravet på metoden. DPCR har dessutom nyligen integrerats i analysen av båda mikroRNA14 och gen avskrifter5,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet följer riktlinjerna i örsta mänsklig forskning etikkommittén.
Obs: Detta förfarande är särskilt utformad för detektion av ett lågt antal cDNA molekyler i färskfryst vävnader. Avsnitten vävnad har skurits på torris, medan fortfarande frysta, från tidigare validerade patientderiverade magsäcken tumör eller normala vävnadsprover.
1. RNA isolering och rening
-
RNA-extraktion
Obs: RNA isolering utförs under huven med hjälp av en viss produkt (se Tabell för material). Dock en mängd isolering kit är kommersiellt tillgängliga.- Homogenisera 50-100 mg fint skuren färskfryst vävnadsprov i en 1,5 mL rör med 1 mL av RNA isolering reagens och vortex kraftigt under 15 s. Inkubera rören vid-80 ° C över natten.
- Inkubera röret som innehåller provet vid rumstemperatur i 5 min och mix av vortexa för 15 s.
- Håll röret på is, tillsätt 200 µL av kloroform och vortex kraftigt i 15 s.
- Inkubera rören i rumstemperatur i 60 s och centrifugera vid 12 000 x g under 15 minuter vid 4 ° C.
- Överför den vattenhaltiga fasen i en 1,5 mL tub och tillsätt 20 µg av glykogen.
Obs: Det är viktigt att noga undvika att överföra någon av interphasen eller organiska skikt för att reducera kontaminering. - Tillsätt 500 µL av isopropanol, Invertera röret för att blanda och inkubera på is i 10 min.
- Centrifugera röret på 12 000 x g i 15 minuter vid 4 ° C utfällning RNA.
Obs: RNA kommer att närvara i en gel-liknande pellet på sida och botten av röret, ofta osynliga efter centrifugering. - Avlägsna supernatanten utan att störa fällningen och tvätta det med 1 mL 75% etanol genom pipettering.
- Centrifugera röret vid 7 500 x g i 5 minuter vid 4 ° C och ta bort supernatanten utan att störa pelleten.
- Låt pelleten torka tills fällningen blir transparent och lös den i 50 µL RNase-gratis vatten.
- Frysa proverna vid-80 ° C minst över natten innan kvantifiering.
-
Genomiskt DNA eliminering och RNA rening
Obs: Ett DNAS matsmältningen steg, följt av en kolumnbaserade RNA rening, rekommenderas för analyser av låg-överflöd mål för att smälta kontaminerande DNA.- Lös upp det frystorkade DNAS I (1.500 Kunitz enheter) i 550 µL RNase-fritt vatten med en spruta, blanda försiktigt genom att vända flaskan, och dela den rekonstituerade stamlösningen i alikvoter.
- Överföring i ett 1,5 mL rör den beräknade volymen av provet med 15 µg av RNA, 10 µL av DNAS matsmältningen buffert från kit (som anges i Tabellen för material), 2,5 µL av DNAS stamlösning och RNase-fritt vatten till 100 µL. Inkubera i rumstemperatur i 10 min.
- Tillsätt 350 μl lyseringsbuffert vävnad (från kit, se Tabell av material) och blanda genom pipettering.
- Tillsätt 250 µL av 100% etanol och mix av pipettering.
- Överför hela volymen (700 µL) till en ny spin kolumn och centrifugera vid 12 000 x g för 15 s.
- Överföra filtret in i en ny samling tub, tillsätt 500 µL av 80% etanol till kolumn och centrifugera vid 12 000 x g under 2 minuter.
- Öppna locket på den spin kolumn och centrifugera vid 12 000 x g i 5 min med en ny samling tub torka filtret; överför sedan filtret till en 1,5 mL tub.
- Tillsätt 14 µL RNase-fritt vatten direkt till filtret kolumn och centrifugera vid 12 000 x g i 1 min.
- Hålla proverna på is och fortsätta till kvantifiering med 2 µL av provet på en bänk spektrofotometer eller lagra RNA vid-80 ° C fram till användning.
2. cDNA syntes
- Plats 1000 ng av RNA, 4 µL av master mix, 1 µL av omvänt transkriptas och RNase-fritt vatten till en slutlig volym av 20 µL i ett sterilt PCR-rör. Blanda försiktigt och snurra ner.
- Inkubera reaktion mixen i en termocykel, tillämpa följande villkor: 5 min vid 25 ° C, 30 min vid 42 ° C, 5 min vid 85 ° C.
- Centrifugera rören kort och gå vidare till dPCR analys eller förvaras vid-20 ° C tills den behövs.
3. digital PCR-reaktionen ställa in
-
dPCR reaktion blanda och provberedning
- Tina huvudmixen och analysen i rumstemperatur i minst 20 min.
- Späd de cDNA proverna till en koncentration på 300 ng i 6 µL av vatten.
- Vortex befälhavaren blanda försiktigt och förbereda blandningen i ett sterilt rör med 8,7 µL av master mix, 0.87 µL av CDH1a anpassade utformade assay primer och 1,83 µL nuclease-fritt vatten för en slutlig volym av 11,4 µL.
Anmärkning: För CDH1a anpassade utformade assay primer detaljer se Tabell för material. - Överföra 11,4 µL av den beredda blandningen till utspädda cDNA provet, blanda försiktigt och centrifugera kort.
Obs: Volymer innehålla 20% överskott att kompensera volymförlust från pipettering. Förbered blandningen för alla prover och en ingen mall kontroll (NTC).
-
Chip förberedelse
För optimalt resultat Lägg marker så snart som möjligt.- Koppla in chip lastaren och vänta tills indikatorlampan med grönt.
- Ta bort locket på nedsänkning vätska sprutan genom att försiktigt dra tillbaka kolven 1-2 mm och släppa den för att underlätta detta steg, och ersätta det med ett tips.
- Ta ett nytt chip och ta del av den kod som skrivs på locket för att associera den med provet.
- Håller locket noggrant vid dess sida, skala bort skyddsfilmen och placera locket med klibbig ansiktet upp i rätt riktning.
- Försiktigt plocka upp ett chip, noga med att inte röra den inre delen, och ladda upp det till chip boet i rätt läge genom att trycka ner spaken för att öppna klämman.
- Ladda en ny lastning blad på lastaren och skjut försiktigt för att säkerställa att den är ordentligt på plats.
- Överför 14,5 µL av dPCR reaktion mixen på lastning bladet utan att göra luftbubblor eller avleda bladet, efter vilket tryck den svarta lastning knappen distribuera volymen på chipet.
- Använd den nedsänkning vätska sprutan för att överföra ca 20 droppar på chip ytan noga med att inte röra vid ytan med spets.
Obs: Det är viktigt att täcka hela ytan utan att spilla vätska över kanterna. - Rotera loader armen så att locket kommer i kontakt med chip och tryck ned för 15 s.
- Tryck på locket för att frigöra chip och tillbaka armen till sin position.
- Håll monterade chip i 45° vinkel och noggrant undvara sprutan genom fylla hamnen nedsänkning vätskan rotera chip något för att se till att det finns inga luftbubblor och ta bort någon överflödig vätska med en steril torka.
- Försegla chip fallet genom att försiktigt dra bort etiketten ovanpå chip locket och tryck över fylla port för minst 5 s.
- Lagra chip i mörkret tills det att läsa i termocykel.
Obs: Beredda marker ska användas inom 2 h.
-
dPCR reaktion
- Öppna locket och installera adaptrarna till båda block, även när ett enda block används.
- Placera marker på prov blocket i rätt position.
Obs: Fyll porten måste vara inriktad på framsidan av den termocykel i en upphöjd position så att eventuella luftbubblor att flyta till toppen utan att störa fönstret av chip. Använd tomma chips för att balansera de två blocken. - Låg termisk pad på prov blocket att helt täcka marker.
- Stäng locket och starta PCR kör, tillämpa följande villkor: håll på 96 ° C i ca 10 min; 45 cykler av 60 ° C i 2 min och 98 ° C för 30 s; Håll vid 60 ° C i 2 min; Håll vid 4 ° C. Stäng av termocykel och Tina marker i rumstemperatur i minst 10 min.
Obs: Chip analys måste utföras inom en timme.
-
Chip analys
- Öppna locket till instrumentet och bort termisk kuddar, sedan ta bort spånorna från korten.
Obs: Lagra marker på en mörk, ren plats fram till analys. - Rengöra chip ytan med isopropanol och en steril torka.
Obs: Inspektera varje chip för läckor eller potentiella problem. - Sätt in USB i detektorn systemet att spara data.
- Öppna chip facket av detektor systemet, ladda den chip ansikte upp i rätt position och stäng sedan facket.
- Vänta 30 s för bearbetning, sedan bort chipet och infoga nästa.
- Vänta på analysen ska slutföras för alla bearbetade marker sedan in USB till en dator för att överföra filer.
Obs: Den totala tiden för analys är runt 2 till 3 min/chip.
- Öppna locket till instrumentet och bort termisk kuddar, sedan ta bort spånorna från korten.
4. data analys och tolkning
- Ansluta till den molnbaserade mjukvaruplattform som krävs för att utföra alla efterföljande analyser.
- Skapa ett projekt och importera alla datafiler marker av intresse.
- Ange exempel namnet; Välj färg och assay används i fliken ”definiera Chips”.
- Avgöra om chippet är godtagbar genom att visualisera det i ”granska Data” fliken, kontrollera hur grundligt provet var lastas chip och hur många datapunkter är utvärderingsbara.
Obs: Avvisa marker med mindre än 13.000 utvärderingsbara datapunkter. - Gå vidare till spridningsdiagrammet av valda chip på höger sida av skärmen; tillämpa ett tröskelvärde på 6.000 för fluorescein amidite (FAM) reporter dye signaler (y-axeln) till alla marker.
Obs: Den gräns som sätts kan variera på grundval av de analyser som använts. - Ta bort eventuella tvivelaktiga positiva signaler att förhindra falska positiva resultat genom att markera den relativa platsen på scatter plot med lassoverktyget och trycka på ”obestämd”. Alla återstående positiva ställen indikera närvaron av cDNA kopior av sällsynta målet analyseras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Använda proceduren presenteras här, kontrolleras vi av uttryck för den sällsynta avskrift varianten CDH1a i magsäcken färskfryst vävnader. Analysen av dPCR utfördes på 21-parat normal och cancer vävnadsprover och i 11 ytterligare tumörprover. CDH1a var detekterbart i 15 av 32 (47%) tumörer, medan ingen normal vävnadsprover visade förekomst av denna sällsynta avskrift5. I vår analys avslogs marker med mindre än 13 000 datapunkter, som var chips med inhomogen lastning. Figur 1 visar en chip Visa för både utvärderingsbara (figur 1A) och icke-utvärderbar (figur 1B, C) prover. När det gäller det senare, måste chip kasseras på grund av närvaro av flera bubblor (figur 1B), en enda stor bubbla (figur 1 c), eller till följd av ett otillräckligt antal datapunkter tröskelvärdet (figur 1B). Dessa prover måste köras igen för att erhålla tolkningsbara resultat. När det gäller spridningsdiagrammet som tillhandahålls av programvaran (figur 2), skildrar det normalt signalerna från FAM reporter färgämnet (y-axeln) mot signaler från VIC (tillverkarens proprietary) reporter färgämnet (x-axeln). De datapunkter som presenteras på spridningsdiagrammet är färgkodade, och här, vi bara visualiseras FAM reporter dye signalerna i blått (figur 2A), som anger brunnarna där målet förstärktes. Dessa signaler är beläget närmare till y-axeln och längre från ursprunget till tomten. Den andra färgen sett på tomten är gul och vägledande av brunnarna som ingen amplifiering inträffade. En tillförlitlig tröskel för de positiva signalerna hade fastställts och tillämpas på alla marker att förhindra samtal bias. Här var det valda tröskelvärdet 6.000 baserat på antalet signaler som observerats för olika marker i dessa experiment. CDH1a cDNA kopior (blå signaler) hittades i ett antal tumörprover, visar en tydlig skillnad i amplitud från negativa signaler (figur 2A). Däremot hittades inga signaler över det valda tröskelvärdet i prover negativa för CDH1a avskrift, dvs, alla normala vävnadsprover och vissa tumörprover (figur 2B). Likaså upptäcktes inga positiva signaler i den NTC där vatten lades i stället för cDNA, därav tjänstgör som en negativ kontroll för dPCR reaktionen (figur 2 c).
En fin chip analys måste tillämpas till filtret i låg kvalitet datapunkter och eliminera risken för tvetydiga resultat. Detta gjordes genom att Visa chip för att fastställa den exakta platsen för den motsvarande positiva signalen: om blå signalen ligger vid mycket gränser av chip (figur 3A) eller runt bubblor (figur 1B), signalen är sparken från analysen . För att ytterligare förhindra risken för falsklarm, signaler över 6.000 för FAM kanalen och längst till höger av tomten var ansedda som förmodligen ett och filtrerades således bort, även om de var lokaliserade inom chip (figur 3B). På detta sätt betraktas ett prov som positivt för uttrycket av sällsynta avskriften, CDH1a, även om den visar en enda förstärkningen signal, så länge den signalen uppfyller ovanstående villkor.
Figur 1 . Representativa utvärderingsbara och icke-utvärderbar chips. De blå prickarna är brunnar där förstärktes CDH1a avskriften; de gula prickarna är brunnar där ingen amplifiering inträffade; de vita prickarna är tomma brunnar. Datapunkter tröskelvärdet anges under varje chip. (A) en utvärderingsbara chip med blå signaler lokaliserade inom chip gränser. (B), en icke-utvärderbar chip med mindre än 13 000 datapunkter tröskelvärdet. (C), en icke-utvärderbar chip med en stor bubbla. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Representativa digital PCR scatter tomter av CDH1a uttryck. Tomter skildra signaler från FAM reporter färgämnet (y-axeln) mot signaler från VIC reporter färgämnet (x-axeln). De blå prickarna är CDH1a positivt uttryck signaler, medan de gula prickarna är ”ingen amplifiering” signalerna. (A) CDH1a-positivt prov. (B) CDH1a-negativt prov. (C) ingen mall kontroll (NTC) visar noll CDH1a uttryck. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Representativa böter-chip analys av digital PCR scatter tomter. Till vänster är vyn chip med signaler av intresse inzoomad i en svart fyrkant, medan den rätten är motsvarande spridningsdiagrammet. (A) en blå signal lokaliserade på den rätta del av tomten men vid gränsen av chip. (B) tre blå signaler markerade i grått lokaliserad längst till höger av tomten men inom chip. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
dPCR utvecklades ursprungligen för DNA molekylär mätningar10,11,12,13 och i tid denna teknik var anpassad för kvantifiering av mikroRNA och RNA avskrifter5, 14,15. I detta protokoll har vi utvidgat listan över ansökningar om att inbegripa påvisande av sällsynta avskrifter härrör från färskfryst vävnadsprover. För detta ändamål utnyttjade vi en ganska stor mängd cDNA (300 ng). Även om detta belopp inte är den högsta som kan användas i dPCR, var det tillräckligt för att ställa in standardiserade förhållanden att jämföra alla våra prover. Genom att ange tröskelvärdet flourescens signal på 6.000 och skötte platserna av positiv amplifiering signaler i både chip och scatter plot, upptäckt vi framgångsrikt detta sällsynta mål i magsäcken tumör vävnadsprover.
Av dPCR, vi kunde absolut inte kvantifiera CDH1a, på grund av en mycket låg mängd målet, men vi kunde på ett tillförlitligt sätt bedöma närvaro/frånvaro av denna sällsynta avskrift. Faktiskt, kvantitativa arten av denna teknik är begränsad av det ursprungliga antalet mål i den analyserade prover7. Relevans återstår tekniken sig vara ganska dyra och tid intensivt. Således, när analysen av många prover och/eller flera mål krävs alternativa tekniker bör övervägas7,8.
Som sagt, ger dPCR utan tvekan den ultimata plattformen för känsliga mätning och kvantifiering av nukleinsyror, eftersom det förbättrar precision och reproducerbarhet avseende qPCR7,8. Dessutom kan det anses som den enda metoden som är tillgängliga för att analysera genuttryck av låg-riklig nukleinsyror som nära gränsen för qPCR känslighet6.
Protokollet här beskrivit kan anpassas till RNAs från alla vävnader, som möjliggör upptäckt av sällsynta mål, som i vår studie. Analysen kunde dessutom förlängas på absolut kvantifiering av avskrifter. I sådana fall måste antalet kopior/μl rapporteras av instrumentet för ett givet prov vara helt enkelt multiplicerat med den inlästa reaktionsvolym och dividerat med det ursprungliga beloppet av cDNA. För att övervinna variabilitet produceras genom omvänd-Transkription, gen-specifika kalibratorer bör inkluderas, om möjligt6. DPCR ser på framtiden, och innehar betydande potential att bli guldmyntfoten plattformen, inte bara för sällsynta sekvens upptäckt, men också sällsynta mutationen upptäckt och exakt kopia nummer kvantifiering7. Detta är särskilt relevant i genetisk mosaicism, såväl som i cancerforskningen där tumör heterogenitet kan påverka patientens kliniska resultat och svar på behandling.
Från en praktisk synvinkel, när du ställer in dPCR protokollet finns det flera kritiska steg som måste lyftas fram. Först av allt, den Reaktionsblandning innehållande lämplig mängd cDNA baserat på uttrycket målnivån förväntat, bör överföras med stor omsorg i bladet lastning så att inte skapa luftbubblor, som kunde störa provets homogenitet. Dessutom bör bladet själv först placeras på lämpligt sätt. Annars kan det resultera i en ojämn prov fördelning. Dessutom bör tillräcklig beläggning med nedsänkning flytande och korrekt tätning av locket alltid utföras. Angående chip bearbetning och analys är det viktigt att vara medveten om möjligheten att ackumulera kondens på chip; i ett sådant scenario, bör chip åter torkas med isopropanol och åter analyseras. Dessutom som dPCR bygger på Poisson statistik, ett minsta antal utvärderingsbara data pekar (> 10 000) måste vara närvarande på chip, annars provet bör köras igen. Slutligen, för låga mål kopia upptäckt experiment, en kritisk confounding faktor kan vara det signal-brus-förhållandet, men en pålitlig tröskel positionering kan hjälpa att identifiera verkliga positiva signaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna rapportera inga intressekonflikter för detta arbete.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Gráinne Tierney för redaktionellt stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIazol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Glycogen 20 mg/ml | ROCHE | 10901393001 | |
| RNeasy MinElute Cleanup kit | QIAGEN | 74204 | |
| iScript cDNA Synthesis kit | BioRad | 1708891 | |
| QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix v2 | Thermo Fisher Scientific | A26358 | |
| CDH1a IDT custom designed assay | Integrated DNA Technologies (IDT) | NA | F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG (R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG (P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ [dPCR optimized assay concentrations: 900 nM (F), 900 nM (R), 250 nM (P)] |
| QuantStudio 3D Digital PCR 20K Chip Kit v2 | Thermo Fisher Scientific | A26316 | |
| Heraeus Biofuge Fresco | Thermo Scientific | 75002402 | |
| Thermocycler (Labcycler) | Sensoquest | 011-103 | |
| GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific | N805-0200 | |
| Dual Flat Block Sample Module | Thermo Fisher Scientific | 4425757 | |
| QuantStudio 3D Tilt Base for Dual Flat Block GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific | 4486414 | |
| QuantStudio 3D Digital PCR Chip Adapter Kit for Flat Block Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4485513 | |
| QuantStudio 3D Digital PCR Chip Loader | Thermo Fisher Scientific | 4482592 | |
| QuantStudio 3D Digital PCR Instrument with power cord | Thermo Fisher Scientific | 4489084 |
References
- van Roy, F., Berx, G. The cell-cell adhesion molecule E-cadherin. Cell Mol Life Sci. 65 (23), 3756-3788 (2008).
- Carneiro, P., et al. E-cadherin dysfunction in gastric cancer: cellular consequences, clinical applications and open questions. FEBS Lett. 586 (18), 2981-2989 (2012).
- Corso, G., et al. Somatic mutations and deletions of the E-cadherin gene predict poor survival of patients with gastric cancer. J Clin Oncol. 31 (7), 868-875 (2013).
- Pinheiro, H., et al. Transcription initiation arising from E-cadherin/CDH1 intron2: a novel protein isoform that increases gastric cancer cell invasion and angiogenesis. Hum Mol Genet. 21 (19), 4253-4269 (2012).
- Abou Khouzam, R., et al. Digital PCR identifies changes in CDH1 (E-cadherin) transcription pattern in intestinal-type gastric cancer. Oncotarget. 8 (12), 18811-18820 (2017).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Sci Rep. 7 (1), (2017).
- Basu, A. S. Digital Assays Part I: Partitioning statistics and digital PCR. SLAS Technol. 22 (4), 369-386 (2017).
- Huggett, J. F., Whale, A. Digital PCR as a novel technology and its potential implications for molecular diagnostics. Clin Chem. 59 (12), 1691-1693 (2013).
- Alikian, M., et al. RT-qPCR and RT-Digital PCR: A comparison of different platforms for the evaluation of residual disease in chronic myeloid leukemia. Clin Chem. 63 (2), 525-531 (2017).
- Hoshino, T., Inagaki, F. Molecular quantification of environmental DNA using microfluidics and digital PCR. Syst Appl Microbiol. 35 (6), 390-395 (2012).
- Salvi, S., et al. Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer. Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).
- Tessitore, M. V., et al. Detection of newly produced T and B lymphocytes by digital PCR in blood stored dry on nylon flocked swabs. J.Transl.Med. 15 (1), (2017).
- Sho, S., et al. Digital PCR Improves mutation analysis in pancreas fine needle aspiration biopsy specimens. PLoS One. 12 (1), e0170897 (2017).
- Conte, D., et al. Novel method to detect microRNAs using chip-based QuantStudio 3D digital PCR. BMC Genomics. 16, 849 (2015).
- Sanders, R., Mason, D. J., Foy, C. A., Huggett, J. F. Evaluation of digital PCR for absolute RNA quantification. PLoS One. 8 (9), e75296 (2013).
