Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

זריחה zygotic השחזור לאחר הלבנת-צילום ןועברל ולגמישות כרומטין המאפשרת פיתוח מלא לטווח

Published: June 12, 2018 doi: 10.3791/57068
Automatic Translation
1,3, 2, 2, 1,3
1Faculty of Life and Environmental Sciences, Department of Biotechnology, University of Yamanashi, 2Department of Integrated Bioscience, Graduate School of Frontier Sciences, University of Tokyo, 3Advanced Biotechnology Center, University of Yamanashi

Summary

כרומטין ולגמישות מופיע להיות מעורב הפוטנציאל ההתפתחותי של blastomeres. עם זאת, לא ידוע אם כרומטין ולגמישות יכול לשמש כאינדקס אמין עבור פוטנציאל התפתחותי של העוברים. . הנה, תואר מערכת ניסיונית שבה כרומטין הערכה ולגמישות מופרות יכולים לפתח את הקדנציה.

Abstract

הדמיה חיה הוא כלי רב עוצמה המאפשר הניתוח של האירועים המולקולריים המתרחשים במהלך ontogenesis. לאחרונה, ולגמישות כרומטין או פתיחות הוכח להיות מעורב בהם פוטנציאל התמיינות של תאי גזע עובריים pluripotent. בעבר דווח כי לעומת עם תאי גזע עובריים, מופרות הנמל מבנה מאוד התיר כרומטין, מציעה את השיוך שלו עם totipotency שלהם. עם זאת, עד עכשיו, זה לא טופלה אם זה מאוד התיר/פתיחה הכרומטין חשוב עבור עובריים פוטנציאל התפתחותי. במחקר הנוכחי, כדי לבדוק השערה זו, מערכת ניסויית ב אשר מופרות נותחו על ידי קרינה פלואורסצנטית התאוששות לאחר הלבנת-צילום יכול לפתח למונח ללא נזק משמעותי פותחה. חשוב לציין, מערכת ניסויית זו צריך רק תנור פלייט-תרמוס בנוסף לייזר קונפוקלי מיקרוסקופ סורק. ממצאי מחקר זה מראים מהגמילה פלורסצנטיות לאחר הלבנת-צילום ניתוח ניתוח (FRAP) יכול לשמש כדי לחקור האירועים המולקולריים כרומטין zygotic חשוב להתפתחות מלא לטווח.

Introduction

לאחר ההפריה, הכרומטין משתנה באופן דינמי, הכרומטין zygotic מכן הוקמה בסופו של דבר1,2. בתקופה זו, pronuclei אבהית, החלבון כרומטין דומיננטי משתנה מ-? מה לעזאזל קרה לתוך היסטון. כרומטין וכתוצאה מכך שונה מאוד מזו של תאי זרע, נקבה oocytes בכמה נקודות (למשל, הרכב משתנה היסטון, שינוי היסטון). לפיכך, בנוי כרומטין zygotic נחשב חשוב להתפתחות עוברית עוקבות. עם זאת, למרות המאמצים לחשוף את הפרטים של הכרומטין zygotic על פני תקופות ארוכות, שיטות להערכת איכות מופרות או לחזות את התפתחותם מלא לטווח בשלב אחד-תא על-ידי ניתוח שלהם הכרומטין. מעולם לא הייתי הקים.

במחקר הקודם, הוא גילה כי מופרות יש מבנה של כרומטין התיר מאוד3. כיום, ולגמישות כרומטין או פתיחות הוא האמין להיות גורם חשוב עבור פוטנציאל תאי גזע עובריים (ES)4התמיינות. ES תאים לא מוצג הומוגניות בטבע, אבל הם מעדיפים הטרוגניות; במושבות תא ES, כמה transiently רוכשים את פוטנציאל התמיינות גבוהה יותר דומה blastomeres של שני תאים בשלב עוברי. במהלך המעבר הזה לתוך התא-השני כמו המדינה, כרומטין ולגמישות ב ES תאים שינויים לתוך מה משולה עם שני תאים בשלב עוברי5. לפיכך, כרומטין ולגמישות נראה להיות חשוב עבור פוטנציאל התמיינות וזה אפשרי בהרחבה פתח כרומטין ב מופרות שימושית לצורך הערכת הפוטנציאל ההתפתחותי zygotic.

הדמיה חיה הוא כלי רב עוצמה המאפשר הניתוח של האירועים המולקולריים המתרחשים במהלך ontogenesis מכיוון ששיטה זו מאפשרת פיתוח עוקבות, אפילו מלא לטווח פיתוח6. בתור אחד של שיטות הדמיה בשידור חי, שימש FRAP ניתוח לבחון כרומטין ולגמישות של העוברים, ES תאים3,4,5. אם ניתן לנתח אותם ולגמישות כרומטין zygotic על ידי ניתוח FRAP ללא השפעה מזיקה על פיתוח מלא לטווח, זה עשוי להיות כלי רב ערך עבור הערכת איכות העוברים בשלב אחד-cell. עם זאת, ההשפעות על פיתוח מלא לטווח בשיטה ניסויית זו לא נבדקו. לאחרונה פותחה מערכת ניסויית באמצעות FRAP להעריך כרומטין zygotic ולגמישות. משום שזוהי מערכת תצפית חדשה עבור מופרות, זה היה כינה FRAP zygotic (zFRAP). zFRAP לא השפיעה באופן ביקורתי פיתוח מלא לטווח ומאז דווח במקום7. בדו ח זה, מתואר הפרוטוקול של שיטה ניסויית זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מחקר זה בוצע בהתאמה קפדנית עם ההמלצות במדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה של האוניברסיטה של יאמאנאשי. הפרוטוקול שאושר על ידי ועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים של האוניברסיטה של יאמאנאשי (מספר היתר: A24-50). כל הניתוחים בוצעו בהרדמה tribromoethanol, נעשה כל מאמץ כדי למזער את הסבל. הצגה מאוירת של נהלים, בזמן-טבלת מוצגים באיור 1 ו- 1 בטבלה, בהתאמה.

1. הכנת RNA שליח (חוץ גופית של שעתוק של eGFP-ויזת עבודה H2B mRNA)

  1. Linearize µg 5 של תבנית ה-DNA pTOPO-eGFP-ויזת עבודה H2B3,7 עם 30 U של לא אני ב µL 50 ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  2. איסוף µL 1.5 של DNA מתעכל לאישור אם מתעכל לחלוטין על ידי אלקטרופורזה.
    1. החל 1.5 µL µL 3-5 של DNA מעוכל עם טעינת לצבוע אל הבאר של ג'ל agarose 2%, בהתאמה, ובכפוף אלקטרופורזה.
      הערה: אם מתעכל לחלוטין, להקה אחת (כ- 5 kb) הוא ציין. DNA מעוכל משמש פקד, אשר מופיע במיקום שונה.
  3. להוסיף µL 151.5 ddH2O ל- 200 µL באלכוהול פנול/כלורופורם/isoamyl (25:24:1) שנותרו מתעכל הדנ א.
    1. מערבבים היטב על ידי מערבולת.
    2. צנטריפוגה-המהירות המרבית למשך 15 דקות.
  4. לשחזר את תגובת שיקוע ולאחר מכן להוסיף 200 µL של כלורופורם.
    1. מערבבים היטב על ידי מערבולת.
    2. צנטריפוגה במהירות מקסימלית למשך 15 דקות.
  5. לשחזר את תגובת שיקוע ולאחר מכן להוסיף 20 µL של 3 מ' סודיום אצטט ו 1.5 µL של ethachinmate.
    1. מערבבים היטב על ידי מערבולת.
    2. הוסף µL 550 של 100% אתנול, ואז לערבב נמרצות על ידי מערבולת.
    3. צנטריפוגה במהירות מקסימלית למשך 15 דקות.
    4. למחוק את תגובת שיקוע ולאחר מכן לשטוף את גלולה עם 70% אתנול.
    5. יבש בגדר אידוי למשך 5-10 דקות.
  6. להמיס פלסמיד זירז DNA ב 8 µL של נוקלאז ללא מים.
  7. להעריך פלסמיד ריכוז (ריכוז הצפוי הוא על 300-500 ng/µL) עם nanodrop על-ידי ביצוע ההוראות של היצרן.
  8. לבצע תמלול במבחנה של mRNA קידוד eGFP-ויזת עבודה H2B עם µg 1 של ה-DNA מטוהרים כתבנית ב 20 µL של התגובה הכולל אמצעי אחסון על-ידי ביצוע ההוראות של היצרן.
    1. לאחר במבחנה שעתוק, להוסיף μL 36 של מים ולאחר מכן לשחזר 1.5 µL µL 56 של mRNA מסונתז לניתוח על ידי אלקטרופורזה (כפי ללא poly A).
  9. בצע poly A עוקב עבור mRNA מסונתז באמצעי אחסון התגובה µL 100 לפי הוראות היצרן.
  10. להוסיף 60 µL של ליתיום כלוריד משקעים פתרון פולי mRNA זנב של eGFP-ויזת עבודה H2B, ואז מערבבים היטב.
    1. מגניב ב-30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    2. צנטריפוגה במהירות מקסימלית למשך 15 דקות.
    3. למחוק את תגובת שיקוע ולאחר מכן לשטוף את גלולה עם 70% אתנול.
    4. יבש בגדר אידוי למשך 5-10 דקות.
  11. להמיס את גלולה עם 20 µL של מים נטולי נוקלאז על ידי חימום ב 55 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  12. להעריך את ריכוז mRNA precipitated עם nanodrop. לדלל כדי 500 ng/µL עם מים ללא נוקלאז וחנות ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.
  13. לאשר המועדף לייצור mRNA; נושא 1 µL של mRNA עם/בלי (להשיג ב 1.8.1 והשלבים 1.12, בהתאמה) פוליפוני זנב מעורבב עם 1.5 µL של 0.1 mg/mL אתידיום ברומיד µL 3 של הטעינה דוגמת צבע לניתוח אלקטרופורזה. אמצעי האחסון השימושית היה 5.5 µL.
    הערה: אם A פולי עוקב הצליח, הלהקה שהוסטו בהשוואה של mRNA בלי פולי עוקב להתייחס (איור 2 א).

2. אופן ההכנה של עיקור עכברים זכרים

  1. שוקלים עכברים גברית ICR בגיל 8-12 חודשים באמצעות סרגל משקל.
  2. Intraperitoneally להזריק עכברים זכרים 0.7 - 0.9 מ ל 1.2% tribromoethanol הרדמה.
    הערה: הסכום של ההרדמה תלוי בגודל של העכבר. לדוגמה, לעכבר השוקל 40 g מוזרק עם 0.8 מ של tribromoethanol הרדמה.
  3. הרטב את ברי עם 70% אתנול.
  4. לבצע קטן וחתכו ברי (3-5 מ מ) ולאחר מכן לבצע חתך בדופן שריר בעזרת מספריים.
    הערה: מלקחיים ומספריים כדאי לנקות עם אתנול 70% לפני תחילת הניתוח.
  5. אחיזה כרית השומן עם מלקחיים, משוך אותו בעדינות. לאחר מכן, testis של צינור הזרע יופיעו.
    הערה: צינור הזרע הוא צינור בצורת U עם כלי דם אדום.
  6. . תקשור צינור הזרע -שתי נקודות עם התפרים כירורגי ולאחר מכן לחתוך את החלק האמצעי בין נקודות קשור.
  7. בעדינות לדחוף בחזרה את fat pad, testis ברי.
    1. חזור על הניתוח עם בזרמה הנותרים.
  8. לתפור את הקיר שריר עם שני תפרים עם תפירה.

3. הפריה חוץ גופית

  1. להזריק 8 - 10 - בן שבועיים B6D2F1 הנשי עכברים (BDF1) intraperitoneally עם 7.5 IU אקווין גונדוטרופין כוריוני (א), גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG) במרווח h 46-50.
  2. להכין טיפות של 300 µL האנושי תובל נוזלים (HTF)8 מדיה capacitation, הזרעה יום אחד לפני IVF בקערה 30 מ מ, מכסה את הטיפות האלה עם שמן מינרלי על הספסל מעבדה, ואז preincubate באינקובטור למשך הלילה.
  3. להקריב התבגר-זכר ICR עכברים מאת נקע בצוואר הרחם. לנתח יותרת האשך תסמונת עם מחט 27 ג'י ולאסוף תא זרע. תרבות אותם עבור capacitation ב 300 µL של HTF מדיה עבור h 1-2-38 מעלות צלזיוס.
  4. 16 שעות לאחר הזרקת hCG, להקריב עכברים נקבה סופר ovulated על ידי נקע בצוואר הרחם. להעביר oviduct ampulla לתוך שמן מינרלי ליד HTF מדיה, ואז לשלות cumulus תאים, oocytes מורכבים ampulla oviduct זו על ידי מחט 30-G לתוך המדיום הזרעה preincubated-HTF.
    הערה: בחלק מהעכברים הנשי אינם מראים לעיתים קרובות הביוץ למרות הטיפול ביוץ סופר. Oviduct מוגדלת ampulla הוא סימן של הביוץ.
  5. לאחר capacitation, להעביר 2-3 µL של תא זרע capacitated המדיה הזרעה-HTF שבו נאספו את oocytes ovulated.
  6. h 1 לאחר הפריה, לאסוף את מופרות מופרית ולפנק אותם עם hyaluronidase-µg/mL 100 10 דקות בתקשורת9 CZB.
    הערה: כאשר הפריה מבוצע כהלכה, h 1 לאחר הפריה, מופרות מופרית בגופה קוטב 2nd שנצפו. אם פחות או באיכות נמוכה הזרע משמש, רק מעט מופרות עם גוף קוטב 2nd שנצפו. כמו כן, אם זרע רבים משמשים עבור הזרעה, polyspermy מתרחשת. הפריה תקין מוביל מופרות עם pronuclei זכר ונקבה. באמצעות קריטריונים אלה, זה אפשרי למצוא אם ההפריה נעשית טוב או לא.
    1. לאחר הרחצה בתקשורת CZB, נושא את מופרות עם גוף קוטב שני microinjection עם eGFP-ויזת עבודה H2B mRNA.

4. הכנת קאמרית, Microinjection סיליקון

  1. לדלל RNA קידוד eGFP-ויזת עבודה H2B באמצעות מים נטולי נוקלאז בריכוז של 250 ng/µL.
  2. להכין 2-3 טיפות של PVP-HTF eGFP-ויזת עבודה H2B טיפות mRNA ו 5-6 טיפות Hepes buffered טיפות CZB (H-CZB) על המנה 60 מ מ. מכסים את הטיפות האלה עם שמן מינרלי.
    הערה: ניתן לבצע הכנות אלה על הספסל מעבדה. יש אין דרישה לשימוש זרימת אוויר למינריות הקבינט.
  3. משוך זכוכית בורוסיליקט עם פולר micropipette (למשל, P = 500, חום = 825, משיכה = 30, ול = 120, וזמן = 200)
  4. לאחר שבירת קצה הפיפטה כופפי את פיפטה microinjection זכוכית משך קרוב הקצה (מיקרומטר −300 חזרה) בסביבות 30 מעלות תוך שימוש microforge.

5. microinjection

  1. כבה את התנור צלחת על הבמה של micromanipulator כדי למנוע הריגת מופרות עם אלמנט פייזו במהלך ההזרקה mRNA.
  2. רוחצים את בחלק הפנימי של מחטים הזרקת ב HEPES-באגירה-HTF המכיל 10% PVP (PVP-HTF).
  3. לאסוף את מופרות מופרית עם גוף קוטב 2nd (איור 2B) והעבר 20-25 מופרות על גבי התא של השלב מיקרוסקופ שמצורפת micromanipulator.
  4. למלא את eGFP מדולל-ויזת עבודה H2B mRNA לתוך נימי זכוכית בורוסיליקט מן העצות.
  5. להחזיק את הזיגוטה עם פיפטה אחזקות ולאחר מכן מחלקים את pellucida zona ואת קרום cytosolic עם כונן piezo.
  6. להזריק בערך 10 pL של mRNA לתוך הציטופלסמה של מופרות. סיום mRNA-הזרקת בתוך 10 דקות כדי למנוע את הנזק שנגרם על ידי יותר culturing את מופרות בחוץ החממה.
    הערה: אמצעי האחסון הזרקת צריך להיות גדול כמו הגוף קוטב 2nd . אם הסכום של ה-mRNA מוזרק גדול מדי, זה אפשרי לגרום השבר eGFP חינם-ויזת עבודה H2B, העשויים להשפיע על השבר ניידים.
  7. 10 דקות לאחר microinjection, לכבס במים לפחות 3 טיפות, ואז תרבות את מופרות מוזרק ב- CZB ב 38 ° C עד zFRAP ניתוח.

6. zFRAP ניתוח

  1. h 1 לפני ניתוח zFRAP, להפעיל את הלייזר ואת פלטה צמוד לשלב של מיקרוסקופ קונפוקלי. הגדר את הטמפרטורה ב- 38 מעלות צלזיוס.
  2. לשים µL 6-10 של מדיה CZB HEPES באגירה מכוסה שמן מינרלי על המנה התחתון 60 מ מ זכוכית חמה על המזגן עד אוסף זיגוטה.
  3. 8 - 12 שעות לאחר ההפריה, לאסוף 5-10 מופרות eGFP-ויזת עבודה H2B-הבעת ' והעברת לתוך µL 6-10 של טרום חימם ירידה בינונית באגירה HEPES CZB.
    הערה: כדי להימנע culturing יותר מחוץ חממה, 5-10 eGFP-ויזת עבודה H2B-הבעת ' מופרות שימשו-כל ניתוח. 5-10 מופרות ניתן לנתח בתוך 1 h.
  4. הגדר את הלבנת ותנאי הדמיה לפי הוראות היצרן. המקרה לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ (טבלה של חומרים) מוצג להלן:
    1. שימוש 60 X עדשה שמן (60 X 60 X / 1.35 שמן).
      הערה: עדשות עם רגישות גבוהה יותר הצג ההגדלה (מפתח נומרי גבוה יותר) גבוהה יותר.
    2. הגדר סריקה מהירות 4.0 µs/פיקסל והגודל כמו "512" על "רכישת הגדרה" (משלימה איור 1).
    3. הגדלת זום דיגיטלי כדי "5" (משלימה איור 1).
      הערה: A זום גבוה יותר נדרש לזהות אם המוקד להיסחף מתרחש או לא.
    4. פתח רשימת צבען (משלימה איור 1), ואז לבחור "EGFP". להגדיר זמן התבוננות 1.6 s (מרווח מוגדר בהגדרת "ריצה חופשית") (משלימה באיור 1)
      הערה: תצפיות יותר עלול לגרום יותר נתונים מפורטים, אך זה עלול גם לגרום phototoxicity. בניתוח zFRAP, זמן התבוננות 1.6 s נראה מספיק כדי לזהות את האסימטריה הורים של כרומטין ולגמישות.
    5. הגדר את המספר של תמונות כמו 12 בסך הכל (משלימה איור 1).
    6. להתחיל "גירוי הגדרה" לוח ולאחר מכן לחץ "ראשי" ב- UseScanner. הגדר סריקה מהירות כמו 10.0 µs לפיקסל. לחץ על "הפעלה של סדרת" ולאחר מכן הגדר PreActivation "3 מסגרות" והשעה הפעלה כמו "5 שניות" (משלימה איור 1).
    7. לחץ על "פוקוס x 2", כוון את הפוקוס ולאחר מכן "Stop".
    8. הגדר הלבנה והדמיה עוצמת הלייזר (477 ננומטר)-110 ו-15 µW, בהתאמה, על ידי התאמת "לייזר gage כוח" (משלימה איור 1).
      הערה: הלבנת מאוד חזקה עלולה לגרום אזור מולבן גדול יותר, מה שגורם לקשיים לניתוח כמותי. למדידת עוצמת הלייזר, השתמש מד הכוח. חשוב לאשר את עוצמת הלייזר כדי למנוע את השפעת הרעת הקשורות זמן עוצמת הלייזר.
    9. לחץ על "קליפ מלבני" (משלימה באיור 1) בחלונית הגדרת גירוי. הגדרת האזור של הריבית (רועי; אדום; רועי #1B) 40 x 40 פיקסלים (7.6 מיקרומטר2). הכנת אזור הפניה (REF; ירוק; רועי #2), ועל רקע (BG; כחול; רועי #3) "באמצעות העתק ROI" והדבק "רועי" (לחצן העכבר הימני על העכבר).
      הערה: ניתן להגדיר את גודל הפיקסל דרך "רועי מנהל" אשר יכול להיקרא על ידי לחיצה על הלחצן הימני של העכבר כשהסמן מצביע על רועי. ROIs גדולים יותר הם חשבו להיות טוב יותר שכן הם באפשרותך לתקנן את הפיזור של התוצאה zFRAP. עם זאת, גדול מדי של רועי אינם יכולים לשמש עבור ניתוח זה כי זה עושה את זה קשה להימנע מבשר גרעינון הגוף (NPB). eGFP-ויזת עבודה H2B במחלקה הזו היה נחשב חינם מכרומטין והראה מדהים ניידות גבוהה3. רועי ואזורי REF להפרידם ככל האפשר. אם אלה שני אזורים קרובים, הלבנת עשוי להשפיע גם על האזור של שופט.
    10. לחץ על "חי" על הבר כלי ולאחר מכן להתחיל "Live עלילה" (משלימה איור 1).
      הערה: עלילת חיים מצביע על ידי קרינה פלואורסצנטית עוצמת האות בתוך כל רועי והוא משמש להתאמת עוצמת הלייזר באמצעות HV. שים לב כי אם רועי לא נבחרה, זו לא היתה עוצמה יתגלה בלוח מגרש בשידור חי.
    11. קביעת המיקום רועי
      הערה: רועי ניתן להעביר על ידי גרירת אל המיקום הרצוי ב- pronuclei. (1) להיות בטוח למנוע את גרעינון, (2) להתאים את רועי כולו לתוך נוקלאופלזמה. אינם מכילים את האזור מחוץ לאזור של קרום גרעיני (ציטופלזמה) ב- ROI. הלוקליזציה של eGFP-ויזת עבודה H2B הוא מוגבל מאוד לתוך נוקלאופלזמה כך שיהיה קל למצוא אם רועי מכיל הציטופלסמה או לא על ידי על ידי קרינה פלואורסצנטית של eGFP-ויזת עבודה H2B. Pronuclei זכר נוטים להיות גדולים יותר מאלה של נשים, לעתים קרובות הלוקליזציה ליד הגופה קוטב 2nd . תוך שימוש בקריטריונים אלה, לשפוט את pronuclei זכר או נקבה.
    12. לחץ על "פוקוס x 2" (משלימה באיור 1) ולאחר מכן התאם את HV כוח gage של הערוץ עבור EGFP לתוך עוצמת קרינה פלואורסצנטית בסביבות 2000 (עוצמת קרינה פלואורסצנטית ניתן לראות בחלון "מזימה בשידור חי").
  5. לחץ על "הזמן" ולאחר מכן "XY" (משלימה באיור 1) כדי להתחיל את הניתוח zFRAP.
    הערה: אם כפתור "הזמן" נבחר כראוי, "t" מופיעה על כפתור "XY".
    1. לחץ על "סדרת עשה" (משלימה איור 1), אשר מופיעה לאחר FRAP הדמיה ליד כפתור"XY" ולאחר מכן לקבל נתונים מנותח FRAP.
    2. שמור את הקובץ "2D תמונת נוף-כאשר XXXXX" בתור קובץ בשם המועדפת (oib-תבנית קובץ) על ידי "שמור בשם" (Ctrl + Shift + S יכול גם לשמש).
    3. רועי, שופט, BG ולאחר מכן לוחצים על (Ctrl + A יכול גם לשמש) "סדרת ניתוח" בחלון "תמונת תצוגה 2D".
    4. לקבל נתונים FRAP שורה ולאחר מכן לחץ על "הלחצן בחלון מגרש בשידור חי שמור".
      הערה: שורת נתונים כמותיים FRAP נשמר כקובץ csv.
  6. אין שליטה zFRAP, שים חלק מופרות הזריק mRNA על המסירה, שנמצא בקצה כלי הזכוכית התחתונה כדי למנוע את ההשפעה של זריחה תצפית.

7. נתוני חישוב

  1. תוך שימוש נתונים כמותיים המתקבלים, להפוך את הגרף של "עיקול שחזור" ו- "שבר ניידים" על-ידי Excel כמוצג3,הפניות7 עם מספר שינויים (ראה להלן ומשמש כתוספת קובץ excel).
  2. לחשב שהבוטות היחסית על-ידי חיסור הערך של BG מאלו של רועי, שופט ב 12 תמונות עבור כל נקודת זמן.
  3. לחלק את הערך של רועי על ידי השופט. כתוצאה מכך, ניתן להשיג ציונים 12 מתוקננת שהבוטות היחסית בכל נקודה בזמן.
  4. לחשב את הממוצע של הציון היחסי עבור רועי 3 תמונות שצולמו לפני צילום הלבנת.
  5. לחשב את קצב ההחלמה. לחלק שה-12 השיג ציונים היחסי עבור ROI של תמונות שצולמו לכל נקודת זמן (להשיג אצל 7.1.2.) לפי הממוצע של הציון היחסי לפני צילום הלבנה (להשיג אצל 7.1.3.). צייר עקומה התאוששות עם שימוש בציונים (2E איור).
  6. לחשב את קצב הלבנת.
    הערה: הלבנת קצב (%) = 100 - קצב ההתאוששות של 4ה image.
  7. לחשב את השבר ניידים (MF) באמצעות הנוסחה כפי שמוצג להלן10,11,12
    MF (%) = 12th שחזור קצב (נקודת הקצה) - קצב ההתאוששותה 4 / הלבנת קצב × 100.

8. השתלת

  1. חבר התבגר ICR נקבות בגיל 8-12 חודשים עם עיקור עכברים ICR זכר בלילה לפני העובר להעביר על ידי נותן להם להיות באותו הכלוב בן לילה.
  2. לאסוף את העוברים היו מנותח zFRAP, נחוש לפתח לשלב שני תאים.
  3. Intraperitoneally להזריק עכברים הנשי להרדמה tribromoethanol 1.2% 0.7 - 0.9 מ ל או עם 0.35 - mL 0.45 מהסוכנים 0.75/4/5mg/kg medetomidine/midazolam/butorphanol מעורב לפני השתלת.
    הערה: הנפח של ההרדמה נקבע לפי משקל הגוף של עכברים. Tribromoethanol: 0.2 מ"ל/10 גרם של משקל הגוף; medetomidine/midazolam/butorphanol מעורב סוכנים: 0.1 מ"ל/10 גרם של משקל הגוף.
    1. העברת העוברים שלב שני תאים אלה לתוך oviducts של pseudopregnant-נקבה ICR עכברים עם תקע הנרתיק-ימים 0.5 פוסט coitum (dpc).
    2. לאחר המעבר העובר, לשים העכברים הנשי החימום להגדיר ב 37 ° C עד שיתעורר.
  4. 18.5 dpc, להקריב את פונדקאית מאת נקע בצוואר הרחם, לשחזר את הגורים נגזר מופרות מנותח zFRAP בניתוח קיסרי. חלק הגורים התאושש נמסרו עם האמא המאמצת, משקל הגוף שלהם היו העריכו כל שבוע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניתוח zFRAP עם eGFP-ויזת עבודה H2B

כראוי המיוצר mRNA קידוד eGFP-מקש ויזת עבודה-H2B, אשר נראה כי להקה שהוסטו הנגרמת על ידי פוליפוני עוקב (איור 2 א), היה מוזרק לתוך הציטופלסמה של מופרות עם גוף קוטב 2 ב 1-3 h הזרעה (איור 2B). 8-12 שעות לאחר ההפריה, מופרות עם 2 pronuclei מציג את הביטוי של eGFP-ויזת עבודה H2B היו נאספים, נתון zFRAP ניתוח (איור 2C). הניתוח FRAP מורכב מהשלבים הלבנת ושחזור. שלב טרום הלבנה, האות של eGFP-ויזת עבודה H2B יכול להיות שנצפו (איור דו-ממדי-1), אבל ברגע מולבן, האות ירדה לרמה זניחה (איור דו-ממדי-2). אם הלבנה הייתה מוצלחת, חור שחור גדול כמו רועי הופיעו זמן קצר לאחר הלבנת. לאחר ניקוי הפנים, עוצמת האות זריחה eGFP-ויזת עבודה H2B התאושש מעט; האות פלורסנט בהדרגה בשל בתנאיי השבר מולבן של eGFP-ויזת עבודה H2B לתוך רועי מאזור מולבן נוקלאופלזמה (2D באיור-3). לקבלת אישור של ההצלחה של ניתוח zFRAP של כרומטין ולגמישות, מומלץ להשתמש הורים האסימטריה של כרומטין ולגמישות; pronuclei זכר הראה עיקול התאוששות מהירה יותר ושברים נייד יותר מאלה של הנקבות (איור 2E ו- F). אחרי ניתוח zFRAP, שטף, בתרבית מופרות בתקשורת CZB, יכול להתפתח לשלב הבלסטוציסט ללא נזק משמעותי (איור 2G ו- H). גם אם מולבן בתוקף למשך זמן ארוך יותר, מופרות עדיין יכולה לפתח לשלב הבלסטוציסט באותה מידה7.

ניתוח של ההתפתחות מלא לטווח של מנותח zFRAP מופרות

כדי לנתח את ההתפתחות מלא לטווח של עוברי נגזר מופרות מנותח zFRAP, העוברים בשלב שני תאים הועברו לתוך oviducts של האמהות pseudopregnant. כפקדי, הוכנו עוברי תקין, ואחד מוזרק עם ה-mRNA, אבל לא מנותח zFRAP. קצב הילודה של העוברים מנותח zFRAP (41.0%) היה מעט נמוכה יותר בצורה משמעותית מזה של עוברי תקין (62.2%), אבל היה זהה לזה של הפקד zFRAP אין (52.6%) (טבלה 2). לפיכך, zFRAP-ניתוח נראה מעט מזיקות להתפתחות עוברית מלא לטווח. עם זאת, חשוב, הגורים נגזר מופרות מנותח zFRAP נראה בריא, מפותחת (איור 3).

Figure 1
איור 1: איור סכמטי של הזרימה של נהלי הניסויים. הפריה במבחנה : oocytes II (MII) מפה של טרי שנאספו היו הופרתה בזרע capacitated. במבחנה תמלול: RNA שליח (mRNA) קידוד היסטון התמזגו eGFP ויזת עבודה H2B (eGFP-ויזת עבודה H2B) תמללו מן האמרגן SP6 של pTOPO-eGFP-ויזת עבודה H2B3 ליניארית עם לא אני. ה-mRNA eGFP-ויזת עבודה H2B נתון poly A עוקב ולאחר מכן טיהור. ה-mRNA eGFP מטוהרים-ויזת עבודה H2B משמש הזרקה mRNA. הזרקת ה-mRNA: ה-mRNA eGFP מוכן-ויזת עבודה H2B מוזרק לתוך הציטופלסמה של מופרות עם 2nd קוטב הגוף. zFRAP ניתוח: מופרות eGFP-ויזת עבודה H2B-לבטא עברו ניתוח zFRAP. האזור של האינטרסים (רועי; מלבן אדום) היה מולבן עם לייזר חזק, לאחר מכן האות eGFP-ויזת עבודה H2B ירדה לרמה זניחה. לאחר ניקוי הפנים, עוצמת האות eGFP-ויזת עבודה H2B בהדרגה. במבחנה פיתוח: אחרי ניתוח zFRAP, מופרות יכול להתפתח לשלב הבלסטוציסט. השתלת: שלב שני תאים, העוברים מנותח zFRAP הועברו לתוך oviducts של עכברים הנשי pseudopregnant. 18 ימים יכולה להיות מושגת הגורים בשידור חי מאוחר יותר, בריאים מעוברים מנותח zFRAP. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: ניתוח zFRAP של מופרות עם eGFP-ויזת עבודה H2B. (א) תמונת הנציגה של mRNA הוכנו כראוי על ידי במבחנה שעתוק ו poly A עוקב. ליין 1: פוליפוני קדם עוקב; ליין 2: פוסט poly A עוקב. MRNA (B) , קידוד eGFP-ויזת עבודה H2B הוזרק לתוך הציטופלסמה של מופרות עם 2nd גוף קוטב 1-3 h פוסט הזרעה. מדד מחירי הבתים (. של). סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר (ג) eGFP-ויזת עבודה H2B-הבעת ' מופרות שנאספו-מדד מחירי הבתים של 8-12. כוכביות לבן הצג גרעינון מבשר הגופות (NPB). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר (ד) eGFP-ויזת עבודה H2B ביטוי זוהה את נוקלאופלזמה כולו אפילו ב NPB בשלב טרום הלבנה (D-1), זמן קצר לאחר ניקוי הפנים (D-2), ואחרי התאוששות (D-3). גרעיני הריריים (קווים מנוקדים לבנים) ואת NPB (כוכביות) מסומנים. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. עקומת השחזור (E, F) ושברים ניידים, התקבלו 45 מופרות בניסויים עצמאית 5. כחול ואדום עולה זכר ונקבה, בהתאמה. בזמן התאוששות, עיגולים יחיד להצביע על נקודת מדידה. ב פיזור החלקות, ציין יחיד נקודות הציון של שברים ניידים המתקבל pronuclei. (G) מוצגים להחליפן בתמונות של ההתפתחות של מנותח zFRAP מופרות. שני תאים, 4-8 תאים, ו הבלסטוציסט שלב עוברי ב 24, 48, ו. מדד מחירי הבתים, של 96 בהתאמה. העיגול הצהוב מצביע על הבלסטוציסט מפותח. הבלסטוציסט זה מוגדל, המוצגים בלוח השמאלי. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (H) גרף מייצג פעילות של שיעורי התפתחותית של מנותח zFRAP עוברי. ברים מצביעים על עוברי מנותח zFRAP (zFRAP) (לבן) ושליטה עוברי (שחור) מוזרק עם ה-mRNA אבל אין ניתוח zFRAP (לא zFRAP). הנתונים המוצגים הם 3 ניסויים עצמאית, בחינת עוברי 57 לפחות סך הכל. שני תאים, 4-8 תאים, morula (מו), ו בשלבים הבלסטוציסט (Bl) נצפו ב 24, 48, 72 ו. מדד מחירי הבתים, של 96 בהתאמה. איור זה השתנה [Ooga et al 2017]7. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: לצמיחה בריאה של הגורים נגזר מנותח FRAP מופרות. (א) מוצגות התמונות של הגורים נגזר מנותח zFRAP מופרות. (B) צמיחה רגיל נצפתה במהלך ההנקה של הגורים מנותח zFRAP. (ג) הגרף מצביע על שהמשקל של הגורים נגזר עוברי תקין (כחול), העוברים בקרה מולבן (אדום), העוברים מנותח zFRAP (ירוק). גוף משקולות ולהמליט 29 נגזר עוברי תקין, 24 מן העוברים לא-zFRAP ו- 15 מעוברים מנותח zFRAP על פני תקופה 8 שבועות. הערכים שצוינו על ידי כוכביות שונים באופן משמעותי הפקד ללא פגע. איור זה השתנה [Ooga et al 2017]7. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

משלימה איור 1: ממשק משתמש גרפי לניתוח FRAP. (א) סקירה כללית של ממשק משתמש גרפי הוצגה. (ב) מוגדל תמונות עבור כל חלון הוצגו. (1) הגדרת רכישה החלון משמש עבור הגדרת תנאי רכישה של התמונה. (2) הגדרת גירוי החלון משמש להגדרת המצב הלבנה. בחלון זה ניתן לפתוח על ידי לחיצה על הלחצן על החלון רכישת התמונה. (3) חלון פקד רכישת התמונה משמשת לניתוח FRAP. (4) תצוגה חיה מראה את התמונה הנוכחית (התמונה הנוכחית מופיע לאחר לחיצה על המוקד x2 או לחצן XY). מלבנים כחול אדום, ירוק, קל להראות את רועי (אזור בעל עניין), שופט (הפניה) ו- BG (רקע), בהתאמה. (5) 2D התצוגה מראה את התמונה מנותח FRAP ומופיע לאחר לחיצה על "הסדרה נעשה" כפתור. במקרה זה, pronucleus זכר מנותח FRAP מוצג בתור דוגמה. שלושה מלבנים עם 8 נקודות מציינות אזורים אלה נבחרו. (6) לחיות העלילה מראה את עוצמת קרינה פלואורסצנטית נוכח בכל אזור. הצירים X ו- Y מציינים זמן (ms) ועוצמת קרינה פלואורסצנטית, בהתאמה. (7) ניתוח סדרה מראה עקבות קרינה פלואורסצנטית בעוצמה בכל אזור, מופיעה לאחר לחיצה על כפתור ניתוח סדרה על חלון תצוגת 2D. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

1 קובץ Excel משלים: נתוני לדוגמה וחישוב הנתונים. (גיליון 1) נתונים לדוגמה עבור pronucleus זכר מוצג. אמא מציין את מספר רצופים של התמונה. עוצמות שורה עבור כל אזור (רועי Ref, BG) היו מצוינת. (גיליון 2) דוגמא לחישוב הנתונים מוצג. פרוטוקול מספר מציין את המקומות המתאימים במקטע פרוטוקול. הערות להסביר את המשמעות של כל הציון. הנוסחה מספריים יכולים להתייחס על-ידי לחיצה על התאים. דוגמאות של שחזור עקומה גרף עמודות שבר ניידים מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

יום-3 יום-2 יום-1 יום של FRAP יום +1 יום +3 יום +19
mRNA הכנה תבנית חיתוך פלסמיד
(במשך הלילה)		 1). טיהור תבנית פלסמיד
2)-תמלול במבחנה
3). במבחנה פולי עוקב
4)-mRNA בדיקת האיכות על ידי אלקטרופורזה
FRAP 1). הכנת מניפולציה pipet, קאמרית
2)-mRNA הזרקה
3)-ניתוח zFRAP
4)-חישוב של שחזור עקומה, שבר ניידים* 2
IVF וניתוח של התפתחות טרום השרשה אק ג זריקה 1). הזרקת hCG 1). capacitation זרע
2). דגירה מראש של מדיה (HTF) 2). הפריה חוץ גופית
הכנה של אמצעי התקשורת (HTF, CZB, H-CZB ו- PVP-CZB) 3)-פיתוח של הערכה
השתלת הכנת נקבה pseudopregnant
(הזדווגות עם זכר שם.* 1)		 העברת העוברים שלב 2-תא pseudopregnant נקבה-נקבה הערכת קצב הילודה
* 1: עיקור עכבר זכר צריך להיות מוכן לפחות שבועיים לפני ההזדווגות
* 2: החישוב יכול להיות ממושך לתוך למחרת (יום +1)

טבלה 1: לוח הזמנים של הניסויים. ביום הניתוח FRAP נחשב היום 0 הניסויים צריך להתבצע מסומנים על הימים המתאימים עבור כל פריט.

קטגוריות אמא של מופרות מוזרק אמא של מופרות התאושש לאחר ההזרקה mRNA (%) * אמא של מופרות ניתח אמא של העבירה אמא של נמענים אמא גורים (%) * * * המשקל של הגורים (g) אמא גורים מהונדס
שלב 2-תא עוברי (%) * *
ללא פגע - - 99 98 (99.0) 9 61 (62.2) 1.64±0.02 n.d
אין FRAP 420 398 (בכ-94.8) 82 78 (95.1) 7 41 (52.6)a,b 1.66±0.03 n.d
FRAP 79 78 (98.7) 7 32 (41.0)b 1.69±0.03 0
*: מחושב על ידי חלוקת ללא. של מופרות מוזרק; * *: מחושב על ידי חלוקת ללא. של מופרות ניתח; : מחושב על ידי חלוקת ללא. שלב 2-תאים שהועברו העובר. a, b: עילי להצביע על הבדל משמעותי (P < 0.05). n.d: לא נקבע. טבלה זו שונתה [Ooga et al 2017]7.

בטבלה 2: קצב הילודה של העוברים שנותחה: הפוטנציאל ההתפתחותי של העוברים, שעד כה היה מנותח FRAP, מלא לטווח נבדק. קצב הילודה שהושג של העוברים אלה מוצג. כפי פקדים, ללא פגע, עוברי אין מנותח FRAP נבחנו גם. המשקולות של הגורים נגזר מן העוברים שהועברו אלה מוצגים גם כן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כפי גילה במחקר זה, הניתוח zFRAP אינו גורם נזק קריטי להתפתחות מלא לטווח, מציע שיטה זו הוא כלי מאוד שימושי כדי לחשוף את הקשר בין אירועים מולקולריים עובריים פוטנציאל התפתחותי. במהלך התיכנות לתוך התא-השני כמו מצב של תאים ES, שלפיו הפוטנציאל דיפרנציאלית של תאים אלה הופך גבוהה כמו זו של שני תאים בשלב עוברי כרומטין ולגמישות שינוי זה דומה עם שני תאים בשלב עוברי5. בהתאם לכך, אפשרי כי ולגמישות כרומטין zygotic חשוב בשביל עובריים פוטנציאל התפתחותי. ספירת תאים סומטיים גרעינים הועבר לתוך הציטופלסמה של oocytes הראתה ולגמישות כרומטין נמוכה יותר בהשוואה לא רק pronuclei אבהית, אלא גם pronuclei האימהי, רומז שהוא היעדרה של רכישת כרומטין פתוח במופרות העברת גרעין תאים סומטיים מעורב הפוטנציאל ההתפתחותי המסכן שלהם. באופן קולקטיבי, הניתוח zFRAP נראה שימושי עבור שחקרתי הגנום התכנות מנגנונים.

מערכת zFRAP יכול לעשות את זה ניתן לבחור מופרות עם פוטנציאל התפתחותי גבוה. במחקר ראשוני, בנוסף SCNT, התגלה זה מסביב spermatid הזרקה (ROSI)-נגזר מופרות הארבור כרומטין חריג ולגמישות. חוץ מזה, התברר כי חלק מהם הראו כרומטין ולגמישות ברמת להשוות IVF-derived מופרות, מופרות האלה שיש פוטנציאל התפתחותי גבוה. חשוב, מופרות של כרומטין אילו ולגמישות הוערך על ידי zFRAP יכול לפתח למונח. בעתיד, לכן, ייתכן ניתן להבחין את SCNT ואת ROSI-נגזר מופרות עם פוטנציאל התפתחותי גבוה יותר מכל אלה נמוכה יותר על-ידי הערכת כרומטין ולגמישות על-ידי zFRAP.

עד כה, מחקרים קודמים הראו השירות של חיה הדמיה שיטה לניתוח של המדינה epigenetic של העוברים. חלק מהשיטות הדמיה בשידור חי יכול לגלות כל שינוי epigenetic (למשל שינוי ה-DNA/היסטון) ב-13,של העוברים14, אבל באמצעות zFRAP, זה אפשרי להעריך את ולגמישות כרומטין zygotic ללא הורג את התאים. כרומטין ולגמישות נראה להיות מושפעת על ידי שינויים epigenetic. לדוגמה, הטרוכרומטין באיזה שינוי epigenetic נוקשים כגון H3K9me3 ו- H3K27me3 הם מועשרים הראה ניידות היסטון נמוכה יותר מאשר אזור תהיה3,15. ואכן, הטיפול, תרכובת כימית אשר ממירה המדינה epigenetic, גרם משינוי של כרומטין ולגמישות מופרות. לכן, שימוש zFRAP, אפשרי לחשוף את המדינה epigenetic ההרצה של הכרומטין. חשבו שתהיה זו יתרון להערכת הפוטנציאל ההתפתחותי של מופרות.

ההזרקה של mRNA קידוד eGFP-ויזת עבודה H2B עבור zFRAP יש חיסרון אך מגביר את הרב-גוניות של zFRAP. Demerit של הזריקה mRNA הוא הנזק שנגרם על ידי microinjection. כדי להימנע מכך, היא יעילה מאוד לנצל את העכבר הטרנסגניים eGFP-ויזת עבודה H2B. אם eGFP-ויזת עבודה H2B העכבר הטרנסגניים קו, צאצא עשוי להיות גדל שיעור בהשוואה לבמקרה של שימוש mRNA microinjection. לעומת זאת, זה בזכות של mRNA הזרקת zFRAP הזה מאפשר שימוש מכל סוג שהוא של זן של פראי-סוג עכברים. החוקרים שרוצים להשתמש zFRAP עם התעניינותם של העכבר זן לא צריך להכין את המתח העכבר הרצוי עם transgene eGFP-ויזת עבודה H2B. זה הופך להיות בולט יותר בניתוח הטרנסגניים (למשל. ביטוי/נוקאאוט) או קו העכבר נוקאאוט. החוקרים שרוצים לנצל את zFRAP עבור נושאי המחקר שלהם עם הקו הטרנסגניים/הסתרה אין להכין קו eGFP-ויזת עבודה H2B הטרנסגניים במספר מצומצם של ההתעניינות שלהם, אלה. הדבר מעיד על יתרון על ההתקדמות של המחקר.

ניתוח ההדמיה בשידור חי עם עוברי דורש ידע מיוחד מכשירים מיוחדים מאוד יקר, משומנת. לכן, מבוא במערכת כזו ניסיוני אינה החלטה קלה. מערכת ניסויית שהוקם במחקר זה צריך רק תרמו-הגל מלבד לייזר קונפוקלי מיקרוסקופ סורק. בנוסף, ללמוד את השיטה הוא קל כך מתחיל ב מעבדה ניתן ללמוד את השיטה של zFRAP בתוך חודש. עם זאת, ישנם כמה בעיות עדיין צריך שיקול דעת. ראשית הוא המוקד סחיפה. במהלך התצפית, זה אפשרי כי את pronuclei או את מופרות תסטה המיקום הציגה לפני התצפית מתחילה. אם הסחף המוקד מתרחשת, ROIs תסטה גם המיקום הנכון. כתוצאה מכך, נתונים כמותיים הופך חסר ערך. כדי להימנע מבעיה זו, החוקר יש להשתמש את המכסה של הכלים התחתון זכוכית להגנה כנגד החלון, של המזגן ולחכות הרחבת שמן מעל העדשה המטרה. אם המוקד להיסחף להתרחש, נתונים מופרות deviating צריכים להיות מושלך, ניתוח FRAP 2nd עם מופרות אותו לא מומלץ. במחקר זה, קיצור הזמן תצפית s 1503 ל- s כ-257 היה מאוד מועיל. השני הוא יותר זמן דגירה מחוץ החממה. מאז חשיפה ארוך יותר לסביבה מחוץ החממה היא בהחלט מזיקים לפיתוח עובריים, הומלץ לסיים את הניתוח-FRAP בתוך h 1 לכל אצווה. מספר מופרות מנותח FRAP בתקשורת באגירה HEPES על הכלים התחתון זכוכית צריך להיות 6-10. במצב זה ניסיוני, המספר המרבי הוא בסביבות 30 במשך 4 שעות אבל אם מופרות יותר נדרשים, ניתן לנתח מופרות 20 לכל h על-ידי לדחות את ההערכה בעוצמה פלורסנט באזור הפניה ורקע. השלישי הוא "הקשורות בזמן ההתדרדרות של הלייזר של מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי". אם הלייזר הלבנה אינה מספיקה, הנתונים הכמותיים הנכונה אינה יכולה להתקבל בשל הלבנת לא מספיקות. אכן, אסימטריה הורים של כרומטין zygotic ולגמישות שלא ניתן להשיג עם לייזר הלבנת חלש. כדי למנוע זאת, מומלץ לבדוק אם עוצמת הלייזר החלישה כשיגיע. במחקר זה, 110-µW הלבנת היה מספיק לצורך רכישת אסימטריה הורים.

zFRAP ניתוח יכול לשמש עבור סוגים אחרים של חלבונים, בנוסף הליבה שינויים היסטוניים. מאז שינויים הליבה היסטוניים להראות ניידות נמוכה באופן בולט, יותר סה כ זמן התצפית (כ-25 s במחקר זה) יש צורך בניתוח zFRAP. לכן, כדי לנתח מספר ניכר של מופרות, culturing בתקשורת באגירה HEPES על התנור במשך זמן רב היא בלתי נמנעת. מצד שני, ניתוח zFRAP של חלבונים ניידות גבוהה, הזמן הכולל תצפית ניתן להגדיר קצר, הפעלת שעת culturing בתקשורת באגירה HEPES החימום יהיה קצר. לכן, מאז חשיפה ארוך יותר לסביבה מחוץ החממה מזיקה מאוד להתפתחות עוברית, zFRAP ניתוח חלבונים חוץ הליבה שינויים היסטוניים, אשר יש ניידות גבוהה מטבעם, נראה מראים רעילות נמוכה יותר מאשר שינויים היסטוניים הליבה . יש לקוות כי מערכת ניסויית זו תסייע בהמשך החקירה של קשרי הגומלין בין האירועים המולקולריים המתרחשים ופיתוח עובריים שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים Kishigami סטושי סאיאקה וואקאיאמה, Hiroaki Nagatomo, Kamimura סטושי, קאנה Kishida על מתן תגובות ביקורתיות ותמיכה טכנית. עבודה זו מומן בחלקו על ידי משרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה התוכנית לקידום הרפורמה של האוניברסיטאות לאומי כדי הפעולה; החברה יפן לקידום המדע (16H 02593), אסדה למדע של קרן המדע טקדה כדי T.W. התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם או אופן ההכנה של כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal laser scaning microscope Olympus FV1200 FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7)
Thermo plate Tokai Hit TP-110RH26
Inverted microscope Olympus IX71
Micro manupilator Narishige MMO-202ND
Pieze Micro Micromanipulator Prime tech PMAS-CT150
35 mm culture dish Falcom 351008 35 x 100 mm style; for IVF
60 mm culture dish Falcom 351007 60 x 15 mm style; for embryo culture
50 mm culture dish Falcom 351006 50 x 9 mm style; for manipulation on the stage
50 mm glass bottom dish Matsunami D910400 50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis
Mineral oil Organic spceiality chemicals 625071 For FRAP analysis on the glass bottom dishes
Mineral oil Sigma M8410-1L For IVF and embryo culture
glass capillary Drummond 1-000-1000 For handling mouse zygotes
Borosilicate glass Prime tech B100-75-10-PT For microinjection of mRNA
Micropipett puller Sutter instrument P-97/IVF For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm) 
Microforge  Narishige MF-900
mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit Thermo
Fisher scientific		 AM1340
Poly (A) tailing kit Thermo
Fisher scientific		 AM1350
PVP solution 10% (PVP-HTF) IrvineSceientific 99311 HEPES buffered HTF containing 10% PVP
Sodium HEPES Sigma H3784
pTOPO eGFP-H2B Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6)
NorthernMax Gly Sample loading Dye  Thermo
Fisher scientific		 AM8551 For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA
Phenol chloroform isamyl alcohol nacalai tesque 25970-14
Chloroform nacalai tesque  08401-65
Not I TOYOBO NOT-111X
Ethachinmate WAKO 318-01793
3664 Otical power meter Hioki 3664  Power meter for laser power
Stereomicmicroscope Olympus SZX16

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Burton, A., Torres-Padilla, M. E. Epigenetic reprogramming and development: a unique heterochromatin organization in the preimplantation mouse embryo. Brief Funct Genomics. 9, 444-454 (2010).
  2. Okada, Y., Yamaguchi, K. Epigenetic modifications and reprogramming in paternal pronucleus: sperm, preimplantation embryo, and beyond. Cell Mol Life Sci. 74, 1957-1967 (2017).
  3. Ooga, M., Fulka, H., Hashimoto, S., Suzuki, M. G., Aoki, F. Analysis of chromatin structure in mouse preimplantation embryos by fluorescent recovery after photobleaching. Epigenetics. 11, 85-94 (2016).
  4. Meshorer, E., et al. Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells. Dev Cell. 10, 105-116 (2006).
  5. Boskovic, A., et al. Higher chromatin mobility supports totipotency and precedes pluripotency in vivo. Genes Dev. 28, 1042-1047 (2014).
  6. Yamagata, K., Ueda, J. Long-term live-cell imaging of mammalian preimplantation development and derivation process of pluripotent stem cells from the embryos. Dev Growth Differ. 55, 378-389 (2013).
  7. Ooga, M., Wakayama, T. FRAP analysis of chromatin looseness in mouse zygotes that allows full-term development. PLoS One. 12, e0178255 (2017).
  8. Quinn, P., Begley, A. Effect of human seminal plasma and mouse accessory gland extracts on mouse fertilization in vitro. Australian journal of biological sciences. 37, 147-152 (1984).
  9. Chatot, C. L., Lewis, J. L., Torres, I., Ziomek, C. A. Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium. Biology of reproduction. 42, 432-440 (1990).
  10. Bae, J., Sung, B. H., Cho, I. H., Song, W. K. F-actin-dependent regulation of NESH dynamics in rat hippocampal neurons. PLoS One. 7, e34514 (2012).
  11. Dieteren, C. E., et al. Defective mitochondrial translation differently affects the live cell dynamics of complex I subunits. Biochim Biophys Acta. 1807, 1624-1633 (2011).
  12. Subramanian, V., et al. H2A.Z acidic patch couples chromatin dynamics to regulation of gene expression programs during ESC differentiation. PLoS Genet. 9, e1003725 (2013).
  13. Hayashi-Takanaka, Y., et al. Tracking epigenetic histone modifications in single cells using Fab-based live endogenous modification labeling. Nucleic Acids Res. 39, 6475-6488 (2011).
  14. Yamazaki, T., Yamagata, K., Baba, T. Time-lapse and retrospective analysis of DNA methylation in mouse preimplantation embryos by live cell imaging. Dev Biol. 304, 409-419 (2007).
  15. Puschendorf, M., et al. PRC1 and Suv39h specify parental asymmetry at constitutive heterochromatin in early mouse embryos. Nat Genet. 40, 411-420 (2008).

Tags

התפתחותית ביולוגיה גיליון 136 zFRAP ניתוח הכרומטין zygotic לפתוח כרומטין ולגמישות כרומטין ניידות היסטון פוטנציאל התפתחותי
זריחה zygotic השחזור לאחר הלבנת-צילום ןועברל ולגמישות כרומטין המאפשרת פיתוח מלא לטווח
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ooga, M., Funaya, S., Aoki, F.,… More

Ooga, M., Funaya, S., Aoki, F., Wakayama, T. Zygotic Fluorescence Recovery After Photo-bleaching Analysis for Chromatin Looseness That Allows Full-term Development. J. Vis. Exp. (136), e57068, doi:10.3791/57068 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter