Summary
Frouxidão de cromatina parece estar envolvido no desenvolvimento potencial dos blastómeros. No entanto, não se sabe se a frouxidão de cromatina pode ser usado como um índice confiável para o potencial do desenvolvimento de embriões. Aqui, tem sido descrito um sistema experimental no qual zigotos de frouxidão-avaliada de cromatina podem desenvolver à gestação completa.
Abstract
Imagem ao vivo é uma ferramenta poderosa que permite a análise dos eventos moleculares durante a ontogênese. Recentemente, frouxidão de cromatina ou abertura tem demonstrada ser envolvido no potencial de diferenciação celular de células-tronco embrionárias pluripotentes. Anteriormente foi relatado que em comparação com células-tronco embrionárias, zigotos abrigam uma estrutura extremamente afrouxada cromatina, sugerindo sua associação com sua totipotência. No entanto, até agora, isso não foi resolvido se essa estrutura extremamente solta/abrir cromatina é importante para o potencial do desenvolvimento embrionário. No presente estudo, para examinar esta hipótese, foi desenvolvido um sistema experimental no quais zigotos que foram analisados por fluorescência recuperação após o clareamento foto pode desenvolver a termo sem qualquer dano significativo. Importante, este sistema experimental precisa de apenas um aquecedor térmico-placa além de um laser confocal microscópio. As conclusões deste estudo sugerem que recuperação de fluorescência após análise de análise (FRAP) foto-branqueamento pode ser usado para investigar se os eventos moleculares na cromatina zigóticos são importantes para o desenvolvimento do termo.
Introduction
Após a fertilização, a estrutura da cromatina é alterada dinamicamente, e estrutura da cromatina zigóticos é então eventualmente estabelecido1,2. Durante este período, em pró-núcleos paternos, proteínas da cromatina dominante é mudada de protamina na histona. A cromatina resultante é extremamente diferente dos espermatozoides e ovócitos femininos em vários pontos (por exemplo, composição variante de histona, modificação de histona). Assim, a cromatina foi formada é pensada para ser importante para o posterior desenvolvimento embrionário. No entanto, apesar dos esforços para revelar os detalhes da estrutura da cromatina zigóticos durante longos períodos, métodos para avaliar a qualidade de zigotos ou para prever seu desenvolvimento termo na fase de uma célula, analisando sua estrutura da cromatina nunca foram estabelecido.
No estudo anterior, é descoberto que zigotos tem uma estrutura extremamente afrouxada cromatina3. Atualmente, frouxidão de cromatina ou abertura é acreditada para ser um importante factor de diferenciação celular potencial de células estaminais embrionárias (ES)4. Pilhas do ES não apresentam homogeneidade na natureza, mas são bastante heterogêneas; em colônias de células ES, alguns transitoriamente adquirem um maior potencial de diferenciação comparável aos blastômeros de embriões do estágio de duas células. Durante esta transição para a dois-célula como estado, frouxidão de cromatina no ES células no que é comparável com o estágio de duas células de embriões5alterações. Assim, frouxidão de cromatina parece ser importante para o potencial de diferenciação celular e é possível que abrir extensivamente cromatina em zigotos é útil para a avaliação do potencial de desenvolvimento zigóticos.
Imagem ao vivo é uma ferramenta poderosa que permite a análise dos eventos moleculares durante a ontogênese desde que esse método permite o posterior desenvolvimento e até mesmo termo desenvolvimento6. Como um dos métodos de imagem ao vivo, FRAP análise tem sido usado para examinar a frouxidão de cromatina embriões pré-implantação e ES células3,4,5. Se frouxidão zigóticos cromatina pode ser analisado sem um efeito prejudicial sobre o termo desenvolvimento pela análise FRAP, pode ser uma ferramenta valiosa para a avaliação da qualidade dos embriões na fase de uma célula. No entanto, os efeitos sobre o desenvolvimento do termo por esse método experimental não foram examinados. Recentemente, um sistema experimental usando FRAP avaliar frouxidão zigóticos cromatina foi desenvolvido. Porque este era um novo sistema de observação de zigotos, ele foi denominado como zigóticos FRAP (zFRAP). zFRAP não afetou criticamente termo desenvolvimento e tem sido relatado em outro lugar7. Neste relatório, é descrito o protocolo desse método experimental.
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Protocol
Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório da Universidade de Yamanashi. O protocolo foi aprovado pelo Comité sobre a ética de experimentos Animal da Universidade de Yamanashi (número de licença: A24-50). Todas as cirurgias foram realizadas sob anestesia tribromoetanol, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. Uma visão geral ilustrada dos procedimentos e horário são mostrados na Figura 1 e tabela 1, respectivamente.
1. preparação do RNA mensageiro (In Vitro e transcrição de mRNA eGFP-H2B)
- Linearizar 5 µ g de modelo DNA pTOPO-eGFP-H2B3,7 com 30 U de não eu em 50 µ l a 37 ° C durante a noite.
- Colete 1,5 µ l de DNA digerido para confirmação se completamente digerido por eletroforese.
- Aplica 1,5 µ l e 3 a 5 µ l de DNA não digerido com carregamento de tintura para o poço do gel de agarose 2%, respectivamente e sujeitos a electroforese.
Nota: Se completamente digerida, é observada uma única banda (aprox. 5 kb). DNA não digerida é usado como um controle, que aparece em uma posição diferente.
- Aplica 1,5 µ l e 3 a 5 µ l de DNA não digerido com carregamento de tintura para o poço do gel de agarose 2%, respectivamente e sujeitos a electroforese.
- Adicionar 151,5 µ l de DDQ2O e 200 µ l de álcool isoamílico/fenol/clorofórmio (25:24:1) para o restante digerido DNA.
- Misture vigorosamente pelo vórtice.
- Centrifugar a velocidade máxima durante 15 min.
- Recuperar o sobrenadante e em seguida, adicione 200 µ l de clorofórmio.
- Misture vigorosamente pelo vórtice.
- Centrifugar a velocidade máxima por 15 min.
- Recuperar o sobrenadante e adicionar 20 µ l de acetato de sódio 3M e 1,5 µ l de ethachinmate.
- Misture vigorosamente pelo vórtice.
- Adicione 550 µ l de etanol 100% e em seguida, misture vigorosamente pelo vórtice.
- Centrifugar a velocidade máxima por 15 min.
- Desprezar o sobrenadante e em seguida, lave a pelota com etanol a 70%.
- Seca o sedimento por evaporação durante 5-10 min.
- Dissolva o precipitado do Plasmídeo em 8 µ l de água livre de nuclease.
- Avaliar a concentração do plasmídeo (concentração esperada é de 300-500 ng / µ l) com nanodrop, seguindo as instruções do fabricante.
- Realize em vitro transcrição de mRNA codificação eGFP-H2B com 1 µ g de DNA purificado como um modelo em 20 µ l de volume total da reação, seguindo as instruções do fabricante.
- Após a transcrição em vitro , adicione 36 μL de água, em seguida, recuperar 1,5 µ l de 56 µ l de mRNA sintetizado para análise por eletroforese (sem poli A).
- Execute o rejeito de A poli para mRNA sintetizado em um volume de reação de 100 µ l, seguindo as instruções do fabricante.
- Adicionar 60 µ l de solução de precipitação de cloreto de lítio para o poli uma cauda mRNA de eGFP-H2B e misture vigorosamente.
- Legal a-30 ° C durante 30 min.
- Centrifugar a velocidade máxima por 15 min.
- Desprezar o sobrenadante e em seguida, lave a pelota com etanol a 70%.
- Seca o sedimento por evaporação durante 5-10 min.
- Dissolva a pelota com 20 µ l de água livre de nuclease por aquecimento a 55 ° C por 30 min.
- Avalie a concentração do mRNA precipitado com nanodrop. Dilua a 500 ng / µ l com água livre de nuclease e loja a-80 ° C até o uso.
- Confirmar a produção de mRNA preferencial; submeta a 1 µ l de mRNA com/sem (obtidos em 1.8.1 e 1,12 passos, respectivamente) poli uma cauda misturada com 1,5 µ l de brometo de etídio 0,1 mg/mL e 3 µ l de corante de carregamento da amostra para a análise de eletroforese. Volume aplicado foi de 5,5 µ l.
Nota: Se A poli rejeito foi bem sucedido, a banda mudou em comparação com o mRNA sem poli um rejeito deve ser observada (Figura 2A).
2. preparação de ratos machos vasectomizados
- Pese os ratos masculinos ICR em 8-12 meses usando uma escala de peso.
- Intraperitonealmente injete camundongos machos com anestesia de 1,2% tribromoetanol 0,7 - 0,9 mL.
Nota: A quantidade de anestesia depende do tamanho do mouse. Por exemplo, um mouse pesando 40 g é injetado com 0,8 mL de anestesia tribromoetanol. - Molhe a baga com etanol a 70%.
- Faça um pequeno corte (3-5 mm) sobre a baga e em seguida, fazer uma incisão na parede muscular, com a ajuda de uma tesoura.
Nota: Tesouras e pinças devem ser limpos com álcool 70% antes de iniciar a cirurgia. - Pega uma almofada de gordura com pinça e puxá-lo suavemente. Em seguida, o testículo e deferentes aparecem.
Nota: O canal deferente é um tubo em U e com uma embarcação de sangue vermelha. - Amarrar o canal deferente , em dois pontos com suturas cirúrgicas e então cortar a parte do meio entre os pontos vinculados.
- Suavemente empurre para trás a almofada de gordura e testículo na baga.
- Repita a operação com o restante do testículo.
- Costure a parede muscular com dois pontos com sutura cirúrgica.
3. FERTILIZAÇÃO IN VITRO
- Injetar 8 - 10 - semanas de idade B6D2F1 feminino (BDF1) ratos intraperitonealmente com 7,5 IU gonadotrofina coriônica equina (eCG) e gonadotrofina coriônica humana (hCG) no intervalo de 46-50 h.
- Prepare-se gotas de 300 µ l humano tubal fluid (HTF)8 meios para capacitação e inseminação 1 dia antes da fertilização in vitro em um prato de 30 mm, cobrir estas gotas com o óleo mineral na bancada do laboratório e então preincubate na incubadora durante a noite.
- Sacrifica o amadurecido camundongos ICR machos por deslocamento cervical. Dissecar a cauda epidídimo com uma agulha de 27-G e coletar o espermatozoide. Cultura-los para capacitação em 300 µ l de mídia HTF para 1-2 h a 38 ° C.
- 16 h após a injeção de hCG, sacrificar ratos fêmeas super ovularam por deslocamento cervical. Transferência da ampola do oviduto em óleo mineral, ao lado de mídia HTF e então desenhar células do cumulus e complexo de oócitos desta ampola do oviduto, uma agulha 30G no meio de inseminação-HTF pré-incubada.
Nota: Alguns ratos fêmeas não mostram muitas vezes ovulação apesar do tratamento de super ovulação. Ampola de oviduto alargada é um sinal de ovulação. - Após a capacitação, transferência de 2-3 µ l do espermatozoide capacitado em mídia de inseminação-HTF em que foram coletados os oócitos ovulated.
- 1 h após a inseminação, recolher os zigotos fertilizados e tratá-los com hialuronidase em 100 µ g/mL por 10 min em media de9 CZB.
Nota: Quando a inseminação é realizada corretamente, 1 h após a inseminação, zigotos fertilizados com o corpo polar 2nd são observados. Se menos ou baixa qualidade esperma é usada, apenas pouco zigotos com o corpo polar 2nd são observados. Além disso, se muitos espermas são utilizadas para a inseminação, poliespermia ocorre. Inseminação adequada leva a zigotos com pró-núcleos masculinos e femininos. Usando estes critérios, é possível encontrar se a inseminação é feita bem ou não.- Após a lavagem nos meios CZB, submeta os zigotos com um segundo corpo polar a microinjeção com eGFP-H2B mRNA.
4. preparação da câmara e Microinjection pipetas
- Dilua a codificação eGFP-H2B usando água nuclease livre para obter uma concentração de 250 ng / µ l de RNA.
- Prepare-se 2-3 gotas de PVP-HTF e eGFP-H2B gotas mRNA, e 5-6 gotas de Hepes buffer CZB (H-CZB) gotas sobre o prato de 60 mm. Cobrir estas gotas com óleo mineral.
Nota: Estas preparações podem ser executadas na bancada do laboratório. Não há nenhum requisito para usar o armário de fluxo de ar laminar. - Puxar o vidro de borosilicato com um puxador de micropipeta (por exemplo, P = 500, calor = 825, puxar = 30, vel = 120 e tempo = 200)
- Depois de quebrar a ponta da pipeta, dobre a pipeta de microinjeção de vidro puxado perto da ponta (−300 µm volta) em torno de 30 °, usando um microforge.
5. microinjection
- Desligue o aquecedor da placa no palco do micromanipulador para impedir a matança de zigotos com uma sirene piezelétrica durante a injeção de mRNA.
- Lavar e revestir o interior de agulhas de injeção em tampão HEPES-HTF contendo 10% PVP (PVP-HTF).
- Recolher os zigotos fertilizados com um corpo de 2nd polar (Figura 2B) e transferência de zigotos de 20-25 para a câmara do microscópio estágio anexado com um micromanipulador.
- Preencha o mRNA eGFP-H2B diluídos em capilares de vidro de borosilicato das pontas.
- Segure o zigoto com uma pipeta de exploração e depois quebrar a zona pelúcida e a membrana citosólica com uma unidade de piezo.
- Injetar cerca de 10 pL do mRNA para o citoplasma de zigotos. Termine a injeção de mRNA dentro de 10 min para evitar danos causados pelo cultivo mais zigotos fora da incubadora.
Nota: O volume de injeção deve ser tão grande quanto o corpo polar 2nd . Se a quantidade de mRNA injetado é muito grande, é possível causar a fração livre eGFP-H2B, que pode afetar a fração móvel. - 10 min depois da microinjeção, lavar pelo menos 3 gotas e em seguida cultura zigotos injetados no CZB a 38 ° C até análise de zFRAP.
6. zFRAP análise
- 1 h antes da análise de zFRAP, ativar o laser e a chapa quente anexado ao palco do microscópio confocal. Definir a temperatura a 38 ° C.
- Coloque 6-10 µ l de meios CZB tampão HEPES quente e coberto com óleo mineral sobre o prato de fundo de vidro de 60mm o aquecedor até coleção de zigoto.
- 8 - 12 h após a inseminação, coletar 5-10 eGFP-H2B-expressando zigotos e transferência em 6-10 µ l de pré aquecido média gota CZB tampão HEPES.
Nota: Para evitar cultivo mais tempo fora da incubadora, 5-10 eGFP-H2B-expressando zigotos foram usados em cada análise. zigotos de 5 a 10 podem ser analisados dentro de 1h. - Defina as condições de branqueamento e de imagem de acordo com as instruções do fabricante. O caso um laser confocal microscópio (Tabela de materiais) é mostrado abaixo:
- Uso 60 X lente de petróleo (60 X 60 X / 1.35 óleo).
Nota: As lentes com maior ampliação (maior abertura numérica) Mostrar maior sensibilidade. - Defina velocidade de digitalização como 4,0 µs/Pixel e tamanho como "512" em "Configuração de aquisição" (Supplemental Figura 1).
- Aumente o zoom Digital para "5" (Supplemental Figura 1).
Nota: Um zoom maior é necessário para reconhecer se deriva de foco ocorre ou não. - Abrir lista de tintura (Supplemental Figura 1) e em seguida escolha "EGFP". Definir o tempo de observação como 1.6 s (interval é definido como "corrida livre" configuração) (Supplemental Figura 1)
Nota: Mais pontos de observação podem causar dados mais detalhados, mas também pode causar fototoxicidade. Na análise zFRAP, um momento de observação s 1.6 parece ser suficiente para detectar a assimetria parental de frouxidão de cromatina. - Defina o número de fotos como o 12 no total (Supplemental Figura 1).
- Iniciar Painel de "Configuração de estímulo" e clique em "Main" na UseScanner. Conjunto de digitalização velocidade como 10.0 µs/Pixel. Clique em "Ativação na série" e em seguida, defina preligação como "3 quadros" e o tempo de ativação como "5 s" (Supplemental Figura 1).
- Clique em "Foco x 2" e definir o foco e depois "parar".
- Conjunto de branqueamento e poder do laser de imagem (477 nm) em µW 110 e 15, respectivamente, por ajuste "gage poder laser" (Supplemental Figura 1).
Nota: Branqueamento muito forte pode causar uma maior área branqueada, o que causa dificuldades para a análise quantitativa. Para a medição da potência do laser, use um medidor de energia. É importante confirmar a potência do laser para evitar o efeito da deterioração relacionadas ao tempo da potência do laser. - Clique em "Clip Rect" (Supplemental Figura 1) no painel de configuração do estímulo. Definir a região de interesse (ROI; vermelho; ROI #1B) como 40 x 40 pixels (7.6 µm.2). Preparar uma região de referência (REF; verde; ROI #2) e um plano de fundo (BG; azul; ROI #3) usando "copiar o ROI" e "colar ROI" (botão direito do mouse o mouse).
Nota: O tamanho do Pixel pode ser definido através do "Gerenciador de ROI", que pode ser chamado clicando o botão direito do mouse quando o cursor está sobre o ROI. ROIs maiores são pensados para ser melhor, pois eles podem padronizar a dispersão da nota de zFRAP. No entanto, muito grande de um ROI não pode ser usado para esta análise porque torna difícil evitar o corpo de precursor do nucléolo (NPB). H2B-eGFP neste compartimento foi pensado para ser livre da cromatina e mostrou notável de mobilidade superior3. ROI e REF áreas devem ser separadas tanto quanto possível. Se estas duas regiões são próximos, branqueamento também pode afetar a região de REF. - Clique em "Live" na barra de ferramentas e inicie o "Live Trace" (Supplemental Figura 1).
Nota: Ao vivo enredo indica a intensidade do sinal de fluorescência dentro cada ROI e é usado para ajustar a potência do laser usando HV. Observe que se o ROI não é selecionada, sem intensidade seria detectada na painel de trama ao vivo. - Determinação da posição de ROI
Nota: ROI pode ser movido arrastando para a posição desejada no pró-núcleos. (1) ser certo para evitar o nucléolo e (2) se encaixa o ROI todo o nucleoplasma. Não contém a região fora da área da membrana nuclear (citoplasma) em ROI. A localização do eGFP-H2B é altamente restrito para o nucleoplasma para que seja fácil de encontrar se ROI contém citoplasma ou não, a fluorescência de eGFP-H2B. Pró-núcleos masculinos tendem a ser maiores que as fêmeas, que muitas vezes são localizadas perto do corpo de polar 2nd . Enquanto estiver usando estes critérios, julga os pró-núcleos masculinos ou femininos. - Clique em "Foco x 2" (Supplemental Figura 1) e, em seguida, ajuste o HV poder gage do canal para EGFP em intensidade de fluorescência para em torno de 2000 (intensidade de fluorescência pode ser vista na janela "trama ao vivo").
- Uso 60 X lente de petróleo (60 X 60 X / 1.35 óleo).
- Clique em "Tempo" e, em seguida, "XY" (Supplemental Figura 1) para iniciar a análise de zFRAP.
Nota: Se o botão "Time" é devidamente selecionado, "t" aparece no botão "XY".- Clique "Série feita" (Supplemental Figura 1), que aparece após FRAP imaging perto do botão"XY" e em seguida, obter dados analisados FRAP.
- Salve o arquivo "2D imagem de exibição XXXXX" como um arquivo nomeado preferencial (oib. formato de arquivo) por "salva como" (Ctrl + Shift + S pode ser também usada).
- Selecione o ROI, REF e BG e clique (Ctrl + A pode ser usada também) "Análise de série" na janela "imagem de exibição 2D".
- Obter dados de linha FRAP e clique em "salvar" botão na janela da trama ao vivo.
Nota: Linha dados quantitativos FRAP é salvo como um arquivo csv.
- Sem controle de zFRAP, coloque um pouco de zigotos injetados com mRNA na gota, que é perto da borda dos pratos vidro inferior para evitar o efeito da observação da fluorescência.
7. dados cálculo
- Enquanto estiver usando os dados quantitativos obtidos, fazer o gráfico da "curva de recuperação" e "fração móvel" pelo Excel, conforme as referências3,7 , com algumas modificações (arquivo excel Veja abaixo e suplementar).
- Calcule a intensidade relativa subtraindo o valor da BG dos de ROI e REF em 12 fotos para cada ponto de tempo.
- Divida o valor do ROI por isso do árbitro. Como resultado, podem ser obtidos 12 escores padronizados intensidade relativa em cada ponto de tempo.
- Calcule a média da Pontuação relativa para ROI em 3 imagens tiradas antes foto branqueamento.
- Calcule a taxa de recuperação. Divide que o 12 obtidos escores relativos para ROI nas imagens tomadas em cada ponto do tempo (Obtido em 7.1.2.) pela média da Pontuação relativa antes foto branqueamento (obtidos em 7.1.3.). Desenhar a curva de recuperação com o uso de partituras (Figura 2E).
- Calcule a taxa de branqueamento.
Nota: Branqueamento taxa (%) = 100 - taxa de recuperação de 4th de imagem. - Calcule a fração móvel (MF) usando a fórmula como segue10,11,12
MF (%) = 12th taxa de recuperação (no ponto final) - taxa de recuperação 4th / branqueamento taxa × 100.
8. transferência de embriões
- Amigo amadurecidas fêmeas ICR em 8-12 meses com vasectomizado camundongos machos do ICR a noite antes de transferência de embrião por deixá-los passar a noite na mesma jaula.
- Recolha os embriões que foram analisados zFRAP e determinado a desenvolver para o estágio de duas células.
- Intraperitonealmente injete camundongos fêmeas com anestesia de 1,2% tribromoetanol 0,7 - 0,9 mL ou com 0.35 - 0,45 mL de 0.75/4/5mg/kg medetomidina/midazolam/butorfanol misto agentes antes da transferência de embriões.
Nota: O volume da anestesia é determinado pelo peso corporal de ratos. Tribromoetanol: 0,2 mL/10 g de peso corporal; medetomidina/midazolam/butorfanol misturado agentes: 0,1 mL/10g de peso corporal.- Transferi estes embriões de duas células estágio para os ovidutos de camundongos fêmeas pseudopregnant do ICR com um plugue vaginal em 0,5 dias post coitum (dpc).
- Após a transferência de embriões, colocar os camundongos fêmeas no aquecedor definida a 37 ° C até que eles acordem.
- No dpc 18,5, sacrificar a mãe de aluguel por deslocamento cervical e recuperar os filhotes derivados de zigotos zFRAP-analisado por cesárea. Alguns dos filhotes recuperados foram entregues para a mãe adotiva e seus pesos de corpo foram avaliados a cada semana.
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Representative Results
análise de zFRAP com eGFP-H2B
Devidamente produzida mRNA codificação eGFP-H2B, que é visto como uma banda deslocou causada por poli um rejeito (Figura 2A), foi injetado no citoplasma de zigotos com um corpo polar 2 em 1-3 h após a inseminação (Figura 2B). 8 a 12 h após a inseminação, zigotos com 2 pró-núcleos mostrando a expressão de eGFP-H2B foram coletadas e submetidas a análise de zFRAP (Figura 2). A análise da FRAP consiste em etapas de branqueamento e recuperação. Na fase de pré-branqueamento, o sinal de eGFP-H2B podia ser observado (Figura 2D-1), mas uma vez branqueadas, o sinal recusou-se a um nível insignificante (Figura 2D-2). Se o branqueamento foi bem sucedido, um buraco negro tão grande quanto o ROI apareceu logo após o branqueamento. Após o branqueamento, a intensidade do sinal de fluorescência do eGFP-H2B recuperou ligeiramente; o sinal fluorescente gradualmente aumentado por causa da afluência da fração não-branqueada de eGFP-H2B para o ROI da área não-branqueada no nucleoplasma (Figura 2D-3). Para a confirmação do sucesso da análise de zFRAP de frouxidão de cromatina, é recomendável usar a assimetria parental de frouxidão de cromatina; pró-núcleos masculinos mostraram uma curva de recuperação mais rápida e mais móveis frações do que aqueles das fêmeas (Figura 2E e F). Após a análise zFRAP, zigotos lavados e cultivados em meios CZB, poderão desenvolver-se para a fase de blastocisto sem danos significativos (Figura 2 e H). Mesmo se fortemente branqueada por mais tempo, zigotos ainda podem evoluir para o estágio de blastocisto, bem7.
Análise do termo desenvolvimento de zigotos analisados zFRAP
Para analisar o termo desenvolvimento de embriões derivados de zigotos zFRAP-analisados, os embriões no estágio de duas células foram transferidos para os ovidutos das mães pseudopregnant. Como controles, embriões intactos e um injetado com mRNA, mas zFRAP-analisados não estavam preparados. A taxa de natalidade de embriões zFRAP-analisados (41.0%) foi ligeiramente significativamente menor do que a de embriões intactos (62,2%), mas foi o mesmo que o não controle de zFRAP (52,6%) (Tabela 2). Assim, zFRAP-análise parece ser ligeiramente prejudiciais ao desenvolvimento embrionário do termo. No entanto, importante, os filhotes derivado zFRAP-analisados zigotos parecia saudáveis e totalmente desenvolveram (Figura 3).
Figura 1: Ilustração esquemática do fluxo de procedimentos para os experimentos. Fertilização in vitro : recém coletados metáfase II (MII) oócitos foram inseminados com sêmen capacitado. In vitro transcrição: RNA mensageiro (mRNA) codificação eGFP-fundido histona H2B (eGFP-H2B) foram transcritas o promotor SP6 do linear pTOPO-eGFP-H2B3 com não eu. O mRNA eGFP-H2B submetido a purificação e, em seguida, a perseguição de poli A. O mRNA purificado eGFP-H2B é usado em injeção de mRNA. injeção de mRNA: mRNA eGFP-H2B preparado é injetado no citoplasma de zigotos com 2nd polar corpo. zanálise FRAP: eGFP-H2B-expressando zigotos foram submetidos à análise de zFRAP. A região de interesse (ROI; retângulo vermelho) foi descorada com um laser forte e em seguida o sinal de eGFP-H2B recusou-se a um nível insignificante. Após o branqueamento, a intensidade do sinal eGFP-H2B aumentada gradualmente. In vitro desenvolvimento: Após a análise de zFRAP, zigotos poderiam evoluir para o estágio de blastocisto. Transferência de embriões: fase de duas células, os embriões zFRAP-analisados foram transferidos para os ovidutos de camundongos fêmeas pseudopregnant. 18 dias mais tarde, saudáveis filhotes ao vivo poderiam ser obtidos embriões zFRAP-analisou. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: análise de zFRAP de zigotos com eGFP-H2B. (A) imagem representativa do mRNA devidamente preparados por em vitro transcrição e poli A rejeito. Pista 1: pré-poli um rejeito; pista 2: post rejeito de poli A. (B) mRNA codificação eGFP-H2B foi injetado no citoplasma de zigotos com uma inseminação de post de 1-3 h 2nd corpo polar (hpi). Barra de escala = 25 µm (C) eGFP-H2B-expressando zigotos foram coletados no hpi de 8-12. Asteriscos brancos mostram nucléolo corpos precursor (NPB). Barra de escala = 10 µm (D) eGFP-H2B expressão foi detectado no nucleoplasma inteiro mesmo no NPB na fase pré-branqueamento (D-1), logo após o branqueamento (D-2) e após a recuperação (D-3). As membranas nucleares (brancas linhas pontilhadas) e NPB (asteriscos) são indicados. Barra de escala = 10 µm. curva de recuperação (E, F) e frações móveis foram obtidas de 45 zigotos em 5 experimentos independentes. Azul e vermelho indicam masculino e feminino, respectivamente. Nas curvas de recuperação, único círculos indicam o ponto de medição. Em gráficos de dispersão, único pontos mostram o placar de móveis frações obtidos de pró-núcleos. (G) imagens representativas do desenvolvimento pré-implantação de zigotos zFRAP-analisados são mostradas. Duas câmaras, célula 4-8 e o blastocisto palco embriões em 24, 48 e 96 hpi, respectivamente. O círculo amarelo indica o blastocisto bem desenvolvido. Este blastocisto é ampliado e mostrado no painel direito. Barra de escala = 100 µm. (H) gráfico de barras das taxas do desenvolvimento de embriões zFRAP-analisou. Barras indicam embriões analisados zFRAP (zFRAP) (brancos) e controlam de embriões (pretos) injetados com mRNA, mas nenhuma análise de zFRAP (não zFRAP). Dados mostrados são de três experimentos independentes, examinar pelo menos 57 embriões no total. Duas câmaras, 4-8 células mórula (Mo) e estágios de blastocistos (Bl) foram observados em 24, 48, 72 e 96 hpi, respectivamente. Esta figura foi modificada [Ooga et al. 2017]7. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: O crescimento saudável dos filhotes derivado de zigotos FRAP-analisou. (A) as fotos dos filhotes derivados zFRAP-analisados zigotos são mostradas. (B) crescimento Normal foi observado durante os cuidados dos filhotes zFRAP-analisou. (C) o gráfico indica que o peso dos filhotes derivadas de embriões intactos (azuis), embriões controle crus (vermelho) e zFRAP-analisados embriões (verde). Pesos de 29 filhotes derivadas de embriões intactos, o corpo 24 de embriões não-zFRAP e 15 de embriões zFRAP-analisados durante um período de 8 semanas. Valores indicados por asteriscos são significativamente diferentes do controle intacto. Esta figura foi modificada [Ooga et al. 2017]7. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Suplementar Figura 1: interface gráfica do usuário para análise FRAP. (A) uma visão geral da interface de usuário gráfica foi mostrada. (B) foram mostradas imagens de alargada para cada janela. (1) a definição de aquisição janela é usada para definir a condição de aquisição de imagem. (2) a janela de configuração de estímulo a é usada para definir a condição de branqueamento. Esta janela pode ser aberta clicando no botão na janela de aquisição de imagem. (3) o controle de aquisição de imagem janela é usado para a análise da FRAP. (4) o Live View mostra a imagem atual (a imagem presente aparece após clicar em foco x2 ou botão XY). Os retângulos azuis vermelhos, verdes e luz mostram o ROI (região de interesse), REF (referência) e BG (fundo), respectivamente. (5) vista 2D mostra a imagem FRAP-analisados e aparece após clicar em "Série feita" botão. Neste caso, um pronucleus masculino FRAP-analisado é mostrado como um exemplo. Três retângulos com 8 pontos indicam que estas regiões estão selecionadas. (6) viver o enredo mostra a intensidade de fluorescência presente em cada região. Os eixos X e Y indicam tempo (ms) e a intensidade da fluorescência, respectivamente. (7) a série de análise mostra as faixas de intensidade de fluorescência em cada região e aparece depois de clicar o botão de análise de série na janela de visualização 2D. Clique aqui para baixar este arquivo.
Suplementar Excel arquivo 1: dados de exemplo e cálculo de dados. (Folha 1) São mostrados um dados de exemplo para um pronucleus masculino. Não. indica o número de consecutivo da imagem. As intensidades de linha para cada região (ROI, Ref e BG) foram indicadas. (Folha 2) É mostrado um exemplo de cálculo de dados. Protocolo número indica os lugares correspondentes na seção de protocolo. Notas de explicam o significado de cada nota. A fórmula numérica pode ser encaminhada, clicando as células. São mostrados exemplos de curva de recuperação e gráfico de barras de fração móvel. Clique aqui para baixar este arquivo.
| Dia -3 | Dia -2 | Dia -1 | Dia da FRAP | Dia + 1 | Dia + 3 | Dia + 19 | |
| preparação de mRNA | Plasmídeo de modelo de corte (durante a noite) |
1). plasmídeo de modelo de purificação | |||||
| 2). In vitro a transcrição | |||||||
| 3). poli In vitro um rejeito | |||||||
| 4). verificação da qualidade do mRNA por eletroforese | |||||||
| VOU ESMAGÁ-LOS | 1). preparação da pipeta de manipulação e câmara | ||||||
| 2). injeção de mRNA | |||||||
| 3). análise de zFRAP | |||||||
| 4). cálculo de curva de recuperação e fração móvel* 2 | |||||||
| Fertilização in vitro e análise de desenvolvimento pré-implantação | injeção de eCG | 1). injeção de hCG | 1). capacitação de esperma | ||||
| 2). pré-incubação dos meios de comunicação (HTF) | 2). Fertilização In vitro | ||||||
| Preparação dos meios de comunicação (HTF, CZB, H-CZB e PVP-CZB) | 3). desenvolvimento pré-implantação de avaliação | ||||||
| Transferência de embriões | Preparação de pseudopregnant fêmea (acasalamento com o macho vasectomizado* 1) |
Transferência de embriões de estágio de 2 células para fêmea pseudopregnant | Avaliação da taxa de natalidade | ||||
| * 1: rato macho vasectomizado deve ser preparado pelo menos 2 semanas antes do acasalamento | |||||||
| * 2: cálculo pode ser prorrogado até o dia seguinte (dia + 1) | |||||||
Tabela 1: tabela de tempo dos experimentos. No dia da análise FRAP é considerado como dia 0. as experiências que devem ser executadas são indicadas nos dias respectivos de cada item.
| Categorias | Não. de zigotos injetados | Não. de zigotos recuperados após a injeção de mRNA (%) * | Não. de zigotos analisados | Não. de transferência | Não. de destinatários | Não. dos filhotes (%) * * * | Peso dos filhotes (g) | Não. dos filhotes transgênicos |
| embriões de estágio de 2 células (%) * * | ||||||||
| Intacta | - | - | 99 | 98 (99.0) | 9 | 61 (62,2)um | 1.64±0.02 | n.d |
| Não FRAP | 420 | 398 (94,8) | 82 | 78 (95,1) | 7 | 41 (52,6),b | 1.66±0.03 | n.d |
| VOU ESMAGÁ-LOS | 79 | 78 (98,7) | 7 | 32 (41.0)b | 1.69±0.03 | 0 | ||
| *: calculada dividindo-se com não. de zigotos injetados; * *: calculada dividindo-se com não. de zigotos analisados; : calculada dividindo-se com não. de embriões transferidos estágio de 2 células. a, b: sobrescritos indicam diferença significativa (P < 0,05). n.d: não determinado. Esta tabela foi alterada de [Ooga et al. 2017]7. | ||||||||
Tabela 2: A taxa de natalidade de embriões analisados: Analisou-se o potencial do desenvolvimento dos embriões, que tinha sido analisados FRAP, para nascer. A taxa de natalidade obtida esses embriões é mostrada. Como controles, intactas e sem embriões FRAP-analisados foram também examinados. Os pesos dos filhotes derivados destes embriões transferidos são mostrados também.
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Discussion
Como revelado neste estudo, a análise zFRAP não causa danos críticos para o desenvolvimento do termo, sugerindo que este método é uma ferramenta muito útil para revelar a associação entre eventos moleculares e o potencial do desenvolvimento embrionário. Durante a reprogramação, para as duas câmaras como estado de pilhas do ES, pelo qual o potencial diferencial dessas células torna-se tão elevado como aquele do estágio de duas células, frouxidão de cromatina de mudanças em que comparável com embriões de duas células estágio5. Nesse sentido, é possível que a frouxidão zigóticos cromatina é importante para o potencial do desenvolvimento embrionário. Núcleos de células somáticas transferida para o citoplasma de ovócitos mostrou frouxidão de cromatina inferior em comparação com não só pró-núcleos paternos, mas também pró-núcleos maternos, sugerindo que a falta de cromatina aberta de aquisição em zigotos de transferência nuclear de células somáticas é envolvido em seu potencial de desenvolvimento pobre. Coletivamente, a análise de zFRAP parece ser útil para elucidar os mecanismos de reprogramação de genoma.
O sistema zFRAP pode tornar possível selecionar zigotos com alto potencial de desenvolvimento. No estudo preliminar, além de TNCS, foi revelado que ronda a injeção nucleologênese (ROSI)-derivado de zigotos harbor anormal da cromatina frouxidão. Além disso, verificou-se que alguns deles mostraram frouxidão de cromatina no nível comparável aos zigotos derivado de fertilização in vitro, sugerindo que estes zigotos tem alto potencial de desenvolvimento. Importante, zigotos de qual cromatina frouxidão foi avaliada por zFRAP poderiam desenvolver a termo. No futuro, portanto, pode ser possível distinguir TNCS e ROSI derivada de zigotos com maior potencial de desenvolvimento de menores queridos pela avaliação de frouxidão de cromatina por zFRAP.
Até à data, estudos anteriores mostraram a utilidade do método de imagens ao vivo para a análise do estado epigenética em embriões pré-implantação. Alguns dos métodos de imagem ao vivo podem revelar cada modificação epigenética (por exemplo, modificação do DNA/histona) em embriões pré-implantação13,14, mas usando o zFRAP, é possível avaliar a frouxidão de cromatina zigóticos sem matando as células. Frouxidão de cromatina parece ser afetado por modificações epigenéticas. Por exemplo, heterocromatina no qual modificação epigenética repressiva tais como H3K9me3 e H3K27me3 são enriquecidos mostrou baixa mobilidade de histona de eucromatina região3,15. De fato, um tratamento com um composto químico, que converte o estado epigenético, causado a alteração de frouxidão de cromatina em zigotos. Portanto, usando o zFRAP, é possível revelar o estado epigenético sumativa da estrutura da cromatina. Pensava que isso seria uma vantagem para avaliar o potencial do desenvolvimento dos zigotos.
A injeção de mRNA de codificação eGFP-H2B para zFRAP tem um demérito, mas aumenta a versatilidade do zFRAP. O demérito da injeção do mRNA é o dano causado pela microinjeção. Para evitar isso, é muito eficaz utilizar o rato transgénico eGFP-H2B. Se a linha de rato transgénico eGFP-H2B é usada, a taxa de descendência pode ser aumentada em comparação com o caso do uso de microinjeção de mRNA. Por outro lado, é o mérito de injeção de mRNA que zFRAP permite o uso de qualquer tipo de cepa de ratos tipo selvagem. Os pesquisadores que querem usar o zFRAP com o interesse da estirpe do mouse não é necessário preparar a tensão desejada do mouse com eGFP-H2B transgene. Este mérito torna-se mais proeminente na análise de transgénicos (EG. superexpressão/nocaute) ou linha de rato de nocaute. Os pesquisadores que querem utilizar zFRAP para seus tópicos de pesquisa com a linha de transgénicos/nocaute não precisa preparar linha eGFP-H2B transgênicos de um número limitado de seu interesse os. Isto indica uma vantagem para a progressão da pesquisa.
Análise de imagens ao vivo com embriões pré-implantação requer conhecimento especializado e dispositivos especializados muito caros e bem afinados. Portanto, uma introdução de um sistema tão experimental não é uma decisão fácil. O sistema experimental que é estabelecido neste estudo precisa de apenas um thermo-aquecedor além de um laser confocal microscópio. Além disso, o método de aprendizagem é fácil para que um novato em um laboratório pode aprender o método de zFRAP dentro de 1 mês. No entanto, existem alguns problemas que ainda precisam de cuidados. Primeiro é o desvio de foco. Durante a observação, é possível que os pró-núcleos ou zigotos desviam a posição onde eles se apresentaram antes do início de observação. Se ocorrer o desvio de foco, ROIs também desviam-se na posição correta. Como resultado, dados quantitativos se torna inútil. Para evitar esse problema, o pesquisador tem de usar a tampa dos pratos vidro inferior para proteção contra a janela do aparelho de ar condicionado e esperar para a expansão do óleo sobre a lente objetiva. Se ocorrer desvio de foco, dados de zigotos divergentes devem ser descartados e uma análise FRAP 2nd com as mesmas zigotos não é recomendada. Neste estudo, encurtando o tempo de observação de 150 s3 para cerca de 25 s7 foi muito útil. O segundo é a incubação mais tempo fora da incubadora. Uma vez que uma exposição mais longa para o ambiente fora da incubadora é definitivamente prejudicial para o desenvolvimento embrionário, foi recomendado para terminar a FRAP-análise dentro de 1h por lote. O número de zigotos FRAP-analisados em uma tampão HEPES mídia sobre os pratos de fundo de vidro deve ser de 6-10. Nesta condição experimental, o número máximo é de cerca de 30 para 4 h, mas se forem necessários mais zigotos, 20 zigotos por h podem ser analisados por adiar a avaliação da intensidade fluorescente na região de referência e o plano de fundo. Em terceiro lugar é "relacionadas ao tempo de deterioração do laser da microscopia confocal do laser". Se o branqueamento laser for insuficiente, os dados quantitativos corretos não podem ser obtidos por causa do branqueamento insuficiente. De fato, a assimetria parental de frouxidão zigóticos cromatina não é adquirida com um laser branqueamento fraco. Para evitar isso, recomenda-se verificar se a potência do laser enfraqueceu como surge a ocasião. Neste estudo, 110-µW branqueamento foi suficiente para a aquisição da assimetria dos pais.
análise de zFRAP pode ser usado para outros tipos de proteínas, além de histones do núcleo. Desde que histones do núcleo mostram com destaque de baixa mobilidade, mais tempo de observação total (cerca de 25 s neste estudo) é necessária na análise zFRAP. Portanto, para analisar um número considerável de zigotos, cultivo em tampão HEPES mídia o aquecedor por um longo tempo é inevitável. Por outro lado, para a análise de zFRAP de proteínas de alta mobilidade, o tempo de observação total pode ser definido curto, permitindo que o tempo de cultivo no tampão HEPES mídia em cima do aquecedor ser curta. Portanto, uma vez que uma exposição mais longa para o ambiente fora da incubadora é altamente prejudicial para o desenvolvimento embrionário, zFRAP análise de proteínas que não sejam histones do núcleo, que têm alta mobilidade, por natureza, parecem mostrar menor toxicidade do que histones do núcleo . Espera-se que este sistema experimental vai ajudar ainda mais a investigação das relações entre vários eventos moleculares e desenvolvimento embrionário.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos Satoshi Kishigami, Sayaka Wakayama, Hiroaki Nagatomo, Satoshi Kamimura e Kana Kishida fornecendo comentários críticos e suporte técnico. Este trabalho foi parcialmente financiado pelo programa do Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia para promover a reforma das universidades nacionais, m.o.; a sociedade japonesa para a promoção da ciência (16H 02593), Asada Science Foundation e da Fundação de ciência Takeda para TW Os financiadores não tinham qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados e análise, a decisão de publicar ou preparação do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal laser scaning microscope | Olympus | FV1200 | FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7) |
| Thermo plate | Tokai Hit | TP-110RH26 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Micro manupilator | Narishige | MMO-202ND | |
| Pieze Micro Micromanipulator | Prime tech | PMAS-CT150 | |
| 35 mm culture dish | Falcom | 351008 | 35 x 100 mm style; for IVF |
| 60 mm culture dish | Falcom | 351007 | 60 x 15 mm style; for embryo culture |
| 50 mm culture dish | Falcom | 351006 | 50 x 9 mm style; for manipulation on the stage |
| 50 mm glass bottom dish | Matsunami | D910400 | 50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis |
| Mineral oil | Organic spceiality chemicals | 625071 | For FRAP analysis on the glass bottom dishes |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | For IVF and embryo culture |
| glass capillary | Drummond | 1-000-1000 | For handling mouse zygotes |
| Borosilicate glass | Prime tech | B100-75-10-PT | For microinjection of mRNA |
| Micropipett puller | Sutter instrument | P-97/IVF | For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm) |
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit | Thermo Fisher scientific |
AM1340 | |
| Poly (A) tailing kit | Thermo Fisher scientific |
AM1350 | |
| PVP solution 10% (PVP-HTF) | IrvineSceientific | 99311 | HEPES buffered HTF containing 10% PVP |
| Sodium HEPES | Sigma | H3784 | |
| pTOPO eGFP-H2B | Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6) | ||
| NorthernMax Gly Sample loading Dye | Thermo Fisher scientific |
AM8551 | For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA |
| Phenol chloroform isamyl alcohol | nacalai tesque | 25970-14 | |
| Chloroform | nacalai tesque | 08401-65 | |
| Not I | TOYOBO | NOT-111X | |
| Ethachinmate | WAKO | 318-01793 | |
| 3664 Otical power meter | Hioki | 3664 | Power meter for laser power |
| Stereomicmicroscope | Olympus | SZX16 |
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