Summary
Kromatin glapp verkar vara inblandade i den utvecklande potentialen av blastomerer. Det är dock inte känt om kromatin glapp kan användas som en pålitlig index för den utvecklande potentialen för embryon. Här, har en experimentell system där kromatin glapp-utvärderas zygoter kan utvecklas till full sikt beskrivits.
Abstract
Levande bildbehandling är ett kraftfullt verktyg som möjliggör analys av molekylära händelser under ontogenin. Nyligen, kromatin glapp eller öppenhet har visat sig vara inblandade i celldifferentiering potential av pluripotenta embryonala stamceller. Det rapporterades tidigare som jämfört med embryonala stamceller, zygoter harbor en extremt lossade kromatinstruktur, tyder på associationen med deras totipotency. Men fram till nu, har det inte behandlats om denna extremt lossade/öppna kromatinstruktur är viktigt för embryonala utvecklingspotentialen. I den aktuella studien, för att pröva denna hypotes, utvecklades en experimentell system i vilka zygoter som analyserades av fluorescens återhämtning efter foto-blekning kan utvecklas till sikt utan betydande skada. Allt behöver detta experimentella system endast en termos-plattan värmare förutom en confocal laser skanning Mikroskop. Resultaten av denna studie föreslår att fluorescens återhämtning efter foto-blekning analys (FRAP) analys kan användas för att undersöka om de molekylära händelserna i zygotic kromatin är viktigt för fullgångna utveckling.
Introduction
Efter befruktningen, kromatinstruktur ändras dynamiskt, och zygotic kromatinstruktur är sedan så småningom etablerade1,2. Under denna period, i Faderns pronuclei, ändras proteinet dominerande kromatin från Protamin till Histon. Det resulterande kromatinet skiljer sig extremt från spermier och kvinnliga oocyter i flera punkter (t.ex., Histon variant sammansättning, Histon modifiering). Således tros bildade zygotic kromatin vara viktigt för efterföljande embryonal utveckling. Men trots ansträngningar att avslöja detaljerna i zygotic kromatinstrukturen under långa perioder, har metoder att utvärdera kvaliteten på zygoter eller att förutsäga deras fullgången utveckling i en-cellstadie genom att analysera deras kromatinstruktur aldrig varit etablerade.
I den tidigare studien upptäcks det att zygoter har en extremt lossade kromatin struktur3. För närvarande, tros kromatin glapp eller öppenhet vara en viktig faktor för celldifferentiering potential i embryonala stamceller (ES) celler4. ES-celler uppvisar inte homogenitet i naturen, men är ganska heterogen; i ES cell kolonier få vissa övergående en högre differentiering potential jämförbar med blastomerer två-cellstadie embryon. Under denna övergång in i två-cellen som stat, kromatin glapp i ES-celler förändringar i vad som är jämförbara med två-cellstadie embryon5. Kromatin glapp verkar således vara viktigt för celldifferentiering potential och det är möjligt att i stor utsträckning öppna kromatin i zygoter är användbart för utvärdering av zygotic utvecklingspotential.
Levande bildbehandling är ett kraftfullt verktyg som möjliggör analys av molekylära händelser under ontogenin eftersom denna metod möjliggör framtida utveckling och även fullgångna utveckling6. Som en av de levande avbildningsmetoder, har FRAP analys använts för att undersöka kromatin glapp i preimplantatorisk embryon och ES celler3,4,5. Om zygotic kromatin glapp kan analyseras utan en skadlig effekt på fullgångna utveckling av FRAP analys, kan det vara ett värdefullt verktyg för utvärdering av kvaliteten på embryon i en-cellstadie. Effekterna på fullgångna utvecklingen av denna experimentella metod har dock inte undersökts. Nyligen, en experimentell system använder FRAP för att utvärdera zygotic kromatin glapp utvecklades. Eftersom detta var ett nytt observationssystem för zygoter, var det betecknas som zygotic FRAP (zFRAP). zFRAP påverkade inte kritiskt fullgången utveckling och har varit rapporterade någon annanstans7. I denna rapport beskrivs i protokollet av den experimentella metoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie utfördes i strikt överensstämmelse med rekommendationerna i Guide för skötsel och användning av laboratoriedjur av de universitet i Yamanashi. Protokollet godkändes av kommittén för etik av djur experimenten av de universitet i Yamanashi (tillåta nummer: A24-50). Alla operationer utfördes under tribromoethanol anestesi, och alla ansträngningar gjordes att minimera lidande. En illustrerad översikt av förfaranden och tidsplan visas i figur 1 och tabell 1, respektive.
1. beredning av budbärar-RNA (In Vitro transkription av andra-H2B mRNA)
- Linjär 5 µg mall DNA pTOPO-andra-H2B3,7 med 30 U i inte jag i 50 µL vid 37 ° C över natten.
- Samla in 1,5 µL av smält DNA för att bekräfta huruvida helt rötas genom elektrofores.
- Tillämpa 1,5 µL och 3-5 µL av osmält DNA med lastning dye till brunnen av 2% agarosgel, respektive, och föremål för elektrofores.
Obs: Om helt rötas, ett enda band (ca 5 kb) observeras. Osmält DNA används som en kontroll som visas på en annan plats.
- Tillämpa 1,5 µL och 3-5 µL av osmält DNA med lastning dye till brunnen av 2% agarosgel, respektive, och föremål för elektrofores.
- Lägg till 151,5 µL ddH2O och 200 µL av fenol/kloroform/isopentanol (25:24:1) om du till övriga rötas DNA.
- Blanda kraftigt av virvel.
- Centrifugera vid högsta hastighet för 15 min.
- Återställa supernatanten och sedan tillsätt 200 µL av kloroform.
- Blanda kraftigt av virvel.
- Centrifugera vid maxhastighet för 15 min.
- Återställa supernatanten och Lägg sedan till 20 µL av 3M natriumacetat och 1,5 µL av ethachinmate.
- Blanda kraftigt av virvel.
- Tillsätt 550 µL av 100% etanol och blanda kraftigt av virvel.
- Centrifugera vid maxhastighet för 15 min.
- Avlägsna supernatanten och sedan tvätta pelleten med 70% etanol.
- Torka pelleten genom avdunstning för 5-10 min.
- Lös upp utfällda plasmid DNA i 8 µL nuclease-gratis vatten.
- Bedöma plasmid koncentration (förväntad koncentration handlar om 300-500 ng/µL) med nanodrop genom att följa tillverkarens instruktioner.
- Utför in vitro- transkription för mRNA kodning andra-H2B med 1 µg av renade DNA som mall i 20 µL av total reaktionsvolym genom att följa tillverkarens instruktioner.
- Efter in vitro- transkription, tillsätt 36 μL vatten sedan återställa 1,5 µL från 56 µL av syntetiserade mRNA för analys genom elektrofores (som utan poly A).
- Utföra poly A tailing för syntetiserade mRNA i en 100 µL reaktionsvolym genom att följa tillverkarens instruktioner.
- Tillsätt 60 µL litium natriumkloridlösning nederbörd i poly en tailed mRNA av andra-H2B och blanda kraftigt.
- Cool vid-30 ° C i 30 min.
- Centrifugera vid maxhastighet för 15 min.
- Avlägsna supernatanten och sedan tvätta pelleten med 70% etanol.
- Torka pelleten genom avdunstning för 5-10 min.
- Lös pelleten med 20 µL av nuclease-fritt vatten genom uppvärmning vid 55 ° C i 30 min.
- Bedöma koncentrationen av utfällda mRNA med nanodrop. Späd till 500 ng/µL med nuclease-gratis vatten och förvaras vid-80 ° C fram till användning.
- Bekräfta Rekommenderad mRNA produktion; ämne 1 µL av mRNA med/utan (erhålls i 1.8.1 och 1.12 steg, respektive) poly en svans blandas med 1,5 µL 0,1 mg/mL etidiumbromid och 3 µL prov lastning färgämne till elektrofores analysen. Tillämpad volym var 5,5 µL.
Obs: Om Poly A tailing lyckades skiftade bandet jämfört med mRNA utan poly en tailing bör observeras (figur 2A).
2. förberedelse av vasektomerade manliga möss
- Väga de ICR hanmössen på 8-12 månader med hjälp av en vikt skala.
- Intraperitonealt injicera hanmöss 0,7 - 0,9 mL 1,2% tribromoethanol anestesi.
Obs: Mängden anestesi beror på storleken på musen. Till exempel injiceras en mus som väger 40 g med 0,8 mL tribromoethanol anestesi. - Blöt berry med 70% etanol.
- Göra en liten skära (3-5 mm) på bär och gör sedan ett snitt på muskel väggen med hjälp av sax.
Obs: Sax och pincett bör rengöras med 70% etanol innan operationen. - Grepp en fet pad med pincett och dra försiktigt ut. Sedan visas de testiklarna och sädesledaren.
Obs: Sädesledaren är en U-formad tube och med ett rött blodkärl. - Binda den sädesledaren vid två punkter med kirurgiska suturer och sedan skära ut den mellersta delen mellan bundet pekar.
- Försiktigt Tryck tillbaka de fett pad och testiklarna i bär.
- Upprepa operationen med återstående testiklarna.
- Sy muskel väggen med två stygn med kirurgiska suturer.
3. IVF
- Injicera 8 - 10 vecka gammal kvinnliga B6D2F1 (BDF1) möss intraperitonealt med 7,5 IU equine koriongonadotropin (EKG) och humant koriongonadotropin (hCG) 46-50 h intervall.
- Förbereda droppar 300 µL humant tubal vätska (HTF)8 media för capacitation och insemination 1 dag innan IVF i en 30-mm maträtt, täcka dessa droppar med mineralolja på bänken laboratorium och sedan preincubate i en inkubator över natten.
- Offra mognat ICR hanmöss av cervikal dislokation. Dissekera cauda epididymis med 27-G nål och samla spermie. Kultur dem för capacitation i 300 µL av HTF media för 1-2 h vid 38 ° C.
- 16 h efter hCG-injektionen, offra super ägglossning honmöss av cervikal dislokation. Överför den äggledaren ampulla till mineralolja bredvid HTF media och sedan dra ut cumulus celler och oocyter komplexa från denna äggledaren ampulla av en 30-G nål till teststamman insemination-HTF medium.
Obs: Vissa kvinnliga möss visar ofta inte ägglossning trots super ägglossning behandling. Utvidgade äggledaren ampulla är ett tecken på ägglossning. - Efter capacitation, överför du 2-3 µL av den capacitated spermien till insemination-HTF media där ovulated oocyterna samlades.
- 1 h efter insemination, samla de befruktade zygoter och behandla dem med hyaluronidas på 100 µg/mL i 10 min i CZB9 media.
Obs: Vid inseminationen utförs korrekt, 1 h efter insemination, de befruktade zygoter med 2nd polar kroppen observeras. Om spermier används mindre eller låg kvalitet, observeras endast lilla zygoter med 2nd polar kroppen. Även om många spermier används för insemination, uppstår polyspermy. Ordentlig insemination leder till zygoter med manliga och kvinnliga pronuclei. Med hjälp av dessa kriterier, är det möjligt att hitta om insemination görs väl eller inte.- Efter tvätt i CZB media, som omfattas av zygoter med en andra polar kropp Mikroskop med andra-H2B mRNA.
4. beredning av kammaren och Mikroskop pipetter
- Späd RNA kodning andra-H2B med nuclease-fritt vatten för att få en koncentration av 250 ng/µL.
- Förbereda 2-3 droppar av PVP-HTF och andra-H2B droppar mRNA och 5-6 droppar Hepes buffrade CZB (H-CZB) droppar på 60 mm skålen. Täcka dessa droppar med mineralolja.
Obs: Dessa preparat kan utföras på en arbetsbänk. Det finns inga krav för att använda laminärt luftflöde skåp. - Dra borosilikatglas med en mikropipett avdragare (t.ex. P = 500, värme = 825, pull = 30, vel = 120, och tid = 200)
- Efter att bryta spetsen på pipetten, böj drog glas Mikroskop pipetten nära spetsen (−300 µm tillbaka) på runt 30 ° med hjälp av en microforge.
5. Mikroskop
- Stäng av plattan värmaren på scenen av micromanipulator att förhindra dödandet av zygoter med en piezo under mRNA injektion.
- Tvätta och belägga insidan av injektionsnålar i HEPES-buffrat-HTF innehållande 10% PVP (PVP-HTF).
- Samla de befruktade zygoter med 2nd polar kropp (figur 2B) och överföra 20-25 zygoter till ögonkammaren på Mikroskop scenen fäst med en micromanipulator.
- Fyll den utspädda andra-H2B mRNA in i borosilikatglas kapillärer från tips.
- Håll zygoten med innehav pipett och sedan bryta zona pellucida och cytosoliska membranet med en piezo drive.
- Injicera ca 10 pL av mRNA in i cytoplasman i zygoter. Slut mRNA-injektion inom 10 min att förebygga skador som orsakas av längre odling i zygoter utanför inkubatorn.
Obs: Injektionsvolymen bör vara så stor som 2nd polar kroppen. Om mängden av mRNA som injiceras är för stor, är det möjligt att orsaka gratis andra-H2B fraktionen, som kan påverka den mobila fraktionen. - 10 min efter Mikroskop, tvätta i minst 3 droppar och sedan kultur de injicerade zygoter i CZB vid 38 ° C tills zFRAP analys.
6. zFRAP analys
- 1 h före zFRAP analys, slå på lasern och värmeplatta bifogas scenen av mikroskopet confocal. Ställa in temperaturen vid 38 ° C.
- Sätta 6-10 µL av HEPES-buffrat CZB media täckt med mineralolja på 60 mm glas botten skålen och varm på värmaren tills zygot samling.
- 8 - 12 h efter insemination, samla 5-10 andra-H2B-uttryckande zygoter och överföring i 6-10 µL av pre värmde HEPES-buffrat CZB medium droppe.
Obs: För att undvika längre odling utanför inkubator, 5-10 andra-H2B-uttryckande zygoter användes vid varje analys. 5 till 10 zygoter kan analyseras i 1 h. - Ange de blekning och imaging villkoren enligt tillverkarens anvisningar. Fallet en confocal laser skanning Mikroskop (Tabell för material) visas nedan:
- Användning 60 X olja linsen (60 X 60 X / 1,35 olja).
Obs: Objektiv med högre förstoring (högre numerisk bländare) Visa högre känslighet. - Ange skanningshastighet som 4.0 µs/Pixel och storlek som ”512” på ”förvärv Setting” (kompletterande Figur1).
- Att öka Digital zoom till ”5” (kompletterande Figur1).
Obs: En högre zoom krävs att erkänna om fokus drift uppstår eller inte. - Öppna dye lista (kompletterande Figur1) och sedan valde ”andra”. Ange observationstid som 1.6 s (intervall är inställd som ”free run” inställning) (kompletterande Figur1)
Obs: Fler observationspunkter kan orsaka mer detaljerade uppgifter, men det kan också orsaka fototoxicitet. I den zFRAP analysen tycks en 1,6 s observationstiden vara tillräckligt för att upptäcka föräldrarnas asymmetrin av kromatin glapp. - Ange antalet bilder som 12 totalt (kompletterande Figur1).
- Starta ”Stimulus setting”-panelen och klicka på ”Main” på UseScanner. Ange avsökningen fart 10,0 µs/pixel. Klicka på ”aktivering i serien” och sedan ange PreActivation som ”3 ramar” och aktiveringstid som ”5 sec” (kompletterande Figur1).
- Klicka på ”fokus x 2” och ställa in fokus och sedan ”Stop”.
- Blekning och imaging lasereffekt (477 nm) på 110 och 15 µW, respektive genom justera ”laser gage makt” (kompletterande Figur1).
Obs: Mycket stark blekning kan orsaka ett större blekt område, som orsakar svårigheter för kvantitativ analys. För mätning av lasereffekten, använda en kraftmätare. Det är viktigt att bekräfta laser befogenhet att undvika effekten av tidsrelaterade försämringen av lasereffekten. - Klicka på ”klipp Rect” (kompletterande Figur1) i stimulans inställningen panelen. Ange regionen av intresse (ROI; röd; ROI #1B) som 40 x 40 pixlar (7,6 µm2). Förbereda en referens region (REF; grön; ROI #2), och en bakgrund (BG; blå; ROI #3) använder ”kopiera ROI” och ”klistra in ROI” (högerklicka knapp på musen).
Obs: Pixelstorlek kan anges via ”ROI manager” som kan anropas genom att klicka på högerknappen på musen när markören är på ROI. Större ROIs tros vara bättre eftersom de kan standardisera spridningen av zFRAP poäng. Dock för stora för en ROI kan inte användas för denna analys eftersom det gör det svårt att undvika nucleolus föregångare kroppen (NPB). Andra-H2B i kupén var tänkt att vara fri från kromatin och visade anmärkningsvärd högre rörlighet3. ROI och REF områden bör separeras så mycket som möjligt. Om dessa två regioner är nära, kan blekning också påverka regionen i REF. - Klicka på ”Live” på verktygsfältet och sedan börja ”Live-Plot” (kompletterande Figur1).
Obs: Live tomt anger signal fluorescensintensiteten inom varje ROI och används för att justera lasereffekt med HV. Observera att om ROI inte väljs, ingen intensitet skulle upptäckas på levande tomt panel. - Fastställande av ROI ståndpunkt
Obs: ROI kan flyttas genom att dra till önskad position i pronuclei. (1) vara säker på att undvika nucleolus, och (2) passa in hela ROI i nukleoplasman. Innehåller inte regionen utanför området för det nukleära membranet (cytoplasman) i ROI. Localizationen av andra-H2B är mycket begränsad i nukleoplasman så att det är lätt att hitta om ROI innehåller cytoplasman eller inte genom fluorescensen av andra-H2B. Manliga pronuclei tenderar att vara större än de av hondjur, som är ofta lokaliserade nära 2nd polar kroppen. När du använder dessa kriterier, bedöma de manliga eller kvinnliga pronuclei. - Klicka på ”fokus x 2” (kompletterande Figur1) och sedan justera HV power nivåglaset kanal för andra in fluorescensintensiteten till omkring 2000 (fluorescensintensitet kan ses i fönstret ”levande plot”).
- Användning 60 X olja linsen (60 X 60 X / 1,35 olja).
- Klicka på ”tid” och sedan ”XY” (kompletterande Figur1) för att starta den zFRAP analysen.
Obs: Om ”Time” knappen väljs passande, ”t” visas på knappen ”XY”.- Klicka på ”serien gjort” (kompletterande Figur1), som visas efter FRAP imaging nära knappen ”XY” och sedan få FRAP-analyserade data.
- Spara filen ”2D gradersbilden XXXXX” som en rekommenderad namngiven fil (oib. filformat) av ”Spara som” (Ctrl + Skift + S kan också användas).
- Välj ROI, REF och BG och klicka (Ctrl + A kan också användas) ”serie analys” ”2D Visa bild” fönster.
- Erhålla FRAP raddata och klicka sedan på ”Spara” knappen i fönstret live tomt.
Obs: Ror FRAP kvantitativa data sparas som en CSV-fil.
- För ingen zFRAP kontroll, lägga en del av de zygoter injiceras med mRNA på det droppa, som ligger nära kanten av glas botten rätter att undvika effekt från fluorescens observation.
7. uppgifter beräkning
- Medan du använder gör kvantitativa uppgifterna, grafen av den ”recovery kurvan” och ”mobila bråkdel” av Excel som visas i referenser3,7 med vissa ändringar (se nedan och kompletterande excel-fil).
- Beräkna den relativa intensiteten genom att subtrahera värdet av BG från de ROI och REF i 12 bilder för varje tidpunkt.
- Dela upp värdet av ROI av domaren. Som ett resultat, kan 12 standardiserade relativa intensitet Poäng vid varje tidpunkt erhållas.
- Beräkna medelvärdet för den relativa poängen för ROI i 3 bilder tagna innan foto blekning.
- Beräkna återvinningsgraden. Klyfta 12 erhållits relativa noter för ROI i bilder tagna vid varje tidpunkt (erhålls på 7.1.2.) av genomsnittet av den relativa poängen före foto blekning (erhålls på 7.1.3.). Rita återhämtning kurva med hjälp av dessa noter (figur 2E).
- Beräkna den blekning.
Obs: Blekning skattesats (%) = 100 - återvinningsgraden av 4th image. - Beräkna andelen mobila (MF) med hjälp av formeln som följer10,11,12
MF (%) = 12th återvinningsgrad (vid slutpunkten) - 4th återvinningsgrad / blekning skattesats × 100.
8. embryotransfer
- Mate mognat ICR honor vid 8-12 månader med vasektomerade hanmöss av ICR kvällen innan embryot överföra genom att låta dem vara i samma bur under natten.
- Samla de embryon som var zFRAP-analyseras och fast besluten att utveckla till två celler scenen.
- Intraperitonealt injicera honmöss med 0,7 - 0,9 mL 1,2% tribromoethanol anestesi eller 0,35 - 0,45 mL av 0.75/4/5mg/kg Medetomidin/midazolam/butorfanol blandade agenter innan embryotransfer.
Obs: Volymen av anestesi bestäms av kroppsvikten hos möss. Tribromoethanol: 0,2 mL/10 g kroppsvikt; Medetomidin/midazolam/butorfanol blandat agenter: 0,1 mL/10 g kroppsvikt.- Överföra dessa två-cellstadie embryon i oviducts pseudopregnant kvinnliga ICR möss med en vaginal plugg på 0,5 dagar post intravenösa (dpc).
- Efter embryotransfer, sätta honmöss på värmaren inställd vid 37 ° C tills de vaknar.
- På 18,5 dpc, offra surrogatmamma av cervikal dislokation och återställa den pups härstammar från zFRAP-analyseras zygoter genom kejsarsnitt. Några av de återvunna pups levererades till fostermor och deras kroppsvikt utvärderades varje vecka.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
zFRAP analys med andra-H2B
Korrekt producerad injicerades mRNA kodning andra-H2B, som ses som ett skiftat band orsakas av poly en tailing (figur 2A), i cytoplasman i zygoter med en 2: a polar kropp på 1-3 h efter insemination (figur 2B). Åtta till 12 h efter insemination, zygoter med 2 pronuclei visar uttrycket av andra-H2B samlades och utsätts för zFRAP analys (figur 2 c). FRAP analysen består av blekning och återställning steg. I fasen före blekning signalera av andra-H2B kunde observeras (figur 2D-1), men när blekt, signalen sjönk till en försumbar nivå (figur 2D-2). Om blekning lyckades dök ett mörkt hål stora som ROI snart efter blekning. Efter blekning, intensiteten i andra-H2B fluorescens signalen återhämtat sig något; fluorescerande signalen successivt ökat på grund av inflödet av oblekt fraktionen av andra-H2B in ROI från området oblekt i nukleoplasman (figur 2D-3). För bekräftelse av framgången för zFRAP analys av kromatin glapp rekommenderas det att använda föräldrakontroll asymmetri av kromatin glapp; manliga pronuclei visade en snabbare återhämtning kurva och rörligare fraktioner än hos kvinnor (figur 2E och F). Efter zFRAP analys, tvättat och odlade zygoter i CZB media, skulle kunna utvecklas till blastocyststadiet utan betydande skada (figur 2 g och H). Även om starkt blekt under en längre tid, kan zygoter fortfarande utvecklas till blastocyststadiet samt7.
Analys av zFRAP-analyseras zygoter fullgångna
För att analysera fullgången utvecklingen av embryon som härrör från zFRAP-analyseras zygoter, överfördes embryon i två-cellstadie in i oviducts pseudopregnant mödrar. Som kontroller, var intakt embryon, och en injiceras med mRNA men inte zFRAP-analyseras beredda. Födelsetalen zFRAP-analyseras embryon (41,0%) var något men betydligt lägre än intakt embryon (62,2 procent), men var densamma som i kontrollen ingen zFRAP (52,6%) (Tabell 2). ZFRAP-analys verkar således vara något skadligt för fullgångna embryonal utveckling. Men ännu viktigare, valparna härrör från zFRAP-analyseras zygoter verkade friska och fullt utvecklad (figur 3).
Figur 1: En Schematisk illustration av flödet av förfaranden för experiment. In vitro befruktning: nyligen uppsamlat metafas II (MII) oocyter var inseminerats med sperma från capacitated. In vitro transkription: budbärar-RNA (mRNA) kodning andra-smält Histon H2B (andra-H2B) var transkriberat från SP6 arrangören av linearized pTOPO-andra-H2B3 med inte jag. Andra-H2B mRNA utsätts poly A tailing och sedan rening. Renat andra-H2B mRNA används i mRNA injektion. mRNA injektion: beredda andra-H2B mRNA injiceras i cytoplasman i zygoter med 2nd polar kropp. zFRAP analys: de andra-H2B-uttryckande zygoter utsattes för zFRAP analys. Regionen i intressen (ROI; röd rektangel) var blekt med en stark laser och andra-H2B signalen minskade sedan till en försumbar nivå. Efter blekning, intensiteten i andra-H2B signalen successivt ökat. In vitro utveckling: Efter zFRAP analys, kunde zygoter utvecklas till blastocyststadiet. Embryotransfer: två-cellstadie, zFRAP-analyseras embryona överfördes in i oviducts av pseudopregnant honmöss. 18 dagar senare, friska levande ungar kunde erhållas från zFRAP-analyseras embryon. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: zFRAP analys av zygoter med andra-H2B. (A) representativ bild av ordentligt förberedda mRNA av in vitro- transkription och poly A tailing. Lane 1: före poly en tailing; Lane 2: bokför poly A tailing. (B) mRNA kodning andra-H2B injicerades i cytoplasman i zygoter med en 2nd polar kroppen 1-3 h efter insemination (hpi). Skalstapeln = 25 µm (C) andra-H2B-uttryckande zygoter samlades på 8-12 hpi. Vita asterisker Visa nucleolus föregångare kroppar (NPB). Skalstapeln = 10 µm (D) andra-H2B uttryck upptäcktes i den hela nukleoplasman även i NPB fasen före blekning (d-1), snart efter blekning (d-2), och efter återhämtning (d-3). Den nukleära membran (vita streckade linjer) och NPB (asterisker) indikeras. Skalstapeln = 10 µm. (E, F) återhämtning kurva och mobila fraktioner erhölls från 45 zygoter i 5 oberoende experiment. Blått och rött visar manliga och kvinnliga, respektive. I recovery kurvor indikerar enda cirklar mätpunkten. I spridningsdiagram visar enda prickarna poängen för mobila fraktioner erhålls från pronuclei. (G) representativa bilder av preimplantatorisk utvecklingen av zFRAP-analyseras zygoter visas. Två celler, 4-8 celler och blastocysten stage embryon vid 24, 48 och 96 hpi, respektive. Den gula cirkeln visar välutvecklade blastocystan. Detta blastocysten är förstoras och visas på den högra panelen. Skalstapeln = 100 µm. (H) stapeldiagram av utvecklingstoxicitet klassar av zFRAP-analyseras embryon. Barer indikera zFRAP-analyseras (zFRAP) embryon (vita) och styra embryon (svart) injiceras med mRNA men ingen zFRAP analys (ingen zFRAP). Data som visas är från tre oberoende experiment, att undersöka minst 57 embryon totalt. Två celler, 4-8 celler, morula (Mo) och blastocysten (Bl) stadier observerades vid 24, 48, 72 och 96 hpi, respektive. Denna siffra har ändrats från [Ooga et al 2017]7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: en sund tillväxt av pups härrör från de FRAP-analyseras zygoter. (A) bilderna av pups härrör från zFRAP-analyseras zygoter visas. (B) Normal tillväxt observerades under omvårdnad av den zFRAP-analyseras pups. (C) diagrammet indikerar vikten av pups härledd från intakt embryon (blå), oblekt kontroll embryon (röd) och zFRAP-analyseras embryon (grön). Kroppen vikter på 29 ungar från intakt embryon, 24 från nr-zFRAP embryon, och 15 från zFRAP-analyseras embryon under en 8-veckorsperiod. Värden som anges av asterisker skiljer sig avsevärt från kontrollen intakt. Denna siffra har ändrats från [Ooga et al 2017]7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande Figur1: grafiskt användargränssnitt för FRAP analys. (A) en översikt över det grafiska användargränssnittet visades. (B) förstorade bilder för varje fönster visades. (1) the förvärv inställningen fönstret används för att ange villkoret bild förvärv. (2) the stimulans inställningen fönstret används för att ange villkoret blekning. Detta fönster kan öppnas genom att klicka på knappen fönstret bild förvärv. (3) bild förvärv Control fönstret används för FRAP analys. (4) the Live View visar den nuvarande bilden (den nuvarande bilden visas efter att klicka på fokus x2 eller XY). Rött, grönt och ljus blå rektanglarna visar du ROI (region av intresse), REF (referens) och BG (bakgrund), respektive. (5) 2D-vyn visar FRAP-analyseras bilden och visas när du klickat på ”-serien gjort” knappen. I det här fallet visas en FRAP-analyseras manliga pronucleus som ett exempel. Tre rektanglar med 8 prickar anger att dessa regioner är markerad. (6) the Live tomt visar nuvarande fluorescensintensiteten på varje region. X och Y-axeln anger tid (ms) och fluorescensintensiteten, respektive. (7) the serien analys visar spår av fluorescensintensiteten på varje region och visas efter att klicka serien analys på fönstret Visa 2D. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande Excel fil 1: exempeldata och data beräkning. (Blad 1) Visas ett exempeldata för en manlig pronucleus. Lol anger i följd av bilden. Rad stödnivåerna för varje region (ROI, Ref och BG) indikerades. (2 blad) Ett exempel för beräkning av data visas. Protokollnummer anger de motsvarande platserna i avsnittet protokoll. Anteckningar förklara innebörden av varje poäng. Numeriska formeln kan anges genom att klicka på cellerna. Exempel på återvinning kurvan och mobila bråkdel stapeldiagram visas. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
| Dag -3 | Dag -2 | Dag -1 | Dag av FRAP | Dag + 1 | Dag + 3 | Dag + 19 | |
| mRNA förberedelse | Styckning mall plasmid (över natten) |
1). rening mall plasmid | |||||
| 2). In vitro-transkription | |||||||
| 3). In vitro-poly en tailing | |||||||
| 4). mRNA kvalitetskontroll genom elektrofores | |||||||
| FRAP | 1). beredning av manipulation Pipettera och kammare | ||||||
| 2). mRNA injektion | |||||||
| 3). zFRAP analys | |||||||
| 4). beräkning av återhämtning kurva och mobila bråkdel* 2 | |||||||
| IVF och analys av pre-implantation utveckling | EKG-injektion | 1). hCG-injektionen | 1). sperma capacitation | ||||
| 2). före inkubering av media (HTF) | 2). In vitro-fertilisering | ||||||
| Förberedelse av media (HTF, CZB, H-CZB och PVP-CZB) | 3). utvärdering preimplantatorisk utveckling | ||||||
| Embryotransfer | Beredning av pseudopregnant kvinna (parning med vasektomerade manliga* 1) |
Överföring av 2-cellstadie embryon till pseudopregnant kvinna | Utvärdering av födelsetal | ||||
| * 1: vasektomerade manliga mus bör beredas minst 2 veckor före parning | |||||||
| * 2: beräkning kan förlängas till nästa dag (+ 1) | |||||||
Tabell 1: tidtabell i experimenten. Dagen för FRAP analysen anses dag 0. de experiment som ska utföras anges på respektive dagar för varje objekt.
| Kategorier | Lol av injicerade zygoter | Lol av återvunna zygoter efter mRNA injektion (%) * | Lol av zygoter analyseras | Lol av överförda | Lol mottagare av | Lol valpar (%) *** | Vikt av pups (g) | Lol av transgena pups |
| 2-cellstadie embryon (%) ** | ||||||||
| Intakt | - | - | 99 | 98 (99,0) | 9 | 61 (62,2)en | 1.64±0.02 | Norell |
| Ingen FRAP | 420 | 398 (94,8) | 82 | 78 (95,1) | 7 | 41 (52,6)a,b | 1.66±0.03 | Norell |
| FRAP | 79 | 78 (98,7) | 7 | 32 (41,0)b | 1.69±0.03 | 0 | ||
| *: beräknas genom att dividera med nr. av injicerade zygoter; **: beräknas genom att dividera med nr. av zygoter analyseras; : beräknas genom att dividera med nr. överförda 2-cellstadie embryon. a, b: upphöjd indikerar signifikant skillnad (P < 0,05). Norell: ej fastställt. Den här tabellen har ändrats från [Ooga et al 2017]7. | ||||||||
Tabell 2: födelsetalen analyserade embryon: Fosterskadande potential av embryon, som hade varit FRAP-analyseras, att fullgången undersöktes. De erhållna födelsetalen av dessa embryon visas. Som kontroller undersöktes också intakt och inte FRAP-analyseras embryon. Vikten av valpar från dessa överförda embryon visas också.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som framkommit i denna studie, orsakar den zFRAP analysen inte kritiska skador till fullgångna utveckling, tyder på att denna metod är ett mycket användbart verktyg för att avslöja sambandet mellan molekylära händelser och den embryonala utvecklingspotentialen. Under omprogrammering, in i två-cellen som stat av ES-celler, som differentiell potentialen i dessa celler blir lika hög som för två-cellstadie embryon, ändras kromatin glapp in i det jämförbara med två-cellstadie embryon5. Det är därför möjligt att zygotic kromatin glapp är viktigt för embryonala utvecklingspotentialen. Somatiska cellkärnor övergår i cytoplasman oocyter visade lägre kromatin glapp jämfört med inte bara faderns pronuclei men också moderns pronuclei, vilket tyder på avsaknad av förvärvet öppen kromatin i somatisk kärnöverföring zygoter är involverade i sin fattiga utvecklingspotential. Kollektivt, verkar den zFRAP analysen vara användbart för att belysa genomet omprogrammering mekanismer.
ZFRAP systemet kan göra det möjligt att välja zygoter med hög utvecklingspotential. I förstudien, förutom SCNT, framkom det att runda spermatid injektion (ROSI)-härledda zygoter harbor onormal kromatin glapp. Dessutom konstaterades det att vissa av dem visade kromatin glapp på nivå jämförbar med IVF-derived zygoter samt, vilket tyder på att dessa zygoter har hög utvecklingspotential. Ännu viktigare, kunde zygoter för vilka kromatin glapp utvärderades genom zFRAP framkalla till sikt. I framtiden, därför kan det möjligt att skilja de SCNT - och ROSI-härledda zygoter med högre utvecklingspotential från de lägre av utvärderingen av kromatin glapp genom zFRAP.
Hittills har visat tidigare studier nyttan av levande bildgivande metod för analys av epigenetiska tillstånd i preimplantatorisk embryon. Några av de levande bildgivande metoderna kan avslöja varje epigenetisk modifiering (e.g. DNA/Histon ändring) i preimplantatorisk embryon13,14, men med zFRAP, är det möjligt att utvärdera zygotic kromatin glapp utan döda celler. Kromatin glapp verkar påverkas av epigenetiska förändringar. Till exempel Heterokromatin där repressiva epigenetisk modifiering såsom H3K9me3 och H3K27me3 är berikad visade lägre Histon rörlighet än euchromatic region3,15. Behandling med en kemisk sammansättning, som omvandlar epigenetiska tillstånd, orsakade faktiskt förändring av kromatin glapp i zygoter. Därför är använder zFRAP, det möjligt att avslöja kromatinstruktur summativa epigenetiska tillstånd. Det var tänkt att detta skulle vara en fördel för att utvärdera zygoter utvecklings potential.
Injektion av mRNA kodning andra-H2B för zFRAP har en svagheten men ökar mångsidigheten hos zFRAP. Svagheten av mRNA injektionen är skador som orsakats av Mikroskop. För att undvika detta, är det mycket effektivt att utnyttja de andra-H2B transgena möss. Om andra-H2B transgena möss linje används ökas andelen avkommor jämfört med fallet med hjälp av mRNA Mikroskop. Däremot är det förtjänsten av mRNA injektion att zFRAP tillåter användning av någon slags stam av vild typ möss. De forskare som vill använda zFRAP med deras intresse av mus stam behöver inte förbereda önskad mus stammen med andra-H2B transgenens. Denna merit blir mer framträdande i analysen av transgena (t.ex. överuttryck/knockdown) eller knockout mus linje. De forskare som vill använda zFRAP för deras forskningsämnen med transgena/knockout linjen har inte att förbereda andra-H2B transgena linjen från ett begränsat antal deras intresse och kära. Detta tyder på en fördel för utvecklingen av forskning.
Levande bildanalys med preimplantatorisk embryon kräver specialiserad kunskap och mycket dyra och finstämt specialiserade enheter. Därför, en introduktion av sådant experimentella system är inte ett lätt beslut. Det experimentella system som är etablerad i denna studie behöver endast en thermo-värmare bortsett från en confocal laser skanning Mikroskop. Dessutom lära sig metoden är lätt så att nybörjare i ett laboratorium kan lära metoden för zFRAP inom 1 månad. Men finns det vissa frågor som fortfarande måste beaktas. Först är fokus drift. Under observation är det möjligt att pronuclei eller zygoter avviker från den position där de presenteras innan observation startar. Om fokus drivan uppstår, avvika ROIs även från rätt position. Som ett resultat, blir kvantitativa data värdelösa. För att undvika det här problemet har forskaren använda locket glas botten rätter för skydd mot fönstret från luftkonditioneringen och vänta för olja expansion över objektivet. Om fokus drift uppstår, data från de avvikande zygoter kasseras och en 2nd FRAP analys med de samma zygoter rekommenderas inte. I denna studie var det bra att förkorta observation tiden från 150 s3 till ca 25 s7 . Andra är längre inkubation utanför inkubatorn. Eftersom längre exponering för miljön utanför inkubatorn är definitivt skadligt för embryonal utveckling, rekommenderades att avsluta FRAP-analysen inom 1 h per batch. Antalet i zygoter FRAP-analyseras i en HEPES-buffrat media på glas botten rätter bör vara 6-10. I detta experimentella villkor, maxantalet är runt 30 i 4 h men om det behövs mer zygoter, 20 zygoter per h kan analyseras genom att skjuta upp bedömningen av fluorescerande intensitet i regionen referens och bakgrund. Tredje är 'tidsrelaterade försämring av laser av confocal laser microscopyen'. Om blekning lasern är otillräcklig, inte kan rätt kvantitativa data erhållas på grund av otillräcklig blekning. Faktiskt, föräldrarnas asymmetrin av zygotic kromatin glapp inte kan förvärvas med en svag blekning laser. För att undvika detta, är det rekommenderat att kontrollera huruvida lasereffekten försvagats som tillfälle ges. I denna studie var 110-µW blekning nog för förvärvet av föräldrarnas asymmetri.
zFRAP analys kan användas för andra typer av proteiner, förutom core histoner. Eftersom core histoner visar tydligt låg rörlighet, längre total observationstid (ca 25 s i denna studie) behövs i zFRAP analys. För att analysera ett stort antal zygoter, därför odling i HEPES-buffrat media på värmaren under lång tid oundviklig. Däremot, för zFRAP analys av hög rörlighet proteiner, kan den totala observationstiden ställas in kort, så att tiden för odling i HEPES-buffrat media på värmaren vara kort. Därför, eftersom längre exponering för miljön utanför inkubatorn är mycket skadliga för den embryonala utvecklingen, zFRAP analys för proteiner än core histoner, som har hög rörlighet av naturen, tycks Visa lägre toxicitet än core histoner . Förhoppningen är att detta experimentella system hjälper ytterligare utredning av relationerna mellan olika molekylära händelser och embryonal utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Satoshi Kishigami, Sayaka Wakayama, Hiroaki Nagatomo, Satoshi Kamimura och Kana Kishida för kritiska synpunkter och tekniska stöd. Detta arbete finansierades delvis av ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik programmet för att främja reformen av nationella universitet att M.O.; Japan Society för främjande av vetenskap (16H 02593), Asada Science Foundation och stiftelsen Takeda vetenskap att T.W. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut om att offentliggöra eller beredning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal laser scaning microscope | Olympus | FV1200 | FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7) |
| Thermo plate | Tokai Hit | TP-110RH26 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Micro manupilator | Narishige | MMO-202ND | |
| Pieze Micro Micromanipulator | Prime tech | PMAS-CT150 | |
| 35 mm culture dish | Falcom | 351008 | 35 x 100 mm style; for IVF |
| 60 mm culture dish | Falcom | 351007 | 60 x 15 mm style; for embryo culture |
| 50 mm culture dish | Falcom | 351006 | 50 x 9 mm style; for manipulation on the stage |
| 50 mm glass bottom dish | Matsunami | D910400 | 50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis |
| Mineral oil | Organic spceiality chemicals | 625071 | For FRAP analysis on the glass bottom dishes |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | For IVF and embryo culture |
| glass capillary | Drummond | 1-000-1000 | For handling mouse zygotes |
| Borosilicate glass | Prime tech | B100-75-10-PT | For microinjection of mRNA |
| Micropipett puller | Sutter instrument | P-97/IVF | For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm) |
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit | Thermo Fisher scientific |
AM1340 | |
| Poly (A) tailing kit | Thermo Fisher scientific |
AM1350 | |
| PVP solution 10% (PVP-HTF) | IrvineSceientific | 99311 | HEPES buffered HTF containing 10% PVP |
| Sodium HEPES | Sigma | H3784 | |
| pTOPO eGFP-H2B | Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6) | ||
| NorthernMax Gly Sample loading Dye | Thermo Fisher scientific |
AM8551 | For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA |
| Phenol chloroform isamyl alcohol | nacalai tesque | 25970-14 | |
| Chloroform | nacalai tesque | 08401-65 | |
| Not I | TOYOBO | NOT-111X | |
| Ethachinmate | WAKO | 318-01793 | |
| 3664 Otical power meter | Hioki | 3664 | Power meter for laser power |
| Stereomicmicroscope | Olympus | SZX16 |
References
- Burton, A., Torres-Padilla, M. E. Epigenetic reprogramming and development: a unique heterochromatin organization in the preimplantation mouse embryo. Brief Funct Genomics. 9, 444-454 (2010).
- Okada, Y., Yamaguchi, K. Epigenetic modifications and reprogramming in paternal pronucleus: sperm, preimplantation embryo, and beyond. Cell Mol Life Sci. 74, 1957-1967 (2017).
- Ooga, M., Fulka, H., Hashimoto, S., Suzuki, M. G., Aoki, F. Analysis of chromatin structure in mouse preimplantation embryos by fluorescent recovery after photobleaching. Epigenetics. 11, 85-94 (2016).
- Meshorer, E., et al. Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells. Dev Cell. 10, 105-116 (2006).
- Boskovic, A., et al. Higher chromatin mobility supports totipotency and precedes pluripotency in vivo. Genes Dev. 28, 1042-1047 (2014).
- Yamagata, K., Ueda, J. Long-term live-cell imaging of mammalian preimplantation development and derivation process of pluripotent stem cells from the embryos. Dev Growth Differ. 55, 378-389 (2013).
- Ooga, M., Wakayama, T. FRAP analysis of chromatin looseness in mouse zygotes that allows full-term development. PLoS One. 12, e0178255 (2017).
- Quinn, P., Begley, A. Effect of human seminal plasma and mouse accessory gland extracts on mouse fertilization in vitro. Australian journal of biological sciences. 37, 147-152 (1984).
- Chatot, C. L., Lewis, J. L., Torres, I., Ziomek, C. A. Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium. Biology of reproduction. 42, 432-440 (1990).
- Bae, J., Sung, B. H., Cho, I. H., Song, W. K. F-actin-dependent regulation of NESH dynamics in rat hippocampal neurons. PLoS One. 7, e34514 (2012).
- Dieteren, C. E., et al. Defective mitochondrial translation differently affects the live cell dynamics of complex I subunits. Biochim Biophys Acta. 1807, 1624-1633 (2011).
- Subramanian, V., et al. H2A.Z acidic patch couples chromatin dynamics to regulation of gene expression programs during ESC differentiation. PLoS Genet. 9, e1003725 (2013).
- Hayashi-Takanaka, Y., et al. Tracking epigenetic histone modifications in single cells using Fab-based live endogenous modification labeling. Nucleic Acids Res. 39, 6475-6488 (2011).
- Yamazaki, T., Yamagata, K., Baba, T. Time-lapse and retrospective analysis of DNA methylation in mouse preimplantation embryos by live cell imaging. Dev Biol. 304, 409-419 (2007).
- Puschendorf, M., et al. PRC1 and Suv39h specify parental asymmetry at constitutive heterochromatin in early mouse embryos. Nat Genet. 40, 411-420 (2008).
