Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Zygotic fluorescens utvinning etter Foto-bleking analyse for Chromatin Looseness som tillater Full sikt utvikling

Published: June 12, 2018 doi: 10.3791/57068
Automatic Translation
1,3, 2, 2, 1,3
1Faculty of Life and Environmental Sciences, Department of Biotechnology, University of Yamanashi, 2Department of Integrated Bioscience, Graduate School of Frontier Sciences, University of Tokyo, 3Advanced Biotechnology Center, University of Yamanashi

Summary

Chromatin løshet synes å være involvert i den utviklingsmessige potensialet av blastomeres. Men er det ikke kjent om chromatin løshet kan brukes som en pålitelig indeks for den utviklingsmessige potensialet for embryoer. Her, har en eksperimentell system der chromatin løshet-vurdert zygotes kan utvikle til full sikt blitt beskrevet.

Abstract

Live bildebehandling er et kraftig verktøy som tillater analyse av molekylære hendelser under ontogenesis. Nylig har chromatin løshet eller åpenhet vist å være involvert i differensiering potensialet i pluripotent stamceller. Den tidligere rapportert som sammenlignet med embryonale stamceller, zygotes havn en ekstremt løsnet chromatin struktur, antyder sin tilknytning til deres totipotency. Men inntil nå, har det ikke vært adressert om denne ekstremt løsnet/åpne chromatin strukturen er viktig for embryonale utviklingsmessige potensiale. Studien, for å undersøke denne hypotesen, ble en eksperimentell systemet som zygotes som ble analysert av fluorescens utvinning etter Foto-bleking kan utvikle begrepet uten betydelig skade utviklet. Viktigere, trenger eksperimentelle systemet bare en termos-plate ovn i tillegg til en AC confocal laserskanning mikroskop. Resultatene av denne studien tyder på at fluorescens utvinning etter Foto-bleking analyse (FRAP) analyse kan brukes til å undersøke om molekylære hendelsene i zygotic chromatin er viktig for hele.

Introduction

Chromatin strukturen endres dynamisk etter befruktning, og zygotic chromatin strukturen er så til slutt etablerte1,2. I denne perioden i fars pronuclei, endres dominerende chromatin protein fra protamine i histone. Den resulterende chromatin er svært forskjellig fra sperms og kvinnelige oocytes i flere poeng (f.eks, histone variant komposisjon, histone endring). Dermed er dannet zygotic chromatin antatt å være viktig for embryonale utvikling. Men tross forsøk på å avsløre detaljer om zygotic chromatin struktur over lengre perioder, har metoder å vurdere kvaliteten på zygotes eller å forutsi deres full sikt utvikling på en celle scenen ved å analysere chromatin strukturen aldri vært etablert.

I den tidligere studien, er det oppdaget at zygotes har en ekstremt løsnet chromatin struktur3. Foreløpig antas chromatin løshet eller åpenhet å være en viktig faktor for differensiering i embryonic stem (ES) celler4. ES celler stiller ikke homogenitet i naturen, men er heller heterogen; i ES celle kolonier kjøpe noen transiently et høyere differensiering potensial sammenlignes med blastomeres av to-celle scenen embryo. I løpet av denne overgangen til to-cellen tilstand celler chromatin løshet inne ES endringer i hva er sammenlignbare med to-celle scenen embryo5. Dermed synes chromatin løshet å være viktig for differensiering potensial og det er mulig at mye åpne chromatin i zygotes er nyttig for vurdering av zygotic utviklingsmessige potensiale.

Live bildebehandling er et kraftig verktøy som tillater analyse av molekylære hendelser under ontogenesis siden gir denne metoden utvikling og enda full sikt utvikling6. Som en av metodene for live bildebehandling, har FRAP analyse blitt brukt til å undersøke chromatin løshet inne preimplantation embryoer og ES celler3,4,5. Hvis zygotic chromatin løshet kan analyseres uten virkning på hele utviklingen av FRAP analyse, kan det være et verdifullt verktøy for vurdering av kvaliteten på embryoer på en celle scenen. Men har effekten på hele utviklingen av denne eksperimentelle metoden ikke blitt undersøkt. Nylig ble en eksperimentell systemet bruker FRAP evaluere zygotic chromatin løshet utviklet. Fordi dette var et nytt observasjon system for zygotes, var det betegnet som zygotic FRAP (zFRAP). zFRAP ikke kritisk påvirke hele utvikling og har blitt rapportert andre steder7. Protokoll for denne eksperimentell metode er beskrevet i denne rapporten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne studien ble utført i strengt samsvar med anbefalingene i Guide og bruk av forsøksdyr av universitetet i Yamanashi. Protokollen ble godkjent av komité for etikk av dyr eksperimenter av universitetet i Yamanashi (tillater tall: A24-50). Alle operasjoner ble utført under tribromoethanol anestesi, og alle forsøk ble gjort for å minimere lidelse. En illustrert oversikt over prosedyrer og rutetabell er vist i figur 1 og tabell 1, henholdsvis.

1. utarbeidelse av budbringer RNA (I Vitro transkripsjon av eGFP-H2B mRNA)

  1. Linearize 5 µg mal DNA pTOPO-eGFP-H2B3,7 med 30 U av ikke jeg i 50 µL på 37 ° C over natten.
  2. Samle 1,5 µL av fordøyd DNA bekreftelse om helt fordøyd av geleelektroforese.
    1. Bruke 1,5 µL og 3-5 µL av ufordøyd DNA laste fargestoff til av 2% agarose gel, henholdsvis, og kan geleelektroforese.
      Merk: Hvis helt fordøyd, et enkelt band (ca. 5 kb) er observert. Ufordøyd DNA brukes som en kontroll, som vises på en annen plassering.
  3. Legge til høyde 151,5 µL ddH2O og 200 µL av fenol/kloroform/isoamyl alkohol (25:24:1) for de resterende fordøyd DNA.
    1. Bland kraftig ved vortex.
    2. Sentrifuge maksimal hastighet i 15 min.
  4. Gjenopprette nedbryting og deretter legge 200 µL av kloroform.
    1. Bland kraftig ved vortex.
    2. Sentrifuge med maksimal hastighet i 15 min.
  5. Gjenopprette nedbryting og deretter legge til 20 µL av 3M natrium acetate og 1,5 µL av ethachinmate.
    1. Bland kraftig ved vortex.
    2. Legg 550 µL av 100% etanol og bland kraftig av vortex.
    3. Sentrifuge med maksimal hastighet i 15 min.
    4. Forkast nedbryting og så vaske pellet med 70% etanol.
    5. Tørke av pellets ved fordampning i 5-10 min.
  6. Oppløse utfelt plasmider DNA i 8 µL nuclease uten vann.
  7. Vurdere plasmider konsentrasjon (forventet konsentrasjonen er om 300-500 ng/µL) med nanodrop ved å følge produsentens instruksjoner.
  8. Utføre i vitro transkripsjon for mRNA koding eGFP-H2B med 1 µg renset DNA som en mal i 20 µL av totale reaksjon volum ved å følge instruksjonene fra produsenten.
    1. Etter i vitro transkripsjon, tilsett 36 μL av vann og deretter gjenopprette 1,5 µL fra 56 µL av syntetisk mRNA for analyse av geleelektroforese (som uten poly A).
  9. Utføre poly A tailing for syntetisert mRNA i et 100 µL reaksjon volum ved å følge instruksjonene fra produsenten.
  10. Legg til 60 µL av litium chloride nedbør løsning til poly en hale mRNA av eGFP-H2B og bland kraftig.
    1. Cool på 30 ° C i 30 min.
    2. Sentrifuge med maksimal hastighet i 15 min.
    3. Forkast nedbryting og så vaske pellet med 70% etanol.
    4. Tørke av pellets ved fordampning i 5-10 min.
  11. Oppløse pellets med 20 µL av nuclease-fritt vann ved 55 ° C i 30 min.
  12. Vurdere konsentrasjonen av den utfelt mRNA med nanodrop. Fortynne til 500 ng/µL nuclease-fritt vann og butikk på-80 ° C før bruk.
  13. Bekrefte foretrukne mRNA produksjon; emne 1 µL av mRNA med/uten (innhentet i 1.8.1 og 1,12 trinn, henholdsvis) poly en hale blandet med 1,5 µL av 0,1 mg/mL ethidium bromide og 3 µL eksempel lasting fargestoff til geleelektroforese analyse. Anvendt var 5,5 µL.
    Merk: Hvis Poly A tailing var vellykket, skiftet bandet sammenlignet mRNA uten poly en tailing praktiseres (figur 2A).

2. forberedelse av Vasectomized mannlige mus

  1. Veie ICR mannlige musene på 8-12 måneder med en vekt skala.
  2. Intraperitoneally injisere mannlige mus med 0,7 - 0.9 mL 1,2% tribromoethanol anestesi.
    Merk: Mengden av anestesi, avhenger av størrelsen på musen. For eksempel injiseres en mus som veier 40 g med 0,8 mL tribromoethanol anestesi.
  3. Våt bær med 70% etanol.
  4. Gjøre en liten kutte (3-5 mm) på berry og gjør en snitt på muskel veggen ved hjelp av saks.
    Merk: Saks og tang skal vaskes med 70% etanol før du starter operasjonen.
  5. Grip en fett pad med tang og trekk det forsiktig ut. Deretter vises testikkel og vas deferens.
    Merk: Vas deferens er en U-formet rør og med en rød blodåre.
  6. Tie av vas deferens ved to punkter med kirurgisk suturer og deretter kutte ut den midtre delen mellom de to punktene.
  7. Forsiktig presse tilbake fett puten og testikkel i bær.
    1. Gjenta operasjonen med gjenværende testikkel.
  8. Sy muskel veggen med 2 masker med kirurgisk Sutur.

3. IVF

  1. Injisere 8 - 10 - uke gamle kvinnelige B6D2F1 (BDF1) mus intraperitoneally med 7,5 IU equine choriongonadotropin (eCG) og humant choriongonadotropin (hCG) på 46-50 h intervall.
  2. Forberede dråper 300 µL menneskelige tubal væske (HTF)8 media capacitation og inseminasjon 1 dag før IVF i 30 mm parabol, dekk disse dråper med mineralolje på laboratoriebenken og deretter preincubate i en inkubator over natten.
  3. Ofre modnet mannlige ICR mus for cervical forvridning. Dissekere cauda bitestikkel med en 27-G nål og samle spermatozoon. Kultur dem for capacitation i 300 µL av HTF medier for 1-2 h på 38 ° C.
  4. 16 h etter hCG injeksjon, ofre super ovulated kvinnelige mus for cervical forvridning. Overføre oviduct ampulla til mineralolje ved HTF media og deretter trekke ut cumulus celler og oocytes komplekse fra denne oviduct ampulla av en 30-G-p til preincubated inseminasjon-HTF medium.
    Merk: Noen kvinnelige mus viser ikke ofte eggløsning tross super eggløsning behandling. Forstørret oviduct ampulla er et tegn på eggløsning.
  5. Etter capacitation, overføre 2-3 µL av den capacitated spermatozoon i inseminasjon-HTF media der ovulated oocytes ble samlet.
  6. 1 time etter befruktning, samle befruktet zygotes og behandle dem med hyaluronidase på 100 µg/mL for 10 min i CZB9 medier.
    Merk: Når inseminasjon er riktig utført, 1 time etter insemination, de befruktede zygotes med 2nd polar kroppen er observert. Hvis mindre eller lav kvalitet brukes sperm, er bare små zygotes med 2nd polar kroppen observert. Også, hvis mange sperms brukes for inseminasjon, polyspermy oppstår. Riktig inseminasjon fører til zygotes med mannlige og kvinnelige pronuclei. Ved hjelp av disse kriteriene, er det mulig å finne om inseminasjon er gjort bra eller ikke.
    1. Etter vask i CZB medier, underlagt zygotes med en andre polar microinjection med eGFP-H2B mRNA.

4. forberedelse av kammeret og Microinjection Pipetter

  1. Fortynne RNA koding eGFP-H2B bruke nuclease-fritt vann for å oppnå en konsentrasjon av 250 ng/µL.
  2. Forberede 2-3 dråper PVP-HTF eGFP-H2B drops mRNA og 5-6 dråper Hepes bufret CZB (H-CZB) dråper på 60 mm parabolen. Dekk disse dråper med mineralolje.
    Merk: Disse forberedelsene kan utføres på laboratoriebenken. Det er ingen krav for å bruke laminær luftstrøm regjering.
  3. Trekke Borosilikatglass med en brønnene avtrekker (f.eks, P = 500, varme = 825, trekke = 30, vel = 120, og tid = 200)
  4. Etter å ha brutt bøye spissen av pipette, trakk glass microinjection pipette nær spissen (−300 µm tilbake) på rundt 30 ° ved hjelp av en microforge.

5. microinjection

  1. Slå av platen ovnen på scenen av micromanipulator å hindre drapet på zygotes med en piezo under mRNA injeksjon.
  2. Vask og strøk innsiden av injeksjon nåler i HEPES-bufret-HTF inneholder 10% PVP (PVP-HTF).
  3. Samle de befruktede zygotes med en 2nd polar kropp (figur 2B) og overføre 20-25 zygotes på kammeret av mikroskopet scenen festet med en micromanipulator.
  4. Fylle utvannet eGFP-H2B mRNA i Borosilikatglass kapillærer fra tips.
  5. Hold zygoten med en holde pipette og deretter bryte zona pellucida og cytosolic membranen med en piezo-stasjon.
  6. Injisere ca 10 pL av mRNA i cytoplasm av zygotes. Fullføre mRNA-injeksjon i 10 min å forhindre skade som skyldes lengre dyrking zygotes utenfor inkubator.
    Merk: Injeksjon volumet må være like stor som 2nd polar. Hvis mengden mRNA injisert er for stor, er det mulig å få gratis eGFP-H2B brøk, som kan påvirke mobile brøken.
  7. 10 min etter microinjection, vask i minst 3 dråper og deretter kultur injisert zygotes i CZB på 38 ° C før zFRAP analyse.

6. zFRAP analyse

  1. 1 time før zFRAP analyse, slå på laser- og kokeplate knyttet til scenen av AC confocal mikroskop. Still inn temperaturen på 38 ° C.
  2. Sett 6-10 µL av HEPES-bufret CZB media dekket med mineralolje på 60 mm glass bunnen rett og varm på ovnen til zygote samling.
  3. 8 - 12 h etter befruktning, samle 5-10 eGFP-H2B-uttrykke zygotes og overføring til 6-10 µL av pre varme HEPES-bufret CZB middels slipp.
    Merk: For å unngå lengre dyrking utenfor inkubator, 5-10 eGFP-H2B-uttrykke zygotes ble brukt på hver analyse. 5 til 10 zygotes kan analyseres i 1 time.
  4. Angi bleking og tenkelig betingelsene i henhold til produsentens instruksjoner. Tilfelle en AC confocal laserskanning mikroskopet (Tabell for materiale) er vist nedenfor:
    1. Bruk 60 X olje linsen (60 X 60 X / 1.35 olje).
      Merk: Linser med høyere forstørrelse (høyere numeriske blenderåpning) vise høyere følsomhet.
    2. Angi skannehastighet 4.0 µs/bildepunkt og størrelse som "512" på "Kjøp innstilling" (supplerende figur 1).
    3. Øke Digital zoom "5" (supplerende figur 1).
      Merk: En høyere zoom kreves for å gjenkjenne om fokus drift skjer eller ikke.
    4. Åpne fargestoff liste (supplerende figur 1) og velg deretter "EGFP". Angi observasjon som 1.6 s (intervall angis som "gratis run") (ekstra figur 1)
      Merk: Flere observasjon poeng kan forårsake mer detaljert data, men det kan også forårsake Phototoksisitet. I zFRAP analyse synes en 1.6 s observasjon å være nok til å oppdage den foreldrene asymmetri av chromatin løshet.
    5. Angi antall bilder som 12 totalt (supplerende figur 1).
    6. Starte "Stimulans innstilling" panel og deretter "Main" på UseScanner. Angi skannehastighet som 10,0 µs/piksel. Klikk "Aktivisering i serien" og angi PreActivation som "3 rammer" og aktivering som "5 sec" (supplerende figur 1).
    7. Klikk "Fokus x 2" og sette fokus og så "slutte".
    8. Angi bleking og tenkelig laser makt (477 nm) på 110 og 15 µW, henholdsvis for justering "laser gage makt" (supplerende figur 1).
      Merk: Sterkt bleking kan forårsake en større bleket området, som skaper problemer for kvantitativ analyse. For måling av laser makt, bruk en strømmåleren. Det er viktig å bekrefte laser makt til å unngå effekten av tidsrelaterte forverring av laser makt.
    9. Velg "Klipp Rect" (supplerende figur 1) i stimulans innstillingen panelet. Angi regionen rundt (ROI, røde; ROI #1B) som 40 x 40 piksler (7,6 µm2). Forberede en referanse region (REF, grønne; ROI #2), og en bakgrunn (BG, blått. ROI #3) bruker "Kopier avkastning" og "lim Avkastningen" (Høyreklikk knappen på musen).
      Merk: Pikselstørrelsen kan defineres via "Avkastningen manager" som kan kalles ved å klikke på høyre knapp på musen når markøren er på Avkastningen. Større ROIs antas å være bedre siden de kan standardisere spredning av zFRAP score. Men for stor for en avkastning kan ikke brukes for denne analysen fordi det gjør det vanskelig å unngå kjerne forløper kroppen (NPB). eGFP-H2B i dette rommet var tenkt å være fri fra chromatin og viste bemerkelsesverdig høyere mobilitet3. ROI-og REF skal skilles så mye som mulig. Hvis disse to regionene er nær, kan bleking også påvirke regionen i REF.
    10. Klikk "Live" på verktøylinjen og deretter starte "Live plott" (supplerende figur 1).
      Merk: Live tomten angir fluorescens signal intensiteten i hver avkastning og brukes til å justere laser makt bruker HV. Merk at hvis Avkastningen ikke er valgt, vil ingen intensitet registreres Live tomten-panelet.
    11. Bestemme ROI posisjonen
      Merk: Avkastningen kan flyttes ved å dra til ønsket plassering i pronuclei. (1) være sikker på å unngå kjerne, og (2) passer hele Avkastningen i nucleoplasm. Inneholde regionen utenfor området de kjernefysiske membranen (cytoplasma) i avkastning. Lokalisering av eGFP-H2B er svært begrenset i nucleoplasm slik at det er lett å finne om Avkastningen inneholder cytoplasma eller ikke ved fluorescens av eGFP-H2B. Mannlige pronuclei pleier å være større enn kvinner, som er ofte lokalisert nær 2nd polar kroppen. Mens du bruker disse kriteriene, dømme de mann eller kvinne pronuclei.
    12. Klikk "Fokus x 2" (supplerende figur 1) og deretter justere den HV makt gage av kanalen for EGFP til fluorescens intensitet til rundt 2000 (fluorescens intensitet kan sees i vinduet "live tomten").
  5. Klikk "Tid" og deretter "XY" (supplerende figur 1) for å starte zFRAP analysen.
    Merk: Hvis "Tid" knappen velges passende, "t" vises på knappen "XY".
    1. Klikk "serien gjort" (supplerende figur 1), som vises etter FRAP bildebehandling i nærheten "XY-knappen" og deretter få FRAP-analysert data.
    2. Lagre filen "2D visning-Image xxxx" som en foretrukket navngitt fil (oib.-filformat) av "Lagre som" (Ctrl + SKIFT + S kan brukes).
    3. Velg avkastning, REF og BG og klikk (Ctrl + A kan også brukes) "Serien analyse" i "2D Vis bilde"-vinduet.
    4. Få FRAP raddata og klikk "lagre"-knappen i vinduet live tomten.
      Merk: P FRAP kvantitative data lagres som en csv-fil.
  6. Putte noen av zygotes injisert med mRNA på miste, som ligger nær kanten av glasset bunnen retter å unngå effekten fra fluorescens observasjon for kontroll zFRAP.

7. data beregning

  1. Mens du bruker gjøre innhentet kvantitative data, grafen til "recovery kurve" og "mobil fraksjon" av Excel som vist i referanser3,7 med noen modifikasjoner (se nedenfor og supplerende excel-fil).
  2. Beregne den relative intensiteten ved å trekke verdien av BG fra avkastning og REF i 12 bilder for hvert punkt.
  3. Dele verdien av avkastning av DOMMEREN. Som et resultat, kan 12 standardisert relative intensiteten score på hvert punkt oppnås.
  4. Beregne gjennomsnittet av relativ poeng for avkastning i 3 bilder tatt før Foto bleking.
  5. Beregne utvinningsgrad. Skille 12 innhentet relative score for avkastning i bilder tatt på hvert punkt (innhentet på 7.1.2.) av gjennomsnittet av den relative score før Foto bleking (innhentet på 7.1.3.). Tegne utvinning kurven med hjelp av disse score (figur 2E).
  6. Beregne bleking hastigheten.
    Merk: Bleking rate (%) = 100 - utvinningsgrad på 4th bilde.
  7. Beregne mobile brøken (MF) ved hjelp av formelen som følger10,11,12
    MF (%) = 12th utvinningsgrad (ved sluttpunktet) - 4th utvinningsgrad / bleking rate × 100.

8. embryoer

  1. Kompis modnet ICR kvinner på 8-12 måneder med vasectomized mannlige ICR mus natten før embryoet overføre ved å la dem være i samme buret over natten.
  2. Samle embryoene var zFRAP-analysert og bestemte å utvikle til to-celle scenen.
  3. Intraperitoneally injisere kvinnelige mus med 0,7 - 0.9 mL 1,2% tribromoethanol anestesi eller 0,35 - 0,45 mL av 0.75/4/5mg/kg medetomidine/midazolam/butorphanol blandet agenter før embryoer.
    Merk: Volumet av anestesi bestemmes av kroppsvekten mus. Tribromoethanol: 0,2 mL/10 g av kroppsvekt; medetomidine/midazolam/butorphanol blandet agenter: 0,1 mL/10 g av kroppsvekt.
    1. Overføre disse to celle scenen Foster til oviducts pseudopregnant kvinnelige ICR mus med en vaginal plugg i 0,5 dager innlegget coitum (PPC).
    2. Etter embryoer, sette de kvinnelige mus på ovnen satt på 37 ° C før de våkner.
  4. 18.5 dpc, ofre det surrogat moder av cervical forvridning og gjenopprette pups avledet fra zFRAP-analysert zygotes ved keisersnitt. Noen av de gjenopprettede pups ble levert til fostermor og deres kropp vekter ble vurdert hver uke.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

zFRAP analyse med eGFP-H2B

Riktig produsert ble mRNA koding eGFP-H2B, som er sett på som et skiftet band skyldes poly en tailing (figur 2A), injisert i cytoplasm i zygotes med en 2 polar på 1-3 h etter inseminasjon (figur 2B). Åtte til 12 h etter befruktning, zygotes med 2 pronuclei viser uttrykk for eGFP-H2B var samlet og utsatt for zFRAP analyse (figur 2C). FRAP analysen består av bleking og utvinning. På den pre bleking fasen, signalet fra eGFP-H2B kunne observeres (figur 2D-1), men når bleket, signalet falt til et ubetydelig nivå (figur 2D-2). Hvis bleking var vellykket, dukket et mørkt hull så stor som avkastning etter bleking. Etter bleking, intensiteten av eGFP-H2B fluorescens signalet gjenopprettet litt; fluorescerende signalet gradvis økt på grunn av tilførsel av ubleket brøkdel av eGFP-H2B i Avkastningen fra ubleket området i nucleoplasm (figur 2D-3). For bekreftelse av suksessen til zFRAP analyse av chromatin løshet anbefales det å bruke foreldrekontroll asymmetri av chromatin løshet; mannlige pronuclei viste en raskere utvinning kurve og mer mobile fraksjoner enn kvinner (figur 2E og F). Etter zFRAP analyse, vasket og kultivert zygotes i CZB medier, kunne utvikle til blastocysten scenen uten betydelig skade (figur 2 g og H). Selv om sterkt bleket i lengre tid, kunne zygotes fortsatt utvikle i blastocysten scenen også7.

Analyse av hele utviklingen av zFRAP-analysert zygotes

For å analysere hele utviklingen av embryo avledet fra zFRAP-analysert zygotes, ble embryoer på to-celle scenen overført til oviducts av pseudopregnant mødre. Kontroller, ble intakt embryo, og en injisert med mRNA men ikke zFRAP-analysert utarbeidet. Fødselsrate på zFRAP-analysert embryo (41.0%) var litt men betydelig lavere enn intakt embryo (62.2%), men var den samme som på ingen zFRAP kontrollen (52.6%) (Tabell 2). Dermed synes zFRAP-analyse å være litt skadelig for hele embryonale utvikling. Men viktigst, pups avledet fra zFRAP-analysert zygotes virket frisk og fullt utviklet (Figur 3).

Figure 1
Figur 1: En skjematisk illustrasjon av flyten av prosedyrer for eksperimenter. In vitro fertilisering: fersk samlet metaphase II (MII) oocytes var inseminated med capacitated sperm. In vitro transkripsjon: budbringer RNA (mRNA) eGFP-smeltet histone H2B-koding (eGFP-H2B) ble transkribert fra SP6 arrangøren av lineær pTOPO-eGFP-H2B3 med ikke jeg. EGFP-H2B mRNA utsatt poly A tailing og rensing. Den renset eGFP-H2B mRNA brukes i mRNA injeksjon. mRNA injeksjon: forberedt eGFP-H2B mRNA injiseres i cytoplasm i zygotes med 2nd polar kroppen. zFRAP analyse: eGFP-H2B-uttrykke zygotes ble utsatt for zFRAP analyse. Regionen interesser (ROI, røde rektanglet) ble bleket med en sterk laser og deretter eGFP-H2B signalet falt til et ubetydelig nivå. Etter bleking, intensiteten av eGFP-H2B gradvis økt. In vitro utvikling: Etter zFRAP analyse, kunne zygotes utvikle seg til blastocysten scenen. Embryoer: på to-celle Stadium, de zFRAP-analysert embryoene ble overført til oviducts pseudopregnant kvinnelige mus. dager senere, sunn live pups kan hentes fra zFRAP-analysert embryo. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: zFRAP analyse av zygotes med eGFP-H2B. (A) representativt bilde av skikkelig forberedt mRNA av i vitro transkripsjon og poly A tailing. Lane 1: pre poly en tailing; Lane 2: legge poly A tailing. (B) mRNA koding eGFP-H2B ble injisert i cytoplasm i zygotes med en 2nd polar kroppen 1-3t innlegget inseminasjon (hpi). Skala bar = 25 µm (C) eGFP-H2B-uttrykke zygotes var samlet på 8-12 hpi. Hvite stjerner viser kjerne forløper organer (NPB). Skala bar = 10 µm (D) eGFP-H2B uttrykket ble oppdaget i det hele nucleoplasm i NPB i den pre bleking fasen (D-1), snart etter bleking (D-2), og etter utvinning (D-3). Den kjernefysiske membraner (hvite stiplede linjer) og NPB (stjerner) angis. Skala bar = 10 µm. (E, F) utvinning kurve og mobile fraksjoner Hentet fra 45 zygotes 5 uavhengige eksperimenter. Blå og røde indikerer mannlige og kvinnelige, henholdsvis. I utvinning kurver angi enkelt sirkler måling poenget. Scatter tomter indikerer enkelt prikker poengsummen for mobile fraksjoner fra pronuclei. (G) representant bilder av preimplantation utviklingen av zFRAP-analysert zygotes vises. To-celle, 4-8 celle, og blastocysten scenen embryoer på 24, 48 og 96 hpi, henholdsvis. Gul sirkel angir velutviklet blastocysten. Denne blastocysten er forstørret og vises i panelet til høyre. Skala bar = 100 µm. (H) stolpediagram av utviklingsmessige priser av zFRAP-analysert embryo. Angi zFRAP-analysert (zFRAP) embryo (hvit) og kontrollere embryo (svart) injisert med mRNA men ingen zFRAP analyse (ingen zFRAP). Dataene er fra tre uavhengige eksperimenter, undersøke minst 57 embryo totalt. To-celle, 4-8 celle, morulastadiet (Mo) og blastocysten (Bl) etapper ble observert på 24, 48, 72 og 96 hpi, henholdsvis. Dette tallet er endret fra [Ooga et al 2017]7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: sunn vekst av pups avledet fra FRAP-analysert zygotes. (A) bilder av valpene avledet fra zFRAP-analysert zygotes vises. (B) Normal vekst ble observert under pleie av zFRAP-analysert valpene. (C) diagrammet angir vekten av pups avledet fra intakt embryo (blå), ubleket kontroll embryo (rød) og zFRAP-analysert embryo (grønn). Kroppen vekten av 29 pups avledet fra intakt embryo, 24 fra no-zFRAP embryoer og 15 fra zFRAP-analysert embryo over en 8-ukers periode. Verdier angitt av stjerner er signifikant forskjellig fra kontrollen intakt. Dette tallet er endret fra [Ooga et al 2017]7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Ekstra figur 1: grafisk brukergrensesnitt for FRAP analyse. (A) en oversikt over det grafiske brukergrensesnittet ble vist. (B) forstørret bilder for hvert vindu ble vist. (1) oppkjøpet oppsett vinduet brukes til å angi betingelsen bilde oppkjøpet. (2) stimulans oppsett vinduet brukes til å angi betingelsen bleking. Dette vinduet kan åpnes ved å klikke på kjøp bildevinduet. (3) the oppkjøpet bildekontrollen vinduet brukes for FRAP analyse. (4) Live View viser nåværende bildet (nåværende bildet vises når du klikker fokus x2 eller XY-knappen). Rød, grønn og lys blå rektanglene viser avkastning (område av interesse), REF (referanse) og BG (bakgrunn), henholdsvis. (5) 2D-visningen viser FRAP-analysert bildet og vises når du klikker "Serien gjort" knappen. I dette tilfellet vises en FRAP-analysert mannlige pronucleus som et eksempel. Tre rektangler med 8 prikker angir at disse områdene er merket. (6) the Live Plot viser nåværende fluorescens intensiteten på hvert område. X og Y aksene angi tid (ms) og fluorescens intensitet, henholdsvis. (7) serien analyse viser spor av fluorescens intensiteten på hvert område og vises etter å klikke tidsserier analyse på 2D visningsvinduet. Klikk her for å laste ned denne filen.

Ekstra Excel filen 1: eksempeldata og data beregning. (Ark 1) En eksempeldataene for en mannlig pronucleus vises. nei. Angir rad antallet bildet. Rad intensiteter for hver region (avkastning, Ref og BG) ble angitt. (Ark 2) Et eksempel for beregning av dataene vises. Protokollnummeret angir tilsvarende i delen protokollen. Notater forklare betydningen av hvert poeng. Numerisk formelen kan refereres ved å klikke cellene. Eksempler på utvinning kurve og mobile brøkdel stolpediagram vises. Klikk her for å laste ned denne filen.

Dag -3 Dag -2 Dag -1 Dag FRAP Dag 1 Dag 3 Dag 19
mRNA forberedelse Kutte mal plasmider
(over natten)		 1). rensing mal plasmider
2). In vitro transkripsjon
3). In vitro poly en tailing
4). mRNA kvalitetskontroll av geleelektroforese
FRAP 1). forberedelse av manipulasjon Pipetter og kammer
2). mRNA injeksjon
3). zFRAP analyse
4). beregning av utvinning kurve og mobile brøkdel* 2
IVF og analyse av før implantasjon utvikling EKG-injeksjon 1). hCG injeksjon 1). sperm capacitation
2). pre-inkubering medier (HTF) 2). In vitro fertilisering
Utarbeidelse av media (HTF, CZB, H-CZB og PVP-CZB) 3). evaluering preimplantation utvikling
Embryoer Utarbeidelse av pseudopregnant kvinne
(mating med vasectomized mann* 1)		 Overføring av 2-celle scenen embryo til pseudopregnant kvinne Evaluering av fødselsrate
* 1: vasectomized mannlige musen bør være forberedt minst 2 uker før parring
* 2: beregningen kan bli forlenget til neste dag (dag 1)

Tabell 1: tidstabell av eksperimenter. Dagen av FRAP analyse regnes som dag 0. eksperimentene som skal utføres angis på respektive dager for hver vare.

Kategorier nei. av injisert zygotes nei. av gjenopprettede zygotes etter mRNA injeksjon (%) * nei. av zygotes analysert nei. av overført nei. mottakere nei. av pups (%) *** Vekten av pups (g) nei. av transgene pups
2-celle scenen embryo (%) **
Intakt - - 99 98 (99,0) 9 61 (62.2)en 1.64±0.02 n.d
Ingen FRAP 420 398 (94,8) 82 78 (95.1) 7 41 (52.6)a,b 1.66±0.03 n.d
FRAP 79 78 (98.7) 7 32 (41.0)b 1.69±0.03 0
*: beregnet ved å dele uten. av injisert zygotes; **: beregnet ved å dele uten. av zygotes analysert; : beregnet ved å dele uten. av overførte 2-celle scenen embryo. en, b: hevet indikere betydelig forskjell (P < 0,05). n.d: ikke bestemt. Denne tabellen er endret fra [Ooga et al 2017]7.

Tabell 2: fødselsrate på analysert embryo: Den utviklingsmessige potensialet av embryo, som hadde vært FRAP-analysert, til full sikt ble undersøkt. Innhentet fødselsrate av disse Foster vises. Kontroller, ble intakt og ikke FRAP-analysert embryo også undersøkt. Vekten av pups avledet fra disse overførte Foster vises også.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Som i denne studien, medfører zFRAP analysen ikke kritiske skader hele utvikling, tyder denne metoden er et veldig nyttig verktøy å avsløre tilknytningen mellom molekylære hendelser og den embryonale utviklingsmessige potensialet. Under reprogramming, i to-cellen som delstaten ES celler som differensial potensialet i disse cellene blir så høy som i to celler scenen embryoer, endres chromatin løshet i det sammenlignbare med to-celle scenen embryo5. Følgelig er det mulig at zygotic chromatin løshet er viktig for embryonale utviklingsmessige potensiale. Somatisk cell kjerner overført til cytoplasm i oocytes viste lavere chromatin løshet sammenlignet med ikke bare fars pronuclei, men også mors pronuclei, antyder mangel på oppkjøp åpne chromatin i somatisk cell nuclear transfer zygotes er involvert i deres dårlig utviklingsmessige potensiale. Samlet synes zFRAP analyse å være nyttig for Klargjørende genomet omprogrammering mekanismer.

ZFRAP systemet kan gjøre det mulig å velge zygotes med høy utviklingsmessige potensiale. I den innledende studien, i tillegg til SCNT, ble det avslørt at runde spermatid injeksjon (ROSI)-avledet zygotes havnen unormal chromatin løshet. Dessuten ble det funnet at noen av dem viste chromatin løshet på nivå sammenlignes med IVF-avledet zygotes, noe som tyder på at disse zygotes har høy utviklingsmessige potensiale. Viktigere, kunne zygotes av chromatin som løshet ble evaluert av zFRAP utvikle begrepet. I fremtiden, derfor kan det være mulig å skille SCNT - og ROSI-avledet zygotes med høyere utviklingsmessige potensiale fra lavere seg til evaluering av chromatin løshet ved zFRAP.

Dato har tidligere studier vist nytten av live bildebehandling metode for analyse av epigenetic tilstanden i preimplantation embryoer. Noen av metodene for live bildebehandling kan avsløre hver epigenetic endring (f.eks DNA/histone modifisering) i preimplantation embryo13,14, men bruker zFRAP, er det mulig å vurdere zygotic chromatin looseness uten drepe celler. Chromatin løshet synes å være påvirket av epigenetic endringer. For eksempel viste heterochromatin i som undertrykkende epigenetic endringer som H3K9me3 og H3K27me3 er anriket lavere histone mobilitet enn euchromatic regionen3,15. Faktisk forårsaket behandling med en kjemisk forbindelse, som konverterer epigenetic tilstand, endring av chromatin løshet i zygotes. Derfor, bruker zFRAP, er det mulig å avsløre den summative epigenetic delstaten chromatin struktur. Det ble antatt at dette ville være en fordel for å vurdere den utviklingsmessige potensialet for zygotes.

Injeksjon av mRNA koding eGFP-H2B for zFRAP har en demerit, men øker allsidigheten til zFRAP. Demerit av mRNA injeksjon er skader forårsaket av microinjection. For å unngå dette, er det veldig effektivt å utnytte eGFP-H2B transgene musen. Hvis eGFP-H2B transgene musen linjen brukes, kan avkom hastigheten økes sammenlignet med ved hjelp av mRNA microinjection. Derimot er det fortjeneste av mRNA injeksjon som zFRAP tillater bruk av alle slags stamme av vill-type mus. Forskere som vil bruke zFRAP med sin interesse av musen belastning trenger ikke å forberede ønsket musen belastningen med eGFP-H2B transgene. Dette fortjener blir mer fremtredende i analyse av transgene (f.eks. overuttrykte/knockdown) eller knockout musen linje. Forskere som ønsker å benytte zFRAP for deres forskningstema med transgene/knockout linjen har ikke forberede eGFP-H2B transgene linjen fra et begrenset antall deres interesse seg. Dette indikerer en fordel for utviklingen av forskning.

Live bildebehandling analyse med preimplantation embryo krever spesialisert kunnskap og svært dyrt og finstemt spesialiserte enheter. Derfor er en innføring av et slikt en eksperimentell system ikke en lett avgjørelse. Eksperimentell systemet som er etablert i denne studien trenger bare en thermo-ovn bortsett fra en AC confocal laserskanning mikroskop. I tillegg lære metoden er lett slik at en nybegynner i et laboratorium kan lære metoden zFRAP innen 1 måned. Det er imidlertid noen problemer som fortsatt må vurdering. Først er fokus drift. Under observasjon er det mulig at pronuclei eller zygotes avvike fra plasseringen der de presenterte før observasjon starter. Hvis fokus drift skjer, avvike ROIs også fra riktig sted. Som et resultat, blir kvantitative data verdiløs. For å unngå dette problemet, har forskeren lokket av glass bunn retter for beskyttelse mot vinduet klimaanlegget og vente for olje ekspansjon over linsen. Hvis fokus drift oppstår, data fra de avvikende zygotes bør forkastes og en 2nd FRAP analyse med de samme zygotes anbefales ikke. I denne studien var forkorte observasjon fra 150 s3 til om lag 25 s7 meget hjelpsom. Andre er lengre inkubasjon utenfor inkubator. Siden lenger eksponering for miljøet utenfor inkubator er definitivt skadelig for embryonale utvikling, ble det anbefalt å fullføre FRAP-analysen i 1t per satsvis. Antall i zygotes FRAP-analysert i en HEPES-bufret media glass bunn retter bør være 6-10. I denne eksperimentelle tilstanden, det maksimale antallet er rundt 30 4 h, men hvis det trengs mer zygotes, 20 zygotes per h kan analyseres av utsette vurdering av fluorescerende intensiteten i referanse og bakgrunn. Tredje er "tidsrelaterte forverring av laseren av AC confocal laser mikroskopi". Hvis bleking laser er ikke nok, kan ikke riktig kvantitative data hentes på grunn av utilstrekkelig bleking. Faktisk ikke kan den foreldrene asymmetri av zygotic chromatin løshet nås med en svak bleking laser. For å unngå dette, anbefales det å sjekke om laser makt har svekket som det oppstår. I denne studien var 110-µW bleking nok for oppkjøpet av foreldrenes asymmetri.

zFRAP analyse kan brukes for andre typer proteiner, i tillegg til kjernen histones. Siden kjernen histones viser tydelig lav mobilitet, lenger totalt observasjon (ca 25 s i denne studien) er nødvendig i zFRAP analysen. Derfor for å analysere et betydelig antall zygotes, er dyrking i HEPES-bufret medier på ovnen lenge uunngåelig. På den annen side, for zFRAP analyse av høy mobilitet proteiner, kan den totale observasjon angis kort, slik at tidspunktet for dyrking i HEPES-bufret medier på ovnen å være kort. Derfor, siden lenger eksponering for miljøet utenfor inkubator er svært skadelig for embryonale utvikling, zFRAP analyse for proteiner enn core histones, som har høy mobilitet av natur, synes å vise lavere toksisitet enn core histones . Håpet er at dette eksperimentelle systemet vil hjelpe videre etterforskning av forholdet mellom ulike molekylære hendelser og embryonale utvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Satoshi Kishigami, Sayaka Wakayama, Hiroaki Nagatomo, Satoshi Kamimura og Kana Kishida for å gi kritiske kommentarer og kundestøtte. Dette arbeidet ble delvis finansiert av programmet Kunnskapsdepartementet, kultur, sport, vitenskap og teknologi for å fremme reform av nasjonale universiteter å M.O.; Japan Society for fremme av vitenskap (16H 02593), Asada Science Foundation og Takeda Science grunnlaget for T.W. Fond ikke hadde noen rolle i studien design, innsamling og analyse, beslutningen om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal laser scaning microscope Olympus FV1200 FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7)
Thermo plate Tokai Hit TP-110RH26
Inverted microscope Olympus IX71
Micro manupilator Narishige MMO-202ND
Pieze Micro Micromanipulator Prime tech PMAS-CT150
35 mm culture dish Falcom 351008 35 x 100 mm style; for IVF
60 mm culture dish Falcom 351007 60 x 15 mm style; for embryo culture
50 mm culture dish Falcom 351006 50 x 9 mm style; for manipulation on the stage
50 mm glass bottom dish Matsunami D910400 50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis
Mineral oil Organic spceiality chemicals 625071 For FRAP analysis on the glass bottom dishes
Mineral oil Sigma M8410-1L For IVF and embryo culture
glass capillary Drummond 1-000-1000 For handling mouse zygotes
Borosilicate glass Prime tech B100-75-10-PT For microinjection of mRNA
Micropipett puller Sutter instrument P-97/IVF For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm) 
Microforge  Narishige MF-900
mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit Thermo
Fisher scientific		 AM1340
Poly (A) tailing kit Thermo
Fisher scientific		 AM1350
PVP solution 10% (PVP-HTF) IrvineSceientific 99311 HEPES buffered HTF containing 10% PVP
Sodium HEPES Sigma H3784
pTOPO eGFP-H2B Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6)
NorthernMax Gly Sample loading Dye  Thermo
Fisher scientific		 AM8551 For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA
Phenol chloroform isamyl alcohol nacalai tesque 25970-14
Chloroform nacalai tesque  08401-65
Not I TOYOBO NOT-111X
Ethachinmate WAKO 318-01793
3664 Otical power meter Hioki 3664  Power meter for laser power
Stereomicmicroscope Olympus SZX16

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Burton, A., Torres-Padilla, M. E. Epigenetic reprogramming and development: a unique heterochromatin organization in the preimplantation mouse embryo. Brief Funct Genomics. 9, 444-454 (2010).
  2. Okada, Y., Yamaguchi, K. Epigenetic modifications and reprogramming in paternal pronucleus: sperm, preimplantation embryo, and beyond. Cell Mol Life Sci. 74, 1957-1967 (2017).
  3. Ooga, M., Fulka, H., Hashimoto, S., Suzuki, M. G., Aoki, F. Analysis of chromatin structure in mouse preimplantation embryos by fluorescent recovery after photobleaching. Epigenetics. 11, 85-94 (2016).
  4. Meshorer, E., et al. Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells. Dev Cell. 10, 105-116 (2006).
  5. Boskovic, A., et al. Higher chromatin mobility supports totipotency and precedes pluripotency in vivo. Genes Dev. 28, 1042-1047 (2014).
  6. Yamagata, K., Ueda, J. Long-term live-cell imaging of mammalian preimplantation development and derivation process of pluripotent stem cells from the embryos. Dev Growth Differ. 55, 378-389 (2013).
  7. Ooga, M., Wakayama, T. FRAP analysis of chromatin looseness in mouse zygotes that allows full-term development. PLoS One. 12, e0178255 (2017).
  8. Quinn, P., Begley, A. Effect of human seminal plasma and mouse accessory gland extracts on mouse fertilization in vitro. Australian journal of biological sciences. 37, 147-152 (1984).
  9. Chatot, C. L., Lewis, J. L., Torres, I., Ziomek, C. A. Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium. Biology of reproduction. 42, 432-440 (1990).
  10. Bae, J., Sung, B. H., Cho, I. H., Song, W. K. F-actin-dependent regulation of NESH dynamics in rat hippocampal neurons. PLoS One. 7, e34514 (2012).
  11. Dieteren, C. E., et al. Defective mitochondrial translation differently affects the live cell dynamics of complex I subunits. Biochim Biophys Acta. 1807, 1624-1633 (2011).
  12. Subramanian, V., et al. H2A.Z acidic patch couples chromatin dynamics to regulation of gene expression programs during ESC differentiation. PLoS Genet. 9, e1003725 (2013).
  13. Hayashi-Takanaka, Y., et al. Tracking epigenetic histone modifications in single cells using Fab-based live endogenous modification labeling. Nucleic Acids Res. 39, 6475-6488 (2011).
  14. Yamazaki, T., Yamagata, K., Baba, T. Time-lapse and retrospective analysis of DNA methylation in mouse preimplantation embryos by live cell imaging. Dev Biol. 304, 409-419 (2007).
  15. Puschendorf, M., et al. PRC1 and Suv39h specify parental asymmetry at constitutive heterochromatin in early mouse embryos. Nat Genet. 40, 411-420 (2008).

Tags

Utviklingspsykologi biologi problemet 136 zFRAP analyse zygotic chromatin struktur åpne chromatin chromatin løshet histone mobilitet utviklingsmessige potensiale
Zygotic fluorescens utvinning etter Foto-bleking analyse for Chromatin Looseness som tillater Full sikt utvikling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ooga, M., Funaya, S., Aoki, F.,… More

Ooga, M., Funaya, S., Aoki, F., Wakayama, T. Zygotic Fluorescence Recovery After Photo-bleaching Analysis for Chromatin Looseness That Allows Full-term Development. J. Vis. Exp. (136), e57068, doi:10.3791/57068 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter