Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Zygotisk fluorescens opsving efter foto-blegning analyse for kromatin løshed, der giver mulighed for fuld-sigt udvikling

Published: June 12, 2018 doi: 10.3791/57068
Automatic Translation
1,3, 2, 2, 1,3
1Faculty of Life and Environmental Sciences, Department of Biotechnology, University of Yamanashi, 2Department of Integrated Bioscience, Graduate School of Frontier Sciences, University of Tokyo, 3Advanced Biotechnology Center, University of Yamanashi

Summary

Kromatin løshed synes at være involveret i den udviklingsmæssige potentiale af blastomeres. Det vides dog ikke, om kromatin løshed kan bruges som en pålidelig indeks for den udviklingsmæssige potentiale for embryoner. Her, er blevet beskrevet en eksperimentel system hvor kromatin løshed-evalueret zygotes kan udvikle sig til fuld sigt.

Abstract

Live imaging er et kraftfuldt værktøj, der giver mulighed for analyse af molekylære begivenheder under ontogenesis. For nylig, kromatin løshed eller åbenhed har vist sig at være involveret i cellulære differentiering potentiale af pluripotente stamceller fra embryoner. Det blev tidligere rapporteret, sammenlignet med embryonale stamceller, zygotes havnen en ekstremt løsnede kromatin struktur, tyder på sin forening med deres totipotency. Men indtil nu, det er ikke blevet behandlet om denne yderst løsnes/open kromatin struktur er vigtigt for embryonale udviklingsmæssige potentiale. I den foreliggende undersøgelse, for at undersøge denne hypotese, blev en eksperimentel system i hvilke zygotes, der blev analyseret af fluorescens opsving efter foto-blegning kan udvikle sigt uden nogen betydelige skader udviklet. Vigtigst, systembehov denne eksperimentelle kun Termokande-plade varmelegeme ud over en Konfokal laser scanning mikroskop. Resultaterne af denne undersøgelse tyder at fluorescens opsving efter foto-blegning analyse (FRAP) analyse kan bruges til at undersøge, om de molekylære begivenheder i zygotisk kromatin vigtigt for fuldbårne udvikling.

Introduction

Efter befrugtningen, kromatin struktur ændres dynamisk og zygotisk kromatin struktur er derefter i sidste ende etableret1,2. I denne periode, faderlige pronuclei, er dominerende kromatin protein ændret fra protamine til Histon. Den resulterende kromatin er meget forskellig fra sperms og kvindelige oocyter i flere punkter (fx, Histon variant sammensætning, Histon ændring). Således menes dannet zygotisk kromatin at være vigtig for efterfølgende embryonale udvikling. Trods bestræbelser på at afsløre detaljer om zygotisk kromatin struktur over lange perioder, har metoder til at vurdere kvaliteten af zygotes eller at forudsige deres fuldbårne udvikling på én-celle stadium ved at analysere deres kromatin struktur dog aldrig været etableret.

I den tidligere undersøgelse, er det opdaget, at zygotes har en ekstremt løsnede kromatin struktur3. I øjeblikket, menes kromatin løshed eller åbenhed at være en vigtig faktor for Celledifferentiering potentielle i embryonale stamceller (ES) celler4. ES-celler udstille ikke homogenitet i naturen, men er temmelig heterogene; i ES celle kolonier erhverve nogle forbigående en højere differentiering potentiale svarende til blastomeres to-celle stadium embryoner. Under denne overgang ind i to-cellen som stat celler kromatin løshed i ES ændringer i hvad er sammenlignelige med to-celle stadium embryoner5. Kromatin løshed synes således at være vigtig for cellulære differentiering potentiale og det er muligt, at omfattende åbne kromatin i zygotes er nyttige til vurdering af zygotisk udviklingsmæssige potentiale.

Live imaging er et kraftfuldt værktøj, der giver mulighed for analyse af molekylære begivenheder under ontogenesis, da denne metode giver mulighed for efterfølgende udvikling og endda fuldbårne udvikling6. Som en af de live imaging metoder, er FRAP analyse blevet brugt til at undersøge kromatin løshed i præimplantations embryoner og ES celler3,4,5. Hvis zygotisk kromatin løshed kan analyseres uden en skadelig virkning på fuldbårne udvikling af FRAP analyse, kan det være et værdifuldt redskab til evaluering af kvaliteten af embryoner på én-celle stadium. Effekter på fuld-sigt udvikling af denne eksperimentelle metode er dog ikke undersøgt. For nylig, en eksperimenterende system ved hjælp af FRAP for at evaluere zygotisk kromatin løshed blev udviklet. Fordi dette var en ny observationssystem til zygotes, var det kaldes zygotisk FRAP (zFRAP). zFRAP påvirkede ikke kritisk fuldbårne udvikling og har været rapporteret et andet sted7. I denne betænkning, er protokollen af denne eksperimentelle metode beskrevet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalinger i vejledningen for pleje og brugen af forsøgsdyr i Yamanashi Universitet. Protokollen blev godkendt af Udvalget om etik af dyr eksperimenter på Universitet Yamanashi (tillade nummer: A24-50). Alle operationer blev udført under tribromoethanol anæstesi, og alle bestræbelser blev gjort til at minimere lidelse. En illustreret oversigt over de procedurer og tidsplan er vist i figur 1 og tabel 1, henholdsvis.

1. forberedelse af Messenger RNA (In Vitro transskription af eGFP-H2B mRNA)

  1. Linearize 5 µg af skabelon DNA pTOPO-eGFP-H2B3,7 med 30 U i ikke jeg i 50 µL ved 37 ° C natten over.
  2. Indsamle 1,5 µL af fordøjet DNA for bekræftelse om helt fordøjet af elektroforese.
    1. Anvende 1,5 µL og 3-5 µL af ufordøjet DNA lastning farvestof til godt af 2% agarosegel, henholdsvis, og elektroforese.
      Bemærk: Hvis helt fordøjet, observeret en enkelt band (ca. 5 kb). Ufordøjet DNA bruges som et kontrolelement, der vises på en anden placering.
  3. Tilføj 151.5 µL af Hedeselskabet2O og 200 µL chloroform-phenol-isoamyl alkohol (25:24:1) til de resterende fordøjet DNA.
    1. Bland kraftigt af vortex.
    2. Der centrifugeres ved den maksimale hastighed for 15 min.
  4. Genskab supernatanten og derefter tilføje 200 µL chloroform.
    1. Bland kraftigt af vortex.
    2. Der centrifugeres ved maksimal hastighed for 15 min.
  5. Genskab supernatanten og derefter tilføje 20 µL 3M natriumacetat og 1,5 µL af ethachinmate.
    1. Bland kraftigt af vortex.
    2. Tilføje 550 µL af 100% ethanol og derefter blande kraftigt af vortex.
    3. Der centrifugeres ved maksimal hastighed for 15 min.
    4. Supernatanten fjernes og derefter vaske pellet med 70% ethanol.
    5. Tørre pellet ved fordampning for 5-10 min.
  6. Opløse udfældet plasmid DNA i 8 µL nukleasen-gratis vand.
  7. Vurdere plasmid koncentration (forventede koncentration er omkring 300-500 ng/µL) med nanodrop ved at følge fabrikantens anvisninger.
  8. Udføre i vitro transskription for mRNA kodning eGFP-H2B med 1 µg oprenset DNA som en skabelon i 20 µL af samlede reaktion volumen ved at følge producentens anvisninger.
    1. Efter in vitro- transskription, tilføje 36 μl vand og derefter gendanne 1,5 µL fra 56 µL af syntetiserede mRNA for analyse af elektroforese (uden poly A).
  9. Udføre poly A hale for syntetiserede mRNA i en 100 µL reaktion volumen ved at følge producentens anvisninger.
  10. Tilsættes 60 µL lithium chloridopløsning nedbør til poly en tailed mRNA af eGFP-H2B og derefter blande kraftigt.
    1. Cool på mellem-30 ° C i 30 min.
    2. Der centrifugeres ved maksimal hastighed for 15 min.
    3. Supernatanten fjernes og derefter vaske pellet med 70% ethanol.
    4. Tørre pellet ved fordampning for 5-10 min.
  11. Opløse pellet med 20 µL nukleasen-gratis vand ved opvarmning på 55 ° C i 30 min.
  12. Vurdere koncentrationen af det udfældede mRNA med nanodrop. Fortyndes til 500 ng/µL med nukleasen-gratis vand og opbevares ved-80 ° C indtil brug.
  13. Bekræfte foretrukne mRNA produktion; emne 1 µL af mRNA med/uden (fremstillet i 1.8.1 og 1.12 trin, henholdsvis) poly en hale blandet med 1,5 µL af 0,1 mg/mL ethidiumbromid og 3 µL af prøven lastning farvestof til elektroforese analyse. Anvendt mængde var 5,5 µL.
    Bemærk: Hvis Poly A hale var vellykket, skiftede bandet i forhold til mRNA uden poly en hale bør observeres (figur 2A).

2. forberedelse af Vasectomized mandlige mus

  1. Veje ICR mandlige mus på 8-12 måneder ved hjælp af en vægt skala.
  2. Intraperitoneal injicere mandlige mus med 0,7 - 0,9 mL 1,2% tribromoethanol anæstesi.
    Bemærk: Mængden af anæstesi afhænger af størrelsen af musen. For eksempel sprøjtes en mus vejer 40 g med 0,8 mL af tribromoethanol anæstesi.
  3. Våd bær med 70% ethanol.
  4. Lave en lille klippe (3-5 mm) på bær og derefter gøre et snit på musklen væggen ved hjælp af saks.
    Bemærk: Saks og pincet bør være rengjort med 70% ethanol før du starter operationen.
  5. Greb et fedt pad med pincet og træk det forsigtigt. Derefter, testiklerne og sædlederen vises.
    Bemærk: Sædlederen er et U-formet rør og med en rød blodkar.
  6. Tie off sædlederen på to punkter med kirurgiske suturer og derefter skære den midterste del mellem de bundne punkter.
  7. Forsigtigt skubbe tilbage fedt pad og testiklerne til bær.
    1. Gentag operationen med de resterende testis.
  8. Sy musklen væggen med to sting med kirurgisk sutur.

3. IVF

  1. Injicere 8 - 10 - uge forhenværende kvindelig B6D2F1 (BDF1) mus intraperitoneal med 7,5 IU equine chorion gonadotropin (EKG) og humant choriongonadotropin (hCG) på 46-50 h interval.
  2. Forberede dråber af 300 µL humant tubal væske (HTF)8 medier for retsevne og insemination 1 dag før IVF i en 30-mm parabol, dække disse dråber med mineralsk olie på laboratoriebænk og derefter preincubate i en inkubator natten.
  3. Ofre modnet mandlige ICR mus af cervikal dislokation. Dissekere cauda epididymis med en 27-G kanyle og indsamle sædcelle. Kultur dem for retsevne i 300 µL af HTF medier i 1-2 timer ved 38 ° C.
  4. 16 h efter hCG injektion, ofrer super ægløsning hunmus af cervikal dislokation. Overføre oviduct ampulla til mineralsk olie ved siden af HTF medier og derefter trække ud cumulus celler og oocyter komplekse fra denne oviduct ampulla af en 30-G kanyle ind forud inkuberet insemination-HTF medium.
    Bemærk: Nogle hunmus viser ofte ikke ægløsning på trods af super ægløsning behandling. Udvidede oviduct ampulla er et tegn på ægløsning.
  5. Efter retsevne, overføre 2-3 µL af den capacitated sædcelle til insemination-HTF medier, hvor de ovulated oocyter blev indsamlet.
  6. 1 h efter insemination, indsamle de befrugtede zygotes og behandle dem med hyaluronidase på 100 µg/mL for 10 min i CZB9 medier.
    Bemærk: Når insemination er udført korrekt, 1 h efter insemination, de befrugtede zygotes med 2nd polar krop er observeret. Sædcellerne anvendes, mindre eller lav kvalitet, er kun lidt zygotes med 2nd polar krop observeret. Også, hvis mange sperms anvendes til insemination, polyspermy opstår. Ordentlig befrugtning fører til zygotes med mandlige og kvindelige pronuclei. Ved hjælp af disse kriterier, er det muligt at finde om insemination er gjort godt eller ej.
    1. Efter vask i CZB medier, er underlagt zygotes med en anden polar krop mikroinjektion med eGFP-H2B mRNA.

4. forberedelse af kammeret og mikroinjektion pipetter

  1. Fortynd RNA kodning eGFP-H2B bruger nukleasen-gratis vand til at opnå en koncentration af 250 ng/µL.
  2. Forberede 2-3 dråber af PVP-HTF eGFP-H2B dråber mRNA, og 5-6 dråber af Hepes buffer CZB (H-CZB) dråber på 60 mm parabol. Dække disse dråber med mineralsk olie.
    Bemærk: Disse præparater kan udføres på laboratoriebænk. Der er ingen krav til brug af laminar airflow kabinet.
  3. Trække borsilikatglas med en mikropipette puller (fx, P = 500, varme = 825, pull = 30, vel = 120, og tid = 200)
  4. Efter udslåning bøje spidsen af pipetten, trak glas mikroinjektion pipette tæt på spidsen (−300 µm tilbage) på omkring 30 ° ved hjælp af en microforge.

5. mikroinjektion

  1. Slukke plade varmelegeme på scenen i micromanipulator at forhindre drab på zygotes med et piezo under mRNA injektion.
  2. Vask og coat indersiden af injektion nåle i HEPES-buffered-HTF indeholdende 10% PVP (PVP-HTF).
  3. Indsamle de befrugtede zygotes med en 2nd polar kroppen (figur 2B) og overføre 20-25 zygotes på afdeling af mikroskop fase fastgjort med en micromanipulator.
  4. Fylde den fortyndede eGFP-H2B mRNA i borsilikatglas kapillærer fra spidsen.
  5. Hold zygote med en bedrift pipette og derefter bryde zona pellucida og cytosole membranen med et piezo-drevet.
  6. Injicere omkring 10 pL af mRNA i cytoplasma af zygotes. Afslutte mRNA-injektion inden for 10 min til at forebygge skader forårsaget af længere dyrkning zygotes udenfor rugemaskine.
    Bemærk: Injektionsvolumen bør være så stor som 2nd polar krop. Hvis mængden af mRNA injiceres er for stor, er det muligt at få gratis eGFP-H2B brøkdel, som kan påvirke de mobile brøkdel.
  7. 10 min efter mikroinjektion, vaske i mindst 3 dråber og derefter kultur de injicerede zygotes i CZB ved 38 ° C indtil zFRAP analyse.

6. zFRAP analyse

  1. 1 h før zFRAP analyse, aktivere laser og varmeplade knyttet til fase af en Konfokal mikroskop. Indstil temperaturen ved 38 ° C.
  2. Sætte 6-10 µL af HEPES-buffered CZB medier dækket med mineralsk olie på 60 mm glas bund fad og varm på ovnen indtil zygote samling.
  3. 8 - 12 timer efter insemination, indsamle, 5-10 eGFP-H2B-udtrykker zygotes og overførsel i 6-10 µL af pre varmede HEPES-buffered CZB medium drop.
    Bemærk: For at undgå længere dyrkning uden for inkubator, 5-10 eGFP-H2B-udtrykker zygotes blev brugt på hver analyse. 5-10 zygotes kan analyseres inden for 1 h.
  4. Betingelserne blegning og billedbehandling ifølge producentens anvisninger. Sagen en Konfokal laser scanning mikroskop (Tabel af materialer) er vist nedenfor:
    1. Brug 60 X olie linse (60 X 60 X / 1,35 olie).
      Bemærk: Objektiver med højere forstørrelse (højere numerisk blænde) Vis højere følsomhed.
    2. Indstille scanning hastighed som 4.0 µs/Pixel og størrelse som "512" på "Erhvervelse Setting" (supplerende figur 1).
    3. Øge Digital zoom til "5" (supplerende figur 1).
      Bemærk: En højere zoom er forpligtet til at anerkende, hvad enten fokus drift sker eller ej.
    4. Åbn farvestof liste (supplerende figur 1) og derefter vælge "EGFP". Indstille observationstidspunkt som 1,6 s (interval er angivet som "fri sigt" indstilling) (supplerende figur 1)
      Bemærk: Flere observationspunkter kan forårsage mere detaljerede data, men det kan også forårsage fototoksicitet. I zFRAP analysen synes en 1,6 s observation tiden at være nok til at opdage den parental asymmetri af kromatin løshed.
    5. Angiv antallet billeder som 12 i alt (supplerende figur 1).
    6. Start "Stimulus indstilling" panel, og klik derefter på "Main" på UseScanner. Sæt scanning hastighed som 10,0 µs/Pixel. Klik på "Aktivering i serien" og derefter indstille PreActivation som "3 rammer" og aktivering tid som "5 sec" (supplerende figur 1).
    7. Klik på "Focus x 2" og indstille fokus og derefter "Stop".
    8. Blegning og imaging laser power (477 nm) på 110 og 15 µW, henholdsvis ved justering "laser gage magt" (supplerende figur 1).
      Bemærk: Meget stærk blegning kan forårsage en større blegede område, hvilket forårsager vanskeligheder for den kvantitative analyse. Til måling af laser power, bruge en energimåler. Det er vigtigt at bekræfte laser power at undgå effekten af tidsrelaterede forringelse af laser power.
    9. Klik på "Klip Rect" (supplerende figur 1) Stimulus indstilling panelet. Sat region af interesse (ROI, rød; ROI #1B) som 40 x 40 pixels (7,6 µm2). Forberede en reference region (REF; grøn; ROI #2), og en baggrund (BG; blå; ROI #3) ved hjælp af "kopiere ROI" og "Indsæt ROI" (Højreklik på knappen på musen).
      Bemærk: Pixelstørrelse kan indstilles via "ROI manager", som kan kaldes ved at klikke på den højre knap på musen, når markøren på Investeringsafkastet. Større ROIs menes at være bedre, da de kan standardisere spredningen af zFRAP score. Dog for stor af en ROI kan ikke bruges til denne analyse fordi det gør det vanskeligt at undgå nucleolus forløber krop (NPB). eGFP-H2B i dette rum var anset for at være fri for kromatin og viste bemærkelsesværdige højere mobilitet3. ROI og REF områder bør være adskilt så meget som muligt. Hvis disse to områder er tæt, kan blegning også påvirke REF-regionen.
    10. Klik på "Live" på værktøjslinjen og derefter starte "Live Plot" (supplerende figur 1).
      Bemærk: Live plot viser fluorescens signal intensitet inden for hver ROI og bruges til at justere laser power ved hjælp af HV. Bemærk at hvis ROI ikke er markeret, ingen intensitet ville påvises levende plot panel.
    11. Positioneringen ROI
      Bemærk: ROI kan flyttes ved at trække til den ønskede position i pronuclei. (1) være sikker på at undgå nucleolus, og (2) passer hele ROI ind i nukleoplasmaet. Ikke indeholde region uden for området i Kernemembranen (cytoplasma) i ROI. Lokalisering af eGFP-H2B er meget begrænset i nukleoplasmaet så at det er nemt at finde om ROI indeholder cytoplasma eller ikke af fluorescens af eGFP-H2B. Mandlige pronuclei tendens til at være større end hunnerne, som ofte er lokaliseret nær 2nd polar krop. Mens du bruger disse kriterier, bedømme de mandlige eller kvindelige pronuclei.
    12. Klik på "Focus x 2" (supplerende figur 1) og derefter justere HV magt gage af kanalen for EGFP til fluorescens intensitet til ca. 2000 (Fluorescens intensitet kan ses i vinduet "live plot").
  5. Klik på "Tid" og derefter "XY" (supplerende figur 1) for at starte zFRAP analyse.
    Bemærk: Hvis "Tid" knappen vælges passende, "t" vises på knappen "XY".
    1. Klik på "Serien gjort" (supplerende figur 1), som vises efter FRAP imaging nær knappen"XY" og derefter få FRAP-analyseret data.
    2. Gem filen "2D View-billedet XXXXX" som en foretrukne navngivet fil (oib. filformat) af "Gem som" (Ctrl + Shift + S kan også bruges).
    3. Vælg ROI, REF og BG og klik derefter (Ctrl + A kan også bruges) "Serie analyse" i "2D se billede" vindue.
    4. Få række FRAP data og derefter klikke på "Gem" knappen i vinduet live plot.
      Bemærk: Række FRAP kvantitative data er gemt som en CSV-fil.
  6. For ingen zFRAP kontrol, sætte nogle af de zygotes sprøjtet med mRNA på falde, hvilket er tæt på kanten af bunden glasfade at undgå virkning fra fluorescens observation.

7. data beregning

  1. Mens du bruger gøre de opnåede kvantitative data, grafen for "recovery kurven" og "mobile brøkdel" af Excel som vist i referencer3,7 med nogle ændringer (jf. nedenfor og supplerende excel-fil).
  2. Beregne den relative intensitet ved at trække værdien af BG fra dem af ROI og REF i 12 billeder til hvert tidspunkt.
  3. Dividere værdien af ROI med der af REF. Som følge heraf kan 12 standardiseret relativ intensitet scores på hvert tidspunkt opnås.
  4. Beregne gennemsnittet af den relative score for ROI i 3 billeder taget før foto blegning.
  5. Beregne genfindingsprocenten. Kløft 12 opnået relative scores for ROI i billeder taget ved hvert tidspunkt (opnået på 7.1.2.) af gennemsnittet af de relative score før foto blegning (opnået på 7.1.3.). Tegne opsving kurve med hjælp af disse noder (figur 2E).
  6. Beregne de blegning.
    Bemærk: Blegning sats (%) = 100 - genfindingsprocenten for 4th billede.
  7. Beregne den mobile fraktion (MF) ved hjælp af formlen som følger10,11,12
    MF (%) = 12th genfindingsprocenten (ved slutpunktet) - 4th genfindingsprocenten / blegning sats × 100.

8. embryo Transfer

  1. Mate modnet ICR hunner på 8-12 måneder med vasectomized mandlige ICR mus natten før ægoplægning ved at lade dem blive i samme bur natten over.
  2. Indsamle de embryoner, der var zFRAP-analyseret og fast besluttet på at udvikle til de to-celle stadium.
  3. Intraperitoneal injicere hunmus med 0,7 - 0,9 mL 1,2% tribromoethanol anæstesi eller med 0,35 - 0,45 mL af 0.75/4/5mg/kg medetomidine/midazolam/butorphanol blandet agenter før ægoplægning.
    Bemærk: Mængden af anæstesi bestemmes af kropsvægt af mus. Tribromoethanol: 0,2 mL/10 g kropsvægt; medetomidine/midazolam/butorphanol blandet agenter: 0,1 mL/10 g kropsvægt.
    1. Overføre disse to-celle stadium embryoner til æggelederne af pseudopregnant kvindelige ICR mus med en vaginal plug på 0,5 dage post coitum (dpc).
    2. Efter ægoplægningen, sætte de kvindelige mus på ovnen indstillet på 37 ° C, indtil de vågner op.
  4. På 18,5 dpc, ofre rugemor ved cervikal dislokation og genoprette de pups, afledt af zFRAP-analyseret zygotes ved kejsersnit. Nogle af de gendannede unger blev leveret til den plejemor og deres krop vægte blev vurderet hver uge.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

zFRAP analyse med eGFP-H2B

Ordentligt produceret blev mRNA kodning eGFP-H2B, som ses som en skiftede bandet forårsaget af poly en hale (figur 2A), sprøjtet ind i cytoplasma af zygotes med en 2. polar kroppen på 1-3 h efter insemination (figur 2B). Otte til 12 h efter insemination, zygotes med 2 pronuclei viser udtryk for eGFP-H2B blev indsamlet og zFRAP analyseret (figur 2 c). FRAP analyse består af blegning og recovery trin. Signalet fra eGFP-H2B kunne observeres (figur 2D-1) på fasen før blegning, men når bleget, signalet faldt til et ubetydeligt niveau (figur 2D-2). Hvis blegning var vellykket, syntes et mørkt hul så stort som ROI snart efter blegning. Efter blegning, intensiteten af eGFP-H2B fluorescens signal genvundet lidt; Den fluorescerende signal gradvist øget på grund af tilstrømningen af ubleget brøkdel af eGFP-H2B i ROI fra ublegede området i nukleoplasmaet (figur 2D-3). Bekræftelse af zFRAP analyse af kromatin løshed succes anbefales det at bruge forældrenes asymmetri af kromatin løshed; mandlige pronuclei viste en hurtigere genopretning kurve og mere mobile fraktioner end dem af hunner (figur 2E og F). Efter zFRAP analyse, vasket og kulturperler zygotes i CZB medier, kunne udvikle sig til blastocyststadiet uden betydelig skade (figur 2 g og H). Selvom kraftigt bleget i længere tid, kunne zygotes stadig udvikle sig til blastocyststadiet samt7.

Analyse af fuldbårne udviklingen af zFRAP-analyseret zygotes

For at analysere fuldbårne udviklingen af embryoner stammer fra zFRAP-analyseret zygotes, blev embryoner på de to-celle stadium overført til æggelederne på pseudopregnant mødre. Som kontrol, blev intakt embryoner, og en sprøjtet med mRNA, men ikke zFRAP-analyseret udarbejdet. Fødselstallet i zFRAP-analyseret embryoner (41,0%) var lidt men betydeligt lavere end for intakt embryoner (62,2%), men var de samme som for kontrolelementet ingen zFRAP (52,6%) (Tabel 2). ZFRAP-analyse synes således at være lidt skade fuldbårne embryonale udvikling. Men vigtigere, hvalpene stammer fra zFRAP-analyseret zygotes virkede sundt og fuldt udviklet (figur 3).

Figure 1
Figur 1: En skematisk illustration af strømmen af procedurer for forsøgene. In vitro- befrugtning: frisk indsamlede metafase II (MII) oocyter blev insemineret med sæd fra capacitated. In vitro transskription: Messenger RNA (mRNA) kodning eGFP-smeltet Histon H2B (eGFP-H2B) blev transskriberet fra SP6 promotor af lineariseret pTOPO-eGFP-H2B3 med ikke jeg. EGFP-H2B mRNA udsættes poly A hale og derefter rensning. Renset eGFP-H2B mRNA bruges i mRNA injektion. mRNA injektion: forberedt eGFP-H2B mRNA indsprøjtes i cytoplasma af zygotes med 2nd polar krop. zFRAP analyse: de eGFP-H2B-udtrykker zygotes blev udsat for zFRAP analyse. Regionen af interesse (ROI, røde rektangel) blev bleget med en kraftig laser og derefter eGFP-H2B signal faldt til et ubetydeligt niveau. Efter blegning, intensiteten af eGFP-H2B signal gradvist øges. In vitro udvikling: Efter zFRAP analyse, kunne at zygotes udvikle sig til blastocyststadiet. Ægoplægning: på to-celle stadium, de zFRAP-analyseret embryoner blev overført til æggelederne på pseudopregnant hunmus. 18 dage senere, sunde levende unger kunne indhentes fra zFRAP-analyseret embryoner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: zFRAP analyse af zygotes med eGFP-H2B. (A) repræsentativt billede af ordentligt forberedt mRNA af in vitro- transskription og poly A hale. Lane 1: før poly en hale; Lane 2: post poly A hale. (B) mRNA kodning eGFP-H2B blev sprøjtet ind i cytoplasma af zygotes med en 2nd polar krop 1-3 h post insemination (hpi). Skalalinjen = 25 µm (C) eGFP-H2B-udtrykker zygotes blev indsamlet på 8-12 hpi. Hvide stjerner Vis nucleolus forløber organer (NPB). Skalalinjen = 10 µm (D) eGFP-H2B udtryk blev opdaget i den hele nukleoplasmaet selv i NPB på forhånd blegning fase (D-1), snart efter blegning (D-2), og recovery (D-3). Nukleare membraner (hvide stiplede linjer) og NPB (stjerner) er angivet. Skalalinjen = 10 µm. (E, F) opsving kurve og mobile fraktioner blev indhentet fra 45 zygotes i 5 uafhængige forsøg. Blå og røde angiver henholdsvis mandlige og kvindelige. I opsving kurver angive enkelt cirkler det målepunkt. I scatter parceller angiver enkelt prikker score på mobile fraktioner fra pronuclei. (G) repræsentative billeder af præimplantations udviklingen af zFRAP-analyseret zygotes er vist. To-celle, 4-8 celle og blastocyst stage embryoner på 24, 48 og 96 hpi, henholdsvis. Den gule cirkel angiver veludviklet blastocyst. Denne blastocyst er forstørret og vist på højre panel. Skalalinjen = 100 µm. (H) Bar graf af udviklingsmæssige satserne for zFRAP-analyseret embryoner. Barer angive zFRAP-analyseret (zFRAP) embryoner (hvid) og styre embryoner (sort) injiceres med mRNA, men ingen zFRAP analyse (ingen zFRAP). Vises data er fra tre uafhængige eksperimenter, undersøge mindst 57 embryoner i alt. To-celle, 4-8 celle, morula (Mo) og blastocyst (Bl) faser blev observeret på 24, 48, 72 og 96 hpi, henholdsvis. Dette tal er blevet ændret fra [Ooga mfl 2017]7. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: sund vækst af unger stammer fra de FRAP-analyseret zygotes. (A) billeder af hvalpe stammer fra zFRAP-analyseret zygotes er vist. (B) Normal vækst blev observeret i løbet af sygepleje i de zFRAP-analyseret pups. (C) grafen angiver vægten af unger afledt af intakt embryoner (blå), ubleget kontrol embryoner (rød), og zFRAP-analyseret embryoner (grøn). Body vægte af 29 unger fra intakt embryoner, 24 fra no-zFRAP embryoner og 15 fra zFRAP-analyseret embryoner over en 8-ugers periode. Værdier angivet af stjerner er væsentligt forskellige fra kontrolelementet intakt. Dette tal er blevet ændret fra [Ooga mfl 2017]7. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1: grafisk brugergrænseflade til FRAP analyse. (A) et overblik over den grafiske brugergrænseflade blev vist. (B) udvidede billeder for hvert vindue blev vist. (1) the erhvervelse indstilling vindue bruges til indstilling af billede erhvervelse tilstand. (2) the Stimulus indstilling vindue bruges til blegning indstillingstilstanden. Vinduet kan åbnes ved at klikke på knappen billede erhvervelse vinduet. (3) the Image erhvervelse kontrolvinduet bruges til FRAP analyse. (4) the Live View viser det nuværende image (det nuværende billede vises efter at klikke fokus x2 eller XY). De røde, grønne og lyse blå rektangler vise ROI (region af interesse), REF (reference) og BG (baggrund), henholdsvis. (5) 2D-visning viser FRAP-analyseret billedet og vises, når du klikker på "Serien gjort" knappen. I dette tilfælde er en FRAP-analyseret mandlige pronucleus vist som eksempel. Tre rektangler med 8 prikker angiver, at disse regioner er markeret. (6) the Live Plot viser den nuværende fluorescens intensitet i hver region. X og Y-akser angiver tid (ms) og fluorescens intensitet, henholdsvis. (7) den serie analyse viser spor af fluorescens intensitet på hver region og vises efter serie analyse knappen på vinduet 2D. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende Excel fil 1: eksempeldata og data beregning. (Sheet 1) Et eksempeldata for en mandlig pronucleus er vist. Lol Angiver det fortløbende nummer af billedet. Række intensiteter for hver region (ROI, Ref og BG) blev angivet. (Ark 2) Er vist et eksempel til beregning af data. Protokolnummer angiver de tilsvarende steder i afsnittet protokol. Noter forklare betydningen af hver enkelt score. Den numeriske formel kan betegnes ved at klikke på cellerne. Eksempler på recovery kurve og mobile brøkdel søjlediagrammet er vist. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Dag -3 Dag -2 Dag -1 Dag af FRAP Dag + 1 Dag + 3 Dag + 19
mRNA forberedelse Skære skabelon plasmid
(over natten)		 1). rensning skabelon plasmid
2). In vitro transskription
3). In vitro poly en hale
4). mRNA kvalitetstjek af elektroforese
FRAP 1). forberedelse af manipulation pipette og kammer
2). mRNA injektion
3). zFRAP analyse
4). beregning af recovery kurve og mobile brøkdel* 2
IVF og analyse af præ-implantation udvikling EKG injektion 1). hCG injektion 1). sperm retsevne
2). præ-inkubation af medier (HTF) 2). In vitro-befrugtning
Forberedelse af medierne (HTF, CZB, H-CZB og PVP-CZB) 3). evaluering præimplantations udvikling
Ægoplægning Forberedelse af pseudopregnant kvinde
(parring med vasectomized mandlige* 1)		 Overførsel af 2-celle stadium embryoner til pseudopregnant kvinde Evaluering af fødselstallet
* 1: vasectomized mandlige musen skal forberedes mindst 2 uger før parring
* 2: beregning kan forlænges til næste dag (dag 1)

Tabel 1: tidsplan for eksperimenterne. Dag i FRAP analyse anses dag 0. de eksperimenter, der skal udføres, angives på de respektive dage for hver vare.

Kategorier Lol af injicerede zygotes Lol af gendannede zygotes efter mRNA injektion (%) * Lol af zygotes analyseres Lol af overført Lol af modtagere Lol klapmydsunger (%) *** Vægten af unger (g) Lol af transgene unger
2-celle stadium embryoner (%) **
Intakt - - 99 98 (99,0) 9 61 (62,2)en 1.64±0.02 Birk Nielsen
Ingen FRAP 420 398 (94.8) 82 78 (95.1) 7 41 (52,6)a,b 1.66±0.03 Birk Nielsen
FRAP 79 78 (98,7) 7 32 (41,0)b 1.69±0.03 0
*: beregnes ved at dividere med nr. af injicerede zygotes; **: beregnes ved at dividere med nr. af zygotes analyseres; : beregnes ved at dividere med nr. overførte 2-celle stadium embryoner. en, b: hævet indikerer signifikant forskel (P < 0,05). Nielsen: ikke fastlagt. Denne tabel er ændret fra [Ooga mfl 2017]7.

Tabel 2: fødselstallet analyseret embryoner: Udviklingsmæssige potentiale for embryoner, som havde været FRAP-analyseret, fuldbårne blev undersøgt. Opnåede fødselstallet disse embryoner er vist. Som kontrol, intakt og ingen FRAP-analyseret embryoner blev også undersøgt. Vægte af hvalpe fra disse overførte embryoner er vist så godt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Som åbenbaret i denne undersøgelse, forårsage zFRAP analyse ikke kritisk skade fuldbårne udvikling, tyder på, denne metode er et meget nyttigt redskab til at afsløre sammenhængen mellem molekylære begivenheder og embryonale udviklingsmæssige potentiale. Under omprogrammering, ind i to-cellen som stat af ES-celler, hvorved differential potentialet i disse celler bliver så stor som to-celle stadium embryoner, ændringer kromatin løshed ind, at sammenlignelige med to-celle stadium embryoner5. Det er derfor muligt at zygotisk kromatin løshed er vigtigt for embryonale udviklingsmæssige potentiale. Somatiske cellekerner overføres til cytoplasma af oocytter viste lavere kromatin løshed sammenlignet med ikke kun faderlige pronuclei, men også mødre pronuclei, tyder på manglende erhvervelse åben kromatin i somatiske cell nuclear transfer zygotes er involveret i deres fattige udviklingsmæssige potentiale. Kollektivt, synes zFRAP analyse at være nyttig for belyse genom omprogrammering mekanismer.

ZFRAP systemet kan gøre det muligt at vælge zygotes med høj udviklingsmæssige potentiale. I forundersøgelsen, ud over SCNT, blev det afsløret, at runde spermatid injektion (ROSI)-afledt zygotes harbor unormal kromatin løshed. Desuden konstateredes det, at nogle af dem viste kromatin løshed på niveau svarende til IVF-afledte zygotes samt, tyder på, at disse zygotes har høj udviklingsmæssige potentiale. Vigtigere, kunne zygotes af hvilke kromatin løshed blev evalueret af zFRAP udvikle sigt. I fremtiden kan det derfor være muligt at skelne de SCNT - og ROSI-afledte zygotes med højere udviklingsmæssige potentiale fra lavere dem ved evalueringen af kromatin løshed af zFRAP.

Til dato, har tidligere undersøgelser vist nytten af live billedbehandling metode til analyse af epigenetiske stat i præimplantations embryoner. Nogle af de live imaging metoder kan afsløre hver epigenetiske ændringer (f.eks. DNA/Histon ændring) præimplantations embryoner13,14, men bruger zFRAP, er det muligt at evaluere zygotisk kromatin løshed uden dræbe cellerne. Kromatin løshed synes at være påvirket af epigenetiske modifikationer. For eksempel, heterochromatin hvor undertrykkende epigenetiske ændringer såsom H3K9me3 og H3K27me3 er beriget viste lavere Histon mobilitet end euchromatic region3,15. Ja, behandling med en kemisk forbindelse, som konverterer epigenetiske tilstand, forårsaget ændring af kromatin løshed i zygotes. Derfor er bruger zFRAP, det muligt at afsløre den summative epigenetiske tilstand af kromatin struktur. Man mente, at dette ville være en fordel for at vurdere zygotes udviklingsmæssige potentiale.

Injektion af mRNA kodning eGFP-H2B for zFRAP har en demerit men øger alsidigheden af zFRAP. Demerit af indsprøjtning af mRNA er skader ved mikroinjektion. For at undgå dette, er det meget effektivt at udnytte eGFP-H2B Transgene mus. Hvis eGFP-H2B Transgene mus linje bruges, kan afkom øges i forhold til sagen om ved hjælp af mRNA mikroinjektion. Omvendt, det er fortjeneste af mRNA injektion, zFRAP tillader brug af nogen form for stamme af wild-type mus. De forskere, der ønsker at bruge zFRAP med deres interesse for musen stamme skal ikke forberede den ønskede mus stamme med eGFP-H2B transgenet. Denne fordel bliver mere fremtrædende i analysen af transgene (fx. overekspression/knockdown) eller knockout mus linje. De forskere, der ønsker at udnytte zFRAP for deres forskningsemner med linjen transgene/knockout skal ikke forberede eGFP-H2B transgene linje fra et begrænset antal deres interesse ones. Dette indikerer en fordel for progression af forskning.

Live imaging analyse med præimplantations embryoner kræver specialiseret viden og meget dyrt og fint afstemt specialiserede enheder. Derfor, en introduktion af sådan en eksperimentel system er ikke en nem beslutning. Den eksperimentelle system, der er etableret i denne undersøgelse skal kun en thermo-varmelegeme bortset fra en Konfokal laser scanning mikroskop. Derudover læring metoden er let, således at en nybegynder i et laboratorium kan lære metoden for zFRAP inden for 1 måned. Men der er nogle spørgsmål, som stadig har brug for behandling. Først er fokus drift. Under observation er det muligt, at pronuclei eller zygotes afviger fra den position, hvor de præsenterede før observation starter. Hvis fokus drift sker, afvige ROIs også fra den korrekte position. Som et resultat, bliver kvantitative data værdiløse. For at undgå dette problem, har forskeren brug låget af bunden glasfade for beskyttelse mod vinduet fra klimaanlægget og vente på olie ekspansion over mål linsen. Hvis fokus drift forekomme, data fra de afvigende zygotes skal kasseres og en 2nd FRAP analyse med de samme zygotes kan ikke anbefales. I denne undersøgelse var afkortning observationstidspunkt fra 150 s3 til ca. 25 s7 meget hjælpsom. For det andet er længere inkubation udenfor rugemaskine. Da længere eksponering til miljøet udenfor rugemaskine er absolut skadelig for den embryonale udvikling, blev det anbefalet at afslutte FRAP-analyse inden for 1 time pr. parti. Antallet af zygotes FRAP-analyseres i en HEPES-buffered medier på bunden glasfade bør være 6-10. I denne eksperimentelle tilstand, det maksimale antal er omkring 30 til 4 h men hvis flere zygotes er nødvendige, 20 zygotes per Hansen kan analyseres ved at udskyde vurdering af fluorescerende intensitet i regionen reference og baggrund. For det tredje er "tidsrelaterede forringelse af laser mikroskopi Konfokal laser". Hvis blegning laseren er utilstrækkelige, ikke kan de rigtige kvantitative data opnås på grund af utilstrækkelig blegning. Faktisk, den parental asymmetri af zygotisk kromatin løshed kan ikke erhverves med en svag blegning laser. For at undgå dette, anbefales det at tjekke om laser power har svækket som lejligheden byder sig. I denne undersøgelse var 110-µW blegning nok for erhvervelse af forældrenes asymmetri.

zFRAP analyse kan anvendes til andre former for proteiner, ud over core histoner. Da core histoner Vis fremtrædende lav mobilitet, længere samlet observation tid (ca. 25 s i denne undersøgelse) er nødvendig i zFRAP analysen. Derfor, for at analysere et stort antal zygotes, dyrkning i HEPES-buffered medier på varmelegeme i lang tid er uundgåelig. På den anden side for zFRAP analysen af høj mobilitet proteiner, kan samlede observationsperiodens indstilles kort, gør det muligt for tidspunktet for dyrkning i HEPES-buffered medier på opvarmningsanlægget skal være kort. Derfor, da længere eksponering til miljøet udenfor rugemaskine er yderst skadelig for fosterudviklingen, zFRAP analyse til proteiner end core histoner, som har høj mobilitet af naturen, synes at vise lavere toksicitet end core histoner . Det er håbet, at denne eksperimentelle system vil hjælpe yderligere undersøgelse af forholdet mellem forskellige molekylære begivenheder og embryonale udvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi takker Satoshi Kishigami, Sayaka Wakayama, Hiroaki Nagatomo, Satoshi Kamimura og Kana Kishida for kritiske kommentarer og teknisk support. Dette arbejde blev delvist finansieret af Ministeriet for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi-program for at fremme reformen af nationale universiteter til M.O.; Japan-samfund til fremme af videnskab (16H 02593), Asada Science Foundation og Takeda Science Foundation til T.W. Finansieringskilderne spillede ingen rolle i undersøgelse design, dataindsamling og analyse, beslutningen om at offentliggøre eller forberedelse af manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal laser scaning microscope Olympus FV1200 FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7)
Thermo plate Tokai Hit TP-110RH26
Inverted microscope Olympus IX71
Micro manupilator Narishige MMO-202ND
Pieze Micro Micromanipulator Prime tech PMAS-CT150
35 mm culture dish Falcom 351008 35 x 100 mm style; for IVF
60 mm culture dish Falcom 351007 60 x 15 mm style; for embryo culture
50 mm culture dish Falcom 351006 50 x 9 mm style; for manipulation on the stage
50 mm glass bottom dish Matsunami D910400 50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis
Mineral oil Organic spceiality chemicals 625071 For FRAP analysis on the glass bottom dishes
Mineral oil Sigma M8410-1L For IVF and embryo culture
glass capillary Drummond 1-000-1000 For handling mouse zygotes
Borosilicate glass Prime tech B100-75-10-PT For microinjection of mRNA
Micropipett puller Sutter instrument P-97/IVF For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm) 
Microforge  Narishige MF-900
mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit Thermo
Fisher scientific		 AM1340
Poly (A) tailing kit Thermo
Fisher scientific		 AM1350
PVP solution 10% (PVP-HTF) IrvineSceientific 99311 HEPES buffered HTF containing 10% PVP
Sodium HEPES Sigma H3784
pTOPO eGFP-H2B Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6)
NorthernMax Gly Sample loading Dye  Thermo
Fisher scientific		 AM8551 For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA
Phenol chloroform isamyl alcohol nacalai tesque 25970-14
Chloroform nacalai tesque  08401-65
Not I TOYOBO NOT-111X
Ethachinmate WAKO 318-01793
3664 Otical power meter Hioki 3664  Power meter for laser power
Stereomicmicroscope Olympus SZX16

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Burton, A., Torres-Padilla, M. E. Epigenetic reprogramming and development: a unique heterochromatin organization in the preimplantation mouse embryo. Brief Funct Genomics. 9, 444-454 (2010).
  2. Okada, Y., Yamaguchi, K. Epigenetic modifications and reprogramming in paternal pronucleus: sperm, preimplantation embryo, and beyond. Cell Mol Life Sci. 74, 1957-1967 (2017).
  3. Ooga, M., Fulka, H., Hashimoto, S., Suzuki, M. G., Aoki, F. Analysis of chromatin structure in mouse preimplantation embryos by fluorescent recovery after photobleaching. Epigenetics. 11, 85-94 (2016).
  4. Meshorer, E., et al. Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells. Dev Cell. 10, 105-116 (2006).
  5. Boskovic, A., et al. Higher chromatin mobility supports totipotency and precedes pluripotency in vivo. Genes Dev. 28, 1042-1047 (2014).
  6. Yamagata, K., Ueda, J. Long-term live-cell imaging of mammalian preimplantation development and derivation process of pluripotent stem cells from the embryos. Dev Growth Differ. 55, 378-389 (2013).
  7. Ooga, M., Wakayama, T. FRAP analysis of chromatin looseness in mouse zygotes that allows full-term development. PLoS One. 12, e0178255 (2017).
  8. Quinn, P., Begley, A. Effect of human seminal plasma and mouse accessory gland extracts on mouse fertilization in vitro. Australian journal of biological sciences. 37, 147-152 (1984).
  9. Chatot, C. L., Lewis, J. L., Torres, I., Ziomek, C. A. Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium. Biology of reproduction. 42, 432-440 (1990).
  10. Bae, J., Sung, B. H., Cho, I. H., Song, W. K. F-actin-dependent regulation of NESH dynamics in rat hippocampal neurons. PLoS One. 7, e34514 (2012).
  11. Dieteren, C. E., et al. Defective mitochondrial translation differently affects the live cell dynamics of complex I subunits. Biochim Biophys Acta. 1807, 1624-1633 (2011).
  12. Subramanian, V., et al. H2A.Z acidic patch couples chromatin dynamics to regulation of gene expression programs during ESC differentiation. PLoS Genet. 9, e1003725 (2013).
  13. Hayashi-Takanaka, Y., et al. Tracking epigenetic histone modifications in single cells using Fab-based live endogenous modification labeling. Nucleic Acids Res. 39, 6475-6488 (2011).
  14. Yamazaki, T., Yamagata, K., Baba, T. Time-lapse and retrospective analysis of DNA methylation in mouse preimplantation embryos by live cell imaging. Dev Biol. 304, 409-419 (2007).
  15. Puschendorf, M., et al. PRC1 and Suv39h specify parental asymmetry at constitutive heterochromatin in early mouse embryos. Nat Genet. 40, 411-420 (2008).

Tags

Udviklingsmæssige biologi sag 136 zFRAP analyse zygotisk kromatin struktur åbne kromatin kromatin løshed Histon mobilitet udviklingsmæssige potentiale
Zygotisk fluorescens opsving efter foto-blegning analyse for kromatin løshed, der giver mulighed for fuld-sigt udvikling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ooga, M., Funaya, S., Aoki, F.,… More

Ooga, M., Funaya, S., Aoki, F., Wakayama, T. Zygotic Fluorescence Recovery After Photo-bleaching Analysis for Chromatin Looseness That Allows Full-term Development. J. Vis. Exp. (136), e57068, doi:10.3791/57068 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter