Summary
يظهر الارتخاء الكروماتين أن تشارك في الإمكانات الإنمائية بلاستوميريس. ومع ذلك، لم يتضح ما إذا كان الارتخاء الكروماتين يمكن استخدامها كمؤشر موثوق لإمكانات النمو للأجنة. هنا، قد وصف نظام تجريبي التي يمكن أن تتطور الكروماتين zygotes تقييم الارتخاء لفترة كاملة.
Abstract
تصوير الحية هو أداة قوية تسمح لتحليل الأحداث الجزيئية خلال الخيطي. مؤخرا، ثبت أن تشارك في إمكانيات التمايز الخلوي للخلايا الجذعية الجنينية pluripotent الكروماتين الارتخاء أو الانفتاح. وذكر سابقا أن مقارنة مع الخلايا الجذعية الجنينية، ميناء zygotes بنية الكروماتين خففت جداً، مما يوحي بارتباطها بما توتيبوتينسي. ومع ذلك، حتى الآن، قد لم تعالج عما إذا كان هذا الهيكل الكروماتين الغاية خففت/فتح مهم لإمكانات النمو الجنينية. في هذه الدراسة، ولدراسة هذه الفرضية، وضع نظام تجريبي في زيجوتيس التي التي تم تحليلها بواسطة الأسفار الانتعاش بعد تبييض الصورة يمكن أن تتطور إلى المدة دون أي أضرار كبيرة. الأهم من ذلك، يحتاج هذا النظام التجريبي فقط سخان الترمس-لوحة بالإضافة إلى المسح مجهر ليزر [كنفوكل]. نتائج هذه الدراسة تشير إلى أن الانتعاش الأسفار بعد تبييض الصورة تحليل التحليل (فراب) يمكن استخدامها للتحقيق في ما إذا كانت الأحداث الجزيئية في الكروماتين زيجوتيك هامان للتنمية الكاملة ومدتها.
Introduction
بعد الإخصاب، هو تغيير بنية الكروماتين بشكل حيوي، وهيكل الكروماتين زيجوتيك ثم أنشئت في نهاية المطاف1،2. خلال هذه الفترة، والأب برونوكلي، يتم تغيير البروتين الكروماتين المهيمنة من البروتامين إلى هيستون. الكروماتين الناتجة من مختلف للغاية من الحيوانات المنوية وبويضات الإناث في عدة نقاط (مثلاً، التكوين البديل هستون، هستون تعديل). وهكذا، يعتقد الكروماتين زيجوتيك شكلت مهمة للتنمية الجنينية اللاحقة. ومع ذلك، وعلى الرغم من الجهود المبذولة للكشف عن تفاصيل هيكل الكروماتين زيجوتيك على مدى فترات طويلة، أساليب لتقييم نوعية زيجوتيس أو للتنبؤ بتنميتها الأجل الكامل في مرحلة واحدة-خلية عن طريق تحليل بنيتها الكروماتين لم تكن المنشأة.
في الدراسة السابقة، فهو اكتشف أن zygotes هيكل الكروماتين خففت الغاية3. في الوقت الراهن، يعتقد أن يكون عاملاً هاما في التمايز الخلوي المحتملة في الخلايا الجذعية الجنينية (ES)4الارتخاء الكروماتين أو الانفتاح. دإط الخلايا لا يحمل التجانس في الطبيعة، ولكن بدلاً من ذلك غير المتجانسة؛ في مستعمرات الخلايا دإط، اكتساب بعض عابر إمكانية تفريق أعلى يماثل blastomeres المرحلة اثنين خلايا الأجنة. خلال هذه المرحلة الانتقالية إلى الاثنين-الخلية مثل الدولة، خلايا الكروماتين الارتخاء في وفاق التغييرات إلى ما قابل للمقارنة مع المرحلة اثنين خلايا الأجنة5. وهكذا، يبدو الارتخاء الكروماتين لتكون هامة لإمكانيات التمايز الخلوي وأنه من الممكن أن فتح الكروماتين على نطاق واسع في زيجوتيس مفيد لتقييم الإمكانات الإنمائية زيجوتيك.
تصوير الحية هو أداة قوية تسمح لتحليل الأحداث الجزيئية خلال الخيطي حيث يسمح هذا الأسلوب لذلك من تنمية وتطوير كامل المدة حتى6. وقد استخدمت تحليل فراب كأحد أساليب التصوير الحي، دراسة الارتخاء الكروماتين في الأجنة preimplantation وداط الخلايا3،،من45. إذا كان يمكن تحليل الارتخاء الكروماتين زيجوتيك دون أثر ضار على التنمية الكاملة ومدتها بتحليل فراب، قد يكون أداة قيمة لتقييم نوعية الأجنة في مرحلة واحدة-الخلية. ومع ذلك، قد لا درست آثار على التنمية على المدى الكامل بهذا الأسلوب التجريبي. مؤخرا، تم تطوير نظام تجريبي لاستخدام فراب لتقييم الارتخاء الكروماتين زيجوتيك. لأن هذا نظام جديد لمراقبة زيجوتيس، وقد وصفته فراب زيجوتيك (زفراب). زفراب لم تؤثر على التنمية على المدى الكامل خطيرة، وقد ذكرت في مكان آخر7. ويرد في هذا التقرير، البروتوكول هذا الأسلوب التجريبي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجرى هذه الدراسة يتفق بشكل صارم مع التوصيات الواردة في الدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية لجامعة ياماناشي. البروتوكول أقرته لجنة "أخلاقيات التجارب الحيوانية" من جامعة ياماناشي (تصريح رقم: A24-50). وأجريت جميع العمليات الجراحية تحت التخدير تريبروموثانول، وقد بذلت جميع الجهود للتقليل من المعاناة. وترد لمحة توضيحية للإجراءات والجدول الزمني في الشكل 1 و الجدول 1، على التوالي.
1-إعداد الجيش الملكي النيبالي رسول (النسخفي المختبر مرناً H2B اجفب)
- لينيريزي 5 ميكروغرام من قالب الحمض النووي توبو-اجفب-H2B3،7 مع 30 يو لا أنا في 50 ميليلتر في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- جمع 1.5 ميليلتر من هضم الحمض النووي لتأكيد ما إذا كانت تعي تماما بالتفريد.
- تطبيق ميليلتر 1.5 و 3-5 ميليلتر من الحمض النووي عسر الهضم مع تحميل صبغ للبئر من 2% [اغروس] هلام، على التوالي، ورهنا بالتفريد.
ملاحظة: إذا استوعبت تماما، هو لاحظ عصابة واحدة (ما يقارب 5 كيلو بايت). عسر الهضم الحمض النووي كعنصر تحكم الذي يظهر في موضع آخر.
- تطبيق ميليلتر 1.5 و 3-5 ميليلتر من الحمض النووي عسر الهضم مع تحميل صبغ للبئر من 2% [اغروس] هلام، على التوالي، ورهنا بالتفريد.
- إضافة ميليلتر 151.5 ddH2س و 200 ميليلتر الكحول الفينول/كلوروفورم/إيسواميل (25:24:1) لتبقى هضم الحمض النووي.
- مزيج من قوة بدوامة.
- الطرد المركزي في الحد الأقصى للسرعة لمدة 15 دقيقة.
- استعادة المادة طافية، ثم قم بإضافة 200 ميليلتر من كلوروفورم.
- مزيج من قوة بدوامة.
- الطرد المركزي بأقصى سرعة ممكنة لمدة 15 دقيقة.
- استعادة المادة طافية، ثم قم بإضافة 20 ميليلتر من خلات الصوديوم م 3 و 1.5 ميليلتر من اثاتشينماتي.
- مزيج من قوة بدوامة.
- إضافة ميليلتر 550 من الإيثانول 100% وثم تخلط بقوة بدوامة.
- الطرد المركزي بأقصى سرعة ممكنة لمدة 15 دقيقة.
- تجاهل المادة طافية ويغسل بيليه مع الإيثانول 70%.
- جاف بيليه بالتبخر لمدة 5-10 دقائق.
- يحل الحمض النووي بلازميد سرع في 8 ميليلتر من المياه خالية من نوكلياسي.
- تقييم تركيز بلازميد (تركيز المتوقعة عن 300-500 نانوغرام/ميليلتر) مع نانودروب باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
- إجراء النسخ في المختبر مرناً ترميز H2B اجفب مع 1 ميكروغرام لتنقية الحمض النووي كقالب في 20 ميليلتر من حجم رد الفعل الكلي باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
- بعد النسخ في المختبر ، إضافة 36 ميكروليتر من الماء ثم استرداد 1.5 ميليلتر من 56 ميليلتر من تجميعي مرناً لتحليل بالتفريد (دون بولي A).
- أداء بولي بتراجع للمركب مرناً في حجم رد فعل 100 ميليلتر باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
- إضافة 60 ميليلتر من كلوريد الليثيوم هطول الأمطار الحل إلى بولي مرناً الذيل من H2B اجفب وثم تخلط بقوة.
- باردة عند-30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- الطرد المركزي بأقصى سرعة ممكنة لمدة 15 دقيقة.
- تجاهل المادة طافية ويغسل بيليه مع الإيثانول 70%.
- جاف بيليه بالتبخر لمدة 5-10 دقائق.
- حل بيليه مع 20 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس بتدفئة في 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- تقييم تركيز مرناً سرع مع نانودروب. تضعف إلى 500 نانوغرام/ميليلتر مع المياه خالية من نوكلاس ومخزن في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- تأكيد المفضل مرناً الإنتاج؛ الموضوع 1 ميليلتر من مرناً مع/بدون (حصلت 1.8.1 والخطوات 1.12، على التوالي) بولي ذيل مختلطة مع 1.5 ميليلتر من 0.1 مغ/مل اثيديوم بروميد و 3 ميليلتر من صبغة تحميل عينة للتحليل الكهربي. وكان حجم التطبيقية 5.5 ميليلتر.
ملاحظة: إذا تراجع أ بولي كان ناجحاً، الفرقة تحول مرناً دون بولي تراجع بالمقارنة مع ينبغي التقيد (الشكل 2A).
2-إعداد الفئران الذكور استؤصل الاسهر لديهم
- وزن الفئران الذكور الممثل المدني الدولي في 8-12 شهرا باستخدام مقياس وزن.
- إينترابيريتونيلي حقن الفئران الذكور مع 0.7-0.9 مل تريبروموثانول 1.2% التخدير.
ملاحظة: كمية التخدير يعتمد على حجم الماوس. على سبيل المثال، يتم حقن ماوس وزنها 40 ز مع 0.8 مل تخدير تريبروموثانول. - ويت بيري مع الإيثانول 70%.
- جعل صغيرة قطع (3-5 مم) على بري ثم قم بإجراء شق في الجدار العضلات مع مساعدة المقص.
ملاحظة: المقص والملقط يجب تنظيف مع الإيثانول 70% قبل البدء الجراحة. - قبضة وسادة الدهون مع الملقط واسحبه برفق. ثم، تظهر الخصية والاسهر.
ملاحظة: الاسهر أنبوب على شكل U ومع الأوعية الدموية حمراء. - التعادل قبالة الاسهر عند نقطتين بخيوط الجراحة وبعد ذلك قطع الجزء الأوسط بين نقاط ربط.
- ادفع برفق مرة أخرى لوحة الدهون والخصية إلى بري.
- كرر العملية مع الخصية المتبقية.
- خياطة الجدار العضلات مع غرز اثنين مع خياطة العمليات الجراحية.
3-التلقيح الاصطناعي
- حقن 8-10-الأسبوع القديمة B6D2F1 الإناث الفئران (BDF1) إينترابيريتونيلي مع 7.5 وحدة دولية تروج المشيمة الخيلي (eCG) وتروج المشيمية البشرية (hCG) عند الفاصل الزمني ح 46-50.
- إعداد قطرات من 300 ميليلتر البشرية البوقي السوائل (HTF)8 وسائط تأهيلية والتلقيح يوم 1 قبل التلقيح الاصطناعي في صحن 30 ملم وتغطي هذه القطرات مع الزيوت المعدنية على مقاعد البدلاء المختبر وثم بريينكوباتي في حاضنة بين عشية وضحاها.
- التضحية نضجت الفئران الذكور الممثل المدني الدولي بخلع عنق الرحم. تشريح البربخ كودا بإبرة 27-ز وجمع المني. الثقافة منهم تأهيلية في 300 ميليلتر HTF وسائل الإعلام ح 1-2 في 38 درجة مئوية.
- ح 16 بعد قوات حرس السواحل الهايتية الحقن، التضحية الفئران الإناث سوبر أوفولاتيد بخلع عنق الرحم. نقل ampulla قناة في الزيوت المعدنية بجوار HTF وسائل الإعلام وثم استخلاص الخلايا الركام وبويضات معقدة من هذا أمبالا قناة بإبرة 30-ز في المتوسط HTF التلقيح بريينكوباتيد.
ملاحظة: لا تظهر بعض الفئران الإناث غالباً الإباضة رغم العلاج سوبر الإباضة. أمبالا قناة الموسع علامة على الإباضة. - بعد تأهيلية، نقل 2-3 ميليلتر من المني كاباسيتاتيد في وسائل الإعلام HTF التلقيح التي جمعت بويضات أوفولاتيد.
- جمع zygotes المخصبة ح 1 بعد التلقيح، وتعاملهم مع البروتين السكري المثبط في 100 ميكروغرام/مل لمدة 10 دقيقة في كزب9 وسائط الإعلام.
ملاحظة: ح 1 بعد التلقيح، عندما يتم إجراء التلقيح بشكل صحيح، هي ملاحظة zygotes المخصبة مع الجسم القطبي 2nd . إذا تم استخدام الحيوانات المنوية أقل أو منخفضة الجودة، ويلاحظ إلا القليل زيجوتيس مع الجسم القطبي 2nd . أيضا، إذا تم استخدام العديد من الحيوانات المنوية للتلقيح، يحدث بوليسبيرمي. التلقيح المناسب يؤدي إلى زيجوتيس مع برونوكلي الذكور والإناث. باستخدام هذه المعايير، من الممكن العثور على ما إذا كان يتم التلقيح جيدا أم لا.- بعد الغسيل في كزب الإعلام، رهنا زيجوتيس مع جسم القطبي ثاني microinjection مع اجفب-H2B مرناً.
4-إعداد الدائرة والماصات Microinjection
- تمييع الحمض النووي الريبي ترميز اجفب-H2B استخدام مياه خالية من نوكلاس للحصول على تركيز 250 نانوغرام/ميليلتر.
- تحضير 2-3 قطرات من حماية الأصناف النباتية--HTF H2B اجفب قطرات مرناً، ومعزولة 5-6 قطرات حبيس قطرات كزب (ح-كزب) على الطبق 60 ملم. وتغطي هذه القطرات مع الزيوت المعدنية.
ملاحظة: يمكن تنفيذ هذه الأعمال التحضيرية على مقاعد البدلاء المختبر. لا يوجد أي شرط لاستخدام تدفق الهواء الصفحي مجلس الوزراء. - سحب زجاج البورسليكات مع ساحبة ميكروبيبيتي (مثلاً P = 500، الحرارة = 825، سحب = 30، حطي = 120، والوقت = 200)
- بعد كسر منحنى غيض الماصة، ماصة microinjection الزجاج سحبت قريبة من الحافة (ميكرومتر −300 مرة أخرى) في حوالي 30 ° استخدام ميكروفورجي.
5-microinjection
- إيقاف تشغيل سخان لوحة على مرحلة ميكرومانيبولاتور الحيلولة دون قتل زيجوتيس مع بيزو خلال حقن مرناً.
- أغسل ومعطف داخل إبر الحقن في HTF حبيس مخزنة يحتوي على 10% حماية الأصناف النباتية (حماية الأصناف النباتية--HTF).
- جمع zygotes مخصبة بهيئة القطبي 2nd (الشكل 2B) ونقل زيجوتيس 20-25 إلى الدائرة بمرحلة مجهر المرفقة مع ميكرومانيبولاتور.
- تعبئة مرناً H2B اجفب المخفف في الشعيرات الدموية زجاج البورسليكات من النصائح.
- عقد اقحه مع ماصة القابضة وثم كسر بيلوسيدا زونا والغشاء سيتوسوليك مع محرك أقراص بيزو.
- ضخ حوالي 10 رر مرناً في السيتوبلازم زيجوتيس. إنهاء مرناً-الحقن داخل 10 دقيقة لمنع الضرر الناجم عن أطول استزراع zygotes خارج الحاضنة.
ملاحظة: يجب أن يكون حجم حقن كبيرة مثل الجسم القطبي 2nd . إذا كان مقدار مرناً حقن كبير جداً، من الممكن يسبب الكسر H2B اجفب الحرة، التي يمكن أن تؤثر في كسر الجوال. - تغسل في مالا يقل عن 3 قطرات 10 دقيقة بعد microinjection، وثم الثقافة zygotes حقنه في كزب في 38 درجة مئوية حتى التحليل زفراب.
6-زفراب التحليل
- ح 1 قبل التحليل زفراب، قم بتشغيل الليزر وصفيحة المرفقة إلى مرحلة المجهر [كنفوكل]. تعيين درجة الحرارة عند 38 درجة مئوية.
- وضعت 6-10 ميليلتر من وسائط التخزين المؤقت حبيس كزب مغطاة بالزيت المعدني في الطبق أسفل الزجاج عيار 60 ملم والحارة على السخان حتى جمع الزيجوت.
- 8-12 ساعة بعد التلقيح، جمع الإعراب عن H2B اجفب زيجوتيس 5-10 ونقل إلى 6-10 ميليلتر من قبل استعد الإسقاط المتوسط مخزنة هيبيس كزب.
ملاحظة: لتجنب استزراع أطول خارج الحاضنة، استخدمت zygotes معربا عن H2B اجفب 5-10 في كل تحليل. يمكن تحليل zygotes 5 إلى 10 ضمن ح 1. - تعيين شروط تبيض والتصوير وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. القضية [كنفوكل] ليزر المسح مجهر (جدول المواد) يظهر أدناه:
- استخدام 60 X عدسة النفط (60 X 60 X/1.35 النفط).
ملاحظة: العدسات مع أعلى التكبير (أعلى الفتحة العددية) إظهار حساسية أكبر. - تعيين سرعة المسح الضوئي ك 4.0 المايكروثانيه/بكسل والحجم ك "512" على "اقتناء الإعداد" (تكميلية الشكل 1).
- زيادة التكبير الرقمي "5" (تكميلية الشكل 1).
ملاحظة: مطلوب تكبير أعلى للتعرف عما إذا كان التركيز الانجراف يحدث أم لا. - فتح قائمة صبغ (تكميلية الشكل 1) واختار ثم "اجفب". تعيين وقت الملاحظة ك 1.6 s (يتم تعيين الفاصل الزمني كالأعداد "تشغيل حرة") (الإضافي رقم 1)
ملاحظة: قد يسبب المزيد من نقاط المراقبة بيانات أكثر تفصيلاً، ولكن قد يسبب أيضا الضيائية. في تحليل زفراب، يبدو وقت ملاحظة s 1.6 تكون كافية للكشف عن اللاتناظر الأبوية من الارتخاء الكروماتين. - تعيين عدد الصور ك 12 في المجموع (تكميلية الشكل 1).
- بدء تشغيل لوحة "التحفيز الإعداد" وثم انقر فوق "الرئيسي" في أوسيسكانير. تعيين سرعة بيكسل المايكروثانيه 10.0 المسح الضوئي. انقر فوق "تنشيط في سلسلة" ثم قم بتعيين PreActivation "3 إطارات" ووقت التنشيط "5 ثانية" (تكميلية الشكل 1).
- انقر فوق "التركيز x 2" وتعيين التركيز وثم "إيقاف".
- مجموعة تبيض والتصوير طاقة الليزر (477 nm) في µW 110 و 15، على التوالي، ضبط الليزر "عداد الطاقة" (تكميلية الشكل 1).
ملاحظة: تبييض قوية جداً قد يسبب منطقة المبيضة أكبر، مما يتسبب في صعوبات بالنسبة للتحليل الكمي. لقياس قوة الليزر، استخدام مقياس طاقة. من المهم تأكيد قوة الليزر لتجنب تأثير تدهور قوة الليزر المتصلة بالوقت. - انقر فوق "قصاصة Rect" (تكميلية الشكل 1) في لوحة "الإعداد التحفيز". تعيين المنطقة للفائدة (العائد على الاستثمار؛ أحمر؛ ROI #1B) ك 40 × 40 بكسل (7.6 ميكرومتر2). تعد منطقة مرجعية (REF؛ أخضر؛ ROI #2)، وفي الخلفية (حرس الحدود؛ أزرق؛ ROI #3) باستخدام "نسخ عائد الاستثمار" و "لصق عائد الاستثمار" (الزر الأيمن على الماوس).
ملاحظة: يمكن تعيين حجم بكسل من خلال "إدارة العائد على الاستثمار" التي يمكن استدعاؤها بواسطة النقر فوق الزر الأيمن للماوس عندما يكون المؤشر في العائد على الاستثمار. ويعتقد أن أفضل نظراً لأنها يمكن أن توحيد تشتت نقاط زفراب رويس أكبر. ومع ذلك، كبير جداً دوروا لا يمكن استخدام لهذا التحليل لأنه يجعل من الصعب تجنب الجسم السلائف نوية (بروميد البروبيل – ن). كان يعتقد أن تكون خالية من الكروماتين اجفب-H2B في هذه المقصورة وأظهرت ملحوظة التنقل أعلى3. يجب فصل المناطق العائد على الاستثمار، والمرجع إلى أقصى حد ممكن. في حالة إغلاق هاتين المنطقتين، تبيض قد تؤثر أيضا على المنطقة للمرجع. - انقر فوق "لايف" على شريط الأدوات ثم قم بتشغيل "يعيش الأرض" (تكميلية الشكل 1).
ملاحظة: الأرض الحية يشير إلى كثافة إشارة الأسفار داخل كل عائد الاستثمار ويستخدم لضبط طاقة الليزر باستخدام الجيش الكرواتي. لاحظ أنه إذا لم يتم تحديد العائد على الاستثمار، أن اكتشاف لا كثافة في لوحة الأرض حية. - تحديد موقف عائد الاستثمار
ملاحظة: يمكن نقل العائد على الاستثمار عن طريق سحب إلى الموضع الذي تريده في برونوكلي. (1) يمكن التأكد من تجنب نوية، و (2) تناسب دوروا كامل نوكليوبلاسم. لا تحتوي على منطقة خارج منطقة الغشاء النووي (السيتوبلازم) في العائد على الاستثمار. توطين H2B اجفب مقيد جداً في نوكليوبلاسم حيث أنه من السهل العثور على ما إذا كان العائد على الاستثمار يحتوي السيتوبلازم أو لا بالأسفار من اجفب-H2B. برونوكلي الذكور تميل إلى أن تكون أكبر من تلك التي للإناث، والتي غالباً ما تكون مترجمة قرب الجسم القطبي 2nd . أثناء استخدام هذه المعايير، القاضي pronuclei الذكور أو الإناث. - انقر فوق "التركيز x 2" (تكميلية الشكل 1) ثم قم بضبط HV سبر طاقة القناة اجفب إلى كثافة الأسفار إلى حوالي 2000 (كثافة fluorescence يتبين في إطار "مؤامرة حية").
- استخدام 60 X عدسة النفط (60 X 60 X/1.35 النفط).
- انقر فوق "وقت" و "س" (تكميلية الشكل 1) ثم بدء تحليل زفراب.
ملاحظة: إذا تم تحديد الزر "الوقت" مناسب "t" يظهر على الزر "س".- انقر فوق "سلسلة" القيام به (تكميلية الشكل 1)، الذي يظهر بعد تصوير فراب بالقرب من زر "س"، وثم الحصول على بيانات تحليل فراب.
- قم بحفظ الملف "XXXXX عرض صورة 2D" كملف مسمى مفضل (تنسيق الملف oib.) من "حفظ باسم" (Ctrl + Shift + S يمكن أيضا استخدامها).
- تحديد العائد على الاستثمار، والمرجع، وحرس الحدود، وثم انقر فوق (Ctrl + A يمكن أيضا استخدام) "تحليل سلسلة" في إطار "عرض صورة ثنائية الأبعاد".
- الحصول على بيانات الصف فراب وثم انقر فوق "حفظ" زر في إطار مؤامرة حية.
ملاحظة: صف البيانات الكمية فراب يتم حفظه كملف csv.
- للا مراقبة زفراب، وضعت بعض zygotes حقن مرناً في الانخفاض، وقريب من حافة الأطباق أسفل الزجاج لتجنب التأثير من الأسفار والمراقبة.
7-بيانات الحساب
- أثناء استخدام البيانات الكمية التي تم الحصول عليها، وجعل الرسم البياني لمنحنى "الاسترداد" و "كسر المتنقلة" من Excel كما هو موضح في مراجع3،7 مع بعض التعديلات (انظر أدناه وتكميلية ملف أكسل).
- حساب الكثافة النسبية عن طريق طرح قيمة حرس الحدود من العائد على الاستثمار، والمرجع في 12 من الصور لكل نقطة في الوقت.
- تقسيم قيمة العائد على الاستثمار بالمرجع. نتيجة لذلك يمكن الحصول على 12 عشرات الكثافة النسبية موحدة في كل نقطة في الوقت.
- حساب متوسط درجة النسبية للعائد على الاستثمار في 3 من الصور التي التقطت قبل صور تبيض.
- حساب معدل الاسترداد. الفجوة التي حصلت 12 عشرات النسبي لعائد الاستثمار الصور التي اتخذت في كل مرة نقطة (التي تم الحصول عليها في 7.1.2.) بمتوسط نقاط النسبية قبل تبييض الصورة (التي تم الحصول عليها في 7.1.3.). رسم منحنى الانتعاش مع استخدام هذه النقاط (الشكل 2E).
- حساب معدل تبيض.
ملاحظة: التبييض المعدل (%) = 100-معدل استرداد الصورةال 4. - حساب الكسر المتنقلة (وسط) باستخدام الصيغة كالتالي10،،من1112
وسط (%) = معدل استردادال 12 (عند نقطة النهاية)-4 معدل الاستردادth /تبيض معدل × 100.
8. نقل الأجنة
- ورفيقه نضجت الممثل المدني الدولي الإناث في 8-12 شهرا مع استؤصل الاسهر لديهم ذكور الفئران الممثل المدني الدولي ليلة قبل نقل الجنين قبل السماح لهم بأن تكون في القفص نفسه بين عشية وضحاها.
- جمع الأجنة التي تم تحليلها زفراب والعزم على تطوير إلى مرحلة الخلية اثنان.
- إينترابيريتونيلي حقن الفئران الإناث مع 0.7-0.9 مل تريبروموثانول 1.2% التخدير أو 0.35-0.45 مل 0.75/4/5mg/kg ميديتوميديني/الميدازولام/بوتورفانول العوامل المختلطة قبل نقل الأجنة.
ملاحظة: يتحدد حجم التخدير بوزن الجسم في الفئران. تريبروموثانول: 0.2 مل/10 غم وزن الجسم؛ ميديتوميديني/الميدازولام/بوتورفانول المختلطة وكلاء: 0.1 مل/10 غرام وزن الجسم.- نقل هذه الأجنة مرحلة الخلية اثنين في أوفيدوكتس من بسيودوبريجنانت الإناث من الفئران الممثل المدني الدولي مع المكونات مهبلية في أيام 0.5 وظيفة كويتوم (dpc).
- بعد نقل الجنين، وضع الفئران الإناث على سخان تعيين عند 37 درجة مئوية حتى تستيقظ.
- في dpc 18.5، التضحية بآلام البديلة بخلع عنق الرحم واسترداد الجراء مستمدة من تحليل زفراب زيجوتيس بالعملية القيصرية. وسلمت بعض الجراء المستردة إلى الأم الحاضنة واوزانها الهيئة قيمت كل أسبوع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تحليل زفراب مع اجفب-H2B
تنتج بشكل صحيح تم حقن مرناً ترميز H2B اجفب، الذي ينظر إليه بسبب عصابة تحول بولي تراجع (الشكل 2A)، في السيتوبلازم زيجوتيس مع جسم القطبي 2 في 1-3 ح بعد التلقيح (الشكل 2). 8 إلى 12 ح بعد التلقيح، زيجوتيس مع برونوكلي 2 عرض التعبير عن اجفب-H2B جمعت وتخضع للتحليل زفراب (الشكل 2). تحليل فراب يتكون من خطوات تبيض والانتعاش. في مرحلة ما قبل التبييض، يمكن ملاحظة إشارة H2B اجفب (2D الشكل-1)، ولكن بمجرد مقصور، الإشارة انخفضت إلى مستوى لا يذكر (الشكل 2D-2). إذا تبيض كان ناجحاً، ظهرت حفرة مظلمة كبيرة مثل العائد على الاستثمار قريبا بعد التبييض. بعد التبييض، كثافة إشارة fluorescence H2B اجفب تعافي قليلاً؛ إشارة الفلورسنت زادت تدريجيا بسبب التدفق غير مقصور كسر اجفب-H2B في العائد على الاستثمار من المنطقة غير مقصور في نوكليوبلاسم (2D الشكل-3). لتأكيد نجاح التحليل زفراب من الارتخاء الكروماتين، من المستحسن استخدام اللاتماثل الأبوية للارتخاء الكروماتين؛ وأظهرت برونوكلي الذكور منحنى انتعاش أسرع والكسور الجوال أكثر من تلك التي للإناث (الشكل 2 هاء و واو). بعد تحليل زفراب، زيجوتيس غسلها ومثقف في كزب وسائل الإعلام، يمكن أن تتطور إلى مرحلة الكيسة دون أضرار كبيرة (الشكل 2 و H). حتى لو كان مقصور بشدة لفترة أطول، zygotes يمكن أن لا تزال تتطور إلى مرحلة الكيسة، فضلا عن7.
تحليل لتطوير المدى الكامل لتحليل زفراب زيجوتيس
لتحليل تطوير المدى الكامل من الأجنة المستمدة من تحليل زفراب زيجوتيس، تم نقل الأجنة في مرحلة الخلية اثنين في أوفيدوكتس الأمهات بسيودوبريجنانت. كعناصر تحكم، وأعدت أجنة سليمة، وحقن مع مرناً ولكن لم يتم تحليلها زفراب. معدل المواليد من الأجنة التي تم تحليلها زفراب (41.0%) كان قليلاً لكن أقل بكثير مما أجنة سليمة (62.2%)، ولكن كان نفسه لا عنصر التحكم زفراب (52.6%) (الجدول 2). وهكذا، يبدو أن قليلاً تضر بالتنمية الجنينية المدى الكامل زفراب-تحليل. إلا أن الأهم من ذلك، الجراء المستمدة من zygotes حلل زفراب تبدو صحية ونموا كاملا (الشكل 3).
الشكل 1: توضيح تخطيطي تدفق الإجراءات للتجارب. الإخصاب في المختبر : كانت تلقح بويضات الثاني (MII) الطورية الطازجة التي تم جمعها مع الحيوانات المنوية مناطقية. في المختبر النسخ: رسول الحمض النووي الريبي (مرناً) ترميز هيستون اجفب تنصهر H2B (اجفب-H2B) تم نسخها من المروج SP6 بتوبو-اجفب-H2B خطية3 مع لا أنا. تعرض مرناً H2B اجفب بولي بتراجع، ومن ثم تنقية. ويستخدم في حقن مرناً مرناً H2B اجفب المنقي. حقن مرناً: يتم حقن مرناً H2B اجفب المعدة في السيتوبلازم زيجوتيس مع 2nd القطبية الجسم. zفراب التحليل: zygotes معربا عن H2B اجفب تعرضوا لتحليل زفراب. كان مقصور على منطقة المصالح (عائد الاستثمار؛ مستطيل أحمر) مع ليزر قوية وثم إشارة H2B اجفب انخفضت إلى مستوى لا يعتد بها. بعد التبييض، زادت كثافة إشارة H2B اجفب تدريجيا. في المختبر التنمية: بعد تحليل زفراب، زيجوتيس يمكن أن تتطور إلى مرحلة الكيسة. نقل الأجنة: مرحلة الخلية اثنين، تم نقل الأجنة تحليل زفراب في أوفيدوكتس بسيودوبريجنانت الفئران الإناث. 18 يوما يمكن الحصول الجراء يعيش في وقت لاحق، سليمة من الأجنة حللت زفراب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تحليل زفراب زيجوتيس مع اجفب-H2B. (أ) صورة تمثيلية مرناً معدّة بشكل صحيح قبل في المختبر وتدوين وبولي بتراجع. لين 1: قبل بولي تراجع؛ لين 2: تراجع بولي ألف وظيفة. تم حقن (باء) مرناً ترميز H2B اجفب السيتوبلازم زيجوتيس مع 2nd جسم القطبي ح 1-3 وظيفة التلقيح (hpi). شريط المقياس = 25 ميكرومتر (ج) التعبير عن H2B اجفب زيجوتيس وجمعت في hpi 8-12. تظهر العلامات النجمية الأبيض نوية الهيئات السلائف (بروميد البروبيل – ن). شريط المقياس = 10 ميكرون (د) اجفب-H2B التعبير اكتشفت في نوكليوبلاسم كامل حتى في بروميد البروبيل – ن في مرحلة ما قبل التبييض (D-1)، قريبا بعد التبييض (D-2)، وبعد استرداد (D-3). يرد الأغشية النووية (الخطوط المنقطة البيضاء) وبروميد البروبيل – ن (العلامات النجمية). شريط المقياس = 10 ميكرومتر. منحنى الاسترداد (ه، و) والكسور متنقلة تم الحصول عليها من 45 zygotes في 5 تجارب مستقلة. زرقاء وحمراء تشير إلى الذكور والإناث، على التوالي. في المنحنيات الانتعاش، وتشير الدوائر واحدة نقطة قياس. في التبعثر مؤامرات، تشير النقاط واحدة إلى النتيجة للكسور المتنقلة التي تم الحصول عليها من برونوكلي. (ز) يتم عرض الصور التمثيلية لتطوير تحليل زفراب زيجوتيس برييمبلانتيشن. اثنين-الخلية، الخلية، 4-8، والكيسه مرحلة الأجنة في 24 و 48 و 96 hpi، على التوالي. دائرة صفراء تشير إلى الكيسة متطورة. وسعت هذه الكيسة وسيظهر في اللوحة اليسرى. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (ح) رسم بياني شريطي المعدلات التنموية للأجنة حللت زفراب. أشرطة تشير إلى الأجنة تحليل زفراب (زفراب) (أبيض) ومراقبة الأجنة (أسود) حقن مرناً ولكن لا يوجد تحليل زفراب (لا زفراب). البيانات المعروضة من ثلاث تجارب مستقلة، فحص أجنة 57 على الأقل في المجموع. اثنين-الخلية، الخلية 4-8 ومورولا (مو) ومراحل الكيسة (Bl) لوحظ في 24، 48، 72 و 96 من hpi، على التوالي. لقد تم تعديل هذا الرقم من [أوجا et al عام 2017]7. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: النمو الصحي الجراء المستمدة من زيجوتيس حلل فراب. (أ) تظهر صور الجراء المستمدة من تحليل زفراب زيجوتيس. (ب) لوحظ النمو الطبيعي خلال التمريض الجراء حلل زفراب. (ج) الرسم البياني يشير إلى وزن الجراء المستمدة من الأجنة سليمة (الأزرق)، أجنة التحكم غير مقصور (أحمر)، وحلل زفراب الأجنة (أخضر). هيئة أوزان الجراء 29 المستمدة من الأجنة سليمة، 24 من الأجنة لا زفراب، و 15 من الأجنة تحليل زفراب لمدة 8 أسابيع. القيم المؤشرة العلامات النجمية تختلف اختلافاً كبيرا عن مراقبة سليمة. لقد تم تعديل هذا الرقم من [أوجا et al عام 2017]7. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
تكميلية الشكل 1: واجهة المستخدم الرسومية لتحليل فراب. (أ) وأبدى لمحة عامة عن واجهة المستخدم الرسومية. (ب) وقد أظهرت الصور الموسع لكل نافذة. (1) يستخدم نافذة "اقتناء الإعداد" لتعيين شرط الحصول على الصورة. (2) يستخدم نافذة "التحفيز الإعداد" لتعيين الشرط تبيض. يمكن فتح هذا الإطار بالنقر فوق الزر في الإطار اقتناء الصورة. (3) يتم استخدام نافذة "التحكم اقتناء صورة" لتحليل فراب. (4) "عرض مباشر" يوضح الصورة الحالية (الصورة الحالية التي تظهر بعد النقر فوق الزر XY أو التركيز x2). إظهار المستطيلات الزرقاء الضوء الأحمر والأخضر عائد الاستثمار (منطقة فائدة)، REF (المرجع)، وحرس الحدود (الخلفية)، على التوالي. (5) رأي 2D يعرض الصورة تحليل فراب ويظهر بعد النقر فوق "سلسلة فعل" الزر. في هذه الحالة، يظهر من تحليل فراب برونوكليوس ذكور كمثال. ثلاثة مستطيلات بالنقاط 8 تشير إلى أن يتم تحديد هذه المناطق. (6) "يعيشون الأرض" يبين كثافة الأسفار الحالية في كل منطقة. المحاور X و Y تشير إلى الوقت (مللي ثانية) وشدة الأسفار، على التوالي. (7) سلسلة تحليل يبين مسارات شدة الأسفار في كل منطقة ويظهر بعد النقر فوق الزر "تحليل السلسلة" في 2D إطار العرض. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
تكميلية 1 ملف Excel: نموذج البيانات وحساب البيانات. (ورقة 1) ويرد بيانات مثال برونوكليوس ذكور. لا. يشير إلى عدد الصورة متتالية. وأشير إلى كثافة صف لكل منطقة (العائد على الاستثمار، والمرجع، وحرس الحدود). (ورقة 2) يتم عرض مثال لحساب البيانات. رقم البروتوكول يشير إلى الأماكن المقابلة في قسم البروتوكول. مذكرات شرح معنى كل درجة. يمكن الإشارة صيغة عددية بالنقر فوق الخلايا. وترد أمثلة لمنحنى الانتعاش وكسر الجوال شريطي. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
| اليوم-3 | اليوم-2 | اليوم-1 | يوم فراب | يوم + 1 | يوم + 3 | اليوم + 19 | |
| إعداد مرناً | قطع قالب بلازميد (أكثر من ليلة) |
1)-تنقية قالب بلازميد | |||||
| 2). النسخ في المختبر | |||||||
| 3)-بولي في المختبر تراجع | |||||||
| 4)-فحص الجودة مرناً بالتفريد | |||||||
| اربط | 1)-إعداد بيبيت التلاعب والدائرة | ||||||
| 2)-حقن مرناً | |||||||
| 3)-تحليل زفراب | |||||||
| 4)-حساب منحنى الانتعاش وكسر الجوال* 2 | |||||||
| التلقيح الاصطناعي وتحليل لغرس ما قبل التنمية | حقن eCG | 1)-قوات حرس السواحل الهايتية الحقن | 1)-تأهيلية الحيوانات المنوية | ||||
| 2)-ما قبل الحضانة لوسائل الإعلام (HTF) | 2)-الإخصاب في الأنابيب | ||||||
| إعداد وسائط الإعلام (HTF، كزب، ح-كزب وحماية الأصناف النباتية--كزب) | 3)-تنمية برييمبلانتيشن التقييم | ||||||
| نقل الأجنة | إعداد الإناث بسيودوبريجنانت (التزاوج مع أنثى استؤصل الاسهر لديهم* 1) |
نقل الأجنة المرحلة 2-خلية للإناث بسيودوبريجنانت | تقييم معدل المواليد | ||||
| * 1: ينبغي إعداد الماوس الذكور استؤصل الاسهر لديهم 2 أسابيع على الأقل قبل التزاوج | |||||||
| * 2: يمكن إطالة الحساب في اليوم التالي (يوم + 1) | |||||||
الجدول 1: جدول زمني للتجارب- ويعتبر يوم تحليل فراب 0. يوم يتم الإشارة إلى التجارب التي ينبغي أن يقوم على أيام كل منها لكل عنصر.
| فئات | لا. لحقن زيجوتيس | لا. من zygotes المستردة بعد حقن مرناً (%) * | لا. لتحليل زيجوتيس | لا. لنقل | لا. للمستلمين | لا. من الجراء (%) * * * | وزن الجراء (ز) | لا. من الجراء المحورة وراثيا |
| المرحلة 2-خلايا الأجنة (%) * * | ||||||||
| سليمة | - | - | 99 | 98 (99.0) | 9 | 61 (62.2) | 1.64±0.02 | n.d |
| لا فراب | 420 | 398 (94.8) | 82 | 78 (95.1) | 7 | 41 (52.6)أ،ب | 1.66±0.03 | n.d |
| اربط | 79 | 78 (98.7) | 7 | 32 (41.0)ب | 1.69±0.03 | 0 | ||
| *: تحسب بقسمة مع أي. لحقن زيجوتيس؛ * *: تحسب بقسمة مع أي. من zygotes تحليلها؛ : تحسب بقسمة مع أي. المرحلة 2-خلية نقل الأجنة. أ، ب: مرتفع تشير إلى اختلاف كبير (ف < 0.05). n.d: لم يحدد. لقد تم تعديل هذا الجدول من [أووجا et al عام 2017]7. | ||||||||
الجدول 2: معدل ولادة أجنة تم تحليلها: وتم بحث إمكانات التنموية للأجنة، التي قد تم تحليلها فراب، لكامل المدة. ويبين معدل الولادات التي تم الحصول عليها من هذه الأجنة. كما تم أيضا فحص الضوابط، سليمة ولا يوجد أجنة حلل فراب. وترد كذلك أوزان الجراء المستمدة من هذه الأجنة المنقولة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تحليل زفراب كما اتضح في هذه الدراسة، لا يسبب الضرر الحرجة للتنمية على المدى الكامل، مما يوحي بهذا الأسلوب أداة مفيدة للغاية للكشف عن الرابطة بين الأحداث الجزيئية وإمكانية إنمائية الجنينية. أثناء إعادة برمجة، إلى الاثنين-الخلية مثل الدولة دإط الخلايا، ومن خلالها إمكانيات تفضيلية لتلك الخلايا يصبح مرتفعا كما أن المرحلة اثنين خلايا الأجنة، الكروماتين الارتخاء يتغير إلى أن المقارنة مع المرحلة اثنين خلايا الأجنة5. وبناء على ذلك، فمن الممكن أن الارتخاء الكروماتين زيجوتيك مهم لإمكانات النمو الجنينية. نقل نواة الخلية الجسدية في السيتوبلازم بويضات أظهرت الارتخاء الكروماتين أقل مقارنة مع برونوكلي الأب ليس فقط ولكن أيضا pronuclei الأمهات، مما يوحي بعدم اقتناء الكروماتين مفتوحة في زيجوتيس نقل نواة الخلية الجسدية وتشارك في إمكانياتها التنموية الفقراء. جماعياً، ويبدو أن تكون مفيدة لتوضيح الجينوم إعادة برمجة آليات تحليل زفراب.
قد يتيح النظام زفراب لتحديد زيجوتيس مع إمكانيات إنمائية عالية. في هذه الدراسة الأولية، بالإضافة إلى سكنت، كشفت عن أن جولة حقن النطف (ROSI)-تستمد zygotes هاربور الكروماتين الشاذ الارتخاء. وعلاوة على ذلك، تبين أن بعضهم أظهر الارتخاء الكروماتين على المستوى يضاهي zygotes المستمدة من التلقيح الاصطناعي، وكذلك، مما يوحي بأن هذه زيجوتيس لها إمكانات كبيرة إنمائية. الأهم من ذلك، يمكن وضع zygotes من الكروماتين التي كانت تقيمها الارتخاء زفراب للمصطلح. وفي المستقبل، ولذلك قد يكون من الممكن التمييز بين zygotes سكنت روزي مشتقة-ومع إمكانات النمو أعلى من أقل منها بتقييم الارتخاء الكروماتين زفراب.
وحتى الآن، أظهرت الدراسات السابقة فائدة أسلوب التصوير الحي لتحليل حالة جينية في الأجنة برييمبلانتيشن. بعض أساليب التصوير حية يمكن أن تكشف عن كل تعديل جينية (مثل الحمض النووي/هستون تعديل) في الأجنة برييمبلانتيشن13،14، ولكن استخدام زفراب، فمن الممكن لتقييم الارتخاء الكروماتين زيجوتيك دون قتل الخلايا. ويبدو الارتخاء الكروماتين تتأثر بتعديلات جينية. على سبيل المثال، هيتيروتشروماتين فيه التعديل جينية القمعية مثل H3K9me3 و H3K27me3 هي إثراء أظهرت انخفاض هيستون التنقل من منطقة يوتشروماتيك3،15. في الواقع، تسبب العلاج بمادة كيميائية مركبة، الذي يحول الدولة جينية، تغيير رخاوة الكروماتين في زيجوتيس. ولذلك، باستخدام زفراب، من الممكن الكشف عن حالة جينية إجمالية هيكل الكروماتين. ورئي أن هذا سيكون ميزة لتقييم إمكانيات التنمية زيجوتيس.
حقن مرناً ترميز H2B اجفب زفراب نقيصة ولكن يزيد من براعة زفراب. نقيصة حقن مرناً هو الضرر الذي يسببه microinjection. لتجنب هذا الأمر، أنها فعالة جداً استخدام الماوس H2B اجفب المعدلة وراثيا. إذا تم استخدام خط اجفب-H2B الماوس المحورة وراثيا، وقد زاد معدل ذرية مقارنة بحالة استخدام microinjection مرناً. على العكس من ذلك، أنها ميزة لحقن مرناً زفراب أن يسمح باستخدام أي نوع من سلالة فئران البرية من نوع. الباحثون الذين يريدون استخدام زفراب مع اهتمامها سلالة الماوس لا تحتاج إلى إعداد سلالة الماوس المطلوب مع التحوير H2B اجفب. هذا الاستحقاق يصبح أكثر بروزا في تحليل المحورة وراثيا (على سبيل المثال. أوفيريكسبريشن/ضربة قاضية) أو خروج المغلوب الماوس سطر. لم يكن لديك الباحثين الذين يرغبون في الاستفادة من زفراب لمواضيع البحوث الخاصة بهم مع السطر المعدلة وراثيا/بالضربة القاضية لإعداد خط اجفب-H2B المحورة وراثيا من عدد محدود من مصلحتها منها. وهذا يشير إلى ميزة للتقدم للبحوث.
ويتطلب تحليل التصوير العيش مع الأجنة preimplantation المعرفة المتخصصة والأجهزة المتخصصة مكلفة جداً ودقيقا. ولذلك، مقدمة لنظام تجريبي ليس قرارا سهلاً. يحتاج النظام التجريبي الذي تم إنشاؤه في هذه الدراسة فقط حرارية-سخان وبصرف النظر عن المسح مجهر ليزر [كنفوكل]. وبالإضافة إلى ذلك، تعلم الطريقة سهلة حتى يتم مبتدئاً في مختبر لمعرفة طريقة زفراب خلال شهر. ومع ذلك، هناك بعض القضايا التي لا تزال بحاجة إلى النظر فيها. الأول هو الانجراف التركيز. خلال المراقبة، فمن الممكن أن برونوكلي أو زيجوتيس تحيد عن موقف حيث أنها قدمت قبل بدء المراقبة. في حالة حدوث الانجراف التركيز، انحرفت رويس أيضا من الموضع الصحيح. كنتيجة لذلك، يصبح غير ذي قيمة البيانات الكمية. لتجنب هذه المشكلة، قد الباحث ﻻستخدام غطاء الأطباق أسفل الزجاج للحماية ضد الإطار من أجهزة تكييف الهواء، والانتظار لتوسيع النفط عبر العدسة الهدف. في حالة حدوث الانجراف التركيز، يجب أن يتم تجاهل البيانات من zygotes ينحرف ولا ينصح بإجراء تحليل 2nd فراب مع زيجوتيس نفسه. في هذه الدراسة، وتقصير وقت الملاحظة من 150 ق3 إلى حوالي 25 s7 كان مفيداً للغاية. وثانيها حضانة أطول خارج الحاضنة. حيث يعد التعرض للبيئة خارج الحاضنة مضر بالتأكيد لتطوير جنينية، أوصى بإنهاء فراب-التحليل ضمن ح 1 كل دفعة. عدد zygotes تحليل فراب في وسائل الإعلام هيبيس مخزنة على الأطباق أسفل الزجاج يجب أن تكون 6-10. في هذه الحالة التجريبية، العدد الأقصى هو حوالي 30 ح 4 ولكن إذا كان هناك حاجة إلى المزيد من زيجوتيس، زيجوتيس 20 كل ح يمكن تحليلها بتأجيل تقييم شدة الفلورسنت في المنطقة الخلفية والمرجعية. الثالث "تدهور الليزر للفحص المجهري الليزر [كنفوكل] المتصلة بالمرة". إذا كان الليزر تبيض غير كاف، يتعذر الحصول على البيانات الكمية الصحيحة بسبب تبيض غير كافية. وفي الواقع، يتعذر الحصول على اللاتناظر الأبوية من الارتخاء الكروماتين زيجوتيك مع ليزر تبيض ضعيفة. لتجنب هذا، من المستحسن للتحقق من ما إذا كانت قوة الليزر أضعفت كما ينشأ بهذه المناسبة. في هذه الدراسة، 110-µW تبيض كان كافياً للحصول على الوالدين عدم التناظر.
يمكن استخدام تحليل زفراب لأنواع أخرى من البروتينات، بالإضافة إلى هيستونيس الأساسية. منذ histones الأساسية إظهار التنقل تدني مكانة بارزة، يعد إجمالي وقت الملاحظة (حوالي 25 ثانية في هذه الدراسة) مطلوب في التحليل زفراب. ولذلك، لتحليل عدد كبير من زيجوتيس، استزراع في وسائل الإعلام حبيس مخزنة على السخان لفترة طويلة أمر لا مفر منه. من ناحية أخرى، لتحليل البروتينات قدرة عالية على الحركة زفراب، وقت الملاحظة مجموع يمكن تعيين قصيرة، مما يتيح الوقت لاستزراع في وسائل الإعلام حبيس مخزنة على سخان إلى أن تكون قصيرة. ولذلك، يبدو منذ التعرض الطويل للبيئة خارج الحاضنة مضر جداً لتطوير جنينية، تحليل زفراب للبروتينات خلاف histones الأساسية، التي لها قدرة عالية على الحركة بحكم طبيعتها، لإظهار أقل سمية من هيستونيس الأساسية . من المأمول أن يساعد هذا النظام التجريبي مواصلة التحقيق في العلاقات بين مختلف الأحداث الجزيئية والتنمية الجنينية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونشكر ساتوشي كيشيجامي، واكاياما ساياكا، هيرواكي ناغاتومو، كاميمورا ساتوشي، وكانا كيشيدا لتوفير الدعم التقني والتعليقات الانتقادية. تم تمويل هذا العمل جزئيا بالبرنامج وزارة التربية والتعليم، والثقافة والرياضة، والعلوم والتكنولوجيا لتعزيز الإصلاح للجامعات الوطنية إلى مو؛ الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (16 ح 02593) ومؤسسة العلوم اسادا ومؤسسة العلوم وتاكيدا ل T.W. وكان الممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات والتحليل، وقرار نشر أو إعداد المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal laser scaning microscope | Olympus | FV1200 | FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7) |
| Thermo plate | Tokai Hit | TP-110RH26 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Micro manupilator | Narishige | MMO-202ND | |
| Pieze Micro Micromanipulator | Prime tech | PMAS-CT150 | |
| 35 mm culture dish | Falcom | 351008 | 35 x 100 mm style; for IVF |
| 60 mm culture dish | Falcom | 351007 | 60 x 15 mm style; for embryo culture |
| 50 mm culture dish | Falcom | 351006 | 50 x 9 mm style; for manipulation on the stage |
| 50 mm glass bottom dish | Matsunami | D910400 | 50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis |
| Mineral oil | Organic spceiality chemicals | 625071 | For FRAP analysis on the glass bottom dishes |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | For IVF and embryo culture |
| glass capillary | Drummond | 1-000-1000 | For handling mouse zygotes |
| Borosilicate glass | Prime tech | B100-75-10-PT | For microinjection of mRNA |
| Micropipett puller | Sutter instrument | P-97/IVF | For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm) |
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit | Thermo Fisher scientific |
AM1340 | |
| Poly (A) tailing kit | Thermo Fisher scientific |
AM1350 | |
| PVP solution 10% (PVP-HTF) | IrvineSceientific | 99311 | HEPES buffered HTF containing 10% PVP |
| Sodium HEPES | Sigma | H3784 | |
| pTOPO eGFP-H2B | Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6) | ||
| NorthernMax Gly Sample loading Dye | Thermo Fisher scientific |
AM8551 | For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA |
| Phenol chloroform isamyl alcohol | nacalai tesque | 25970-14 | |
| Chloroform | nacalai tesque | 08401-65 | |
| Not I | TOYOBO | NOT-111X | |
| Ethachinmate | WAKO | 318-01793 | |
| 3664 Otical power meter | Hioki | 3664 | Power meter for laser power |
| Stereomicmicroscope | Olympus | SZX16 |
References
- Burton, A., Torres-Padilla, M. E. Epigenetic reprogramming and development: a unique heterochromatin organization in the preimplantation mouse embryo. Brief Funct Genomics. 9, 444-454 (2010).
- Okada, Y., Yamaguchi, K. Epigenetic modifications and reprogramming in paternal pronucleus: sperm, preimplantation embryo, and beyond. Cell Mol Life Sci. 74, 1957-1967 (2017).
- Ooga, M., Fulka, H., Hashimoto, S., Suzuki, M. G., Aoki, F. Analysis of chromatin structure in mouse preimplantation embryos by fluorescent recovery after photobleaching. Epigenetics. 11, 85-94 (2016).
- Meshorer, E., et al. Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells. Dev Cell. 10, 105-116 (2006).
- Boskovic, A., et al. Higher chromatin mobility supports totipotency and precedes pluripotency in vivo. Genes Dev. 28, 1042-1047 (2014).
- Yamagata, K., Ueda, J. Long-term live-cell imaging of mammalian preimplantation development and derivation process of pluripotent stem cells from the embryos. Dev Growth Differ. 55, 378-389 (2013).
- Ooga, M., Wakayama, T. FRAP analysis of chromatin looseness in mouse zygotes that allows full-term development. PLoS One. 12, e0178255 (2017).
- Quinn, P., Begley, A. Effect of human seminal plasma and mouse accessory gland extracts on mouse fertilization in vitro. Australian journal of biological sciences. 37, 147-152 (1984).
- Chatot, C. L., Lewis, J. L., Torres, I., Ziomek, C. A. Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium. Biology of reproduction. 42, 432-440 (1990).
- Bae, J., Sung, B. H., Cho, I. H., Song, W. K. F-actin-dependent regulation of NESH dynamics in rat hippocampal neurons. PLoS One. 7, e34514 (2012).
- Dieteren, C. E., et al. Defective mitochondrial translation differently affects the live cell dynamics of complex I subunits. Biochim Biophys Acta. 1807, 1624-1633 (2011).
- Subramanian, V., et al. H2A.Z acidic patch couples chromatin dynamics to regulation of gene expression programs during ESC differentiation. PLoS Genet. 9, e1003725 (2013).
- Hayashi-Takanaka, Y., et al. Tracking epigenetic histone modifications in single cells using Fab-based live endogenous modification labeling. Nucleic Acids Res. 39, 6475-6488 (2011).
- Yamazaki, T., Yamagata, K., Baba, T. Time-lapse and retrospective analysis of DNA methylation in mouse preimplantation embryos by live cell imaging. Dev Biol. 304, 409-419 (2007).
- Puschendorf, M., et al. PRC1 and Suv39h specify parental asymmetry at constitutive heterochromatin in early mouse embryos. Nat Genet. 40, 411-420 (2008).
