Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Zygotic fluorescentie herstel na het ontkleuren aangebracht van foto analyse voor chromatine losheid waarmee voldragen ontwikkeling

doi: 10.3791/57068 Published: June 12, 2018

Summary

Chromatine losheid lijkt te worden betrokken in het ontwikkelings potentieel van blastomeren. Het is echter niet bekend of chromatine losheid kan worden gebruikt als een betrouwbare index voor de ontwikkelings potentieel voor embryo's. Hier, is een experimenteel systeem waarin chromatine losheid-geëvalueerd zygoten tot volledige termijn ontwikkelen kunnen beschreven.

Abstract

Levende imaging is een krachtig hulpmiddel waarmee voor de analyse van de moleculaire gebeurtenissen die tijdens de ribben. Onlangs, chromatine losheid of openheid is aangetoond te worden betrokken in het potentieel van de celdifferentiatie van pluripotente embryonale stamcellen. Eerder werd gemeld dat in vergelijking met embryonale stamcellen, zygoten haven een uiterst losgedraaide chromatine-structuur, die haar relatie met hun totipotent duiden. Echter, tot nu toe, het niet is beantwoord of de structuur van deze uiterst losgemaakt/open chromatine belangrijk voor de embryonale ontwikkelings potentieel is. In de huidige studie, om te onderzoeken van deze hypothese, werd een experimenteel systeem welke zygoten die werden geanalyseerd door fluorescentie herstel na foto-bleken zich tot termijn zonder significante schade ontwikkelen kan ontwikkeld. Nog belangrijker is, moet dit experimenteel systeem alleen een kachel van thermos-plaat naast een confocale laser scanning microscoop. De bevindingen van deze studie suggereren dat herstel van de fluorescentie na foto-bleken analyse (FRAP) analyse kan worden gebruikt om te onderzoeken of de moleculaire gebeurtenissen in zygotic chromatine belangrijk voor de ontwikkeling van de voldragen zijn.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Na de bevruchting, de structuur van de chromatine is dynamisch gewijzigd en zygotic chromatine structuur is dan uiteindelijk gevestigde1,2. Tijdens deze periode, in de vaderlijke pronuclei, is de dominante chromatine proteïne veranderde van tijdje in Histon. De resulterende chromatine is zeer verschillend van die van sperma en eicellen van de vrouw in verschillende punten (bijvoorbeeld, histone variant samenstelling, histone wijziging). Aldus wordt gevormde zygotic chromatine gezien als belangrijk voor de latere ontwikkeling van het embryo. Echter, ondanks pogingen om de details van de structuur van de chromatine zygotic onthullen over lange periodes, methoden voor de beoordeling van de kwaliteit van zygoten of te voorspellen hun voldragen ontwikkeling in het stadium van een cel door het analyseren van de structuur van de chromatine nooit geweest opgericht.

In de vorige studie, is het ontdekt dat zygoten een uiterst losgedraaide chromatine structuur3 hebben. Op dit moment de losheid van de chromatine of openheid wordt verondersteld te zijn een belangrijke factor voor celdifferentiatie potentieel in embryonale stamcellen (ES) cellen4. ES-cellen homogeniteit in de natuur geen vertonen, maar zijn nogal heterogene; in de kolonies van de cel van de ES verwerven sommige Transient een hogere differentiatie mogelijkheden vergelijkbaar met blastomeren van twee cellen fase embryo's. Tijdens deze overgang in de twee-cel als staat cellen chromatine losheid in ES verandert in wat vergelijkbaar met twee-cel fase embryo's5 is. Zo lijkt de chromatine losheid van belang voor celdifferentiatie potentieel en het is mogelijk dat uitgebreid open chromatine in zygoten is handig voor de evaluatie van zygotic ontwikkelings potentieel.

Levende imaging is een krachtig hulpmiddel waarmee voor de analyse van de moleculaire gebeurtenissen die tijdens de ribben omdat deze methode geschikt is voor verdere ontwikkeling en zelfs voldragen ontwikkeling6. Als een van de levende imaging methoden, is FRAP analyse gebruikt om te onderzoeken van de chromatine losheid in voor inplanting embryo's en ES cellen3,4,5. Als zygotic chromatine losheid kan worden geanalyseerd zonder een schadelijk effect op voldragen ontwikkeling door FRAP analyse, kan het zijn een waardevol instrument voor de beoordeling van de kwaliteit van de embryo's in het stadium van de één-cel. Echter zijn de effecten op voldragen ontwikkeling door deze experimentele methode niet onderzocht. Onlangs, een experimenteel systeem met behulp van FRAP te evalueren zygotic chromatine losheid werd ontwikkeld. Omdat dit een nieuwe waarnemingssysteem voor zygoten was, werd het genoemd als zygotic FRAP (zFRAP). zFRAP beïnvloedde niet kritisch voldragen ontwikkeling en is elders7gemeld. In dit verslag, wordt het protocol voor deze experimentele methode beschreven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Deze studie werd uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de gids voor de zorg en het gebruik van de dieren van het laboratorium van de Universiteit van Yamanashi. Het protocol is goedgekeurd door de Commissie op de ethiek van dier experimenten van de Universiteit van Yamanashi (toestaan nummer: A24-50). Alle operaties werden uitgevoerd onder tribromoethanol narcose en inspanningen werden geleverd om het leed te minimaliseren. Een geïllustreerd overzicht van de procedures en het tijdschema worden weergegeven in Figuur 1 en tabel 1, respectievelijk.

1. voorbereiding van de boodschapper-RNA (In Vitro transcriptie van mRNA eGFP-H2B)

  1. Linearize 5 µg sjabloon DNA pTOPO-eGFP-H2B3,7 met 30 U van niet ik in 50 µL bij 37 ° C's nachts.
  2. Verzamelen 1.5 µL van verteerd DNA voor bevestiging of volledig verteerd door elektroforese.
    1. Toepassing 1.5 µL en 3-5 µL van onverteerd DNA met laden kleurstof naar de waterput van 2% agarose gel, respectievelijk, en onder voorbehoud van elektroforese.
      Opmerking: Als volledig verteerd, een enkele band (ca. 5 kb) wordt waargenomen. Onverteerd DNA wordt gebruikt als een besturingselement, die wordt weergegeven op een andere positie.
  3. Voeg 151.5 µL van ddH2O en 200 µL van fenol/chloroform/Isoamylalcohol (25:24:1) naar de resterende verteerd DNA.
    1. Meng krachtig door vortex.
    2. Centrifugeer bij de maximale snelheid gedurende 15 minuten.
  4. Herstellen van het supernatant en voeg vervolgens 200 µL van chloroform.
    1. Meng krachtig door vortex.
    2. Centrifugeer bij maximale snelheid gedurende 15 minuten.
  5. Herstellen van het supernatant en voeg vervolgens 20 µL van 3M natriumacetaat en 1,5 µL van ethachinmate.
    1. Meng krachtig door vortex.
    2. Voeg 550 µL van 100% ethanol en meng krachtig door vortex.
    3. Centrifugeer bij maximale snelheid gedurende 15 minuten.
    4. Verwijder het supernatant en daarna wassen de pellet met 70% ethanol.
    5. Droog de pellet door verdamping voor 5-10 min.
  6. Ontbinden geprecipiteerde plasmide DNA in 8 µL van nuclease-gratis water.
  7. Beoordelen van de plasmide concentratie (verwachte concentratie is ongeveer 300-500 ng/µL) met nanodrop volgens instructie van de fabrikant.
  8. In vitro transcriptie voor mRNA eGFP-H2B met 1 microgram van gezuiverde DNA codering als een sjabloon in 20 µL van totale reactie volume door het volgen van de instructies van de fabrikant uitvoeren.
    1. Na in vitro transcriptie, 36 μL van water toevoegen en vervolgens herstellen 1.5 µL van 56 µL van gesynthetiseerde mRNA voor analyse door elektroforese (zoals zonder poly A).
  9. Poly A tailing voor gesynthetiseerde mRNA in een 100 µL reactie volume uitvoeren door het volgen van de instructies van de fabrikant.
  10. 60 µL van lithium chloride neerslag oplossing toevoegen aan de poly een staart mRNA van eGFP-H2B en meng het krachtig.
    1. Cool op-30 ° C gedurende 30 minuten.
    2. Centrifugeer bij maximale snelheid gedurende 15 minuten.
    3. Verwijder het supernatant en daarna wassen de pellet met 70% ethanol.
    4. Droog de pellet door verdamping voor 5-10 min.
  11. De pellet met 20 µL nuclease-gratis water oplossen door te verwarmen bij 55 ° C gedurende 30 minuten.
  12. De concentratie van de neergeslagen mRNA met nanodrop beoordelen. Verdun tot 500 ng/µL met nuclease-gratis water en winkel bij-80 ° C tot gebruik.
  13. Bevestigen van voorkeur mRNA productie; onderwerp 1 µL van mRNA met/zonder (verkregen in 1.8.1 en 1.12 stappen, respectievelijk) poly een staart gemengd met 1,5 µL van ethidiumbromide 0,1 mg/mL en 3 µL van monster laden kleurstof de elektroforese analyse. Toegepaste volume was 5.5 µL.
    Opmerking: Indien Poly A tailing succesvol was, de verschoven band in vergelijking met het mRNA zonder poly een tailing moet worden in acht genomen (figuur 2A).

2. bereiding van Vasectomized mannelijke muizen

  1. Weeg de ICR mannelijke muizen op 8-12 maanden met behulp van een gewicht-schaal.
  2. Intraperitoneally injecteren mannelijke muizen met 0.7 - 0,9 mL 1,2% tribromoethanol verdoving.
    Nota: Het bedrag van de verdoving is afhankelijk van de grootte van de muis. Bijvoorbeeld wordt een muis met een gewicht van 40 g geïnjecteerd met 0,8 mL tribromoethanol verdoving.
  3. Natte de BES met 70% ethanol.
  4. Het maken van een klein gesneden (3-5 mm) op de Bes en maak vervolgens een sneetje op de muur van de spier met behulp van schaar.
    Opmerking: Schaar en pincet moeten worden gereinigd met 70% ethanol vóór het begin van de operatie.
  5. Greep van een vet pad met een tang en trek het voorzichtig uit. Vervolgens weergegeven de testis en zaadleiders.
    Opmerking: Zaadleiders is een U-vormige buis en met een rode bloedvat.
  6. Tie uit de zaadleiders op twee punten met chirurgische hechtingen en vervolgens uitknippen de middelste deel tussen de verbonden punten.
  7. Duw voorzichtig terug de vet pad en de testis in de bessen.
    1. Herhaal de operatie met de resterende testis.
  8. Naai de spier muur met twee steken met chirurgische hechtdraad.

3. IVF

  1. Injecteren van 8 - 10 - weken oude vrouwelijke B6D2F1 (BDF1) muizen intraperitoneally met 7,5 IU paarden choriongonadotrofine (eCG) en humaan choriongonadotrofine (hCG) 46-50 h tussenpozen.
  2. Druppels 300 µL menselijke tubal vloeistof (HTF)8 media voorbereiden op rechtsbevoegdheid en inseminatie 1 dag vóór IVF in een schotel van 30 mm, dekken deze druppels met de minerale olie op de Bank laboratorium en daarna preincubate in een incubator's nachts.
  3. Offeren gerijpte mannelijke ICR muizen door cervicale dislocatie. Ontleden cauda bijbal met een 27-G naald en zaadcel verzamelen. Cultuur ze voor rechtsbevoegdheid in 300 µL van HTF media voor 1-2 h bij 38 ° C.
  4. 16 uur na de hCG-inspuiting, offeren super algemeen vrouwelijke muizen door cervicale dislocatie. Breng de ampul oviduct in minerale olie naast HTF media en vervolgens trekken uit cumulus cellen en eicellen complexe deze oviduct ampul door een 30-G naald in het gepreïncubeerd inseminatie-HTF medium.
    Opmerking: Sommige vrouwelijke muizen vertonen vaak geen eisprong ondanks super ovulatie behandeling. Uitgebreide oviduct ampul is een teken van de eisprong.
  5. Pipetteer 2-3 µL van het capacitated zaadcel in inseminatie-HTF media waarin de ovulated eicellen werden verzameld na rechtsbevoegdheid.
  6. 1 h na inseminatie, verzamelen de bevruchte zygoten en behandel hen met hyaluronidase bij 100 µg/mL gedurende 10 minuten in CZB9 media.
    Opmerking: Wanneer inseminatie wordt naar behoren uitgevoerd, 1 h na inseminatie, de bevruchte zygoten met het lichaam van de polar 2nd in acht worden genomen. Als minder of lage kwaliteit sperma wordt gebruikt, worden slechts weinig zygoten met het lichaam van de polar 2nd waargenomen. Ook, als vele zaadcellen worden gebruikt voor de inseminatie, polyspermy optreedt. Juiste inseminatie leidt tot zygoten met mannelijke en vrouwelijke pronuclei. Met behulp van deze criteria, is het mogelijk om te vinden of inseminatie wordt gedaan goed of niet.
    1. Na het wassen in CZB media, onverminderd de de zygoten met een tweede polar lichaam microinjection met eGFP-H2B mRNA.

4. voorbereiding van de kamer en Microinjection pipetten

  1. Verdun RNA eGFP-H2B met behulp van water nuclease-gratis te verkrijgen van een concentratie van 250 ng/µL-codering.
  2. Bereiden van 2-3 druppels PVP-HTF eGFP-H2B druppels mRNA en 5-6 druppels Hepes gebufferd CZB (H-CZB) druppels op de schotel van 60 mm. Betrekking hebben op deze druppels met minerale olie.
    Opmerking: Deze preparaten kunnen worden uitgevoerd op de laboratorium-Bank. Er is geen vereiste voor het gebruik van laminaire luchtstroming kabinet.
  3. Borosilicaat glas met een micropipet-trekker trek (bijvoorbeeld, P = 500, warmte = 825, pull = 30, vel = 120, en tijd = 200)
  4. Na het breken buig het uiteinde van de pipet, de getrokken glazen microinjection pipet dicht bij de tip (−300 terug µm) op ongeveer 30 °, met behulp van een microforge.

5. microinjection

  1. De plaat kachel uitschakelen op het podium van micromanipulator om te voorkomen dat het doden van de zygoten met een piëzo tijdens mRNA injectie.
  2. Wassen en de binnenkant van de injectie naalden in HEPES-buffer-HTF jas met 10% PVP (PVP-HTF).
  3. De bevruchte zygoten met een 2nd polar lichaam (figuur 2B) verzamelen en overbrengen van 20-25 zygoten op de kamer van het stadium van de Microscoop vastgehecht door middel van een micromanipulator.
  4. Vul de verdunde eGFP-H2B mRNA in borosilicaatglas haarvaten van de tips.
  5. Houd de zygote met een pipet bedrijf en verbreekt u daarna de zona zitten en het cytosolische membraan met een piëzo-aandrijving.
  6. Injecteren van ongeveer 10 pL van mRNA in het cytoplasma van de zygoten. Afwerking mRNA-injectie binnen 10 min ter voorkoming van schade veroorzaakt door langere kweken de zygoten buiten de incubator.
    Opmerking: Het geïnjecteerde volume moet zo groot zijn als het lichaam van de polar 2nd . Als het bedrag van mRNA geïnjecteerd te groot is, is het mogelijk tot de gratis eGFP-H2B breuk, die gevolgen voor de mobiele breuk hebben kan.
  7. 10 min na microinjection, wassen in ten minste 3 druppels en cultuur dan de ingespoten zygoten in CZB bij 38 ° C tot zFRAP analyse.

6. zFRAP analyse

  1. 1 uur vóór de zFRAP analyse, zet de laser en de hete plaat gekoppeld aan de fase van de confocal microscoop. Stel de temperatuur van 38 ° C.
  2. Zet 6-10 µL van CZB HEPES-buffer media bedekt met minerale olie op de 60-mm glas onder schotel en warm op de kachel tot zygote collectie.
  3. 8 - 12 uur na de inseminatie, verzamelen 5-10 zygoten eGFP-H2B-uiten en overdracht in 6-10 µL van vooraf verwarmd HEPES-buffer CZB middellange drop.
    Opmerking: Om te vermijden langer culturing buiten incubator, 5-10 eGFP-H2B-uiten zygoten werden gebruikt bij elke analyse. 5 tot 10 zygoten kunnen binnen 1 uur worden geanalyseerd.
  4. Stel de bleken en imaging voorwaarden volgens de instructies van de fabrikant. Het geval een confocale laser scanning microscoop (Tabel of Materials) wordt hieronder weergegeven:
    1. Gebruik 60 X olie lens (60 X 60 X / 1.35 olie).
      Opmerking: Lenzen met hogere vergroting (hogere numerieke diafragma) Toon hogere gevoeligheid.
    2. Stel scansnelheid als 4.0 µs/Pixel grootte als "512" op "Overname instelling" (aanvullende figuur 1).
    3. Verhoging van de digitale zoom op "5" (aanvullende figuur 1).
      Opmerking: Een hogere zoom is vereist om te herkennen of focus drift wordt gebruikt of niet.
    4. Open lijst met kleurstof (aanvullende figuur 1) en vervolgens koos "EGFP". Observatietijdstip instellen als 1.6 s (interval is ingesteld als de instelling van de "vrije termijn") (aanvullende figuur-1)
      Opmerking: Meer waarnemingspunten kunnen veroorzaken meer gedetailleerde gegevens, maar het kan ook leiden tot fototoxiciteit. In de analyse van de zFRAP lijkt een 1.6 s-observatietijdstip genoeg om te ontdekken de ouderlijke asymmetrie van chromatine losheid.
    5. Het aantal foto's instellen als 12 in totaal (aanvullende figuur 1).
    6. Start van "Stimulus instelling" paneel en klik op "Main" op UseScanner. Scansnelheid als 10.0 µs/Pixel instellen Klik op "Activeren in de reeks" en stel PreActivation als "3 frames" en activering tijd als "5 sec" (aanvullende figuur 1).
    7. Klik op "Focus x 2" en de focus vervolgens 'Stop'.
    8. Bleken en imaging laser macht (477 nm) op 110 en 15 μW, respectievelijk door aanpassen "laser gage macht" (aanvullende figuur 1).
      Opmerking: Zeer sterke bleken een grotere gebleekte gebied, waardoor moeilijkheden voor de kwantitatieve analyse kan veroorzaken. Gebruiken voor het meten van de kracht van de laser, een Energiemeter. Het is belangrijk om te bevestigen de kracht van de laser om te voorkomen dat het effect van de tijdsgebonden verslechtering van de kracht van de laser.
    9. Klik op "Clip Rect" (aanvullende figuur 1) in Stimulus instelling Configuratiescherm. Instellen van de regio van belang (ROI; rood; ROI #1B) als 40 x 40 pixels (7.6 µm2). Bereiden van een referentie-regio (REF; groen; ROI #2), en een achtergrond (BG; blauw; ROI #3) met behulp van "Kopieer ROI" en "plak ROI" (Klik met de rechtermuisknop knop op de muis).
      Opmerking: Pixelgrootte kan worden ingesteld via "ROI-manager", die kan worden aangeroepen door te klikken op de rechterknop van de muis wanneer de cursor zich op de ROI. Grotere ROIs worden verondersteld beter te zijn aangezien zij de spreiding van de zFRAP-score kunnen standaardiseren. Worden echter te groot voor een ROI kan niet gebruikt voor deze analyse omdat het maakt het moeilijk om te voorkomen dat het lichaam voorloper nucleolus (NPB). eGFP-H2B in dit compartiment was dacht vrij te zijn van de chromatine en toonde opmerkelijke hogere mobiliteit3. ROI en REF gebieden moeten zoveel mogelijk worden gescheiden. Als deze twee regio's nauwe, bleken kan ook invloed op de regio van REF.
    10. Klik op "Live" op de werkbalk en start "Live Plot" (aanvullende figuur 1).
      Opmerking: Live plot geeft de signaalsterkte fluorescentie binnen elke ROI en wordt gebruikt voor het aanpassen van de kracht van de laser met behulp van HV. Merk op dat als ROI is niet ingeschakeld, geen intensiteit zou worden gevonden op Live perceel paneel.
    11. Bepalen van de positie van de ROI
      Opmerking: ROI kan worden verplaatst door te slepen naar de gewenste positie in pronuclei. (1) zijn zeker te vermijden de nucleolus (2) de hele ROI past door de nucleoplasm. Bevatten niet de regio buiten het gebied van het kernmembraan (cytoplasma) in ROI. De lokalisatie van eGFP-H2B is zeer beperkt in de nucleoplasm, zodat is het gemakkelijk te vinden of ROI cytoplasma bevat of niet door de fluorescentie van eGFP-H2B. Mannelijke pronuclei zijn doorgaans groter dan die van vrouwtjes, die vaak zijn gelokaliseerd in de buurt van het lichaam van de polar 2nd . Keurmeester tijdens het gebruik van deze criteria, de mannelijke of vrouwelijke pronuclei.
    12. Klik op "Focus x 2" (aanvullende figuur 1) en pas vervolgens de HV macht gage van het kanaal voor EGFP in intensiteit van de fluorescentie naar ongeveer 2000 (intensiteit van de fluorescentie te zien in het venster "live plot").
  5. Klik op "Tijd" en vervolgens "XY" (aanvullende figuur 1) om te beginnen met de analyse van de zFRAP.
    Opmerking: Als "Tijd" knop is voldoende geselecteerd, "t" verschijnt op de knop "XY".
    1. Klik op "Reeks gedaan" (aanvullende figuur 1), dat verschijnt nadat FRAP beeldvorming in de buurt van de "XY button" en dan het verkrijgen van gegevens FRAP-geanalyseerd.
    2. Sla het bestand "2D weergave-Image XXXXX" als een voorkeur benoemde bestand (file format oib.) door "opslaan als" (Ctrl + Shift + S kan ook worden gebruikt).
    3. ROI, REF en BG selecteren en klik vervolgens op (Ctrl + A kan ook worden gebruikt) "Serie Analysis" in "2D weergave" afbeeldingsvenster.
    4. FRAP rijgegevens verkrijgen en klik op "opslaan" knop in het venster live plot.
      Opmerking: Rij FRAP kwantitatieve gegevens wordt opgeslagen als een CSV-bestand.
  6. Geen controle van de zFRAP, plaatst enkele van de zygoten ingespoten met mRNA op de daling, die in de buurt van de rand van het glas onder gerechten om te voorkomen dat het effect van fluorescentie observatie.

7. gegevens berekening

  1. Tijdens het gebruik van maken de verkregen kwantitatieve gegevens, de grafiek van de "herstel curve" en "mobiele fractie" door Excel zoals in de verwijzingen3,7 , met enkele wijzigingen (zie hieronder en aanvullend excel-bestand).
  2. Bereken de relatieve intensiteit door de waarde voor BG van die van ROI en REF in 12 afbeeldingen voor elk punt van de tijd af te trekken.
  3. Deelt u de waarde van ROI door die van de REF. Dientengevolge, kunnen 12 gestandaardiseerde relatieve intensiteit scores op elk tijdstip worden verkregen.
  4. Bereken het gemiddelde van de relatieve score voor ROI in 3 beelden genomen voordat foto bleken.
  5. Berekenen van de terugvinding. Verdeel die de 12 verkregen relatieve scores voor ROI in de foto's genomen op elk punt van de tijd (verkregen op 7.1.2.) door het gemiddelde van de relatieve score voor foto bleken (verkregen op 7.1.3.). Herstel curve met behulp van deze scores tekent (figuur 2E).
  6. Bereken het bleken percentage.
    Opmerking: Bleken percentage (%) = 100 - opbrengst van 4th afbeelding.
  7. De mobiele breuk (MF) berekenen met behulp van de formule als volgt10,11,12
    MF (%) = 12th terugvinding (op het eindpunt) - 4th terugbezorgd / bleken tarief × 100.

8. de embryotransfer

  1. Metgezel gerijpte ICR vrouwtjes op 8-12 maanden met vasectomized mannelijke ICR muizen de nacht voordat de embryotransfer door hen worden in de dezelfde kooi 's nachts te laten.
  2. Het verzamelen van de embryo's die werden zFRAP-geanalyseerd en vastbesloten om te ontwikkelen tot de fase twee-cel.
  3. Intraperitoneally injecteren vrouwelijke muizen met 0.7 - 0,9 mL 1,2% tribromoethanol anesthesie of met 0.35 - 0,45 mL 0.75/4/5mg/kg medetomidine/midazolam/Butorfanol gemengde agenten voorafgaand aan de embryotransfer.
    Opmerking: Het volume van de verdoving wordt bepaald door het lichaamsgewicht van muizen. Tribromoethanol: 0,2 mL/10 g van het lichaamsgewicht; Medetomidine/midazolam/Butorfanol gemengd agenten: 0,1 mL/10 g van het lichaamsgewicht.
    1. Breng deze twee-cel fase embryo's in de oviducts van pseudopregnant vrouwelijke ICR muizen met een vaginale stekker aan 0.5 dagen post coitum (dpc).
    2. Na de embryotransfer, door de vrouwelijke muizen te zetten door de kachel ingesteld bij 37 ° C totdat ze wakker worden.
  4. 18.5 dpc, offeren de surrogaat-moeder door cervicale dislocatie en herstellen van de pups zygoten zFRAP-geanalyseerd door keizersnede afgeleid. Enkele van de teruggekregen pups werden geleverd aan de pleegmoeder en hun lichaam gewichten per week werden beoordeeld.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

zFRAP analyse met eGFP-H2B

MRNA codering eGFP-H2B, die wordt gezien als een verschoven band door poly een tailing (figuur 2A veroorzaakt), goed geproduceerd en werd geïnjecteerd in het cytoplasma van zygoten met een 2e polar lichaam 1-3 uur na inseminatie (figuur 2B). Acht tot 12 uur na de inseminatie, zygoten met 2 pronuclei tonen de expressie van eGFP-H2B werden verzameld en onderworpen aan zFRAP analyse (figuur 2C). De FRAP analyse bestaat uit bleken en herstel stappen. Op de vooraf bleken fase, het signaal van eGFP-H2B kon worden waargenomen (figuur 2D-1), maar zodra gebleekt, het signaal daalde tot een te verwaarlozen niveau (figuur 2D-2). Als bleken succesvol was, wordt een donker gat zo groot als de ROI verscheen kort na het bleken. Na het ontkleuren aangebracht, de intensiteit van het signaal van de fluorescentie eGFP-H2B hersteld iets; de fluorescerende signaal stapsgewijs verhoogd vanwege de instroom van de ongebleekte breuk van eGFP-H2B in de ROI uit de ongebleekte gebied in het nucleoplasm (figuur 2D-3). Voor de bevestiging van het succes van zFRAP analyse van chromatine losheid, is het aanbevolen om gebruik van ouderlijke asymmetrie van chromatine losheid; mannelijke pronuclei toonde een sneller herstel curve en mobieler breuken dan die van vrouwtjes (figuur 2E en F). Na zFRAP analyse, gewassen en gekweekte zygoten CZB media, kunnen ontwikkelen tot het blastocyst-stadium zonder significante schade (Figuur 2 g en H). Zelfs als sterk gebleekt voor een langere tijd, kon de zygoten nog uitgroeien tot het blastocyst stadium ook7.

Analyse van de ontwikkeling van de voldragen van zFRAP-geanalyseerd zygoten

Om te analyseren de voldragen-ontwikkeling van embryo's afgeleid van zFRAP-geanalyseerd zygoten, werden de embryo's in de twee-cel stadium overgedragen in het oviducts van pseudopregnant moeders. Als besturingselementen, werden intact embryo's, en een geïnjecteerd met mRNA maar niet zFRAP-geanalyseerd voorbereid. Het geboortecijfer van embryo's zFRAP-geanalyseerd (41,0%) enigszins was aanzienlijk lager dan die van intact embryo's (62,2%), maar was hetzelfde als die van de geen controle van de zFRAP (52,6%) (Tabel 2). ZFRAP-analyse lijkt dus enigszins afbreuk gedaan aan voldragen embryonale ontwikkeling. Maar nog belangrijker is, de pups afgeleid van zFRAP-geanalyseerd zygoten leek gezond en volledig ontwikkeld (Figuur 3).

Figure 1
Figuur 1: Een schematische illustratie van de stroom van de procedures voor de experimenten. In vitro bevruchting: vers verzameld metafase II (MII) eicellen werden geïnsemineerd met sperma van de capacitated. In vitro transcriptie: boodschapper-RNA (mRNA) codering eGFP-gesmolten Histon H2B (eGFP-H2B) werden getranscribeerd van de SP6 promotor van de gelineariseerde pTOPO-eGFP-H2B3 met niet ik. De eGFP-H2B mRNA onderworpen poly A tailing waarna zuivering. De gezuiverde eGFP-H2B mRNA wordt gebruikt in mRNA injectie. mRNA injectie: de bereid eGFP-H2B mRNA wordt ingespoten in het cytoplasma van de zygoten met 2nd polar lichaam. zFRAP analyse: de eGFP-H2B-uiten zygoten werden onderworpen aan zFRAP analyse. De regio van belangen (ROI; rode rechthoek) was gebleekt met een sterke laser en vervolgens het signaal eGFP-H2B daalde tot een te verwaarlozen niveau. Na het ontkleuren aangebracht, de intensiteit van het signaal van eGFP-H2B geleidelijk opgetrokken. In vitro ontwikkeling: Na analyse van de zFRAP, kon de zygoten uitgroeien tot het blastocyst-stadium. Embryotransfer: stadium twee-cel, de zFRAP-geanalyseerd embryo's in de oviducts van pseudopregnant vrouwelijke muizen werden overgebracht. 18 dagen later, gezonde levende pups kon worden verkregen uit embryo's zFRAP-geanalyseerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: zFRAP analyse van zygoten met eGFP-H2B. (A) representatief beeld van goed voorbereide mRNA door in vitro transcriptie en poly A tailing. Lane 1: pre poly een tailing; Lane 2: poly A tailing post. (B) mRNA codering eGFP-H2B werd geïnjecteerd in het cytoplasma van zygoten met een 2nd polar lichaam 1-3 h post inseminatie (hpi). Schaal bar = 25 µm (C) eGFP-H2B-uiten zygoten werden verzameld op 8-12 hpi. Witte sterretjes Toon nucleolus voorloper organen (NPB). Schaal bar = 10 µm (D) eGFP-H2B expressie werd ontdekt in de gehele nucleoplasm zelfs in NPB in het vooraf bleken stadium (D-1), spoedig na het ontkleuren aangebracht (D-2), en na herstel (D-3). De nucleaire membranen (witte stippellijnen) en de NPB (sterretjes) worden vermeld. Schaal bar = 10 µm. (E, F) herstel curve en mobiele breuken 45 zygoten in 5 onafhankelijke experimenten werden verkregen. Geven respectievelijk aan mannelijke en vrouwelijke, blauw en rood. In herstel curven geven één cirkels het meetpunt. In de scatter percelen, enkele punten aangeven de score van mobiele breuken verkregen pronuclei. (G) representatieve beelden van de inplanting ontwikkeling van zFRAP-geanalyseerd zygoten worden getoond. Twee-cel, cel 4-8, en de blastocyst stadium embryo's bij 24, 48 en 96 hpi, respectievelijk. De gele cirkel geeft aan de goed ontwikkelde blastocyst. Deze blastocyst is vergroot en getoond op het juiste paneel. Schaal bar = 100 µm. (H) staafdiagram van ontwikkelingsstoornissen tarieven van embryo's zFRAP-geanalyseerd. Bars geven zFRAP-geanalyseerd (zFRAP) embryo's (wit) en controle van de embryo's (zwart) ingespoten met mRNA maar geen analyse van de zFRAP (geen zFRAP). Gegevens getoond worden uit drie onafhankelijke experimenten, onderzoeken ten minste 57 embryo's in totaal. Twee-cel, 4-8 cel morula (Mo) en stadia van de blastocyst (Bl) werden waargenomen bij 24, 48, 72 en 96 hpi, respectievelijk. Dit cijfer is gewijzigd van [Ooga et al. 2017]7. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: de gezonde groei van de pups is afgeleid van de zygoten FRAP-geanalyseerd. (A) de foto's van pups afgeleid van zFRAP-geanalyseerd zygoten worden weergegeven. (B) normale groei werd waargenomen tijdens de verzorging van de pups zFRAP-geanalyseerd. (C) de grafiek geeft aan dat het gewicht van de pups is afgeleid van intact embryo's (blauw), ongebleekt controle embryo's (rood), en zFRAP-geanalyseerd embryo's (groen). Lichaam van de gewichten van 29 pups afgeleid van intact embryo's, 24 van neen-zFRAP embryo's, en 15 uit embryo's zFRAP-geanalyseerd in een 8-weekse periode. Door sterretjes aangegeven waarden zijn sterk afwijkt van de intact controle. Dit cijfer is gewijzigd van [Ooga et al. 2017]7. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Aanvullende figuur 1: grafische gebruikersinterface voor FRAP analyse. (A) een overzicht van de grafische gebruikersinterface bleek. (B) uitgebreide afbeeldingen voor elk venster werden getoond. (1) de overname instelling venster wordt gebruikt voor het instellen van de voorwaarde van de overname afbeelding. (2) de Stimulus instelling venster wordt gebruikt voor het instellen van de bleken voorwaarde. Dit venster kan worden geopend door te klikken op de knop op het afbeeldingsvenster acquisitie. (3) de overname Afbeeldingsinstelling venster wordt gebruikt voor de FRAP-analyse. (4) de Live View toont het huidige beeld (de huidige afbeelding verschijnt na het klikken op Focus x2 of XY knop). De rode, groene en licht blauwe rechthoeken tonen de ROI (regio van belang), REF (referentie) en BG (achtergrond), respectievelijk. (5) de 2D-weergave toont het beeld FRAP-geanalyseerd en wordt weergegeven na het klikken op de "serie gedaan" knop. In dit geval wordt een FRAP-geanalyseerd mannelijke pronucleus weergegeven als een voorbeeld. Drie rechthoeken met 8 punten geven aan dat deze regio's zijn geselecteerd. (6) the Live Plot geeft de huidige intensiteit van de fluorescentie op elk gebied. De X- en Y-assen geven tijd (ms) en de intensiteit van de fluorescentie, respectievelijk. (7) de serie analyse toont de sporen van de intensiteit van de fluorescentie op elke regio en na analyse van de reeks te klikken op het 2D weergave-venster verschijnt. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Excel bestand 1: voorbeeldgegevens en berekening van de gegevens. (Fiche 1) Een voorbeeld voor een mannelijke pronucleus is weergegeven. Nr. geeft het volgnummer van de afbeelding. De rij-intensiteiten voor elke regio (ROI, Ref en BG) waren aangegeven. (Blad 2) Een voorbeeld voor de berekening van de gegevens wordt weergegeven. Protocolnummer geeft aan de overeenkomstige plaatsen in de sectie protocol. Notities verklaren de betekenis van elke score. De numerieke formule kan worden verwezen door te klikken op de cellen. Voorbeelden van herstel curve en mobiele breuk staafdiagram worden weergegeven. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Dag -3 Dag -2 Dag -1 Dag van FRAP Dag + 1 Dag + 3 Dag + 19
mRNA voorbereiding Snijden sjabloon plasmide
(afgelopen nacht)
1). zuivering sjabloon plasmide
2). In vitro transcriptie
3). In vitro poly een tailing
4). mRNA kwaliteitscontrole door elektroforese
FRAP 1). voorbereiding van manipulatie Pipetteer en kamer
2). mRNA injectie
3). zFRAP analyse
4). berekening van herstel curve en mobiele breuk* 2
IVF en analyse van de pre-implantatieontwikkeling ECG-injectie 1). inspuiting met hCG 1). sperma rechtsbevoegdheid
2). pre-incubatie van media (HTF) 2). In vitro bevruchting
Voorbereiding van de media (HTF, CZB, H-CZB en PVP-CZB) 3). evaluatie voor inplanting ontwikkeling
Embryotransfer Voorbereiding van pseudopregnant vrouw
(paring met vasectomized man* 1)
Overdracht van 2-cel fase embryo's naar de pseudopregnant vrouw Evaluatie van het geboortecijfer
* 1: vasectomized mannelijke muis moet ten minste 2 weken vóór de paring bereid
* 2: berekening kan worden verlengd tot de volgende dag (dag + 1)

Tabel 1: tijd tabel van de experimenten. De dag van de FRAP-analyse wordt beschouwd als dag 0. de experimenten die moeten worden uitgevoerd op de respectieve dagen voor elk item zijn aangegeven.

Categorieën Nr. van ingespoten zygoten Nr. van herstelde zygoten na mRNA injectie (%) * Nr. van zygoten geanalyseerd Nr. van overgedragen Nr. van geadresseerden Nr. van pups (%) *** Gewicht van de pups (g) Nr. van transgene pups
2-cel fase embryo's (%) **
Intact - - 99 98 (99,0) 9 61 (62,2)een 1.64±0.02 n.d
Geen FRAP 420 398 (94,8) 82 78 (95,1) 7 41 (52.6)a,b 1.66±0.03 n.d
FRAP 79 78 (98,7) 7 32 (41,0)b 1.69±0.03 0
*: berekend door met Nee. van ingespoten zygoten; **: berekend door met Nee. van zygoten geanalyseerd; : berekend door met Nee. van overgedragen 2-cel fase embryo's. a, b: superscript geven significant verschil (P < 0,05). n.d: niet bepaald. Deze tabel is gewijzigd van [Ooga et al. 2017]7.

Tabel 2: het geboortecijfer van de geanalyseerde embryo's: Het ontwikkelings potentieel van de embryo's, dat was FRAP-geanalyseerd, tot voldragen werd onderzocht. Het verkregen geboortecijfer van deze embryo's wordt weergegeven. Zoals besturingselementen, intact en geen FRAP-geanalyseerd embryo's eveneens onderzocht werden. De gewichten van de pups die zijn afgeleid van deze overgebrachte embryo's worden ook weergegeven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Zoals geopenbaard in deze studie, veroorzaakt de analyse van de zFRAP geen kritische schade aan voldragen ontwikkeling, suggereert dat deze methode is een zeer nuttig instrument om te onthullen van de associatie tussen moleculaire gebeurtenissen en het embryonale ontwikkelings potentieel. Tijdens de herprogrammering, in de twee-cel als staat van ES-cellen, waardoor de differentiële potentieel van deze cellen zo hoog als die van twee cellen fase embryo's wordt, verandert chromatine losheid in die vergelijkbaar zijn met twee-cel fase embryo's5. Het is daarom mogelijk dat zygotic chromatine losheid belangrijk voor de embryonale ontwikkelings potentieel is. Somatische celkernen overgedragen in het cytoplasma van oöcyten bleek lagere chromatine losheid in vergelijking met niet alleen de vaderlijke pronuclei, maar ook moeders pronuclei, suggereert dat het ontbreken van de open chromatine overname in somatische cellen nucleaire overdracht zygoten is betrokken bij hun arme ontwikkelings potentieel. Collectief, lijkt de analyse van de zFRAP te zijn nuttig voor het ophelderen van genoom herprogrammering mechanismen.

Het zFRAP-systeem kan maken het mogelijk om te selecteren zygoten met hoge ontwikkelings potentieel. In de voorstudie, naast SCNT, werd onthuld dat ronde spermatid injectie (ROSI)-zygoten haven abnormale chromatine losheid afgeleid. Bovendien bleek dat sommige van hen chromatine losheid op niveau vergelijkbaar met IVF-afgeleide zygoten toonde, suggereren dat deze zygoten hoge ontwikkelings potentieel hebben. Bovenal kunnen zygoten van welke chromatine losheid werd beoordeeld door zFRAP ontwikkelen tot termijn. In de toekomst dus, het mogelijk om te onderscheiden van de SCNT - en ROSI-afgeleide zygoten met hoger ontwikkelings potentieel van lagere degenen door de evaluatie van de chromatine losheid door zFRAP.

Tot op heden, eerdere studies is gebleken het nut van live beeldvorming methode voor de analyse van epigenetische staat in voor inplanting embryo's. Sommige van de levende imaging methoden elke epigenetische wijziging (bijvoorbeeld DNA/Histon wijziging) in voor inplanting embryo's13,14kan onthullen, maar met zFRAP, is het mogelijk om te evalueren van de losheid zygotic chromatine zonder het doden van de cellen. Chromatine losheid lijkt te worden beïnvloed door epigenetische aanpassingen. Bijvoorbeeld, bleek heterochromatin in welke repressieve epigenetische wijziging zoals H3K9me3 en H3K27me3 zijn verrijkt lagere Histon mobiliteit dan euchromatique regio3,15. Inderdaad veroorzaakt worden behandeld als een chemische verbinding, die epigenetische staat converteert, de wijziging van de chromatine losheid in zygoten. Dus, met behulp van zFRAP, het is mogelijk te onthullen de summatieve epigenetische staat van de structuur van de chromatine. Men dacht dat dit zou een voordeel voor het beoordelen van het ontwikkelings potentieel van de zygoten.

De injectie van mRNA codering eGFP-H2B voor zFRAP heeft een demerit maar verhoogt de veelzijdigheid van zFRAP. De demerit van de mRNA injectie is de schade veroorzaakt door microinjection. Om dit te vermijden, is het zeer effectief gebruik maken van de eGFP-H2B transgene muis. Als eGFP-H2B transgene muis lijn wordt gebruikt, kan de nakomelingen tarief worden verhoogd in vergelijking met het geval van het gebruik van mRNA microinjection. Omgekeerd is de verdienste van mRNA injectie die zFRAP maakt het gebruik van enige vorm van spanning van wild-type muizen. De onderzoekers die willen gebruiken van de zFRAP met hun belang van muis stam hoeft niet te bereiden de gewenste muis stam met eGFP-H2B transgenic. Deze verdienste wordt meer prominent in de analyse van transgene (bv. overexpressie/knockdown) of knock-out muis lijn. De onderzoekers willen gebruik maken van zFRAP voor hun onderzoeksonderwerpen met de transgene/knock-out-regel hoeft niet te bereiden de eGFP-H2B transgene lijn van een beperkt aantal van hun belang zijn. Dit betekent een voordeel voor de vooruitgang van het onderzoek.

Levende imaging analyse met voor inplanting embryo's vereist gespecialiseerde kennis en erg duur en fijn afgestemde gespecialiseerde apparaten. Daarom is een invoering van een experimenteel systeem niet een gemakkelijke beslissing. Het experimentele systeem dat is gevestigd in deze studie moet alleen een thermo-kachel afgezien van een confocale laser scanning microscoop. Daarnaast leren de methode is gemakkelijk zodat een beginner in een laboratorium de methode van zFRAP binnen 1 maand leren kan. Er zijn echter enkele kwesties die nog aandacht nodig hebben. Ten eerste is focus drift. Tijdens de observatie is het mogelijk dat de pronuclei of de zygoten afwijken van het standpunt waar ze gepresenteerd vóór de aanvang van de observatie. Als de focus drift optreedt, wordt de ROIs ook afwijken van de juiste positie. Dientengevolge, waardeloos kwantitatieve gegevens. U kunt dit probleem voorkomen, heeft de onderzoeker het deksel van de glazen bodem gerechten voor bescherming tegen het raam van de airconditioner en wachten op de uitbreiding van de olie over het objectief. Als focus drift optreedt, gegevens uit de afwijkende zygoten moet worden weggegooid en een 2nd FRAP analyse met de dezelfde zygoten wordt niet aanbevolen. In deze studie, het verkorten van de tijd van de waarneming van 150 s3 tot en met ongeveer 25 s7 watertje zelfs hulpvaardig. Ten tweede is langer incubatie buiten de incubator. Omdat langere blootstelling aan de omgeving buiten de incubator zeker schadelijk zijn voor de ontwikkeling van het embryo is, werd het aanbevolen tot finish de FRAP-analyse binnen 1 uur per batch. Het nummer van de zygoten FRAP-geanalyseerd in een HEPES-buffer media op de glazen bodem gerechten moet 6-10. In deze experimentele voorwaarde, het maximum aantal is zo'n 30 gedurende 4 uur maar als meer zygoten nodig zijn, 20 zygoten per uur kunnen worden geanalyseerd door het uitstel van de beoordeling van fluorescerende intensiteit in de regio van de referentie- en achtergrond. Ten derde is "tijdsgebonden verslechtering van de laser van de confocale laser microscopie". Wanneer de bleken laser ontoereikend is, kunnen niet de juiste kwantitatieve gegevens worden verkregen wegens onvoldoende bleken. Inderdaad, niet de ouderlijke asymmetrie van zygotic chromatine losheid worden verkregen met een zwak bleken laser. Om dit te vermijden, is het raadzaam om te controleren of de kracht van laser heeft verzwakt als de gelegenheid zich voordoet. In deze studie was 110-μW bleken genoeg voor de verwerving van ouderlijke asymmetrie.

zFRAP analyse kan worden gebruikt voor andere soorten eiwitten, naast de kern histonen. Aangezien kern histonen Toon prominent geringe mobiliteit, meer total observatietijdstip (ongeveer 25 s in deze studie) is nodig bij de analyse van de zFRAP. Voor het analyseren van een aanzienlijk aantal zygoten, is kweken in HEPES-buffer media op de kachel voor een lange tijd daarom onvermijdelijk. Aan de andere kant, voor de analyse van de zFRAP van hoge mobiliteit eiwitten, de totale observatietijdstip instelbaar kort, waardoor het moment van kweken in HEPES-buffer media op de kachel te kort. Daarom, omdat langere blootstelling aan de omgeving buiten de incubator zeer schadelijk voor de ontwikkeling van het embryo, zFRAP analyse voor eiwitten dan kern histonen, die hoge mobiliteit door de natuur is hebben, schijnen om te tonen lagere toxiciteit dan histonen kern . Gehoopt wordt dat dit experimenteel systeem het onderzoek naar de relaties tussen verschillende moleculaire gebeurtenissen en embryonale ontwikkeling verder zal helpen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij danken Satoshi Kishigami, Sayaka Wakayama Hiroaki Nagatomo, Satoshi Kamimura en Kana Kishida voor kritische opmerkingen en technische ondersteuning. Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door het programma van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie voor het bevorderen van de hervorming van nationale universiteiten M.O.; de Society van Japan voor de bevordering van de wetenschap (16H 02593), Asada Science Foundation en de Stichting van de wetenschap van de Takeda aan T.W. De financiers had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling en analyse, besloten tot bekendmaking of voorbereiding van het manuscript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal laser scaning microscope Olympus FV1200 FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7)
Thermo plate Tokai Hit TP-110RH26
Inverted microscope Olympus IX71
Micro manupilator Narishige MMO-202ND
Pieze Micro Micromanipulator Prime tech PMAS-CT150
35 mm culture dish Falcom 351008 35 x 100 mm style; for IVF
60 mm culture dish Falcom 351007 60 x 15 mm style; for embryo culture
50 mm culture dish Falcom 351006 50 x 9 mm style; for manipulation on the stage
50 mm glass bottom dish Matsunami D910400 50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis
Mineral oil Organic spceiality chemicals 625071 For FRAP analysis on the glass bottom dishes
Mineral oil Sigma M8410-1L For IVF and embryo culture
glass capillary Drummond 1-000-1000 For handling mouse zygotes
Borosilicate glass Prime tech B100-75-10-PT For microinjection of mRNA
Micropipett puller Sutter instrument P-97/IVF For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm) 
Microforge  Narishige MF-900
mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit Thermo
Fisher scientific
AM1340
Poly (A) tailing kit Thermo
Fisher scientific
AM1350
PVP solution 10% (PVP-HTF) IrvineSceientific 99311 HEPES buffered HTF containing 10% PVP
Sodium HEPES Sigma H3784
pTOPO eGFP-H2B Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6)
NorthernMax Gly Sample loading Dye  Thermo
Fisher scientific
AM8551 For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA
Phenol chloroform isamyl alcohol nacalai tesque 25970-14
Chloroform nacalai tesque  08401-65
Not I TOYOBO NOT-111X
Ethachinmate WAKO 318-01793
3664 Otical power meter Hioki 3664  Power meter for laser power
Stereomicmicroscope Olympus SZX16

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Burton, A., Torres-Padilla, M. E. Epigenetic reprogramming and development: a unique heterochromatin organization in the preimplantation mouse embryo. Brief Funct Genomics. 9, 444-454 (2010).
  2. Okada, Y., Yamaguchi, K. Epigenetic modifications and reprogramming in paternal pronucleus: sperm, preimplantation embryo, and beyond. Cell Mol Life Sci. 74, 1957-1967 (2017).
  3. Ooga, M., Fulka, H., Hashimoto, S., Suzuki, M. G., Aoki, F. Analysis of chromatin structure in mouse preimplantation embryos by fluorescent recovery after photobleaching. Epigenetics. 11, 85-94 (2016).
  4. Meshorer, E., et al. Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells. Dev Cell. 10, 105-116 (2006).
  5. Boskovic, A., et al. Higher chromatin mobility supports totipotency and precedes pluripotency in vivo. Genes Dev. 28, 1042-1047 (2014).
  6. Yamagata, K., Ueda, J. Long-term live-cell imaging of mammalian preimplantation development and derivation process of pluripotent stem cells from the embryos. Dev Growth Differ. 55, 378-389 (2013).
  7. Ooga, M., Wakayama, T. FRAP analysis of chromatin looseness in mouse zygotes that allows full-term development. PLoS One. 12, e0178255 (2017).
  8. Quinn, P., Begley, A. Effect of human seminal plasma and mouse accessory gland extracts on mouse fertilization in vitro. Australian journal of biological sciences. 37, 147-152 (1984).
  9. Chatot, C. L., Lewis, J. L., Torres, I., Ziomek, C. A. Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium. Biology of reproduction. 42, 432-440 (1990).
  10. Bae, J., Sung, B. H., Cho, I. H., Song, W. K. F-actin-dependent regulation of NESH dynamics in rat hippocampal neurons. PLoS One. 7, e34514 (2012).
  11. Dieteren, C. E., et al. Defective mitochondrial translation differently affects the live cell dynamics of complex I subunits. Biochim Biophys Acta. 1807, 1624-1633 (2011).
  12. Subramanian, V., et al. H2A.Z acidic patch couples chromatin dynamics to regulation of gene expression programs during ESC differentiation. PLoS Genet. 9, e1003725 (2013).
  13. Hayashi-Takanaka, Y., et al. Tracking epigenetic histone modifications in single cells using Fab-based live endogenous modification labeling. Nucleic Acids Res. 39, 6475-6488 (2011).
  14. Yamazaki, T., Yamagata, K., Baba, T. Time-lapse and retrospective analysis of DNA methylation in mouse preimplantation embryos by live cell imaging. Dev Biol. 304, 409-419 (2007).
  15. Puschendorf, M., et al. PRC1 and Suv39h specify parental asymmetry at constitutive heterochromatin in early mouse embryos. Nat Genet. 40, 411-420 (2008).
Zygotic fluorescentie herstel na het ontkleuren aangebracht van foto analyse voor chromatine losheid waarmee voldragen ontwikkeling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ooga, M., Funaya, S., Aoki, F., Wakayama, T. Zygotic Fluorescence Recovery After Photo-bleaching Analysis for Chromatin Looseness That Allows Full-term Development. J. Vis. Exp. (136), e57068, doi:10.3791/57068 (2018).More

Ooga, M., Funaya, S., Aoki, F., Wakayama, T. Zygotic Fluorescence Recovery After Photo-bleaching Analysis for Chromatin Looseness That Allows Full-term Development. J. Vis. Exp. (136), e57068, doi:10.3791/57068 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter