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Developmental Biology

Zygotiques Fluorescence Recovery After blanchiment Photo analyse de relâchement de la chromatine qui permet un développement à terme

doi: 10.3791/57068 Published: June 12, 2018

Summary

Relâchement de la chromatine semble être impliquée dans le développement potentiel des blastomères. Cependant, on ne sait pas si le relâchement de la chromatine peut être utilisé comme un indice fiable pour le potentiel de développement pour les embryons. Ici, on a décrit un système expérimental dans lequel les zygotes-Evaluation de relâchement de la chromatine peuvent développer à terme.

Abstract

L’imagerie Live est un outil puissant qui permet l’analyse des événements moléculaires au cours de l’ontogenèse. Récemment, la chromatine desserrement ou une ouverture s’est avéré être impliqués dans le potentiel de différenciation cellulaire des cellules souches embryonnaires pluripotentes. Il a été rapporté précédemment que comparé avec les cellules souches embryonnaires, zygotes hébergent une structure de la chromatine extrêmement desserrées, suggérant sa liaison avec leur totipotence. Toutefois, jusqu'à présent, il n'a pas été traitée si cette structure de la chromatine extrêmement relâché/ouvrir est importante pour les potentialités de développement embryonnaire. Dans la présente étude, afin d’examiner cette hypothèse, un système expérimental dans lequel zygotes qui ont été analysés par fluorescence récupération après blanchiment photo peut se développer à terme sans aucun dommage significatif a été développé. Ce qui est important, ce système expérimental a besoin seulement un chauffage de la thermos-plaque en plus un confocal laser scanning microscope. Les conclusions de cette étude suggèrent que le rétablissement fluorescence après que blanchiment photo analyse (PAF) de l’analyse peut être utilisée pour étudier les événements moléculaires dans la chromatine zygotique sont importants pour le développement à terme.

Introduction

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Après la fécondation, la structure de la chromatine est modifiée dynamiquement, et structure de la chromatine zygotique est puis finalement établie1,2. Durant cette période, dans les pronucléus paternels, la protéine dominante de la chromatine est passée de protamine en histone. La chromatine qui en résulte est extrêmement différente de celle des spermatozoïdes et des ovocytes féminins en plusieurs points (par exemple, composition variant d’histone, modification des histones). Ainsi, formé de chromatine zygotique est considérée comme important pour le développement ultérieur de l’embryon. Cependant, malgré les efforts pour révéler les détails de la structure de la chromatine zygotiques sur de longues périodes, des méthodes pour évaluer la qualité des zygotes ou pour prédire leur développement à terme au stade unicellulaire en analysant leur structure de la chromatine n’ont jamais été mis en place.

Dans l’étude précédente, il est découvert que les zygotes ont une structure de chromatine extrêmement desserré3. Actuellement, la chromatine desserrement ou une ouverture est censé être un important facteur de différenciation cellulaire potentielle de cellules souches embryonnaires (ES)4. ES cellules ne présentent pas d’homogénéité dans la nature, mais sont assez hétérogènes ; dans les colonies de cellules ES, certains acquièrent transitoirement un potentiel plus élevé de différenciation comparable à blastomères des embryons au stade de deux cellules. Au cours de cette transition dans les deux cellules comme État, relâchement de la chromatine dans ES cellules change dans ce qui est comparable avec le stade de deux cellules d’embryons5. Relâchement de la chromatine semble donc être important pour le potentiel de différenciation cellulaire et il est possible qui s’ouvrent largement la chromatine dans les zygotes est utile pour l’évaluation du potentiel de développement zygotique.

L’imagerie Live est un outil puissant qui permet l’analyse des événements moléculaires au cours de l’ontogenèse étant donné que cette méthode permet le développement ultérieur et même à terme développement6. Parmi les méthodes d’imagerie live, FRAP analyse a été utilisé pour examiner le relâchement de la chromatine dans les embryons préimplantatoires et ES cellules3,4,5. Si le relâchement de la chromatine zygotiques peut être analysée sans un effet néfaste sur le développement à terme par FRAP analyse, il peut être un outil précieux pour l’évaluation de la qualité des embryons au stade unicellulaire. Toutefois, les effets sur le développement à terme par cette méthode expérimentale n’ont pas été examinés. Récemment, un système d’expérimentation à l’aide de FRAP pour évaluer le relâchement de la chromatine zygotique a été développé. Parce qu’il s’agissait d’un nouveau système d’observation pour les zygotes, il a été appelé comme FRAP zygotique (zFRAP). zFRAP n’a rien à terme développement critique et a été signalée ailleurs7. Dans ce rapport, le protocole de cette méthode expérimentale est décrit.

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Protocol

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Cette étude a été réalisée en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire de l’Université de Yamanashi. Le protocole a été approuvé par le Comité sur l’éthique de l’expérimentation animale de l’Université de Yamanashi (numéro de permis : A24-50). Toutes les interventions chirurgicales ont été réalisées sous anesthésie de tribromoethanol, et tous les efforts ont été faits pour réduire au minimum les souffrances. An illustrated aperçu des procédures et de calendrier sont indiquées dans la Figure 1 et tableau 1, respectivement.

1. préparation de l’ARN messager (TranscriptionIn Vitro des ARNm eGFP-H2B)

  1. Linéariser 5 µg de modèle ADN pTOPO-eGFP-H2B3,7 avec 30 U de pas j’ai dans 50 µL à 37 ° C durant la nuit.
  2. Prélever 1,5 µL d’ADN digéré pour confirmation si complètement digérée par électrophorèse.
    1. Appliquer 1,5 µL et 3-5 µL d’ADN non digéré avec chargement de colorant dans le puits du gel d’agarose à 2 %, respectivement et sous réserve de l’électrophorèse.
      Remarque : Si la complètement digérée, une seule bande (environ 5 Ko) est observée. ADN non digéré est utilisé comme un contrôle qui s’affiche à un poste différent.
  3. Ajouter 151,5 µL de ddH2O et 200 µL de phénol/chloroforme/isoamylique alcool (25:24:1) pour les autres ADN digéré.
    1. Mélanger vigoureusement par vortex.
    2. Centrifuger à la vitesse maximale pendant 15 minutes.
  4. Récupérer le surnageant et puis ajouter 200 µL de chloroforme.
    1. Mélanger vigoureusement par vortex.
    2. Centrifuger à vitesse maximum pendant 15 min.
  5. Récupérer le surnageant et ajouter 20 µL d’acétate de sodium 3M et 1,5 µL d’ethachinmate.
    1. Mélanger vigoureusement par vortex.
    2. Ajouter 550 µL d’éthanol à 100 %, puis mélanger vigoureusement par vortex.
    3. Centrifuger à vitesse maximum pendant 15 min.
    4. Jeter le surnageant et laver le culot avec l’éthanol à 70 %.
    5. Sécher le culot par évaporation pendant 5-10 min.
  6. Dissoudre le précipité de plasmide dans 8 µL d’eau exempte de nucléase.
  7. Évaluer la concentration de plasmide (concentration prévue est d’environ 300 à 500 ng/µL) avec nanodrop en suivant les instructions du fabricant.
  8. Effectuer in vitro de transcription de l’ARNm codant pour eGFP-H2B avec 1 µg d’ADN purifié comme modèle dans 20 µL du volume total de réaction en suivant les instructions du fabricant.
    1. Après la transcription in vitro , ajouter 36 μL d’eau, puis récupérer 1,5 µL de 56 µL d’ARNm synthétisé pour l’analyse par électrophorèse (car sans poly A).
  9. Effectuer des résidus A poly pour ARNm synthétisé dans un volume de réaction 100 µL en suivant les instructions du fabricant.
  10. Ajouter 60 µL de solution de précipitation de chlorure de lithium à la poly un ARNm à queue d’eGFP-H2B, puis mélanger vigoureusement.
    1. Refroidir à-30 ° C pendant 30 min.
    2. Centrifuger à vitesse maximum pendant 15 min.
    3. Jeter le surnageant et laver le culot avec l’éthanol à 70 %.
    4. Sécher le culot par évaporation pendant 5-10 min.
  11. Dissoudre le culot avec 20 µL d’eau exempte de nucléase par chauffage à 55 ° C pendant 30 min.
  12. Évaluer la concentration de l’ARNm précipité avec nanodrop. Diluer à 500 ng/µL d’eau exempte de nucléase et de conserver à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.
  13. Confirmer la production d’ARNm préféré ; sujet 1 µL d’ARNm avec/sans (obtenu en 1.8.1 et 1,12 étapes, respectivement) poly une queue mélangée avec 1,5 µL de bromure d’éthidium de 0,1 mg/mL et 3 µL de colorant de chargement d’échantillon pour l’analyse par électrophorèse. Volume appliquée était µL de 5,5.
    Remarque : Si Poly A traînée s’est déroulée, la bande décalée par rapport à l’ARNm sans poly une traînée doit être observée (Figure 2 a).

2. préparation des souris mâles vasectomisés

  1. Peser les souris mâles ICR à 8-12 mois en utilisant une échelle de poids.
  2. Injecter par voie intrapéritonéale souris mâles avec anesthésie de 1,2 % tribromoethanol 0,7 - 0,9 mL.
    Remarque : Le montant de l’anesthésie dépend de la taille de la souris. Par exemple, une souris pesant 40 g est injectée avec 0,8 mL d’anesthésie tribromoethanol.
  3. Humides de la baie d’éthanol à 70 %.
  4. Faire une petite coupe (3-5 mm) sur la baie et puis faire une incision sur la paroi musculaire à l’aide de ciseaux.
    NOTE : Ciseaux et pinces doivent être nettoyés avec l’éthanol à 70 % avant de commencer la chirurgie.
  5. Saisir une grosse garniture avec une pince et tirez doucement. Ensuite, les testicules et le canal déférent apparaissent.
    Remarque : Le canal déférent est un tube en U et avec un vaisseau sanguin rouge.
  6. Attacher le canal déférent à deux points avec les sutures chirurgicales et découper la partie centrale entre les points liés.
  7. Doucement repousser les coussinets adipeux et les testicules dans le berry.
    1. Répétez l’opération avec le testicule restant.
  8. Coudre la paroi musculaire avec deux points de suture avec suture chirurgicale.

3. FIV

  1. Injecter des 8 - 10 - semaine vieux B6D2F1 femelles (BDF1) souris par voie intrapéritonéale avec 7,5 IU gonadotrophine chorionique équine (eCG) et la gonadotrophine chorionique humaine (hCG) à intervalle de 46 à 50 h.
  2. Préparer des gouttes de 300 µL humaine tubaire (HTF)8 fluides capacitation et insémination 1 jour avant la FIV dans un plat de 30 mm, couvrir ces gouttes avec l’huile minérale sur le banc de laboratoire et ensuite príncuber dans un incubateur pendant la nuit.
  3. Sacrifier les souris ICR mâles ayant subi une maturation en dislocation cervicale. Disséquer la cauda épididyme avec une aiguille de 27 G et recueillir le spermatozoïde. Leur culture de capacitation dans 300 µL de médias de FASS pendant 1-2 h à 38 ° C.
  4. 16 h après l’injection d’hCG, sacrifier des souris femelles super ovulés par dislocation cervicale. Transférer l’ampoule de l’oviducte dans l’huile minérale à côté de médias de FASS et puis soulignent les cellules du cumulus et complexe des ovocytes de cette ampoule oviducte par une aiguille 30 G dans le milieu préincubées insémination-FASS.
    Remarque : Certaines femelles ne montrent pas souvent l’ovulation malgré un traitement super ovulation. Oviducte élargie ampulla est un signe d’ovulation.
  5. Après la capacitation, transférer 2-3 µL du spermatozoïde capacitated dans médias insémination-FASS dans laquelle les ovocytes ovulés ont été collectées.
  6. 1 h après l’insémination, recueillir les zygotes fertilisés et traitez-les avec hyaluronidase à 100 µg/mL pendant 10 min dans les médias de9 CZB.
    Remarque : Lors de l’insémination est réalisée correctement, 1 h après l’insémination, les zygotes fertilisés avec le globule polaire 2nd sont observées. Si inférieure ou basse qualité sperme est utilisé, seulement peu zygotes avec le globule polaire 2nd sont observées. En outre, si plusieurs spermatozoïdes sont utilisés pour l’insémination, polyspermie se produit. Bonne insémination conduit à zygotes avec pronucléus mâles et femelles. En utilisant ces critères, il est possible de trouver si l’insémination se faite bien ou non.
    1. Apres le lavage médias CZB, sous réserve des zygotes avec un second globule polaire microinjection avec eGFP-H2B ARNm.

4. préparation de la chambre et les Pipettes de micro-injection

  1. Diluer le RNA encodage eGFP-H2B l’eau exempte de nucléase pour obtenir une concentration de 250 ng/µL.
  2. Préparer 2 à 3 gouttes de PVP-FASS eGFP-H2B gouttes ARNm, et 5 à 6 gouttes d’Hepes tamponnée CZB (H-CZB) gouttes sur le plat de 60 mm. Couvrir ces gouttes avec de l’huile minérale.
    Remarque : Ces préparations peuvent être effectuées sur le banc de laboratoire. Il n’y a pas d’exigence pour l’utilisation du cabinet de flux d’air laminaire.
  3. Tirez en verre borosilicate avec un micropipettes (p. ex., P = 500, chaleur = 825, pull = 30, vel = 120 et le temps = 200)
  4. Après la rupture de l’embout de la pipette, plier la pipette de micro-injection de verre tiré près de la pointe (µm −300 retour) à environ 30 ° à l’aide d’une microforge.

5. microinjection

  1. Éteindre le chauffage de la plaque sur la scène du micromanipulateur pour empêcher l’abattage des zygotes avec un piezo pendant l’injection de l’ARNm.
  2. Laver et enduire l’intérieur des aiguilles à injection dans HEPES-tampon-FASS contenant 10 % PVP (JcJ-FASS).
  3. Collecter les zygotes fertilisés avec un globule polaire de 2nd (Figure 2 b) et transférer des zygotes de 20-25 dans la chambre de la platine du microscope attachée avec un micromanipulateur.
  4. Remplissez l’ARNm eGFP-H2B dilué dans les capillaires en verre de borosilicate de la pointe.
  5. Tenez le zygote avec une pipette de tenue et puis briser la zone pellucide et la membrane cytosolique avec un disque piézo-électrique.
  6. Injecter environ 10 pL de l’ARNm dans le cytoplasme des zygotes. Fini les ARNm-injection moins de 10 min pour éviter tout dommage causé en plus cultivant les zygotes en dehors de l’incubateur.
    Remarque : Le volume d’injection devrait être aussi grand que le globule polaire 2nd . Si la quantité d’ARNm injecté est trop grande, il est possible de provoquer la fraction libre eGFP-H2B, susceptibles d’affecter la fraction mobile.
  7. 10 min après microinjection, laver au moins 3 gouttes et puis la culture les zygotes injectées dans CZB à 38 ° C jusqu'à l’analyse de zFRAP.

6. zFRAP analyse

  1. 1 h avant l’analyse zFRAP, allumer le laser et la plaque chauffante, attaché à l’étape de la microscopie confocale. Réglez la température à 38 ° C.
  2. Mettre 6-10 µL de médias CZB tampon HEPES couverte d’huile minérale sur le plat de fond de verre de 60 mm et chaud sur le radiateur jusqu'à collection zygote.
  3. 8 - 12 h après l’insémination, collect zygotes exprimant eGFP-H2B 5-10 et le transfert dans 6-10 µL de préchauffée chute moyenne de tampon HEPES CZB.
    Remarque : Pour éviter une culture plus longtemps en dehors de l’incubateur, 5-10 exprimant eGFP-H2B zygotes servaient à chaque analyse. 5 à 10 zygotes peuvent être analysés à 1 h.
  4. Définir les conditions de blanchiment et d’imagerie selon les instructions du fabricant. L’affaire un confocal laser scanning microscope (Table des matières) est illustré ci-dessous :
    1. Utilisation 60 X lentille de l’huile (60 X 60 X / 1,35 huile).
      NOTE : Les lentilles avec grossissement (ouverture numérique plus élevée) Voir la plus élevée une sensibilité plus élevée.
    2. Réglez la vitesse de balayage comme 4.0 µs/Pixel ou une taille comme « 512 » sur « Acquisition Setting » (la Figure 1).
    3. Augmenter le zoom numérique à « 5 » (la Figure 1).
      Remarque : Un zoom plus élevé est nécessaire pour reconnaître si dérive de discussion ait lieu ou non.
    4. Ouvrez la liste de colorant (la Figure 1) et puis choisissez « EGFP ». La valeur de temps d’observation que 1.6 s (intervalle défini comme paramètre de « free run ») (la Figure 1)
      Remarque : Plusieurs points d’observation peuvent provoquer des données plus détaillées, mais il peut également provoquer de phototoxicité. Dans l’analyse de zFRAP, un temps d’observation s 1.6 semble être suffisant pour détecter l’asymétrie parental de relâchement de la chromatine.
    5. Définir le nombre de photos que 12 au total (la Figure 1).
    6. Démarrer Panneau de « Réglage de Stimulus », puis cliquez sur « Main » sur UseScanner. Définir la vitesse comme 10,0 µs/Pixel de balayage. Cliquez sur « Activation en série », puis définissez pré-allumage « 3 frames » ainsi que le temps d’Activation comme « 5 sec » (la Figure 1).
    7. Cliquez sur « Focus x 2 » et définir le focus et ensuite sur « Stop ».
    8. La valeur de blanchiment et d’imagerie laser puissance (477 nm) à µW 110 et 15, respectivement, en réglage « gage puissance de laser » (la Figure 1).
      NOTE : Blanchiment très forte peut entraîner une plus grande surface blanchie, ce qui provoque des difficultés d’analyse quantitative. Pour la mesure de la puissance du laser, utilisez un wattmètre. Il est important de confirmer la puissance du laser pour éviter l’effet de la détérioration liées au temps de la puissance du laser.
    9. Cliquez sur « Clip Rect » (la Figure 1) dans le panneau de réglage de Stimulus. Définir la zone d’intérêt (ROI ; rouge ; ROI 1 b #) 40 x 40 pixels (7,6 µm2). Préparer une région de référence (REF ; vert ; Retour sur investissement #2) et un fond (BG ; bleu ; ROI #3) à l’aide de « copier le ROI » et « coller le ROI » (bouton de clic-droit sur la souris).
      Remarque : Taille de Pixel peut être réglée par « Gestionnaire de ROI », qui peut être appelé en cliquant sur le bouton droit de la souris lorsque le curseur est sur le retour sur investissement. Grands ROIs sont censés être mieux car ils peuvent normaliser la dispersion de la partition de zFRAP. Cependant, trop grande d’un ROI ne peut servir pour cette analyse car il est difficile d’éviter l’organisme précurseur de nucléole (CNLC). H2B-eGFP dans ce compartiment était considéré comme exempt de la chromatine et remarquable de mobilité supérieure3. ROI et REF zones devraient être séparés autant que possible. Si ces deux régions sont proches, blanchiment peut aussi toucher la région de REF.
    10. Cliquez sur « Live » sur la barre d’outils, puis lancez « Live Plot » (la Figure 1).
      Remarque : Terrain Live indique l’intensité de signal de fluorescence au sein de chaque ROI et est utilisé pour ajuster la puissance du laser à l’aide de HV. Notez que si le ROI n’est pas activée, aucune intensité ne serait détectée sur panneau tracé direct.
    11. Détermination de la position du ROI
      NOTE : Retour sur investissement peut être déplacé en le faisant glisser dans la position souhaitée dans pronucléus. (1) être sûr d’éviter le nucléole et (2) fit le ROI ensemble dans le nucléoplasme. Ne contiennent pas de la région à l’extérieur de la zone de la membrane nucléaire (cytoplasme) dans le ROI. La localisation d’eGFP-H2B est fortement restreint dans le nucléoplasme afin qu’il soit facile de trouver le ROI contient cytoplasme ou non par la fluorescence d’eGFP-H2B. Pronucléus mâles ont tendance à être plus grandes que celles des femelles, qui sont souvent localisées près du globule polaire 2nd . Lors de l’utilisation de ces critères, le juge les pronucléus mâles ou femelles.
    12. Cliquez sur « Focus x 2 » (la Figure 1) puis ajustez la jauge de puissance HV du chenal pour EGFP dans l’intensité de la fluorescence à environ 2000 (intensité de la fluorescence peut être vu dans la fenêtre « complot direct »).
  5. Cliquez sur « Time », puis « XY » (la Figure 1) pour démarrer l’analyse de zFRAP.
    Remarque : Si le bouton « Time » est correctement sélectionné, « t » apparaît sur le bouton « XY ».
    1. Cliquez sur « Série fait » (la Figure 1), qui apparaît après l’imagerie FRAP près de la touche « XY » et puis obtenir FRAP-a analysé les données.
    2. Enregistrez le fichier « 2D vue-Image XXXXX » comme un fichier nommé préféré (format de fichier oib.) par « enregistrer sous » (Ctrl + Maj + S peut être également utilisé).
    3. Sélectionnez retour sur investissement, REF et BG et puis cliquez sur (Ctrl + A peut être également utilisé) « Analyse de la série » dans la fenêtre « Image de vue 2D ».
    4. Obtenir des données de ligne FRAP et puis cliquez sur « enregistrer » dans la fenêtre de tracé direct.
      Remarque : Le rang des données quantitatives FRAP sont enregistrées dans un fichier csv.
  6. Aucun contrôle de zFRAP, mettre un peu de zygotes injectés avec l’ARNm sur la goutte, qui est près de la jante de la vaisselle en verre bas pour éviter l’effet de l’observation de la fluorescence.

7. calcul de données

  1. Tout en utilisant les données quantitatives obtenues, faire le graphique de la « courbe de récupération » et la « fraction mobile » par Excel comme indiqué dans les références3,7 , avec quelques modifications (voir ci-dessous et supplémentaire fichier excel).
  2. Calculer l’intensité relative en soustrayant la valeur du BG de celles du ROI et REF dans 12 photos pour chaque point dans le temps.
  3. Divise la valeur de retour sur investissement par celle de la REF. En conséquence, les 12 notes standardisées d’intensité relative à chaque instant peuvent être obtenues.
  4. Calculer la moyenne du score relatif pour ROI en 3 images prises avant la photo de blanchiment.
  5. Calculer le taux de récupération. Diviser que le 12 a obtenu des scores relatifs pour ROI dans les images prises à chaque instant (obtenu à 7.1.2.) par la moyenne du score relatif avant photo blanchiment (obtenus à 7.1.3.). Dessiner la courbe de récupération avec l’aide de ces scores (Figure 2E).
  6. Calculer le taux de blanchiment.
    NOTE : Blanchiment de taux (%) = 100 - taux de récupération de 4ème image.
  7. Calculer la fraction mobile (MF) en utilisant la formule comme suit10,11,12
    MF (%) = taux de récupération 12ème (à la fin) - 4 taux de récupération deth / taux × 100 de blanchiment.

8. transplantation embryonnaire

  1. S’accoupler des femelles ayant subi une maturation de l’IC à 8-12 mois avec vasectomisés souris ICR mâles la nuit avant le transfert de l’embryon en leur permettant d’être dans la même cage, du jour au lendemain.
  2. Recueillir les embryons qui ont été analysé zFRAP et déterminés à développer pour le stade de deux cellules.
  3. Par voie intrapéritonéale injecter des souris femelles avec anesthésie de 1,2 % tribromoethanol 0,7 - 0,9 mL ou 0,35 - 0,45 mL de 0.75/4/5mg/kg médétomidine/midazolam/butorphanol mixte agents avant le transfert d’embryons.
    Remarque : Le volume de l’anesthésie est déterminé par le poids corporel des souris. Tribromoethanol : 0,2 mL/10 g de poids corporel ; médétomidine/midazolam/butorphanol mélangé des agents : 0,1 mL/10 g de poids corporel.
    1. Transférer ces embryons au stade de deux cellules dans les oviductes de pseudo-gravides souris ICR femelles avec un plug vaginal à 0,5 jour post coitum (dpc).
    2. Après le transfert d’embryon, mettre les souris femelles sur l’appareil de chauffage réglé à 37 ° C jusqu'à ce qu’ils se réveillent.
  4. À 18,5 dpc, sacrifier la mère porteuse par dislocation cervicale et récupérer les chiots provenant de zygotes zFRAP analysé par césarienne. Certains des petits récupérés ont été livrés à la mère nourricière et leurs poids corporel ont été évalués chaque semaine.

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Representative Results

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zFRAP analyse avec eGFP-H2B

Produit correctement ARNm codant pour eGFP-H2B, qui est considéré comme un groupe décalé posés par poly une traînée (Figure 2 a), a été injecté dans le cytoplasme des zygotes avec un 2ème globule polaire à 1-3 h après l’insémination (Figure 2 b). 8 à 12 h après l’insémination, les zygotes avec 2 pronucléi montrant l’expression de H2B-eGFP ont été recueillis et soumis à l’analyse de le zFRAP (Figure 2). L’analyse FRAP se compose des étapes de blanchiment et de récupération. Lors de la phase pré blanchiment, le signal d’eGFP-H2B a pu être observé (Figure 2D-1), mais une fois blanchi, le signal a diminué à un niveau négligeable (Figure 2D-2). Si le blanchiment a été un succès, un trou noir aussi grand que le ROI est apparu bientôt après le blanchiment. Après le blanchiment, l’intensité du signal de fluorescence eGFP-H2B récupéré légèrement ; le signal fluorescent a graduellement augmenté en raison de l’afflux de la fraction non blanchie d’eGFP-H2B dans le retour sur investissement de la région non blanchie dans le nucléoplasme (Figure 2D-3). Pour la confirmation du succès de l’analyse zFRAP de relâchement de la chromatine, il est recommandé d’utiliser une asymétrie parentale de relâchement de la chromatine ; pronucléus mâles a montré une courbe de récupération plus rapide et des fractions plus mobiles que ceux des femelles (Figure 2E et F). Après analyse des zFRAP, des zygotes lavés et mis en cultures dans des milieux CZB, pourrait se développer au stade blastocyste sans dommage important (Figure 2 et H). Même si fortement blanchis pendant des périodes prolongées, les zygotes pourraient développer encore dans le stade de blastocyste aussi bien7.

Analyse de l’évolution à terme des zygotes analysé zFRAP

Pour analyser le développement à terme des embryons issus de zygotes zFRAP analysé, les embryons au stade deux cellules ont été transférés dans les oviductes de mères pseudo-gravides. En tant que contrôles, embryons intacts et celui injecté avec l’ARNm mais pas analysé zFRAP ont été préparés. Le taux de natalité des embryons zFRAP analysé (41,0 %) était légèrement mais significativement inférieure à celle des embryons intacts (62,2 %), mais était la même que celle du aucun contrôle zFRAP (52,6 %) (Tableau 2). Ainsi, zFRAP-analyse semble être légèrement préjudiciable au développement de l’embryon à terme. Cependant, ce qui est important, les chiots provenant de zygotes analysé zFRAP semblés en bonne santés et complètement développement (Figure 3).

Figure 1
Figure 1 : Une illustration schématique de la circulation des procédures pour les expériences. Fécondation in vitro : fraîchement prélevés métaphase II (MII) ovocytes ont été inséminées avec le sperme capacitated. In vitro transcription: l’ARN messager (ARNm) codage fusionnés avec eGFP histone H2B (eGFP-H2B) ont été transcrits du promoteur SP6 de la de pTOPO-eGFP-H2B3 linéarisé avec pas je. L’ARNm eGFP-H2B soumis purification, puis traînée A poly. Le mRNA purifié eGFP-H2B est utilisé en injection d’ARNm. injection de l’ARNm: l’ARNm préparés eGFP-H2B est injecté dans le cytoplasme des zygotes avec 2 globule polaire dend . zFRAP analyse: les zygotes exprimant eGFP-H2B ont été soumis à l’analyse de zFRAP. La région d’intérêt (ROI ; rectangle rouge) a été blanchie avec un laser solide, puis le signal eGFP-H2B ont diminué à un niveau négligeable. Après le blanchiment, l’intensité du signal eGFP-H2B a augmenté progressivement. In vitro développement : Après analyse de la zFRAP, les zygotes pourraient devenir le stade de blastocyste. Transfert d’embryon: au stade de deux cellules, les embryons zFRAP-analysés ont été transférés dans les oviductes chez des souris femelles pseudo-gravides. 18 jours plus tard, en bonne santé les chiots vivants pourraient être obtenus d’embryons zFRAP analysé. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : analyse de zFRAP des zygotes avec eGFP-H2B. (A) une image représentative de l’ARNm correctement préparée par in vitro transcription et poly A traînée. Piste 1 : poly avant une traînée ; voie 2 : post tailing poly A. (B) ARNm codant eGFP-H2B a été injecté dans le cytoplasme des zygotes avec une 2nd globule polaire 1-3 h après l’insémination (hpi). Echelle = 25 µm (C) exprimant l’eGFP-H2B zygotes ont été prélevés à 8-12 hpi. Les astérisques blancs montrent nucléole corps précurseur (CNLC). Echelle = 10 µm (D) eGFP-H2B expression a été détectée dans le nucléoplasme ensemble même dans la CNLC lors de la phase pré blanchiment (D-1), peu de temps après le blanchiment (D-2) et après la restauration (D-3). Les membranes nucléaires (lignes pointillées blanches) et la CNLC (astérisques) sont indiqués. Echelle = 10 µm. courbe de récupération (E, F) et des fractions mobiles proviennent de 45 zygotes dans 5 expériences indépendantes. Bleus et rouges indiquent mâles et femelles, respectivement. Dans les courbes de récupération, unique cercles indiquent le point de mesure. Dans les diagrammes de dispersion, seul points indiquent le score de mobiles fractions obtenues à partir de pronucléi. (G) des images représentatives du développement préimplantatoire des zygotes zFRAP-analysés sont présentés. Deux cellules, 4-8 cellules et blastocyste embryons au stade à 24, 48 et 96 hpi, respectivement. Le cercle jaune indique le blastocyste bien développé. Ce blastocyste est agrandi et affiché sur le panneau de droit. Echelle = 100 µm. (H) Bar graphique des taux de développement des embryons zFRAP analysé. Barres indiquent des embryons analysé zFRAP (zFRAP) (blancs) et contrôlent les embryons (noirs) injectées avec l’ARNm, mais aucune analyse de zFRAP (N° zFRAP). Données présentées proviennent de trois expériences indépendantes, examinant les embryons au moins 57 au total. Deux cellules, 4-8 cellule morula (Mo) et stade de blastocyste (Bl) ont été observées à 24, 48, 72 et 96 hpi, respectivement. Ce chiffre a été modifié par [Ooga et al., 2017]7. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : la croissance saine des chiots issus de zygotes FRAP-analysé. (A) les photos des chiots provenant de zygotes analysé zFRAP apparaissent. (B) croissance normale a été observée au cours de l’allaitement des petits zFRAP-analysés. (C) le graphique indique le poids des chiots provenant d’embryons intacts (bleus), des embryons de témoins non blanchi (rouge) et analysé zFRAP embryons (vert). Corps poids de 29 petits provenant d’embryons intacts, 24 de no-zFRAP embryons et 15 d’embryons zFRAP analysé sur une période de 8 semaines. Valeurs indiquées par des astérisques sont très différentes du contrôle intacte. Ce chiffre a été modifié par [Ooga et al., 2017]7. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Supplémentaire Figure 1 : interface graphique pour l’analyse de la PAF. (A) un aperçu de l’interface graphique a été montré. (B) images élargie pour chaque fenêtre apparaissaient. (1) fenêtre le réglage de l’Acquisition est utilisé pour définir la condition d’acquisition image. (2) relance la fenêtre est utilisé pour définir la condition de blanchiment. Cette fenêtre peut être ouverte en cliquant sur le bouton sur la fenêtre d’acquisition Image. (3) l’Image Acquisition contrôle fenêtre est utilisée pour l’analyse de la PAF. (4) le Live View affiche l’image actuelle (l’image actuelle s’affiche après avoir cliqué sur la mise au point x2 ou bouton XY). Les rectangles bleus clair, verts et rouges indiquent le retour sur investissement (région d’intérêt), REF (référence) et BG (arrière-plan), respectivement. (5) la vue 2D montre l’image FRAP-analysés et apparaît après avoir cliqué sur la série « faite » bouton. Dans ce cas, un pronucléus mâle FRAP-analysé est indiqué à titre d’exemple. Trois rectangles avec 8 points indiquent que ces régions sont sélectionnées. (6) the Live Plot montre l’intensité de fluorescence présents dans chaque région. Les axes X et Y indiquent de temps (ms) et l’intensité de la fluorescence, respectivement. (7) l’analyse des séries montre les traces de l’intensité de fluorescence à chaque région et apparaît après avoir cliqué sur le bouton analyse des séries sur la fenêtre d’affichage 2D. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Supplémentaire Excel File 1 : exemples de données et le calcul de données. (Feuille 1) Un exemple de données pour un pronucléus mâle sont montrées. N ° indique le numéro de l’image. Les intensités de ligne pour chaque région (ROI, Ref et BG) ont été indiquées. (Feuille 2) Un exemple de calcul de données s’affiche. Numéro de protocole indique les places correspondantes dans la section protocole. Notes expliquent la signification de chaque partition. La formule numérique peut être renvoyée en cliquant sur les cellules. Exemples de courbe de récupération et de graphique à barres mobiles fraction sont indiqués. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Jour -3 Jour -2 Jour -1 Jours de la FRAP Jour + 1 Jour + 3 Jour + 19
préparation de l’ARNm Plasmide de gabarit de coupe
(toute la nuit)
1). plasmide de modèle de purification
2). la transcription In vitro
3). In vitro poly une traînée
4). contrôle de qualité des ARNm par électrophorèse
FRAP 1). préparation de la salle et la pipette de manipulation
2). injection d’ARNm
3). analyse zFRAP
4). calcul de la courbe de récupération et de la fraction mobile* 2
FIV et analyse du développement pré-implantatoire injection de l’eCG 1). l’injection d’hCG 1). capacitation des spermatozoïdes
2). la pré-incubation des médias (HTF) 2). la fécondation In vitro
Préparation des médias (FASS, CZB, H-CZB et PVP-CZB) 3). développement préimplantatoire évaluation
Transfert d’embryons Préparation de pseudo-gravides femelle
(accouplement avec mâle vasectomisé* 1)
Transfert des embryons au stade 2 cellules à pseudo-gravides femelle Évaluation du taux de natalité
* 1: souris hommes vasectomisés doit être préparé au moins 2 semaines avant l’accouplement
* 2: calcul peut être prolongée dans le lendemain (jour + 1)

Tableau 1 : tableau de temps des expériences. Le jour de l’analyse de la PAF est considéré comme jour 0 sont indiqués, les expériences qui doivent être effectuées les jours respectifs pour chaque élément.

Catégories Lol des zygotes injectés Lol des zygotes récupérés après l’injection de l’ARNm (%) * Lol des zygotes analysés Lol de transfert Lol des bénéficiaires Lol des petits (%) *** Poids des chiots (g) Lol des petits transgéniques
embryons au stade 2 cellules (%) **
Intact - - 99 98 (99,0) 9 61 (62,2)un 1.64±0.02 n.d
Aucun PAF 420 398 (94,8) 82 78 (95,1) 7 41 (52,6)a,b 1.66±0.03 n.d
FRAP 79 78 (98,7) 7 32 (41,0)b 1.69±0.03 0
* : en divisant avec no. des zygotes injectées ; ** : en divisant avec no. des zygotes analysées ; : en divisant avec no. des embryons au stade de 2 cellules transférés. a, b: exposants indiquent une différence significative (P < 0,05). n.d : non déterminé. Ce tableau a été modifié [Ooga et al., 2017]7.

Tableau 2 : le taux de natalité des embryons analysés : Le potentiel de développement des embryons, qui avait été analysé FRAP, à long terme a été examiné. Le taux de natalité obtenu de ces embryons est montré. En tant que contrôles, embryons intacts et ne FRAP-analysés ont aussi été examinés. Le poids des chiots provenant de ces embryons transférés apparaissent ainsi.

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Discussion

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Comme l’a révélé dans cette étude, l’analyse de zFRAP ne provoque pas de dégâts critiques au développement à terme, suggérant que cette méthode est un outil très utile pour révéler le lien entre les événements moléculaires et le potentiel de développement embryonnaire. Au cours de la reprogrammation, dans les deux cellules comme état de cellules ES, par lequel le différentiel potentiel de ces cellules devient plus élevé que celui des embryons au stade de deux cellules, relâchement de la chromatine se transforme en qui comparable au stade de deux cellules d’embryons5. Par conséquent, il est possible que relâchement de chromatine zygotique est important pour les potentialités de développement embryonnaire. Transfert de noyaux de cellules somatiques dans le cytoplasme d’ovocytes ont montré plus faible relâchement de chromatine par rapport à non seulement les pronucléus paternelles, mais aussi les pronucléus maternelles, ce qui suggère que l’absence d’acquisition ouvert la chromatine des zygotes de transfert nucléaire de cellules somatiques est impliqués dans leur potentiel de développement pauvre. Collectivement, l’analyse de zFRAP semble être utile pour élucider le génome reprogrammation des mécanismes.

Le système zFRAP peut rendre possible de sélectionner des zygotes à fort potentiel de développement. Dans l’étude préliminaire, en plus du TNCS, il a été révélé que ronde injection spermatides (ROSI)-dérivé de zygotes port anormal de la chromatine lâche. En outre, il a été constaté que certains d'entre eux ont montré desserrement de la chromatine au niveau comparable pour FIV-dérivés des zygotes ainsi, ce qui suggère que ces zygotes ont fort potentiel de développement. Ce qui est important, zygotes de dont la chromatine lâche a été évaluée par zFRAP pourraient développer à terme. À l’avenir, par conséquent, il serait possible de distinguer les zygotes dérivés obtenus par TNCS - et ROSI avec potentiel de développement plus élevé de celles du bas de l’évaluation de relâchement de la chromatine par zFRAP.

A ce jour, les études antérieures ont montré l’utilité de la méthode d’imagerie en direct pour l’analyse d’état épigénétique chez les embryons préimplantatoires. Certaines des méthodes d’imagerie live peuvent révéler chaque modification épigénétique (p. ex. modification d’ADN/histones) embryons préimplantatoires13,14, mais à l’aide de zFRAP, il est possible d’évaluer le relâchement de la chromatine zygotiques sans tuer les cellules. Relâchement de la chromatine semble être affectée par des modifications épigénétiques. Par exemple, l’hétérochromatine dans lequel épigénétiques répressives telles que H3K9me3 et H3K27me3 sont enrichis ont montré plus faible mobilité histone de région euchromatique3,15. En effet, le traitement avec un composé chimique, qui convertit l’état épigénétique, entraîne l’altération de relâchement de la chromatine chez les zygotes. Par conséquent, à l’aide de zFRAP, il est possible de révéler l’état épigénétique sommative de la structure de la chromatine. On pensait que ce serait un avantage pour évaluer le potentiel de développement des zygotes.

L’injection d’ARNm codant pour eGFP-H2B pour zFRAP a un démérite, mais augmente la polyvalence de zFRAP. L’inaptitude de l’injection de l’ARNm est le préjudice causé par microinjection. Pour éviter cela, il est très efficace d’utiliser la souris transgénique eGFP-H2B. Si la lignée de souris transgéniques eGFP-H2B est utilisée, le taux de descendance peut être augmenté par rapport à l’affaire à l’aide de microinjection d’ARNm. À l’inverse, c’est le mérite de l’injection de l’ARNm que zFRAP permet l’utilisation de tout type de souche de souris de type sauvage. Les chercheurs qui veulent utiliser zFRAP avec leur intérêt des souris de souche n’avez pas besoin de préparer la souche de souris désiré avec eGFP-H2B transgène. Ce mérite devient plus important dans l’analyse de transgéniques (e.g. surexpression/knockdown) ou lignée de souris knock-out. Les chercheurs qui veulent utiliser zFRAP pour leurs sujets de recherche avec la ligne transgéniques knockout/ne pas préparer la lignée transgénique eGFP-H2B d’un nombre limité de leur intérêt ceux. Cela indique un avantage pour la progression de la recherche.

Analyse d’imagerie en direct avec les embryons préimplantatoires exige des connaissances spécialisées et des dispositifs spécialisés très coûteux et finement réglés. Par conséquent, l’introduction d’un tel système expérimental n’est pas une décision facile. Le système expérimental qui est établi dans la présente étude a besoin seulement un thermo-chauffage mis à part un confocal laser scanning microscope. En outre, la méthode est facile d’apprendre afin qu’un débutant dans un laboratoire peut apprendre la méthode de zFRAP en 1 mois. Cependant, il y a certaines questions qui doivent encore l’examen. Tout d’abord est dérive de mise au point. Pendant l’observation, il est possible que les pronucléus ou les zygotes s’écarter de la position où ils ont présenté avant le début de l’observation. En cas de la dérive de focus, ROIs écartent également la bonne position. Par conséquent, les données quantitatives devient sans valeur. Pour éviter ce problème, le chercheur doit utiliser le couvercle de la vaisselle de fond de verre pour la protection contre la fenêtre du climatiseur et attendez que l’expansion de l’huile sur la lentille de l’objectif. En cas de dérive de mise au point, données de zygotes qui DÉVIES devraient être jetées et une analyse de PAF 2nd avec les zygotes mêmes n’est pas recommandée. Dans cette étude, raccourcir le temps d’observation de 150 s3 à environ 25 s7 a été très utile. Deuxième est une incubation plus longue à l’extérieur de l’incubateur. Étant donné que la plus longue exposition à l’environnement à l’extérieur de l’incubateur est certainement dommageable pour le développement embryonnaire, il a été recommandé pour finir le FRAP-analyse moins de 1 h par lot. Le nombre de zygotes FRAP-analysées dans un tampon HEPES médias sur la vaisselle en verre bas devrait être de 6 à 10. Dans ces conditions expérimentales, le nombre maximal est d’environ 30 pendant 4 h, mais si plusieurs zygotes sont nécessaires, 20 zygotes par h peuvent être analysés en reportant l’évaluation de l’intensité de fluorescence dans la région de référence et l’arrière-plan. Troisième est « lié à la durée de dégradation du laser de la microscopie confocal laser ». Si le laser de blanchiment ne suffit pas, les données quantitatives correctes ne peuvent être obtenues en raison de blanchiment insuffisant. En effet, l’asymétrie parental de relâchement de la chromatine zygotiques ne peut s’acquérir avec un laser de blanchiment faible. Pour éviter cela, il est recommandé de vérifier si la puissance du laser a affaibli que l’occasion se présente. Dans cette étude, 110-µW blanchiment était suffisant pour l’acquisition d’asymétrie parental.

analyse de zFRAP peut être utilisée pour d’autres types de protéines, en plus des histones principales. Étant donné que les histones principales afficher bien en évidence la faible mobilité, plus total des temps d’observation (environ 25 s dans cette étude) est nécessaire dans l’analyse de zFRAP. Pour analyser un nombre considérable de zygotes, mise en culture dans du tampon HEPES médias sur l’appareil de chauffage pendant une longue période est donc inévitable. En revanche, pour l’analyse de zFRAP des protéines de haute mobilité, l’heure de l’observation totale réglable court, ce qui permet du temps de mise en culture dans du tampon HEPES médias sur l’appareil de chauffage courte. Par conséquent, puisqu’une exposition plus longue à l’environnement à l’extérieur de l’incubateur est très néfaste pour le développement embryonnaire, zFRAP analyse de protéines autres que les histones de noyau, qui ont une mobilité élevée par nature, semblent montrer moins toxiques que les histones de noyau . Il est à espérer que ce système expérimental aidera également l’étude des relations entre les divers événements moléculaires et le développement embryonnaire.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions Satoshi Kishigami, Sayaka Wakayama, Hiroaki Nagatomo, Satoshi Kamimura et Kana Kishida pour fournir des commentaires critiques et support technique. Ce travail a été financé en partie par le ministère de l’éducation, Culture, Sports, Science and Technology programme pour promouvoir la réforme des universités nationales de M.O. ; la société japonaise pour la Promotion des sciences (16H 02593), Asada Science Foundation et la Fondation de la Science de Takeda à T.W. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données et analyse, décision de publier ou préparation du manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal laser scaning microscope Olympus FV1200 FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7)
Thermo plate Tokai Hit TP-110RH26
Inverted microscope Olympus IX71
Micro manupilator Narishige MMO-202ND
Pieze Micro Micromanipulator Prime tech PMAS-CT150
35 mm culture dish Falcom 351008 35 x 100 mm style; for IVF
60 mm culture dish Falcom 351007 60 x 15 mm style; for embryo culture
50 mm culture dish Falcom 351006 50 x 9 mm style; for manipulation on the stage
50 mm glass bottom dish Matsunami D910400 50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis
Mineral oil Organic spceiality chemicals 625071 For FRAP analysis on the glass bottom dishes
Mineral oil Sigma M8410-1L For IVF and embryo culture
glass capillary Drummond 1-000-1000 For handling mouse zygotes
Borosilicate glass Prime tech B100-75-10-PT For microinjection of mRNA
Micropipett puller Sutter instrument P-97/IVF For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm) 
Microforge  Narishige MF-900
mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit Thermo
Fisher scientific
AM1340
Poly (A) tailing kit Thermo
Fisher scientific
AM1350
PVP solution 10% (PVP-HTF) IrvineSceientific 99311 HEPES buffered HTF containing 10% PVP
Sodium HEPES Sigma H3784
pTOPO eGFP-H2B Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6)
NorthernMax Gly Sample loading Dye  Thermo
Fisher scientific
AM8551 For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA
Phenol chloroform isamyl alcohol nacalai tesque 25970-14
Chloroform nacalai tesque  08401-65
Not I TOYOBO NOT-111X
Ethachinmate WAKO 318-01793
3664 Otical power meter Hioki 3664  Power meter for laser power
Stereomicmicroscope Olympus SZX16

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References

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Zygotiques Fluorescence Recovery After blanchiment Photo analyse de relâchement de la chromatine qui permet un développement à terme
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Ooga, M., Funaya, S., Aoki, F., Wakayama, T. Zygotic Fluorescence Recovery After Photo-bleaching Analysis for Chromatin Looseness That Allows Full-term Development. J. Vis. Exp. (136), e57068, doi:10.3791/57068 (2018).More

Ooga, M., Funaya, S., Aoki, F., Wakayama, T. Zygotic Fluorescence Recovery After Photo-bleaching Analysis for Chromatin Looseness That Allows Full-term Development. J. Vis. Exp. (136), e57068, doi:10.3791/57068 (2018).

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