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Developmental Biology

Zygotic प्रतिदीप्ति वसूली के बाद फोटो-ब्लीचिंग विश्लेषण के लिए क्रोमेटिन शिथिलता है कि पूर्ण अवधि के विकास की अनुमति देता है

doi: 10.3791/57068 Published: June 12, 2018

Summary

क्रोमेटिन शिथिलता blastomeres की विकासात्मक क्षमता में सम्मिलित प्रतीत होती है. तथापि, यह ज्ञात नहीं है कि क्रोमेटिन शिथिलता भ्रूण के लिए विकासात्मक क्षमता के लिए एक विश्वसनीय सूचकांक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । यहाँ, एक प्रायोगिक प्रणाली जिसमें क्रोमेटिन शिथिलता-मूल्यांकित zygotes को पूर्ण कालिक विकसित कर सकते हैं, वर्णित किया गया है.

Abstract

लाइव इमेजिंग एक शक्तिशाली उपकरण है कि ontogenesis के दौरान आणविक घटनाओं के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है । हाल ही में, क्रोमेटिन शिथिलता या खुलेपन pluripotent भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के सेलुलर भिंनता क्षमता में शामिल होना दिखाया गया है । यह पहले बताया गया था कि भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के साथ तुलना में, zygotes बंदरगाह एक अत्यंत ढीला क्रोमेटिन संरचना, उनके totipotency के साथ अपने सहयोग का सुझाव. हालांकि, अब तक, यह संबोधित नहीं किया गया है कि यह अत्यंत ढीला/खुला क्रोमेटिन संरचना भ्रूण विकासात्मक क्षमता के लिए महत्वपूर्ण है । वर्तमान अध्ययन में, इस परिकल्पना की जांच करने के लिए, एक प्रयोगात्मक प्रणाली जिसमें zygotes है कि फोटो ब्लीचिंग के बाद प्रतिदीप्ति वसूली द्वारा विश्लेषण किया गया किसी भी महत्वपूर्ण नुकसान के बिना कार्यकाल विकसित कर सकते है विकसित किया गया था । महत्वपूर्ण बात यह है कि इस प्रायोगिक प्रणाली में एक फोकल लेसर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के अलावा केवल एक थर्मामीटरों-प्लेट हीटर की जरूरत है । इस अध्ययन के निष्कर्षों का सुझाव है कि प्रतिदीप्ति वसूली के बाद फोटो-ब्लीचिंग विश्लेषण (frap है) विश्लेषण से यह पता लगाया जा सकता है कि zygotic क्रोमेटिन में आणविक घटनाएँ पूर्ण कालिक विकास के लिए महत्वपूर्ण हैं या नहीं.

Introduction

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निषेचन के बाद, क्रोमेटिन संरचना गतिशील रूप से बदल गया है, और zygotic क्रोमेटिन संरचना तो अंततः1,2की स्थापना की है । इस अवधि के दौरान, पैतृक pronuclei में, प्रमुख क्रोमेटिन प्रोटीन protamine से हिस्टोन में बदल जाता है । परिणामस्वरूप क्रोमेटिन कई बिंदुओं में शुक्राणुओं और मादा अंडाणुओं से बेहद अलग है (जैसे, हिस्टोन वैरिएंट संरचना, हिस्टोन संशोधन). इस प्रकार, गठन zygotic क्रोमेटिन बाद भ्रूण के विकास के लिए महत्वपूर्ण माना जाता है । हालांकि, लंबे समय से अधिक zygotic क्रोमेटिन संरचना के विवरण प्रकट करने के प्रयासों के बावजूद, विधियों zygotes की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए या उनके क्रोमेटिन संरचना का विश्लेषण करके एक सेल चरण में उनकी पूर्ण अवधि के विकास की भविष्यवाणी करने के लिए कभी नहीं किया गया है स्थापित.

पिछले अध्ययन में यह पता चला है कि zygotes एक अत्यंत ढीला क्रोमेटिन संरचना3है । वर्तमान में, क्रोमेटिन शिथिलता या खुलेपन भ्रूण स्टेम (ES) कोशिकाओं4में सेलुलर विभेदक क्षमता के लिए एक महत्वपूर्ण कारक माना जा रहा है । ES कोशिकाओं प्रकृति में एकरूपता का प्रदर्शन नहीं है, बल्कि विषम हैं; ES सेल कालोनियों में, कुछ क्षणिक एक उच्च भेदभाव संभावित दो सेल स्टेज भ्रूण के blastomeres के लिए तुलनीय प्राप्त करते हैं । राज्य की तरह दो सेल में इस संक्रमण के दौरान, ES कोशिकाओं में क्रोमेटिन शिथिलता क्या दो सेल स्टेज भ्रूण5के साथ तुलनीय है में परिवर्तन । इस प्रकार, क्रोमेटिन शिथिलता सेलुलर विभेदक क्षमता के लिए महत्वपूर्ण लगती है और यह संभव है कि zygotes में बड़े पैमाने पर खुला क्रोमेटिन zygotic विकासात्मक क्षमता के मूल्यांकन के लिए उपयोगी हो.

लाइव इमेजिंग एक शक्तिशाली उपकरण है कि ontogenesis के दौरान आणविक घटनाओं के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है के बाद से इस विधि बाद के विकास के लिए अनुमति देता है और यहां तक कि पूर्ण अवधि के विकास6। लाइव इमेजिंग तरीकों में से एक के रूप में, frap है विश्लेषण प्रत्यारोपण भ्रूण और ES कोशिकाओं3,4,5में क्रोमेटिन शिथिलता की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । यदि zygotic क्रोमेटिन शिथिलता frap है विश्लेषण द्वारा पूर्ण अवधि के विकास पर एक हानिकारक प्रभाव के बिना विश्लेषण किया जा सकता है, यह एक सेल मंच पर भ्रूण की गुणवत्ता के मूल्यांकन के लिए एक मूल्यवान उपकरण हो सकता है । तथापि, इस प्रायोगिक विधि द्वारा पूर्ण कालिक विकास पर प्रभाव की जांच नहीं की गई है. हाल ही में, एक प्रायोगिक प्रणाली का उपयोग frap है zygotic क्रोमेटिन शिथिलता का मूल्यांकन करने के लिए विकसित किया गया था । क्योंकि यह zygotes के लिए एक नई प्रेक्षण प्रणाली थी, यह zygotic frap है (zFRAP) के रूप में पद दिया गया था । zFRAP गंभीर पूर्ण अवधि के विकास को प्रभावित नहीं किया था और कहीं7सूचना दी गई है । इस रिपोर्ट में इस प्रायोगिक विधि का प्रोटोकाल बताया गया है ।

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Protocol

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इस अध्ययन की देखभाल और Yamanashi विश्वविद्यालय के प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए गाइड में सिफारिशों के साथ सख्त अनुसार प्रदर्शन किया गया । इस प्रोटोकॉल को समिति द्वारा विश्वविद्यालय के पशु प्रयोगों के आचार-Yamanashi (परमिट नंबर: A24-50) पर अनुमोदित किया गया था । सभी सर्जरी tribromoethanol संज्ञाहरण के तहत प्रदर्शन किया गया, और सभी प्रयासों को दुख कम करने के लिए किए गए थे । प्रक्रियाओं और समय तालिका का एक सचित्र अवलोकन चित्र 1 और तालिका 1, क्रमशः में दिखाए जाते हैं ।

1. दूत आरएनए की तैयारी (इन विट्रो प्रतिलेखन की eGFP-H2B mRNA)

  1. Linearize 5 µ जी के टेंपलेट डीएनए pTOPO-eGFP-H2B3,7 के साथ 30 U नहीं ५० µ l में ३७ डिग्री सेल्सियस रातोंरात ।
  2. पुष्टि है कि पूरी तरह से ट्रो द्वारा पचा के लिए पचा डीएनए के १.५ µ एल लीजिए ।
    1. लागू १.५ µ एल और 3-5 µ एल के 2% agarose जेल, क्रमशः के लिए डाई लोड हो रहा है, और ट्रो के अधीन के साथ अपच डीएनए के l ।
      नोट: यदि पूरी तरह से पचा, एक एकल बैंड (लगभग 5 केबी) मनाया जाता है । अपच वाले डीएनए को एक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है, जो एक अलग स्थिति में दिखाई देता है ।
  3. शेष पच डीएनए को phenol/क्लोरोफॉर्म/isoamyl अल्कोहल (25:24:1) के ddH2O और २०० µ l के १५१.५ µ l को जोड़ें ।
    1. भंवर द्वारा जोरदार मिश्रण ।
    2. 15 मिनट के लिए अधिकतम गति पर केंद्रापसारक ।
  4. supernatant को पुनर्प्राप्त करें और फिर क्लोरोफॉर्म के २०० µ l को जोड़ें ।
    1. भंवर द्वारा जोरदार मिश्रण ।
    2. 15 मिनट के लिए अधिकतम गति पर केंद्रापसारक ।
  5. supernatant को पुनर्प्राप्त करें और फिर 3m सोडियम एसीटेट के 20 µ एल और ethachinmate के १.५ µ एल जोड़ें ।
    1. भंवर द्वारा जोरदार मिश्रण ।
    2. जोड़ें १००% इथेनॉल के ५५० µ एल और फिर भंवर ने जोरदार मिश्रण ।
    3. 15 मिनट के लिए अधिकतम गति पर केंद्रापसारक ।
    4. supernatant त्यागें और फिर ७०% इथेनॉल के साथ गोली धो लो ।
    5. 5-10 मिनट के लिए वाष्पीकरण से गोली सूखी ।
  6. भंग nuclease-मुक्त पानी के 8 µ l में हाला प्लाज्मिड डीएनए.
  7. प्लाज्मिड एकाग्रता का आकलन (एकाग्रता की उंमीद के बारे में ३००-५०० एनजी/µ एल) nanodrop के साथ निर्माता के निर्देश का पालन करके ।
  8. इन विट्रो प्रतिलेखन के लिए mRNA एंकोडिंग eGFP-H2B के साथ 1 µ जी के साथ एक टेंपलेट के रूप में शुद्ध डीएनए की कुल प्रतिक्रिया की मात्रा के 20 µ एल में निर्माता के निर्देशों का पालन करके ।
    1. बाद में इन विट्रो प्रतिलेखन, जोड़ें ३६ μL पानी की तो १.५ µ l से ठीक ५६ µ एल के विश्लेषण के लिए संश्लेषित mRNA के लिए ट्रो द्वारा (के रूप में एक पाली के बिना).
  9. निर्माता के निर्देशों का पालन करके एक १०० µ एल प्रतिक्रिया मात्रा में संश्लेषित mRNA के लिए पाली एक पूंछ प्रदर्शन ।
  10. पाली के लिए लिथियम क्लोराइड वर्षा समाधान के ६० µ एल जोड़ें eGFP-H2B की पूंछ mRNA और फिर जोरदार मिश्रण ।
    1. 30 मिनट के लिए-30 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा ।
    2. 15 मिनट के लिए अधिकतम गति पर केंद्रापसारक ।
    3. supernatant त्यागें और फिर ७०% इथेनॉल के साथ गोली धो लो ।
    4. 5-10 मिनट के लिए वाष्पीकरण से गोली सूखी ।
  11. 30 मिनट के लिए ५५ ° c पर हीटिंग से मुक्त पानी nuclease के 20 µ एल के साथ गोली भंग ।
  12. nanodrop के साथ उपजी mRNA की एकाग्रता का आकलन करें । nuclease के साथ ५०० एनजी/µ एल को पतला-मुफ्त पानी और स्टोर पर-८० ° c उपयोग तक ।
  13. पसंदीदा mRNA उत्पादन की पुष्टि करें; विषय 1 µ l के साथ mRNA के/बिना (1.8.1 और १.१२ चरणों में प्राप्त, क्रमशः) पाली एक पूंछ ०.१ mg/एमएल ethidium ब्रोमाइड और 3 µ एल के १.५ µ एल के साथ मिश्रित ट्रो विश्लेषण के लिए नमूना लोड हो रहा है डाई. एप्लाइड वॉल्यूम था ५.५ µ l.
    नोट: यदि पाली एक पूंछ सफल रहा था, पाली एक पूंछ के बिना mRNA की तुलना में स्थानांतरित बैंड (चित्रा 2a) मनाया जाना चाहिए ।

2. Vasectomized नर चूहों की तैयारी

  1. वजन पैमाने का उपयोग कर 8-12 महीने में ICR पुरुष चूहों तौलना ।
  2. Intraperitoneally ०.७-०.९ मिलीलीटर १.२% tribromoethanol संज्ञाहरण के साथ पुरुष चूहों इंजेक्षन ।
    नोट: संज्ञाहरण की मात्रा माउस के आकार पर निर्भर करता है । उदाहरण के लिए, एक माउस ४० जी वजन tribromoethanol संज्ञाहरण के ०.८ मिलीलीटर के साथ इंजेक्शन है ।
  3. गीले ७०% इथेनॉल के साथ बेरी ।
  4. बेरी पर एक छोटा सा कट (3-5 मिमी) बनाओ और फिर कैंची की मदद से मांसपेशी की दीवार पर एक चीरा बनाओ ।
    नोट: सर्जरी शुरू करने से पहले कैंची और संदंश ७०% इथेनॉल के साथ साफ किया जाना चाहिए ।
  5. संदंश के साथ एक मोटी पैड पकड़ और धीरे से इसे बाहर निकाल । फिर, वृषण और वॉज deferens दिखाई देते हैं ।
    नोट: वॉज deferens एक यू के आकार का ट्यूब और एक लाल रक्त वाहिका के साथ है ।
  6. शल्य टांके के साथ दो बिंदुओं पर वॉज deferens से टाई और फिर बंधे अंक के बीच बाहर मध्य भाग में कटौती ।
  7. धीरे वापस वसा पैड और बेरी में वृषण धक्का ।
    1. शेष वृषण के साथ सर्जरी दोहराएं ।
  8. सर्जिकल टांका के साथ दो टांके के साथ मांसपेशी दीवार सीना ।

3. आईवीएफ

  1. 8-10 सप्ताह पुरानी महिला B6D2F1 (BDF1) चूहों intraperitoneally ७.५ IU घोड़े chorionic गोनॉडोट्रॉफिन (ईसीजी) और मानव chorionic गोनॉडोट्रॉफिन (एचसीजी) ४६-५० एच अंतराल के साथ सुई ।
  2. की बूंदें तैयार ३०० µ l मानव तूबल द्रव (HTF)8 मीडिया समाई और गर्भाधान के लिए एक 30-mm पकवान में आईवीएफ से पहले 1 दिन, प्रयोगशाला पीठ पर खनिज तेल के साथ इन बूंदों को कवर और फिर एक मशीन में रातोंरात गर्मी ।
  3. गर्भाशय ग्रीवा विस्थापन द्वारा परिपक्व नर ICR चूहों बलिदान । 27-जी सुई के साथ काटना cauda अधिवृषण और इकट्ठा spermatozoon । ३०० µ में समाई के लिए उंहें संस्कृति 1-2 के लिए HTF मीडिया के एल ३८ डिग्री सेल्सियस पर एच ।
  4. एचसीजी इंजेक्शन के बाद 16 एच, गर्भाशय ग्रीवा के विस्थापन द्वारा सुपर ovulation महिला चूहों बलिदान । ओवीडक्ट कलसा को HTF मीडिया के बगल में मिनरल ऑइल में ट्रांसफर करें और फिर इस अंडाणुओं ओवीडक्ट से मेघपुंज कोशिकाओं और कलसा कॉम्प्लेक्स को एक 30-जी सुई से तैयार कर के प्री-HTF मीडियम में ड्रा करें ।
    नोट: कुछ मादा चूहे अक्सर सुपर ovulation उपचार के बावजूद ovulation नहीं दिखा । बढ़े हुए ओवीडक्ट कलसा ovulation का संकेत है ।
  5. समाई के बाद, स्थानांतरण 2-3 µ के एल capacitated spermatozoon में गर्भाधान-HTF मीडिया जिसमें ovulation अंडाणुओं एकत्र किए गए थे ।
  6. गर्भाधान के बाद 1 ज, निषेचित zygotes इकट्ठा और CZB9 मीडिया में 10 मिनट के लिए १०० µ जी/एमएल में hyaluronidase के साथ उंहें इलाज ।
    नोट: जब गर्भाधान ठीक से किया जाता है, गर्भाधान के बाद 1 ज, 2एन डी ध्रुवीय शरीर के साथ निषेचित zygotes मनाया जाता है । यदि कम या कम गुणवत्ता वाले शुक्राणु का प्रयोग किया जाता है, केवल 2एन डी ध्रुवीय शरीर के साथ थोड़ा zygotes मनाया जाता है । इसके अलावा, यदि गर्भाधान के लिए कई शुक्राणुओं का उपयोग किया जाता है, तो polyspermy होती है । उचित गर्भाधान पुरुष और महिला pronuclei के साथ zygotes की ओर जाता है । इन मानदंडों का उपयोग करके यह पता लगाना संभव है कि गर्भाधान अच्छी तरह से किया गया है या नहीं ।
    1. CZB मीडिया में धोने के बाद, eGFP-H2B mRNA के साथ microinjection करने के लिए एक दूसरे ध्रुवीय शरीर के साथ zygotes विषय ।

4. चैंबर और Microinjection पिपेट की तैयारी

  1. २५० एनजी/µ एल की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए nuclease-मुक्त पानी का उपयोग eGFP-H2B एंकोडिंग आरएनए पतला
  2. PVP-HTF और eGFP-H2B ड्रॉप्स mRNA की 2-3 बूंदें तैयार करें, और ६०-mm डिश पर Hepes बफ़र्ड CZB (H-CZB) की 5-6 बूंदें बूंदें । खनिज तेल के साथ इन बूंदों को कवर ।
    नोट: इन तैयारियों को प्रयोगशाला पीठ पर प्रदर्शन किया जा सकता है । लामिना airflow कैबिनेट का उपयोग करने के लिए कोई आवश्यकता नहीं है ।
  3. एक micropipette खींचने के साथ borosilicate ग्लास खींचो (जैसे, पी = ५००, हीट = ८२५, पुल = 30, vel = १२०, और समय = २००)
  4. पिपेट की नोक को तोड़ने के बाद, खींचा हुआ गिलास microinjection पिपेट करीब 30 ° पर एक microforge का उपयोग कर टिप (− ३०० µm back) के पास झुकाएं ।

5. Microinjection

  1. mRNA इंजेक्शन के दौरान एक पीजो के साथ zygotes की हत्या को रोकने के लिए micromanipulator के मंच पर प्लेट हीटर बंद कर दें ।
  2. धो और कोट HEPES में इंजेक्शन सुई के अंदर-बफ़र्ड 10% pvp (pvp-HTF) युक्त HTF ।
  3. एक 2एन डी ध्रुवीय शरीर के साथ निषेचित zygotes लीजिए (आंकड़ा 2 बी) और माइक्रोस्कोप एक micromanipulator के साथ संलग्न मंच के चैंबर पर 20-25 zygotes हस्तांतरण ।
  4. इस पतला eGFP-H2B mRNA borosilicate ग्लास केशिकाओं में सुझावों से भरें ।
  5. युग्मनज को एक होल्डिंग पिपेट के साथ धारण करें और फिर zona pellucida और cytosolic झिल्ली को पीजो ड्राइव से तोड़ें ।
  6. zygotes के कोशिका द्रव्य में mRNA के लगभग 10 pL इंजेक्षन । खत्म mRNA-10 मिनट के भीतर इंजेक्शन के कारण अब मशीन के बाहर zygotes संवर्धन नुकसान को रोकने के लिए ।
    नोट: इंजेक्शन की मात्रा के रूप में 2एन डी ध्रुवीय शरीर के रूप में बड़े होना चाहिए । यदि mRNA इंजेक्शन की मात्रा बहुत अधिक हो तो यह निःशुल्क eGFP-H2B अंश के कारण संभव है, जो मोबाइल अंश को प्रभावित कर सकता है.
  7. microinjection के बाद 10 मिनट, कम से कम 3 बूंदों में धो लें और फिर संस्कृति zFRAP विश्लेषण तक ३८ डिग्री सेल्सियस पर CZB में इंजेक्शन zygotes ।

6. zFRAP विश्लेषण

  1. 1 ज zFRAP विश्लेषण करने से पहले, फोकल माइक्रोस्कोप के मंच से जुड़ी लेजर और गर्म थाली पर बारी । ३८ डिग्री सेल्सियस पर तापमान सेट करें ।
  2. HEPES के 6-10 µ एल डाल-बफर CZB मीडिया ६० पर खनिज तेल के साथ कवर-mm ग्लास नीचे पकवान और युग्मनज संग्रह तक हीटर पर गर्म ।
  3. 8-12 ज गर्भाधान के बाद, जमा 5-10 eGFP-H2B-व्यक्त zygotes और पूर्व उष्ण HEPES-बफ़र्ड CZB मध्यम ड्रॉप के 6-10 µ l में अंतरण ।
    नोट: मशीन के बाहर अब संवर्धन से बचने के लिए, 5-10 eGFP-H2B व्यक्त zygotes प्रत्येक विश्लेषण में इस्तेमाल किया गया । 1 ज के भीतर 5 से 10 zygotes का विश्लेषण किया जा सकता है ।
  4. निर्माता के निर्देशों के अनुसार ब्लीचिंग और इमेजिंग शर्तों को निर्धारित करें । मामला एक फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (सामग्री की तालिका) नीचे दिखाया गया है:
    1. 60X ऑइल लेंस (60X 60X/1.35 oil) का उपयोग करें ।
      नोट: उच्च आवर्धन (उच्च संख्यात्मक एपर्चर) के साथ लेंस उच्च संवेदनशीलता दिखाते हैं ।
    2. "५१२" पर "अधिग्रहण सेटिंग" (पूरक चित्रा 1) के रूप में ४.० µs/पिक्सेल और आकार के रूप में स्कैनिंग गति सेट करें ।
    3. डिजिटल ज़ूम बढ़ाने के लिए "5" (पूरक चित्रा 1) ।
      नोट: एक उच्च ज़ूम फोकस प्रवाह होता है या नहीं, यह पहचानने के लिए आवश्यक है ।
    4. ओपन डाई सूची (पूरक चित्रा 1) और फिर चुना "EGFP". १.६ s के रूप में अवलोकन समय सेट करें (अंतराल "मुक्त चलाएँ" सेटिंग के रूप में सेट किया गया है) (पूरक चित्रा 1)
      नोट: अधिक अवलोकन बिंदु अधिक विस्तृत डेटा का कारण हो सकता है, लेकिन यह भी phototoxicity कारण हो सकता है । zFRAP विश्लेषण में, एक १.६ s अवलोकन समय क्रोमेटिन शिथिलता की पैतृक विषमता का पता लगाने के लिए पर्याप्त होने लगता है.
    5. कुल (पूरक चित्रा 1) में 12 के रूप में चित्रों की संख्या निर्धारित करें ।
    6. शुरू "उत्तेजना सेटिंग" पैनल और फिर क्लिक करें "मुख्य" UseScanner पर । १०.० µs/पिक्सेल के रूप में स्कैनिंग गति सेट करें । "श्रृंखला में सक्रियण" पर क्लिक करें और फिर "5 सेकंड" (पूरक चित्रा 1) के रूप में "3 फ़्रेम" और सक्रियण समय के रूप में सक्रियकरण सेट ।
    7. "फोकस एक्स 2" पर क्लिक करें और फोकस सेट और फिर "बंद करो."
    8. सेट ब्लीचिंग और इमेजिंग लेजर पावर (४७७ एनएम) ११० और 15 µW, क्रमशः समायोजित करके, "लेजर पण शक्ति" (पूरक चित्रा 1) ।
      नोट: बहुत मजबूत ब्लीचिंग एक बड़ा ब्लीचिंग क्षेत्र का कारण हो सकता है, जो मात्रात्मक विश्लेषण के लिए कठिनाइयों का कारण बनता है. लेजर शक्ति के माप के लिए, एक बिजली मीटर का उपयोग करें । लेजर पावर के समय-संबंधित गिरावट के प्रभाव से बचने के लिए लेजर पावर की पुष्टि करना जरूरी है ।
    9. क्लिक करें "क्लिप रंगरूट" (पूरक चित्रा 1) उत्तेजना सेटिंग पैनल में । ब्याज का क्षेत्र सेट करें (ROI; लाल; रॉय #1B) के रूप में ४० x ४० पिक्सल (७.६ µm2) । कोई संदर्भ क्षेत्र तैयार करें (REF; हरा; रॉय #2), और एक पृष्ठभूमि (BG; नीला; रॉय #3) का उपयोग कर "कॉपी रॉय" और "पेस्ट रॉय" (माउस पर राइट-क्लिक करें बटन) ।
      नोट: पिक्सेल आकार "रॉय प्रबंधक" के माध्यम से सेट किया जा सकता है जो माउस के सही बटन पर क्लिक करके कॉल किया जा सकता है जब कर्सर रॉय पर है । बड़ा ROIs के लिए बेहतर माना जाता है क्योंकि वे zFRAP स्कोर के फैलाव को मानकीकृत कर सकते हैं । हालांकि, इस विश्लेषण के लिए बहुत अधिक ROI का उपयोग नहीं किया जा सकता क्योंकि इससे nucleolus के प्रणेता शरीर (NPB) से बचना मुश्किल हो जाता है । eGFP-H2B इस डिब्बे में क्रोमेटिन से मुक्त होने लगा था और उल्लेखनीय उच्च गतिशीलता3दिखाया । रॉय और रेफरी क्षेत्रों के रूप में ज्यादा संभव के रूप में अलग किया जाना चाहिए । यदि इन दोनों क्षेत्रों के करीब हैं, ब्लीचिंग भी रेफरी के क्षेत्र को प्रभावित कर सकते हैं ।
    10. उपकरण पट्टी पर "लाइव" पर क्लिक करें और फिर "लाइव प्लॉट" (पूरक चित्रा 1) शुरू.
      नोट: लाइव भूखंड प्रत्येक रॉय के भीतर प्रतिदीप्ति संकेत तीव्रता इंगित करता है और एचवी का उपयोग कर लेजर शक्ति को एडजस्ट करने के लिए प्रयोग किया जाता है । ध्यान दें कि यदि ROI चयनित नहीं है, कोई तीव्रता लाइव प्लॉट पैनल पर पता लगाया जाएगा ।
    11. रॉय की स्थिति का निर्धारण
      नोट: ROI को pronuclei में वांछित स्थिति में खींचकर ले जाया जा सकता है. (1) nucleolus से बचने के लिए सुनिश्चित हो, और (2) nucleoplasm में पूरे रॉय फिट । परमाणु झिल्ली (कोशिका द्रव्य) के क्षेत्र के बाहर रॉय में क्षेत्र को शामिल न करें । eGFP-H2B का स्थानीयकरण nucleoplasm में अत्यधिक सीमित होता है जिससे यह पता लगाना आसान हो जाता है कि ROI में कोशिका द्रव्य हैं या नहीं प्रतिदीप्ति-eGFP के H2B से. पुरुष pronuclei के लिए महिलाओं, जो अक्सर 2एन डी ध्रुवीय शरीर के पास स्थानीयकृत है की तुलना में बड़ा हो जाते हैं । इन मानदंडों का उपयोग करते हुए, ंयायाधीश पुरुष या महिला pronuclei ।
    12. क्लिक करें "फोकस एक्स 2" (पूरक चित्रा 1) और फिर EGFP के लिए चैनल के एचवी power पण को समायोजित प्रतिदीप्ति तीव्रता में लगभग २००० (प्रतिदीप्ति तीव्रता "लाइव प्लॉट" विंडो में देखा जा सकता है).
  5. क्लिक करें "समय" और फिर "XY" (पूरक चित्रा 1) zFRAP विश्लेषण शुरू करने के लिए ।
    नोट: "समय" बटन उपयुक्त चयनित है, तो "XY" बटन पर "t" प्रकट होता है ।
    1. "XY बटन" के पास frap है इमेजिंग के बाद प्रकट होता है और फिर frap है-विश्लेषण डेटा प्राप्त करें जो "श्रृंखला किया" (पूरक चित्रा 1)
    2. फ़ाइल सहेजें "2d देखें-छवि XXXXX" एक पसंदीदा नामांकित फ़ाइल (oib. file प्रारूप) के रूप में "के रूप में सहेजें" (Ctrl + Shift + S भी इस्तेमाल किया जा सकता है) ।
    3. रॉय का चयन करें, रेफरी, और बीजी और फिर क्लिक करें (Ctrl + A भी इस्तेमाल किया जा सकता है) "2d देखें छवि" विंडो में "श्रृंखला विश्लेषण" ।
    4. पंक्ति frap है डेटा प्राप्त करें और उसके बाद लाइव प्लॉट विंडो में "सहेजें" बटन क्लिक करते हैं ।
      नोट: पंक्ति frap है मात्रात्मक डेटा एक csv फ़ाइल के रूप में सहेजा जाता है ।
  6. कोई zFRAP नियंत्रण के लिए, ड्रॉप पर mRNA के साथ इंजेक्शन zygotes के कुछ डाल दिया है, जो ग्लास नीचे व्यंजन के रिम के पास है प्रतिदीप्ति अवलोकन से प्रभाव से बचने के लिए ।

7. डेटा गणना

  1. प्राप्त मात्रात्मक डेटा का उपयोग करते हुए, कुछ संशोधनों के साथ संदर्भ3,7 में दिखाए गए के रूप में "वसूली वक्र" और "मोबाइल भिन्न" का ग्राफ बनाने के लिए (नीचे और पूरक एक्सेल फ़ाइल देखें).
  2. प्रत्येक समय बिंदु के लिए 12 चित्रों में रॉय और रेफरी के उन से बीजी के मूल्य को घटाकर सापेक्ष तीव्रता की गणना ।
  3. कि रेफरी के द्वारा रॉय के मूल्य फूट डालो । एक परिणाम के रूप में, 12 मानकीकृत प्रत्येक समय बिंदु पर सापेक्ष तीव्रता स्कोर प्राप्त किया जा सकता है ।
  4. 3 फोटो ब्लीचिंग से पहले लिया छवियों में रॉय के लिए सापेक्ष स्कोर के औसत की गणना ।
  5. वसूली दर की गणना । प्रत्येक समय बिंदु पर लिया छवियों में रॉय के लिए 12 प्राप्त सापेक्ष स्कोर विभाजित (7.1.2 में प्राप्त.) फोटो ब्लीचिंग से पहले रिश्तेदार स्कोर के औसत से (7.1.3 में प्राप्त.) । इन स्कोर (चित्रा 2E) का उपयोग कर के साथ वसूली वक्र ड्रा ।
  6. ब्लीचिंग रेट की गणना करें ।
    नोट: ब्लीचिंग दर (%) = १००-4वें छवि की वसूली दर ।
  7. इस प्रकार10,11,12 के रूप में सूत्र का उपयोग करके मोबाइल अंश (MF) की गणना
    MF (%) = 12वें वसूली दर (अंत बिंदु पर)-4वें वसूली दर/ब्लीचिंग दर × १०० ।

8. भ्रूण हस्तांतरण

  1. मेट परिपक्व ICR महिलाओं के साथ 8-12 महीने में vasectomized नर ICR चूहों ने भ्रूण हस्तांतरण से पहले रात को एक ही पिंजरे में भर कर उन्हें दे दिया.
  2. भ्रूण है कि zFRAP-विश्लेषण किया गया और दो सेल चरण के लिए विकसित करने के लिए निर्धारित ले लीजिए ।
  3. Intraperitoneally ०.७ के साथ महिला चूहों इंजेक्षन-०.९ मिलीलीटर १.२% tribromoethanol संज्ञाहरण या के साथ ०.३५-०.४५ मिलीलीटर की 0.75/4/5दिन/kg medetomidine/मिदाजोलम/butorphanol मिश्रित एजेंट भ्रूण हस्तांतरण करने से पहले ।
    नोट: संज्ञाहरण की मात्रा चूहों के शरीर के वजन से निर्धारित होता है । Tribromoethanol: ०.२ मिलीलीटर/10 शरीर के वजन के g; medetomidine/मिदाजोलम/butorphanol मिश्रित एजेंट्स: ०.१ mL/शरीर के वजन के 10 ग्राम ।
    1. ०.५ दिन बाद coitum (डीपीसी) में एक योनि प्लग के साथ pseudopregnant महिला ICR चूहों के oviducts में इन दो सेल स्टेज भ्रूण स्थानांतरण ।
    2. भ्रूण स्थानांतरण के बाद, मादा चूहों ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेट हीटर पर वे जाग जब तक डाल दिया ।
  4. १८.५ डीपीसी में, गर्भाशय ग्रीवा विच्छेदन द्वारा सरोगेट मां बलिदान और zFRAP से व्युत्पंन पिल्ले ठीक सीजेरियन सेक्शन द्वारा zygotes विश्लेषण किया । बरामद पिल्ले के कुछ पालक मां को दिया गया था और उनके शरीर के वजन प्रत्येक सप्ताह मूल्यांकन किया गया ।

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Representative Results

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eGFP-H2B के साथ zFRAP विश्लेषण

ठीक से उत्पादित mRNA एन्कोडिंग eGFP-H2B, जो पाली एक पूंछ (चित्रा 2a) के कारण एक स्थानांतरित बैंड के रूप में देखा जाता है, गर्भाधान के बाद 1-3 एच में एक 2 ध्रुवीय शरीर के साथ zygotes के कोशिका द्रव्य में इंजेक्ट किया गया था (चित्रा 2 बी). आठ से 12 ज गर्भाधान के बाद, zygotes 2 pronuclei के साथ eGFP-H2B की अभिव्यक्ति दिखा रहे थे एकत्र और zFRAP विश्लेषण (चित्रा 2c) के अधीन थे । frap है विश्लेषण ब्लीचिंग और वसूली कदम के होते हैं । प्री-ब्लीचिंग चरण में, eGFP-H2B के सिग्नल को देखा जा सकता है (चित्र 2d-1), लेकिन एक बार ब्लीच किए जाने के बाद, संकेत नगण्य स्तर (चित्र 2d-2) में आ गया । ब्लीचिंग सफल था, तो एक डार्क होल के रूप में बड़े रॉय के रूप में जल्द ही ब्लीचिंग के बाद दिखाई दिया । ब्लीचिंग के बाद, eGFP-H2B प्रतिदीप्ति सिग्नल की तीव्रता थोड़ा बरामद; nucleoplasm (चित्रा 2d-3) में unब्लीच्ड क्षेत्र से रॉय में eGFP-H2B के unब्लीच्ड अंश की बहिर्वाह की वजह से धीरे-से फ्लोरोसेंट संकेत वृद्धि हुई है । क्रोमेटिन शिथिलता के zFRAP विश्लेषण की सफलता की पुष्टि के लिए, यह क्रोमेटिन शिथिलता के पैतृक विषमता का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है; पुरुष pronuclei एक तेजी से वसूली वक्र और महिलाओं की तुलना में अधिक मोबाइल अंश दिखाया (चित्रा 2E और एफ) । zFRAP विश्लेषण के बाद, धोया और CZB मीडिया में संस्कृतिपूर्ण zygotes, महत्वपूर्ण क्षति (चित्रा 2 जी और एच) के बिना ब्लास्टोसिस्ट चरण के लिए विकसित कर सकते हैं । यहां तक कि अगर जोरदार एक लंबे समय के लिए प्रक्षालित, zygotes अभी भी ब्लास्टोसिस्ट चरण में विकास के रूप में अच्छी तरह से7सकता है ।

zFRAP-विश्लेषित zygotes के पूर्ण कालिक विकास का विश्लेषण

zFRAP-विश्लेषित zygotes से प्राप्त भ्रूणों की पूर्ण अवधि के विकास का विश्लेषण करने के लिए, दो सेल स्टेज पर भ्रूण pseudopregnant माताओं के oviducts में स्थानांतरित कर दिया गया । नियंत्रण के रूप में, बरकरार भ्रूण, और एक mRNA के साथ इंजेक्शन लेकिन नहीं zFRAP-विश्लेषण तैयार थे । zFRAP की जंम दर-विश्लेषण भ्रूण (४१.०%) थोड़ा था, लेकिन काफी बरकरार भ्रूण की तुलना में कम (६२.२%), लेकिन था कि नहीं zFRAP नियंत्रण के रूप में एक ही (५२.६%) (तालिका 2) । इस प्रकार, zFRAP-विश्लेषण के लिए थोड़ा पूर्ण अवधि के भ्रूण के विकास के लिए हानिकारक लगता है । हालांकि, महत्वपूर्ण बात, पिल्ले zFRAP से व्युत्पंन-विश्लेषण zygotes स्वस्थ लग रहा था और पूरी तरह से विकसित (चित्रा 3) ।

Figure 1
चित्रा 1: प्रयोगों के लिए प्रक्रियाओं के प्रवाह का एक योजनाबद्ध चित्रण. इन विट्रो निषेचन: हौसले से एकत्र metaphase द्वितीय (मिि) अंडाणुओं capacitated शुक्राणु के साथ inseminated थे । इन विट्रो में प्रतिलेखन: दूत आरएनए (mRNA) एंकोडिंग eGFP-जुड़े हिस्टोन H2B (eGFP-H2B) रैखिक SP6 के pTOPO प्रमोटर से लिखित थे-eGFP-H2B3 नहीं मैं के साथ । eGFP-H2B mRNA के अधीन पाली एक पट और फिर शुद्धिकरण. शुद्ध eGFP-H2B mRNA का प्रयोग mRNA इंजेक्शन में किया जाता है । mRNA इंजेक्शन: तैयार eGFP-H2B mRNA 2एन डी ध्रुवीय शरीर के साथ कोशिका द्रव्य के zygotes में इंजेक्ट किया जाता है । zfrap है analysis: eGFP-H2B-व्यक्ती zygotes zFRAP विश्लेषण के अधीन थे. हितों के क्षेत्र (रॉय, लाल आयत) एक मजबूत लेजर के साथ ब्लीच किया गया था और फिर eGFP-H2B संकेत एक नगण्य स्तर तक मना कर दिया । ब्लीचिंग होने के बाद eGFP-H2B सिग्नल की तीव्रता धीरे-धीरे बढ़ जाती है । इन विट्रो में विकास: zFRAP विश्लेषण के बाद, zygotes ब्लास्टोसिस्ट अवस्था में विकसित हो सकता है । भ्रूण स्थानांतरण: दो सेल स्टेज पर, zFRAP-विश्लेषण भ्रूण pseudopregnant मादा चूहों के oviducts में स्थानांतरित कर दिया गया । 18 दिन बाद, स्वस्थ रहते पिल्ले zFRAP से प्राप्त किया जा सकता है-भ्रूण विश्लेषण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: eGFP-H2B के साथ zygotes का zFRAP विश्लेषण । (एक) द्वारा ठीक से तैयार mRNA की प्रतिनिधि छवि इन विट्रो प्रतिलेखन और पाली एक पूंछ । लेन 1: पूर्व पाली एक पूंछ; लेन 2: पोस्ट पाली एक पूंछ । (ख) mRNA एंकोडिंग eGFP-H2B को 2nd ध्रुवीय शरीर 1-3 एच पोस्ट गर्भाधान (zygotes) के साथ hpi के कोशिका द्रव्य में इंजेक्ट किया गया था । स्केल बार = 25 µm (C) 8-12 hpi पर eGFP-H2B-व्यक्त zygotes एकत्र किए गए । सफेद तारक nucleolus के प्रणेता निकाय (NPB) दिखाते हैं. स्केल बार = 10 µm (d) eGFP-H2B अभिव्यक्ति पूर्व ब्लीचिंग चरण (डी-1) में NPB में भी पूरे nucleoplasm में पता लगाया गया था, ब्लीचिंग (डी-2) के बाद जल्द ही, और वसूली के बाद (डी-3). परमाणु झिल्ली (सफेद बिंदीदार रेखाएं) और NPB (तारक) संकेत कर रहे हैं । स्केल बार = 10 µm. (ई, एफ) वसूली वक्र और मोबाइल अंश ४५ zygotes से 5 स्वतंत्र प्रयोगों में प्राप्त किए गए । नीला और लाल क्रमशः पुरुष और महिला इंगित करता है । वसूली घटता में, एकल हलकों को मापने बिंदु संकेत मिलता है । तितर बितर भूखंडों में, एकल डॉट्स pronuclei से प्राप्त मोबाइल अंशों के स्कोर का संकेत देते हैं । (छ) zFRAP-विश्लेषित zygotes के आरोपण विकास के प्रतिनिधि चित्र दिखाए गए हैं. दो सेल, 4-8 सेल, और ब्लास्टोसिस्ट स्टेज भ्रूण पर 24, ४८, और ९६ hpi, क्रमशः । येलो सर्कल अच्छी तरह से विकसित ब्लास्टोसिस्ट को इंगित करता है । इस ब्लास्टोसिस्ट बढ़े और सही पैनल पर दिखाया गया है । स्केल बार = १०० µm. (ज) zFRAP के विकासात्मक दरों का बार ग्राफ-भ्रूण का विश्लेषण किया । सलाखों के संकेत zFRAP-विश्लेषण (zFRAP) भ्रूण (सफेद) और नियंत्रण भ्रूण (काला) mRNA के साथ इंजेक्शन लेकिन कोई zFRAP विश्लेषण (कोई zFRAP) । दिखाया डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों से कर रहे हैं, कुल में कम से ५७ भ्रूण की जांच. दो-कक्ष, 4-8 कक्ष, मोरूला (Mo), और ब्लास्टोसिस्ट (बीएल) चरणों क्रमशः 24, ४८, ७२, और ९६ hpi पर मनाया गया । यह आंकड़ा [Ooga एट अल २०१७]7से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: frap है से व्युत्पंन पिल्ले के स्वस्थ विकास-zygotes विश्लेषण किया । (क) zFRAP-विश्लेषित zygotes से प्राप्त पिल्ले की तस्वीरें दिखाई जाती हैं. (ख) सामान्य वृद्धि zFRAP-विश्लेषण पिल्ले के नर्सिंग के दौरान मनाया गया । (ग) ग्राफ बरकरार भ्रूण (नीला), unब्लीच्ड नियंत्रण भ्रूण (लाल), और zFRAP-विश्लेषित भ्रूण (हरा) से व्युत्पंन पिल्ले के वजन को इंगित करता है । 29 पिल्ले के शरीर वजन बरकरार भ्रूण से व्युत्पंन, 24 नहीं से zFRAP भ्रूण, और 15 से zFRAP-एक 8 सप्ताह की अवधि में भ्रूण विश्लेषण । तारांकन चिह्न द्वारा इंगित मान बरकरार नियंत्रण से काफी अलग हैं । यह आंकड़ा [Ooga एट अल २०१७]7से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

पूरक चित्रा 1: frap है विश्लेषण के लिए ग्राफिकल यूजर इंटरफेस । (A) ग्राफ़िकल यूज़र इंटरफ़ेस का ओवरव्यू दिखाया गया था। (ख) प्रत्येक खिड़की के लिए बढ़े हुए चित्र दिखाए गए. (1) अधिग्रहण सेटिंग विंडो छवि अधिग्रहण शर्त सेट करने के लिए उपयोग किया जाता है । (2) उत्तेजना सेटिंग खिड़की ब्लीचिंग हालत स्थापित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । इस विंडो को इमेज अधिग्रहण विंडो पर बटन पर क्लिक करके खोला जा सकता है । (3) frap है विश्लेषण के लिए छवि प्राप्ति नियंत्रण विंडो का उपयोग किया जाता है । (4) लाइव देखें वर्तमान छवि (वर्तमान छवि ध्यान दें x2 या XY बटन पर क्लिक करने के बाद प्रकट होता है) दिखाता है । लाल, हरे, और हल्के नीले रंग की आयतों रॉय शो (ब्याज के क्षेत्र), रेफरी (संदर्भ), और बीजी (पृष्ठभूमि), क्रमशः । (5) 2 डी दृश्य frap है छवि विश्लेषण से पता चलता है और "श्रृंखला किया" बटन पर क्लिक करने के बाद प्रकट होता है । इस मामले में, एक frap है-विश्लेषण पुरुष नाभिक एक उदाहरण के रूप में दिखाया गया है । 8 डॉट्स के साथ तीन आयतों का संकेत है कि इन क्षेत्रों का चयन कर रहे हैं । (६) जीवित भूखंड प्रत्येक क्षेत्र में वर्तमान प्रतिदीप्ति तीव्रता दिखाता है. X और Y अक्षों संकेत समय (ms) और प्रतिदीप्ति तीव्रता, क्रमशः । (7) श्रृंखला विश्लेषण प्रत्येक क्षेत्र में प्रतिदीप्ति तीव्रता की पटरियों से पता चलता है और 2d दृश्य खिड़की पर श्रृंखला विश्लेषण बटन पर क्लिक करने के बाद प्रकट होता है । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

पूरक Excel फ़ाइल 1: उदाहरण डेटा और डेटा परिकलन । (शीट 1) एक पुरुष नाभिक के लिए एक उदाहरण डेटा दिखाया गया है । नहीं. छवि की लगातार संख्या को इंगित करता है । पंक्ति प्रत्येक क्षेत्र के लिए तीव्रता (रॉय, रेफरी, और BG) संकेत दिया गया । (शीट 2) डेटा परिकलन के लिए एक उदाहरण दिखाया गया है । प्रोटोकॉल क्रमांक प्रोटोकॉल अनुभाग में संगत स्थानों को इंगित करता है । नोट्स प्रत्येक स्कोर का अर्थ समझा । संख्यात्मक सूत्र को कक्षों पर क्लिक करके संदर्भित किया जा सकता है. वसूली वक्र और मोबाइल अंश पट्टी ग्राफ के उदाहरण दिखाए जाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

Day-3 Day-2 Day-1 frap है का दिन दिन + 1 दिन + 3 दिन + 19
mRNA तयारी काटना टेम्पलेट प्लाज्मिड
(रात में)
1). शुद्धिकरण टेम्पलेट प्लाज्मिड
2). इन विट्रो प्रतिलेखन
3). इन विट्रो पाली एक पुच्छ
4). ट्रो द्वारा mRNA गुणवत्ता की जांच
frap है 1). हेरफेर प्लास्टिक और चैंबर की तैयारी
2). mRNA इंजेक्शन
3). zFRAP विश्लेषण
4). वसूली वक्र और मोबाइल अंश की गणना* 2
आईवीएफ और पूर्व आरोपण विकास का विश्लेषण ईसीजी इंजेक्शन 1). एचसीजी इंजेक्शन 1). शुक्राणु समाई
2). मीडिया की पूर्व-मशीन (HTF) 2). इन विट्रो निषेचन में
मीडिया की तैयारी (HTF, CZB, एच-CZB और PVP-CZB) 3). मूल्यांकन आरोपण विकास
भ्रूण हस्तांतरण pseudopregnant महिला की तैयारी
(vasectomized पुरुष के साथ सहवास* 1)
pseudopregnant महिला को 2-सेल स्टेज भ्रूण का ट्रांसफर जन्म दर का मूल्यांकन
* 1: Vasectomized पुरुष माउस संभोग से पहले से कम 2 सप्ताह तैयार किया जाना चाहिए
* 2: गणना अगले दिन (दिन + 1 में लंबे समय तक किया जा सकता है)

तालिका 1: प्रयोगों की समय सारणी. frap है विश्लेषण के दिन माना जाता है 0. प्रयोग किया जाना चाहिए कि प्रत्येक आइटम के लिए संबंधित दिनों पर संकेत कर रहे हैं ।

श्रेणियाँ नहीं. इंजेक्शन zygotes का नहीं. की बरामद zygotes के बाद mRNA इंजेक्शन (%) * नहीं. zygotes का विश्लेषण किया नहीं. तबादले की नहीं. प्राप्तकर्ताओं की नहीं. पिल्ले की (%) * * * पिल्ले का वजन (g) नहीं. ट्रांसजेनिक पिल्लई की
2-सेल स्टेज भ्रूण (%) * *
बरकरार - - ९९ ९८ (९९.०) 9 ६१ (६२.२)एक 1.64 ± 0.02 एन. डी
कोई frap है ४२० ३९८ (९४.८) ८२ ७८ (९५.१) 7 ४१ (५२.६)ए,बी 1.66 ± 0.03 एन. डी
frap है ७९ ७८ (९८.७) 7 ३२ (४१.०)बी 1.69 ± 0.03 0
*: नहीं के साथ विभाजित करके गणना की । इंजेक्शन zygotes का; * *: नहीं के साथ विभाजित करके गणना की । च्या zygotes विश्लेषण; : नहीं के साथ विभाजित द्वारा गणना । 2-सेल स्टेज भ्रूण का तबादला । a, b: सुपरस्क्रिप्ट महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं (P < 0.05). n. d: निर्धारित नहीं है । इस तालिका [Ooga एट अल २०१७]7से संशोधित किया गया है ।

तालिका 2: विश्लेषित भ्रूण की जन्म दर: भ्रूण की विकासात्मक क्षमता, जिसका frap है-विश्लेषण किया गया था, की पूर्ण अवधि तक जांच की गई. इन भ्रूणों की प्राप्त जन्म दर को दर्शाया गया है. नियंत्रण के रूप में, बरकरार है और कोई frap है-विश्लेषण भ्रूण भी जांच की गई । इन स्थानान्तरित भ्रूणों से प्राप्त पिल्लई का भार भी वैसे ही दिखाया जाता है.

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Discussion

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के रूप में इस अध्ययन में पता चला, zFRAP विश्लेषण पूर्ण अवधि के विकास के लिए महत्वपूर्ण क्षति का कारण नहीं है, इस विधि का सुझाव एक बहुत ही उपयोगी आणविक घटनाओं और भ्रूण विकास की क्षमता के बीच संघ प्रकट उपकरण है । reprogramming के दौरान, दो में ES कोशिकाओं के राज्य की तरह सेल, जिसके द्वारा उन कोशिकाओं के अंतर की क्षमता के रूप में उच्च के रूप में हो जाता है कि दो सेल स्टेज भ्रूण, दो के साथ तुलनीय में क्रोमेटिन शिथिलता परिवर्तन-सेल स्टेज भ्रूण5। तदनुसार, यह संभव है कि zygotic क्रोमेटिन शिथिलता भ्रूण विकासात्मक क्षमता के लिए महत्वपूर्ण है । दैहिक कोशिका अंडाणुओं के कोशिका द्रव्य में स्थानांतरित नाभिक कम क्रोमेटिन शिथिलता न केवल मामी pronuclei लेकिन यह भी मातृ pronuclei के साथ तुलना में पता चला, दैहिक कोशिका परमाणु अंतरण क्रोमेटिन में अधिग्रहण खुला zygotes की कमी का सुझाव है उनके गरीब विकास की क्षमता में शामिल है । सामूहिक रूप से, zFRAP विश्लेषण elucidating जीनोम reprogramming तंत्र के लिए उपयोगी लगता है ।

zFRAP प्रणाली उच्च विकासात्मक क्षमता के साथ zygotes का चयन करना संभव बना सकती है । प्रारंभिक अध्ययन में, SCNT के अलावा, यह पता चला था कि गोल spermatid इंजेक्शन (ROSI)-व्युत्पन्न zygotes बंदरगाह असामान्य क्रोमेटिन शिथिलता. इसके अलावा, यह पाया गया कि उनमें से कुछ आईवीएफ के लिए तुलनीय zygotes के रूप में अच्छी तरह से व्युत्पंन स्तर पर क्रोमेटिन शिथिलता दिखाया, सुझाव है कि इन zygotes उच्च विकास क्षमता है । महत्वपूर्ण बात, zygotes जिनमें से क्रोमेटिन शिथिलता zFRAP द्वारा मूल्यांकन किया गया था अवधि के लिए विकसित कर सकता है । भविष्य में, इसलिए, यह zFRAP द्वारा क्रोमेटिन शिथिलता के मूल्यांकन के द्वारा कम लोगों से उच्च विकासात्मक क्षमता के साथ SCNT-और ROSI-व्युत्पंन zygotes भेद करने के लिए संभव हो सकता है ।

तिथि करने के लिए, पिछले अध्ययनों से पता चला है epigenetic राज्य के आरोपण भ्रूण में विश्लेषण के लिए लाइव इमेजिंग विधि की उपयोगिता । लाइव इमेजिंग तरीकों में से कुछ एक epigenetic संशोधन प्रकट कर सकते हैं (जैसे डीएनए/हिस्टोन संशोधन) आरोपण भ्रूण13,14, लेकिन zFRAP का उपयोग कर, यह बिना zygotic क्रोमेटिन शिथिलता का मूल्यांकन करने के लिए संभव है कोशिकाओं की हत्या । क्रोमेटिन शिथिलता epigenetic संशोधनों से प्रभावित होने लगती है. उदाहरण के लिए, heterochromatin में जो दमन epigenetic संशोधन जैसे H3K9me3 और H3K27me3 को समृद्ध कर रहे हैं हिस्टोन क्षेत्र की तुलना में कम euchromatic गतिशीलता दिखाया3,15. दरअसल, एक रासायनिक यौगिक है, जो epigenetic राज्य धर्मांतरित के साथ उपचार, zygotes में क्रोमेटिन शिथिलता के परिवर्तन का कारण बना । इसलिए, zFRAP का उपयोग कर, यह क्रोमेटिन संरचना के योगात्मक epigenetic राज्य प्रकट करने के लिए संभव है । यह सोचा था कि यह zygotes की विकासात्मक क्षमता के मूल्यांकन के लिए एक फायदा होगा ।

zFRAP के लिए mRNA एन्कोडिंग eGFP-H2B का इंजेक्शन एक अवगुण है लेकिन zFRAP की बहुमुखी प्रतिभा को बढ़ाता है. mRNA इंजेक्शन के अवगुण microinjection की वजह से नुकसान है. इस से बचने के लिए, यह बहुत eGFP-H2B ट्रांसजेनिक माउस का उपयोग करने के लिए प्रभावी है । यदि eGFP-H2B ट्रांसजेनिक माउस लाइन का प्रयोग किया जाता है, वंश दर mRNA microinjection का उपयोग करने के मामले की तुलना में बढ़ सकता है । इसके विपरीत, यह mRNA इंजेक्शन की योग्यता है कि zFRAP जंगली प्रकार के चूहों के तनाव के किसी भी प्रकार के उपयोग की अनुमति देता है । शोधकर्ताओं जो माउस तनाव के अपने हित के साथ zFRAP का उपयोग करना चाहते eGFP-H2B transgene के साथ वांछित माउस तनाव तैयार करने की जरूरत नहीं है । इस योग्यता ट्रांसजेनिक के विश्लेषण में और अधिक प्रमुख हो जाता है (उदाहरणके लिए व्यक्त/पछाड़ना) या नॉकआउट माउस लाइन । जो शोधकर्ता ट्रांसजेनिक/नॉकआउट लाइन के साथ अपने शोध विषयों के लिए zFRAP का उपयोग करना चाहते हैं उनके हित वालों की सीमित संख्या से eGFP-H2B ट्रांसजेनिक लाइन तैयार करना नहीं है । यह अनुसंधान की प्रगति के लिए एक लाभ इंगित करता है ।

प्रत्यारोपण भ्रूण के साथ लाइव इमेजिंग विश्लेषण विशेष ज्ञान और बहुत महंगा है और पतले देखते विशेष उपकरणों की आवश्यकता है । इसलिए, एक ऐसी प्रयोगात्मक प्रणाली का परिचय एक आसान निर्णय नहीं है । प्रायोगिक प्रणाली है कि इस अध्ययन में स्थापित किया गया है केवल एक थर्मामीटर एक फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप से अलग हीटर की जरूरत है । इसके अलावा, विधि सीखना इतना आसान है कि एक प्रयोगशाला में शुरुआत 1 महीने के भीतर zFRAP की विधि सीख सकते हैं । हालांकि, कुछ मुद्दे है कि अभी भी विचार की जरूरत है । पहला फोकस बहाव है । निरीक्षण के दौरान, यह संभव है कि pronuclei या zygotes स्थिति से विचलित जहां वे अवलोकन शुरू होने से पहले प्रस्तुत किया । यदि ध्यान बहाव होता है, ROIs भी सही स्थिति से विचलित । नतीजतन, मात्रात्मक डेटा बेकार हो जाता है । इस मुद्दे से बचने के लिए, शोधकर्ता को हवा कंडीशनर से खिड़की के खिलाफ संरक्षण के लिए गिलास नीचे व्यंजन के ढक्कन का उपयोग करें और उद्देश्य लेंस पर तेल के विस्तार के लिए रुको है । यदि फ़ोकस बहाव हो, तो deviating zygotes से डेटा छोड़ दिया जाना चाहिए और एक ही zygotes के साथ एक 2nd frap है विश्लेषण अनुशंसित नहीं है । इस अध्ययन में, १५० एस3 से अवलोकन समय छोटा करने के बारे में 25 s7 बहुत उपयोगी था । दूसरा मशीन के बाहर अब गर्मी है । मशीन के बाहर पर्यावरण के लिए अब जोखिम के बाद से निश्चित रूप से भ्रूण के विकास के लिए हानिकारक है, यह बैच प्रति 1 घंटे के भीतर frap है-विश्लेषण खत्म करने की सिफारिश की थी । zygotes frap है की संख्या-एक HEPES में विश्लेषण-ग्लास नीचे व्यंजन पर बफर मीडिया 6-10 होना चाहिए । इस प्रायोगिक दशा में अधिकतम संख्या 4 एच के लिए करीब 30 है लेकिन यदि अधिक zygotes की आवश्यकता हो तो 20 zygotes प्रति ज का विश्लेषण और पृष्ठभूमि क्षेत्र में फ्लोरोसेंट तीव्रता के आकलन को स्थगित करके विश्लेषित किया जा सकता है । तीसरे "फोकल लेजर माइक्रोस्कोपी के लेजर के समय से संबंधित गिरावट" है । यदि ब्लीचिंग लेज़र अपर्याप्त है, तो अपर्याप्त ब्लीचिंग के कारण सही मात्रात्मक डेटा प्राप्त नहीं किया जा सकता. दरअसल, zygotic क्रोमेटिन शिथिलता के पैतृक विषमता एक कमजोर ब्लीचिंग लेजर के साथ प्राप्त नहीं किया जा सकता है । इससे बचने के लिए यह जांच करने की सिफारिश की गई है कि इस अवसर के रूप में लेजर शक्ति कमजोर हुई है या नहीं । इस अध्ययन में ११०-µW ब्लीचिंग माता-पिता विषमता के अधिग्रहण के लिए पर्याप्त था.

zFRAP एनालिसिस का इस्तेमाल अन्य तरह के प्रोटीन्स के लिए, कोर histones के अलावा किया जा सकता है । कोर histones शो प्रमुखता से कम गतिशीलता के बाद से, अब कुल प्रेक्षण समय (इस अध्ययन में लगभग 25 एस) zFRAP विश्लेषण में की जरूरत है । इसलिए, zygotes की एक काफी संख्या का विश्लेषण करने के लिए, HEPES में संवर्धन-एक लंबे समय के लिए हीटर पर बफर मीडिया अपरिहार्य है । दूसरी ओर, उच्च गतिशीलता प्रोटीन के zFRAP विश्लेषण के लिए, कुल प्रेक्षण समय कम सेट किया जा सकता है, HEPES में संवर्धन के समय को सक्षम करने के लिए हीटर पर मीडिया बफर कम हो । इसलिए, के बाद से अब मशीन के बाहर पर्यावरण के लिए जोखिम भ्रूण के विकास के लिए अत्यधिक हानिकारक है, कोर histones, जो प्रकृति द्वारा उच्च गतिशीलता है के अलावा अंय प्रोटीन के लिए zFRAP विश्लेषण, कोर से कम विषाक्तता दिखाने लगते histones . यह आशा की जाती है कि यह प्रायोगिक प्रणाली विभिन्न आणविक घटनाओं और भ्रूण विकास के बीच संबंधों की जांच को आगे बढ़ाने में मदद करेगी.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम सातोशी Kishigami, सायाका वाकायामा, Hiroaki Nagatomo, सातोशी Kamimura, और काना किशिदा महत्वपूर्ण टिप्पणियां और तकनीकी सहायता प्रदान करने के लिए धंयवाद । यह काम आंशिक रूप से M.O. को राष्ट्रीय विश्वविद्यालयों के सुधार को बढ़ावा देने के लिए शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान और प्रौद्योगिकी कार्यक्रम मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित किया गया; विज्ञान के संवर्धन के लिए जापान सोसायटी (16H02593), असद् विज्ञान फाउंडेशन, और टाकेडा विज्ञान फाउंडेशन के लिए T.W. funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal laser scaning microscope Olympus FV1200 FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7)
Thermo plate Tokai Hit TP-110RH26
Inverted microscope Olympus IX71
Micro manupilator Narishige MMO-202ND
Pieze Micro Micromanipulator Prime tech PMAS-CT150
35 mm culture dish Falcom 351008 35 x 100 mm style; for IVF
60 mm culture dish Falcom 351007 60 x 15 mm style; for embryo culture
50 mm culture dish Falcom 351006 50 x 9 mm style; for manipulation on the stage
50 mm glass bottom dish Matsunami D910400 50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis
Mineral oil Organic spceiality chemicals 625071 For FRAP analysis on the glass bottom dishes
Mineral oil Sigma M8410-1L For IVF and embryo culture
glass capillary Drummond 1-000-1000 For handling mouse zygotes
Borosilicate glass Prime tech B100-75-10-PT For microinjection of mRNA
Micropipett puller Sutter instrument P-97/IVF For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm) 
Microforge  Narishige MF-900
mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit Thermo
Fisher scientific
AM1340
Poly (A) tailing kit Thermo
Fisher scientific
AM1350
PVP solution 10% (PVP-HTF) IrvineSceientific 99311 HEPES buffered HTF containing 10% PVP
Sodium HEPES Sigma H3784
pTOPO eGFP-H2B Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6)
NorthernMax Gly Sample loading Dye  Thermo
Fisher scientific
AM8551 For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA
Phenol chloroform isamyl alcohol nacalai tesque 25970-14
Chloroform nacalai tesque  08401-65
Not I TOYOBO NOT-111X
Ethachinmate WAKO 318-01793
3664 Otical power meter Hioki 3664  Power meter for laser power
Stereomicmicroscope Olympus SZX16

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References

  1. Burton, A., Torres-Padilla, M. E. Epigenetic reprogramming and development: a unique heterochromatin organization in the preimplantation mouse embryo. Brief Funct Genomics. 9, 444-454 (2010).
  2. Okada, Y., Yamaguchi, K. Epigenetic modifications and reprogramming in paternal pronucleus: sperm, preimplantation embryo, and beyond. Cell Mol Life Sci. 74, 1957-1967 (2017).
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Zygotic प्रतिदीप्ति वसूली के बाद फोटो-ब्लीचिंग विश्लेषण के लिए क्रोमेटिन शिथिलता है कि पूर्ण अवधि के विकास की अनुमति देता है
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Ooga, M., Funaya, S., Aoki, F., Wakayama, T. Zygotic Fluorescence Recovery After Photo-bleaching Analysis for Chromatin Looseness That Allows Full-term Development. J. Vis. Exp. (136), e57068, doi:10.3791/57068 (2018).More

Ooga, M., Funaya, S., Aoki, F., Wakayama, T. Zygotic Fluorescence Recovery After Photo-bleaching Analysis for Chromatin Looseness That Allows Full-term Development. J. Vis. Exp. (136), e57068, doi:10.3791/57068 (2018).

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