Summary
Раскованность хроматина, по-видимому, участвующих в потенциал развития бластомеров. Однако не известно ли хроматина раскованность может использоваться как надежный индекс на потенциал развития эмбрионов. Здесь была описана экспериментальная система, в которой может развиваться хроматина оценены раскованность зигот на полный срок.
Abstract
Живой изображений является мощным инструментом, который позволяет анализ молекулярных событий в ходе онтогенеза. Недавно чтобы участвовать в клеточной дифференциации потенциал получения эмбриональных стволовых клеток было показано хроматина неплотности или открытости. Ранее сообщалось, что по сравнению с эмбриональных стволовых клеток, зигот гавани структуру чрезвычайно ослабил хроматина, предлагая его связь с их тотипотентность. Однако до сих пор, он не рассматривался ли эта структура хроматина крайне ослаблены/открыть имеет важное значение для эмбрионального развития потенциала. В настоящем исследовании чтобы проверить эту гипотезу, была разработана экспериментальная система, в которой зигот, которые были проанализированы, флюоресценция восстановления после фото отбеливания может развиться в срок без каких-либо значительных повреждений. Важно отметить, что эта экспериментальная система требует только термос плиты утеплителя помимо конфокальный лазерный сканирующий микроскоп. Результаты этого исследования показывают что флуоресценции восстановления после отбеливания фото анализ (FRAP) анализ может использоваться для расследования ли молекулярные события в zygotic хроматина имеют важное значение для развития доношенных.
Introduction
После оплодотворения динамически изменяется структура хроматина, и затем в конечном итоге установленных1,2zygotic хроматина структура. В этот период, в отцовской pronuclei белок доминирующей хроматина меняется с протамина в гистонов. Результате хроматина очень отличается от спермы и женских яйцеклеток в нескольких точках (например, гистонов вариант композиции, изменения гистона). Таким образом сформированное zygotic хроматина, как считается, важное значение для последующего развития эмбриона. Однако несмотря на попытки раскрыть детали структуры zygotic хроматина длительное, методы оценки качества зигот или предсказать их полный срок развития на стадии одной ячейки, анализируя их структура хроматина никогда не были создана.
В предыдущем исследовании обнаружил, что зигот имеют чрезвычайно ослабил хроматина структура3. В настоящее время хроматина неплотности или открытости считается важным фактором для клеточной дифференциации потенциал в эмбриональных стволовых (ES) клетки4. ES клетки не проявляют однородности в природе, но довольно неоднородна; в колонии клеток ES некоторые временно приобрести выше дифференциация потенциал, сопоставимые с бластомеров двух клеточной стадии эмбриона. Во время этого перехода в двух ячейку как государство раскованность хроматина в ES клеток изменения в то, что сопоставимо с двух клеточной стадии эмбриона5. Таким образом раскованность хроматина кажется важным для клеточной дифференциации потенциал и это возможно, что широко открыть хроматина в зигот является полезным для оценки zygotic потенциал развития.
Живой изображений является мощным инструментом, который позволяет для анализа молекулярных событий в ходе онтогенеза, поскольку этот метод позволяет для последующего развития и даже полный срок развития6. Как один из живой методов обработки изображений FRAP анализ был использован для изучения хроматина неплотности в Предимплантационная эмбрионов и ES клеток3,4,5. Если zygotic хроматина раскованность могут быть проанализированы без пагубное воздействие на полный срок развития анализа FRAP, оно может быть ценным инструментом для оценки качества эмбрионы на стадии одной ячейки. Однако влияние на развитие доношенных этот экспериментальный метод не были изучены. Недавно была разработана экспериментальная система для оценки zygotic хроматина раскованность с использованием FRAP. Потому что это была новая система наблюдения для зигот, он был назван как FRAP zygotic (zFRAP). zFRAP критически не влияет на полный срок развития и был другом сообщил7. В настоящем докладе описывается протокол этого экспериментального метода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование было проведено в строгом соответствии с рекомендациями руководства для ухода и использования лабораторных животных университета Яманаси. Протокол был одобрен Комитетом по этике животных эксперименты из университета Яманаси (разрешение номер: А24-50). Все операции проводились под tribromoethanol наркозом, и были предприняты все усилия для сведения к минимуму страданий. Иллюстрированный обзор процедур и времени таблице показаны на рисунке 1 и в таблице 1, соответственно.
1. Подготовка РНК (In Vitro транскрипция мРНК eGFP H2B)
- Линеаризации 5 мкг шаблона ДНК pTOPO-eGFP-H2B3,7 с 30 U не я в 50 мкл при 37 ° C ночь.
- Сбор 1,5 мкл переваривается ДНК для подтверждения ли полностью усваивается электрофореза.
- Примените 1,5 мкл и 3-5 мкл непереваренных ДНК с загрузкой краска хорошо геля агарозы 2%, соответственно и при условии электрофореза.
Примечание: Если полностью усваивается организмом, наблюдается однодиапазонный (около 5 КБ). Непереваренные ДНК используется как элемент управления, который появляется в другом положении.
- Примените 1,5 мкл и 3-5 мкл непереваренных ДНК с загрузкой краска хорошо геля агарозы 2%, соответственно и при условии электрофореза.
- Добавить 151.5 мкл ddH2O и 200 мкл рабочего раствора фенола/хлороформ/изоамилового спирта (25:24:1) к оставшимся переваривается ДНК.
- Смешайте энергично вихря.
- Центрифуга для максимальной скоростью за 15 мин.
- Восстановить супернатант и затем 200 мкл хлороформ.
- Смешайте энергично вихря.
- Центрифуга с максимальной скоростью за 15 мин.
- Восстановить супернатанта, а затем добавить 20 мкл ацетат натрия 3 М и 1,5 мкл ethachinmate.
- Смешайте энергично вихря.
- 550 мкл, 100% этанола, а затем смесь энергично, вихрь.
- Центрифуга с максимальной скоростью за 15 мин.
- Отменить супернатант и после этого помыть лепешка с 70% этиловом спирте.
- Сухие гранулы путем испарения для 5-10 мин.
- Растворите осажденный плазмида ДНК в 8 мкл воды, свободной от нуклеиназы.
- Оценить плазмида концентрации (ожидаемые концентрации — о 300-500 нг/мкл) с nanodrop следуя инструкции производителя.
- Выполните в vitro транскрипция для мРНК кодирования eGFP-H2B с 1 мкг очищенная ДНК как шаблон в 20 мкл общая реакция тома, следуя инструкциям производителя.
- После в vitro транскрипция добавьте 36 мкл воды, а затем восстановить 1.5 µL из 56 мкл синтезированной мРНК для анализа методом электрофореза (как без поли A).
- Выполните поли A хвостохранилищ для синтезированной мРНК в томе реакции 100 мкл, следуя инструкциям производителя.
- Добавьте 60 мкл раствора осадков хлорида лития поли хвостатых мРНК eGFP-H2B и затем смесь энергично.
- Прохладный при-30 ° C за 30 мин.
- Центрифуга с максимальной скоростью за 15 мин.
- Отменить супернатант и после этого помыть лепешка с 70% этиловом спирте.
- Сухие гранулы путем испарения для 5-10 мин.
- Растворите лепешка с 20 мкл нуклеиназы свободной воды на отопление при 55 ° C за 30 мин.
- Оцените концентрацию мРНК осажденный с nanodrop. Разбавляют до 500 нг/мкл с нуклеиназы свободной воды и хранить при температуре-80 ° C до использования.
- Подтвердите предпочтительный мРНК производства; Тема 1 мкл мРНК с/без (полученные в 1.8.1 и 1.12 шаги, соответственно) поли, хвост, смешанного с 1,5 мкл бромид ethidium 0,1 мг/мл и 3 мкл пример загрузки красителя на электрофорез анализ. Прикладной объем составил 5,5 мкл.
Примечание: Если поли A хвостохранилищ был успешным, смещенными группа по сравнению с мРНК без поли хвостохранилища следует соблюдать (рисунок 2A).
2. Подготовка вазэктомии самцов мышей
- Взвешивание мышей-самцов ICR в 8-12 месяцев, используя вес масштаба.
- Внутрибрюшинно придать самцов мышей с 0,7 - 0,9 мл 1,2% tribromoethanol анестезии.
Примечание: Количество анестезии зависит от размера указателя мыши. Например мышь, весом 40 г вводится с 0,8 мл tribromoethanol анестезии. - Влажные Берри с 70% этиловом спирте.
- Сделайте небольшой усечённые Берри (3-5 мм) и затем сделать надрез на стене мышц с помощью ножниц.
Примечание: Ножницы и щипцами должны очищаться с 70% этанол перед началом операции. - Захват жировой ткани с щипцами и осторожно вытащите его. Затем яички и семяпроводов появляются.
Примечание: Семяпроводов -U-образной трубки и с красной кровеносный сосуд. - Галстук с семяпроводов в двух точках с хирургические шовные материалы, а затем вырезать средней части между связанными точками.
- Аккуратно задвиньте жировой ткани и яичка в Берри.
- Повторите операцию с оставшихся яички.
- Шить мышц стенки с двумя стежками с шовного.
3. ЭКО
- Придать 8 - 10 - неделя старый женский B6D2F1 (BDF1) мышах внутрибрюшинно с 7,5 МЕ лошадиный хорионического гонадотропина (ЭКГ) и хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) 46-50 h интервалом.
- Подготовить капли 300 мкл человека трубной жидкости (HTF)8 СМИ капацитации и оплодотворения 1 день до ЭКО в блюдо 30-мм, охватывают эти капли с минеральным маслом на лабораторном столе и затем preincubate в инкубаторе одночасье.
- Пожертвуйте созрели мышей-самцов ICR шейки матки дислокации. Вскрыть конского придатка яичка с иглой 27 G и собирать сперматозоидов. Их культура для капацитации в 300 мкл HTF СМИ для 1-2 ч при температуре 38 ° C.
- 16 ч после инъекции ХГЧ, пожертвовать супер овуляцией самок мышей, шейки матки дислокации. Перевести ампула маточных труб в минеральное масло рядом СМИ HTF а затем вытянуть кучевые клетки и ооциты комплекс от этой маточных труб ампула иглой 30 G преинкубации инсеминация HTF среду.
Примечание: Некоторые самок мышей не часто показывают овуляции несмотря на лечение супер овуляции. Ампула расширенного маточных труб является признаком овуляции. - После капацитации перенесите 2-3 мкл capacitated сперматозоидов в инсеминация HTF СМИ, в котором были собраны овуляцией ооцитов.
- 1 ч после оплодотворения, собирать оплодотворенной зигот и относиться к ним с гиалуронидазы в 100 мкг/мл по 10 мин в CZB9 СМИ.
Примечание: Когда Инсеминация проводится должным образом, 1 ч. после оплодотворения, наблюдаются оплодотворенной зигот с 2nd полярного тельца. Если используется меньше или низкого качества спермы, наблюдаются только мало зигот с 2nd полярного тельца. Кроме того если используется много спермы для осеменения, происходит polyspermy. Правильного осеменения приводит к зигот с мужского и женского pronuclei. С помощью этих критериев можно найти ли осеменения делается хорошо или нет.- После стирки в CZB массовой информации, подлежащих микроинъекции с eGFP H2B мРНК зигот с второй полярного тельца.
4. Подготовка камеры и микроинъекции пипетки
- Разбавьте РНК кодирования eGFP-H2B, используя нуклеиназы свободной воды для получения концентрации 250 нг/мкл.
- Подготовка 2-3 капли PVP-HTF eGFP-H2B снижается мРНК, и 5-6 капель Hepes в буфер CZB (H-CZB) капли на блюдо 60-мм. Покрыть эти капли с минеральным маслом.
Примечание: Эти препараты могут выполняться на лабораторном столе. Существует никаких требований для использования Шкаф ламинарный поток воздуха. - Тянуть боросиликатного стекла с микропипеткой съемник (например, P = 500, тепло = 825, тянуть = 30, vel = 120 и время = 200)
- После разрыва кончиком пипетки, согните вытащил стекла микроинъекции пипеткой недалеко от оконечности (обратно в −300 мкм) на около 30 °, с помощью microforge.
5. микроинъекции
- Выключите подогреватель пластину на сцене микроманипулятор для предотвращения убийства зигот с пьезо во время инъекции мРНК.
- Вымойте и пальто внутри инъекций иглами в HEPES-буфер HTF содержащие 10% PVP (PVP-HTF).
- Собирать оплодотворенной зигот с 2nd полярного тела (рис. 2B) и передачи зигот 20-25 на камеры микроскопа с микроманипулятор прилагается.
- Заполните разреженных eGFP-H2B мРНК в капилляры боросиликатного стекла от кончиков.
- Держите зиготы с пипеткой Холдинг и затем разорвать вителлинового и цитозольной мембраны с пьезо приводом.
- Придать около 10 пл мРНК в цитоплазму зигот. Закончите мРНК инъекции в течение 10 мин для предотвращения повреждения, вызванные длительного культивирования зигот за пределами инкубатора.
Примечание: Объем впрыска должно быть как большой, как 2nd полярного тельца. Если количество мРНК вводится слишком велик, это позволяет вызывать бесплатно eGFP-H2B фракция, которая может повлиять на мобильных дроби. - 10 мин после микроинъекции, мыть в по крайней мере 3 капли и затем культура вводят зигот в CZB на 38 ° C до zFRAP анализа.
6. zFRAP анализ
- 1 час до zFRAP анализа, включите лазер и горячей табличку, прикрепленную к стадии конфокального микроскопа. Установите температуру 38 ° c.
- Положите 6-10 мкл HEPES-амортизированное CZB СМИ покрыты минерального масла на блюдо дно 60-мм стекла и теплые на нагреватель до зиготы коллекции.
- 8 - 12 ч после оплодотворения, собирать eGFP-H2B-выражая зигот 5-10 и передачи в 6-10 мкл предварительно разогрет средних падение HEPES-амортизированное CZB.
Примечание: Чтобы избежать длительного культивирования за пределами инкубатора, выражая eGFP H2B зигот 5-10 были использованы на каждого анализа. 5 до 10 зигот могут быть проанализированы в течение 1 ч. - Задайте условия отбеливания и изображений согласно инструкциям производителя. Случае конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (Таблица материалов) приведен ниже:
- Использование 60 X объектив нефти (60 X 60 X / 1,35 нефти).
Примечание: Линзы с выше увеличение (выше числовая апертура) Показать выше чувствительность. - Задайте скорость сканирования как 4.0 МКС/Pixel и размер как «512» на «приобретение» (дополнительное рис. 1).
- Увеличение цифровой зум до «5» (дополнительное рис. 1).
Примечание: Выше зум требуется признать, происходит ли фокус дрейф или нет. - Открыть список краситель (Дополнительные рис. 1) и затем выбрал «EGFP». Установить время наблюдения как 1.6 s (интервал задается как параметр «свободный запуск») (Дополнительные рис. 1)
Примечание: Больше пунктов наблюдения может привести более подробные данные, но он также может вызывать Фототоксичность. В zFRAP анализе 1.6 s время наблюдения, как представляется, будет достаточно, чтобы обнаружить родительский асимметрия раскованность хроматина. - Задайте количество снимков, как 12 в общей сложности (Дополнительные рис. 1).
- Начало «Стимул настройки» панели и затем нажмите «Основные» на UseScanner. Задайте скорость как 10.0 МКС/пиксель сканирования. Нажмите кнопку «Активация в серии» и затем установите PreActivation как «3 кадров» и время активации как «5 sec» (дополнительное рис. 1).
- Нажмите кнопку «Фокус x 2» и установите фокус и затем «стоп».
- Отбеливание и визуализации мощность лазера (477 Нм) на 110 и 15 мкВт, соответственно, путем корректировки «Гейдж мощность лазера» (дополнительное рис. 1).
Примечание: Очень сильный отбеливание может привести к большей площади отбеленной, который вызывает трудности для количественного анализа. Для измерения мощности лазера используйте измеритель мощности. Важно подтвердить мощности лазера, чтобы избежать связанных с время ухудшения мощность лазера. - Нажмите кнопку «Клип Rect» (дополнительная цифра 1) стимул настройки панели. Установка области интереса (ROI; красный; ROI #1B) как 40 x 40 пикселей (7.62мкм). Подготовить справочник региона (REF; зеленый; ROI #2) и фон (BG; синий; ROI #3) с помощью «копировать ROI» и «вставить ROI» (щелкните правой кнопкой мыши кнопку мыши).
Примечание: Размер пиксела можно задать с помощью «ROI менеджер», которое можно вызвать, нажав правую кнопку мыши, когда курсор находится на ROI. Подуманы, что будет лучше, поскольку они могут стандартизировать дисперсии zFRAP Оценка больше ROIs. Однако слишком большой ROI нельзя использовать для этого анализа потому что оно делает его трудно избежать ядрышко прекурсоров тела (НПБ). eGFP-H2B в этом отсеке думали, чтобы быть свободным от хроматина и показал замечательный выше мобильность3. Рентабельность и REF районах должны быть разделены как можно больше. Если эти два региона близки, отбеливание может также повлиять на регион REF. - Нажмите «Живут» на панели инструментов, а затем начать «Жить участок» (дополнительная цифра 1).
Примечание: Live сюжет показывает интенсивности флуоресценции сигнала в пределах каждой ROI и используется для регулировки мощности лазера с помощью HV. Обратите внимание, что если ROI не установлен, без интенсивность будет обнаружен на прямом участке панели. - Определение позиции ROI
Примечание: ROI можно перемещать путем перетаскивания в желаемое положение в pronuclei. (1) быть уверены, чтобы избежать ядрышко и (2) вписываются все ROI нуклеоплазмы. Не содержат региона за пределами области ядерной мембраны (цитоплазма) в ROI. Локализация eGFP-H2B весьма ограничен в нуклеоплазмы так что это легко найти Руа Цитоплазма содержит ли или не флуоресценции eGFP-H2B. Мужской pronuclei, как правило, больше, чем у женщин, которые часто локализуются возле 2nd полярного тельца. Во время использования этих критериев, судья pronuclei мужского или женского пола. - Нажмите кнопку «Фокус x 2» (дополнительная цифра 1) и затем настроить HV мощности Гейдж канала для EGFP в интенсивности флуоресценции около 2000 (интенсивности флуоресценции можно увидеть в окне «Живая Земля»).
- Использование 60 X объектив нефти (60 X 60 X / 1,35 нефти).
- Нажмите кнопку «Время» и затем «XY» (дополнительная цифра 1) чтобы начать анализ zFRAP.
Примечание: Если выбран соответствующую кнопку «Время», «t» появляется на кнопке «XY».- Нажмите кнопку «Серии сделал» (дополнительная цифра 1), который появляется после того, как FRAP изображений рядом кнопку «XY» и затем получить FRAP проанализированных данных.
- Сохраните файл «2D-изображение XXXXX» как предпочтительный именованный файл (формат файла ОИБ.), «сохранить как» (Ctrl + Shift + S может также использоваться).
- Выберите ROI, REF и BG и нажмите (Ctrl + A может также использоваться) «Анализ серии» в окне «2D представление изображения».
- Получить строку FRAP данных и затем нажмите кнопку «Сохранить» в окне живой сюжет.
Примечание: Row FRAP количественных данных сохраняется в виде файла csv.
- Для не zFRAP управления поставьте некоторые из зигот, вводится с мРНК на падение, который находится недалеко от края стекла дно блюда чтобы избежать эффекта от флуоресценции наблюдения.
7. данных расчет
- При использовании полученные количественные данные, сделать график «кривая восстановления» и «мобильный фракции» в Excel, как показано в ссылки3,7 с некоторыми изменениями (см. ниже и дополнительный файл excel).
- Вычислить относительную интенсивность путем вычитания значения BG от ROI и REF в 12 фотографий для каждой точки времени.
- Разделите значение ROI, REF. В результате 12 стандартных относительной интенсивности баллы в каждый момент времени может быть получена.
- Вычислить среднее относительная оценка для ROI в 3 снимки перед фото отбеливания.
- Расчет ставки возмещения. Разделите полученную 12 относительной оценки для ROI в изображения, принятые в среднем относительная оценка перед фото отбеливание (полученные в 7.1.3.) в каждой точке времени (полученные в 7.1.2.). Нарисуйте кривую восстановления с использованием этих баллов (Рисунок 2E).
- Вычислить степень отбеливания.
Примечание: Отбеливание ставка (%) = 100 - скорость восстановления 4й изображения. - Вычислить мобильных дроби (MF), используя формулу следующим образом10,11,12
MF (%) = 12th скорость восстановления (в конечной точке) - 4й курс восстановления / отбеливания ставка × 100.
8. перенос эмбрионов
- Мат зрелой женщины МГП в 8-12 месяцев с вазэктомии мышей-самцов ICR в ночь перед эмбриона передачи, позволяя им быть в той же клетке на ночь.
- Соберите эмбрионов, которые были проанализированы zFRAP и полны решимости развивать на сцену двухкамерные.
- Внутрибрюшинно впрыскивают самок мышей с 0,7 - 0,9 мл 1,2% tribromoethanol анестезии или 0,35 - 0,45 мл 0.75/4/5mg/kg medetomidine/мидазолама/Буторфанол смешанные агентов до переноса эмбрионов.
Примечание: Объем анестезии определяется вес тела мышей. Tribromoethanol: 0,2 мл/10 г массы тела; medetomidine/мидазолама/Буторфанол смешанные агентов: 0,1 мл/10 г веса тела.- Передача этих двух клеточной стадии эмбриона в яйцеводов pseudopregnant самок мышей МГП с вагинальные вилка на 0,5 дней поста coitum (dpc).
- После переноса эмбрионов Положите самок мышей на нагреватель набор при 37 ° C, до тех пор, пока они просыпаются.
- В 18,5 dpc пожертвовать суррогатной матерью, вывих шейного и восстановить щенков, полученных от zFRAP проанализированы зигот путем кесарева сечения. Некоторые из восстановленных щенков были доставлены в приемной матери и их веса тела были оценены каждую неделю.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
zFRAP анализ с eGFP-H2B
Должным образом произведены мРНК кодирования eGFP-H2B, которая рассматривается как смещенными группа вызванных Поли хвостохранилища (рисунок 2A), был введен в цитоплазме зигот с 2 полярного тела на 1-3 ч после оплодотворения (рис. 2B). 8 до 12 ч после оплодотворения, зигот с 2 pronuclei, показаны выражение eGFP-H2B были собраны и подвергнуты анализу zFRAP (рис. 2 c). FRAP анализ состоит из шагов для отбеливания и восстановления. На этапе предварительного отбеливания сигнал eGFP-H2B можно наблюдать (Рисунок 2D-1), но после отбеленные, сигнал снизилась до незначительного уровня (Рисунок 2D-2). Если отбеливание был успешным, темные дыры, как большой, как рентабельность появилась вскоре после отбеливания. После отбеливания, интенсивность флуоресценции сигнала eGFP-H2B выздоровел немного; Флуоресцентный сигнал постепенно увеличивается за счет притока небеленой фракции eGFP-H2B в ROI от области небеленой нуклеоплазмы (Рисунок 2D-3). Для подтверждения успешного анализа zFRAP хроматина раскованность рекомендуется использовать родительский асимметрия хроматина раскованность; мужской pronuclei показал кривой восстановления быстрее и более мобильных фракций, чем у женщин (Рисунок 2E и F). После zFRAP анализа, промывают и культивировали зигот в CZB массовой информации, может развиться до стадии бластоцисты без значительных повреждений (рис. 2 g и H). Даже если сильно обесцвеченные на более длительное время, зигот по-прежнему может перерасти в стадии бластоцисты, а также7.
Анализ развития доношенных zFRAP проанализированы зигот
Чтобы проанализировать полный срок развития эмбрионов, полученных от zFRAP проанализированы зигот, эмбрионы на стадии Двухкамерные были переведены в яйцеводов pseudopregnant матерей. Как элементы управления были подготовлены нетронутыми эмбрионы и один вводили с мРНК, но не zFRAP проанализированы. Уровень рождаемости проанализированы zFRAP эмбрионов (41.0%) был слегка значительно ниже, чем нетронутыми эмбрионов (62,2%), но был таким же, как не zFRAP управления (52,6%) (Таблица 2). Таким образом zFRAP анализ, как представляется, немного пагубным для доношенных эмбрионального развития. Однако важно отметить, что детенышей производным от zFRAP проанализированы зигот, казалось, здоровый и полностью разработаны (рис. 3).
Рисунок 1: Схематическая иллюстрация потока процедур для экспериментов. В пробирке оплодотворение: ооцитов II (MII) свеже собранных метафаза были оплодотворения спермой полномочия. В пробирке транскрипция: матричная РНК (мРНК) кодирования eGFP кварцевое гистона H2B (eGFP-H2B) были расшифрованы с SP6 промоутер линеаризованного pTOPO-eGFP-H2B3 с не я. МРНК eGFP-H2B подвергаются очистки и поли A хвостохранилищ. В мРНК инъекции используется очищенная eGFP-H2B мРНК. мРНК инъекций: подготовленные eGFP-H2B мРНК впрыскивается в цитоплазме зигот с 2nd полярного тельца. zFRAP анализ: выражая eGFP H2B зигот были подвергнуты анализу zFRAP. Область интересов (ROI; красный прямоугольник) был отбеленные с сильным лазерным и затем сигнал eGFP-H2B снизился до незначительного уровня. После отбеливания, интенсивность сигнала eGFP-H2B постепенно увеличивается. В пробирке развития: После анализа zFRAP зигот может перерасти в стадии бластоцисты. Перенос эмбрионов: на стадии Двухкамерные, проанализированы zFRAP эмбрионы были переведены в яйцеводов pseudopregnant самок мышей. 18 дней спустя, здоровых живых детенышей могут быть получены из zFRAP проанализированы эмбрионов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: zFRAP анализ зигот с eGFP-H2B. (A) представитель изображение должным образом подготовлена мРНК, в vitro транскрипция и поли A хвостохранилищ. Переулок 1: предварительное поли хвостохранилищ; переулок 2: сообщение поли A хвостохранилищ. (B) мРНК кодирования eGFP-H2B было впрыснуто в цитоплазме зигот с оплодотворения пост 1-3 ч 2nd полярного тельца (ХПИ). Шкалы бар = 25 мкм (C) выражая eGFP H2B зигот были собраны на 8-12 Инн. Белые звездочки показывают ядрышко прекурсоров тела (НПБ). Шкалы бар = 10 мкм (D) eGFP-H2B выражение был обнаружен в весь нуклеоплазмы даже в НПБ на стадии предварительного отбеливание (D-1), вскоре после отбеливания (D-2) и после восстановления (D-3). Указаны ядерной мембраны (белый пунктирные линии) и НПБ (звездочки). Шкалы бар = 10 мкм. кривая восстановления (E, F) и мобильные фракций были получены из 45 зигот в 5 независимых экспериментах. Синий и красный указывают мужского и женского пола, соответственно. В кривых восстановления единого круги показывают точки измерения. В точечной участков одной точки указывают Оценка мобильных фракции, полученные от pronuclei. (G) представитель изображения Предимплантационная развития zFRAP проанализированы зигот отображаются. Двухкамерные, 4-8 клеток и бластоциста стадии эмбриона на 24, 48 и 96 hpi, соответственно. Желтый круг указывает на развитую бластоциста. Этот бластоциста расширен и показано на правой панели. Шкалы бар = 100 µm. (H) гистограммы темпов развития zFRAP проанализированы эмбрионов. Бары указывают проанализированы zFRAP (zFRAP) эмбрионов (белый) и контроля эмбрионов (черный) вводят с мРНК, но анализ не zFRAP (не zFRAP). Данные являются от трех независимых экспериментов, изучение по крайней мере 57 эмбрионов в общей сложности. Двухкамерные, 4-8 клетки морулы (Mo), наблюдались и стадии бластоцисты (Bl) на 24, 48, 72 и 96 hpi, соответственно. Эта цифра была изменена с [Ooga et al 2017]7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: здорового роста щенков производным от проанализированы FRAP зигот. (A) показаны фотографии щенков, производный от zFRAP проанализированы зигот. (B) нормальный рост наблюдался во время кормящих проанализированы zFRAP щенков. (C) граф указывает, что вес щенков, полученных от нетронутыми эмбрионов (синий), небеленой управления эмбрионов (красный) и проанализированы zFRAP эмбрионов (зеленый). Тело вес 29 щенков, производный от нетронутыми эмбрионов, 24 от без-zFRAP эмбрионы и 15 из zFRAP проанализированы эмбрионов над 8-недельного периода. Значения, указанные звездочками значительно отличаются от элемента нетронутыми. Эта цифра была изменена с [Ooga et al 2017]7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительные рисунок 1: графический пользовательский интерфейс для анализа FRAP. (A) обзор графического интерфейса пользователя было показано. (B) были показаны расширенного изображений для каждого окна. (1) приобретение установки окно используется для настройки состояния приобретения изображений. (2) окно стимул настроек используется для настройки отбеливания условие. Это окно можно вызвать, нажав на кнопку на приобретение окна изображения. (3) окно приобретение управления Image используется для анализа FRAP. (4) Live View показывает настоящее изображение (настоящее изображение появляется после нажатия кнопки XY или фокус x2). Красный, зеленый и светло синие прямоугольники показывают ROI (регион интерес), REF (Справочник) и BG (фон), соответственно. (5) 2D представление показывает проанализированы FRAP изображение и появляется после нажатия серии «сделал» кнопку. В этом случае проанализированы FRAP мужской пронуклеусами показано в качестве примера. Три прямоугольника с 8 точек указывают, что эти регионы выбраны. (6) Live сюжет показывает настоящий интенсивности флуоресценции в каждом регионе. Оси X и Y указывают время (МС) и интенсивности флуоресценции, соответственно. (7) серии анализ показывает следы интенсивности флуоресценции в каждом регионе и появляется после нажатия кнопки анализа рядов на 2D окно просмотра. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительные 1 файл Excel: пример данных и вычисления данных. (Лист 1) Показан пример данных для мужской пронуклеусами. Нет. Указывает порядковый номер изображения. Были указаны интенсивности строки для каждого региона (ROI, Ref и BG). (Лист 2) Приведен пример расчета данных. Номер протокола указывает соответствующие места в разделе протокол. Примечания объяснить смысл каждого показателя. Численную формулу можно отнести, нажав клетки. Приведены примеры восстановления кривой и мобильных часть гистограммы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
| День -3 | День -2 | День -1 | День FRAP | День + 1 | День + 3 | День + 19 | |
| подготовка мРНК | Резки шаблон плазмиды (за ночь) |
1). Очистка шаблоне плазмиды | |||||
| 2). In vitro транскрипция | |||||||
| 3). В пробирке поли хвостохранилища | |||||||
| 4). Проверка качества мРНК электрофорезом | |||||||
| FRAP | 1). Подготовка манипуляции пипетки и камеры | ||||||
| 2). мРНК инъекций | |||||||
| 3). zFRAP анализ | |||||||
| 4). Расчет кривой восстановления и мобильных фракция* 2 | |||||||
| Анализ развития предимплантационной и эко | ЭКГ инъекций | 1). ХГЧ инъекции | 1). капацитации спермы | ||||
| 2). предварительной инкубации СМИ (HTF) | 2). Экстракорпоральное оплодотворение | ||||||
| Подготовка средств массовой информации (HTF, CZB, H-CZB и PVP-CZB) | 3). Преимплантационная развития оценки | ||||||
| Перенос эмбрионов | Подготовка pseudopregnant девушки (спаривания с вазэктомии мужчины* 1) |
Перенос эмбрионов 2-клеточной стадии pseudopregnant женщин | Оценка уровня рождаемости | ||||
| * 1: вазэктомии мужчины мыши должен быть подготовлен по меньшей мере за 2 недели до вязки | |||||||
| * 2: расчет может быть продлен на следующий день (+ 1) | |||||||
Таблица 1: таблица время экспериментов. В день анализа FRAP рассматривается как день 0. указанные эксперименты, которые должны быть выполнены в соответствующие дни для каждого элемента.
| Категории | Нет. из введенного зигот | Нет. из восстановленных зигот после инъекции мРНК (%) * | Нет. зигот анализ | Нет. из переданных | Нет. получателей | Нет. щенков (%) *** | Вес щенков (g) | Нет. Трансгенные щенков |
| этап 2-клеток эмбрионов (%) ** | ||||||||
| Нетронутыми | - | - | 99 | 98 (99,0) | 9 | 61 (62,2) | 1.64±0.02 | н.д |
| Не FRAP | 420 | 398 (94,8) | 82 | 78 (95,1) | 7 | 41 (52,6),b | 1.66±0.03 | н.д |
| FRAP | 79 | 78 (98,7) | 7 | 32 (41,0)b | 1.69±0.03 | 0 | ||
| *: рассчитывается путем деления с без. из вводят зигот; **: рассчитывается путем деления с без. из зигот проанализированы; : рассчитывается путем деления с без. переданных этап 2-клеток эмбрионов. a, b: надстрочные знаки указывают на существенное различие (P < 0,05). н.д: не определено. Эта таблица была изменена с [Ooga et al 2017]7. | ||||||||
Таблица 2: коэффициент рождаемости анализируемого эмбрионов: Был изучен потенциал развития эмбрионов, которые были проанализированы FRAP, на полный срок. Полученный коэффициент рождаемости этих эмбрионов показано. Как элементы управления были также рассмотрены нетронутыми и не анализируются FRAP эмбрионов. Также показываются веса щенков, производные от этих перенесенных эмбрионов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Как показал в этом исследовании, zFRAP анализ не повредить критического развития доношенных, предполагая, что этот метод является весьма полезным инструментом, чтобы выявить связь между молекулярные события и эмбриональных потенциал развития. Во время перепрограммирования, в двух ячейку как состояние клеток ES, которыми дифференцированный потенциал этих клеток становится выше, чем двухкамерные стадии эмбрионов, раскованность хроматина превращается в, сопоставимых с двух клеточной стадии эмбриона5. Соответственно вполне возможно, что zygotic хроматина раскованность имеет важное значение для эмбрионального развития потенциала. Ядер соматических клеток, переведены в цитоплазму ооцита, показан ниже раскованность хроматина, по сравнению с не только по отцовской линии pronuclei, но и матери pronuclei, предполагая, что отсутствие приобретение открытые хроматина в зигот переноса ядер соматических клеток участие в их бедных потенциал развития. Коллективно zFRAP анализ, как представляется, быть полезным для выяснения генома, перепрограммирование механизмов.
ZFRAP система может сделать возможным выбрать зигот с высоким потенциалом развития. В предварительном исследовании, помимо SCNT, было выявлено, что раунд сперматид инъекции (Рози)-производных зигот гавань аномальные хроматина неплотности. Кроме того было установлено, что некоторые из них показали хроматина раскованность на уровне сопоставимые с эко производные зигот также, предполагая, что эти зигот имеют высокий потенциал развития. Важно отметить, что зигот, из которых хроматина раскованность был оценен zFRAP может развиться в срок. В будущем поэтому, может быть можно выделить SCNT и РОСИ, полученных зигот с более высоким потенциалом развития от нижние оценки хроматина раскованность, zFRAP.
На сегодняшний день, предыдущие исследования показали полезность живой изображений метод для анализа состояния эпигеномные Предимплантационная эмбрионов. Некоторые из живой тепловизионные методы могут выявить каждой Эпигенетические модификации (например ДНК/гистона модификация) в Предимплантационная эмбрионов13,14, но с помощью zFRAP, можно оценить zygotic хроматина раскованность без убивает клетки. Раскованность хроматина, кажется, быть затронуты эпигеномные изменения. Например гетерохроматина, в котором репрессивных эпигеномные изменения такие, как H3K9me3 и H3K27me3 показали ниже гистона мобильности чем эухроматиновых региона3,15. Действительно лечение с химическое соединение, которое преобразует эпигеномные государства, причиной изменений chromatin раскованность в зигот. Таким образом используя zFRAP, это можно выявить состояние итоговый эпигеномные структуры хроматина. Было сочтено, что это будет преимуществом для оценки развития потенциала зигот.
Инъекции мРНК кодирования eGFP-H2B для zFRAP имеет выговор, но повышает универсальность zFRAP. Выговор мРНК инъекции является ущерб, причиненный микроинъекции. Чтобы избежать этого, это очень эффективно использовать eGFP H2B трансгенные мыши. Если используется линия трансгенные мыши eGFP-H2B, уровень потомство может увеличилась по сравнению с в случае использования микроинъекции мРНК. Наоборот, это заслуга мРНК инъекции, zFRAP позволяет использовать любой штамм мышей дикого типа. Исследователи, которые хотят использовать zFRAP с их интересом штамма мыши не нужно подготовить желаемый мыши штамма с eGFP H2B трансген. Это заслуги становится более заметным в анализе трансгенных (например. гиперэкспрессия/нокдаун) или нокаут мыши линии. Исследователи, которые хотят использовать zFRAP для их исследования темы с линией трансгенных/нокаут не должны подготовить eGFP H2B трансгенные линии от ограниченного числа их интерес из них. Это указывает на преимущества для прогрессирования исследований.
Оперативный анализ изображений с предимплантационной эмбрионов требует специальных знаний и очень дорого и тонко специализированных устройств. Таким образом введение такой экспериментальной системы не является легким решением. Экспериментальная система, которая установлена в этом исследовании необходимо только термо нагреватель помимо конфокальный лазерный сканирующий микроскоп. Кроме того метод обучения легко так, что новичок в лаборатории можно узнать метод zFRAP в течение 1 месяца. Однако есть некоторые вопросы, которые по-прежнему нуждаются в рассмотрении. Во-первых, это фокус дрейфа. Во время наблюдения вполне возможно, что pronuclei или зигот отходить от позиции, где они представлены до начала наблюдения. Если фокус дрейф происходит, ROIs также отходить от правильной позиции. В результате количественных данных становится бесполезной. Чтобы избежать этой проблемы, исследователь должен использовать крышку стекла дно блюда для защиты окна от кондиционера и ждать для расширения нефти через объектив. Если фокус дрейф, данные из отклонять зигот должны быть отброшены и 2nd FRAP анализ с же зигот не рекомендуется. В этом исследовании сокращая время наблюдения от 150 s3 около 25 s7 был очень полезным. Во-вторых, это длительный инкубационный за пределами инкубатора. Поскольку больше воздействия окружающей среды за пределами инкубатора определенно вредны для эмбрионального развития, было рекомендовано завершить FRAP-анализ в течение 1 ч в пакете. Количество зигот FRAP проанализированы в HEPES-амортизированное СМИ на дно блюда стекло должно быть 6-10. В этом экспериментальном состоянии максимальное число составляет около 30 ч. 4, но если необходимо больше зигот, 20 зигот за h могут быть проанализированы путем отсрочки оценки интенсивности флуоресценции в регионе ссылку и фона. Третий — «время связанных ухудшение лазерная Конфокальная лазерная микроскопия». Если лазерное отбеливание является недостаточным, правильные количественные данные невозможно получить из-за недостаточной отбеливания. Действительно родительский асимметрия zygotic хроматина раскованность невозможно приобрести с помощью слабого отбеливания лазера. Чтобы избежать этого, рекомендуется проверить, является ли мощность лазера ослабла как случай возникает. В этом исследовании 110-мкВт отбеливания было достаточно для приобретения родительского асимметрии.
zFRAP анализ может использоваться для других видов белков, в дополнение к основной гистонами. Так как ядро гистонами показывают заметно низкой мобильности, больше всего времени наблюдения (около 25 s в этом исследовании) необходимо в zFRAP анализе. Таким образом чтобы проанализировать большое количество зигот, культивирование в HEPES-амортизированное СМИ на нагреватель долгое время является неизбежным. С другой стороны для анализа zFRAP высокой подвижности белков, общее замечание время может быть установлено короткие, позволяя время культивирования в HEPES-амортизированное СМИ на нагреватель быть коротким. Таким образом поскольку больше воздействия окружающей среды за пределами инкубатора очень вредно для эмбрионального развития, zFRAP анализ белков помимо основной гистонов, которые имеют высокую мобильность по своей природе, похоже, чтобы показать Нижняя токсичности, чем ядро гистонами . Остается надеяться, что эта экспериментальная система поможет дальнейшего расследования связей между различными молекулярные события и эмбрионального развития.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим Satoshi Kishigami, Саяка Вакаяма, Хироаки Нагатомо, Сатоси Камимура и Кана Кисиде за критические замечания и технической поддержки. Эта работа частично финансируется министерством образования, культуры, спорта, науки и технологий программы для содействия реформе национальных университетов в м.о.; Японское общество для поощрения науки (16H 02593), фонд науки Асада и Такэда научный фонд к Т.У Спонсоры имел никакой роли в дизайн исследования, сбор данных и анализ, решение опубликовать или подготовка рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal laser scaning microscope | Olympus | FV1200 | FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7) |
| Thermo plate | Tokai Hit | TP-110RH26 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Micro manupilator | Narishige | MMO-202ND | |
| Pieze Micro Micromanipulator | Prime tech | PMAS-CT150 | |
| 35 mm culture dish | Falcom | 351008 | 35 x 100 mm style; for IVF |
| 60 mm culture dish | Falcom | 351007 | 60 x 15 mm style; for embryo culture |
| 50 mm culture dish | Falcom | 351006 | 50 x 9 mm style; for manipulation on the stage |
| 50 mm glass bottom dish | Matsunami | D910400 | 50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis |
| Mineral oil | Organic spceiality chemicals | 625071 | For FRAP analysis on the glass bottom dishes |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | For IVF and embryo culture |
| glass capillary | Drummond | 1-000-1000 | For handling mouse zygotes |
| Borosilicate glass | Prime tech | B100-75-10-PT | For microinjection of mRNA |
| Micropipett puller | Sutter instrument | P-97/IVF | For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm) |
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit | Thermo Fisher scientific |
AM1340 | |
| Poly (A) tailing kit | Thermo Fisher scientific |
AM1350 | |
| PVP solution 10% (PVP-HTF) | IrvineSceientific | 99311 | HEPES buffered HTF containing 10% PVP |
| Sodium HEPES | Sigma | H3784 | |
| pTOPO eGFP-H2B | Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6) | ||
| NorthernMax Gly Sample loading Dye | Thermo Fisher scientific |
AM8551 | For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA |
| Phenol chloroform isamyl alcohol | nacalai tesque | 25970-14 | |
| Chloroform | nacalai tesque | 08401-65 | |
| Not I | TOYOBO | NOT-111X | |
| Ethachinmate | WAKO | 318-01793 | |
| 3664 Otical power meter | Hioki | 3664 | Power meter for laser power |
| Stereomicmicroscope | Olympus | SZX16 |
References
- Burton, A., Torres-Padilla, M. E. Epigenetic reprogramming and development: a unique heterochromatin organization in the preimplantation mouse embryo. Brief Funct Genomics. 9, 444-454 (2010).
- Okada, Y., Yamaguchi, K. Epigenetic modifications and reprogramming in paternal pronucleus: sperm, preimplantation embryo, and beyond. Cell Mol Life Sci. 74, 1957-1967 (2017).
- Ooga, M., Fulka, H., Hashimoto, S., Suzuki, M. G., Aoki, F. Analysis of chromatin structure in mouse preimplantation embryos by fluorescent recovery after photobleaching. Epigenetics. 11, 85-94 (2016).
- Meshorer, E., et al. Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells. Dev Cell. 10, 105-116 (2006).
- Boskovic, A., et al. Higher chromatin mobility supports totipotency and precedes pluripotency in vivo. Genes Dev. 28, 1042-1047 (2014).
- Yamagata, K., Ueda, J. Long-term live-cell imaging of mammalian preimplantation development and derivation process of pluripotent stem cells from the embryos. Dev Growth Differ. 55, 378-389 (2013).
- Ooga, M., Wakayama, T. FRAP analysis of chromatin looseness in mouse zygotes that allows full-term development. PLoS One. 12, e0178255 (2017).
- Quinn, P., Begley, A. Effect of human seminal plasma and mouse accessory gland extracts on mouse fertilization in vitro. Australian journal of biological sciences. 37, 147-152 (1984).
- Chatot, C. L., Lewis, J. L., Torres, I., Ziomek, C. A. Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium. Biology of reproduction. 42, 432-440 (1990).
- Bae, J., Sung, B. H., Cho, I. H., Song, W. K. F-actin-dependent regulation of NESH dynamics in rat hippocampal neurons. PLoS One. 7, e34514 (2012).
- Dieteren, C. E., et al. Defective mitochondrial translation differently affects the live cell dynamics of complex I subunits. Biochim Biophys Acta. 1807, 1624-1633 (2011).
- Subramanian, V., et al. H2A.Z acidic patch couples chromatin dynamics to regulation of gene expression programs during ESC differentiation. PLoS Genet. 9, e1003725 (2013).
- Hayashi-Takanaka, Y., et al. Tracking epigenetic histone modifications in single cells using Fab-based live endogenous modification labeling. Nucleic Acids Res. 39, 6475-6488 (2011).
- Yamazaki, T., Yamagata, K., Baba, T. Time-lapse and retrospective analysis of DNA methylation in mouse preimplantation embryos by live cell imaging. Dev Biol. 304, 409-419 (2007).
- Puschendorf, M., et al. PRC1 and Suv39h specify parental asymmetry at constitutive heterochromatin in early mouse embryos. Nat Genet. 40, 411-420 (2008).
