Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Zygotic floresan kurtarma fotoğraf ağartma sonra analiz için tam dönemlik geliştirme sağlar kromatin gevşeklik

Published: June 12, 2018 doi: 10.3791/57068
Automatic Translation
1,3, 2, 2, 1,3
1Faculty of Life and Environmental Sciences, Department of Biotechnology, University of Yamanashi, 2Department of Integrated Bioscience, Graduate School of Frontier Sciences, University of Tokyo, 3Advanced Biotechnology Center, University of Yamanashi

Summary

Kromatin gevşeklik blastomeres gelişim potansiyelini yer gibi görünüyor. Ancak, kromatin gevşekliği güvenilir bir dizin olarak embriyoların gelişim potansiyeli için kullanılıp kullanılamayacağını bilinmemektedir. Burada, kromatin gevşekliği tarafından değerlendirilmiş zigotları tam dönem için gelişebilir bir deneysel sistem tarif edilmiştir.

Abstract

Canlı görüntüleme moleküler olayların analizi için ontogeni sırasında sağlayan güçlü bir araçtır. Son zamanlarda, kromatin gevşeklik veya açıklık pluripotent embriyonik kök hücre hücresel farklılaşma potansiyeli dahil olmak gösterilmiştir. Bu daha önce kıyasla bildirildi embriyonik kök hücreleri ile onların totipotency ile dernek düşündüren bir son derece gevşetti kromatin yapısı zigotları liman. Bu son derece gevşetti/aç kromatin yapısı embriyonik gelişim potansiyeli için önemli olup olmadığını ancak, şimdiye kadar bu giderilmiş değil. Bu da çalışmanın, floresans tarafından analiz edildi hangi zigotları içinde fotoğraf ağartma sonra kurtarma terime önemli zarar vermeden gelişebilir bir deneysel sistem bu hipotez incelemek için geliştirilmiştir. Önemlisi, bu deneysel sistem sadece bir termos-tabak ısıtıcı ek olarak confocal bir lazer mikroskobu tarama gerekir. Sonra çözümleme (sıkı bağlamak) fotoğraf ağartma zygotic kromatin moleküler olaylarda tam dönemlik geliştirme için önemli olup olmadığını araştırmak için kullanılabilir Bu çalışma bulguları bu floresan kurtarma öneririz.

Introduction

Gübreleme sonra dinamik olarak değişmiş kromatin yapısı, ve zygotic kromatin yapısı sonra sonunda kurulan1,2. Baba tarafından pronuclei, bu döneminde sırasında baskın kromatin protein histon protamine değiştirilir. Elde edilen kromatin son derece spermlerinin ve birkaç puan (Örneğin, histon varyant kompozisyon, histon değişiklik) dişi yumurta farklıdır. Böylece, kurulan zygotic kromatin sonraki embriyonik geliştirme için önemli olduğu düşünülmektedir. Ancak, uzun sürelerle zygotic kromatin yapısı ayrıntıları ortaya çıkarmak için çabalara rağmen yöntemleri zigotları niteliğini değerlendirmek için veya onların kromatin yapısı analiz ederek tam dönemlik gelişimleri tek hücreli aşamada tahmin etmek hiç var kurulan.

Önceki çalışmada, bu zigotları son derece gevşetti kromatin yapısı3var keşfedilir. Şu anda, kromatin gevşeklik veya açıklık hücresel farklılaşma (ES) embriyonik kök hücreleri4' te potansiyel için önemli bir faktör olduğuna inanılıyor. ES hücreleri homojenliği doğada sergi değil, ama oldukça heterojen; ES Hücre koloniler halinde bazı geçici bir daha yüksek farklılaşma potansiyeli iki hücreli sahne embriyo blastomeres için karşılaştırılabilir elde etmek. Devlet gibi iki hücresine bu geçiş sırasında ES kromatin gevşekliği iki hücreli sahne embriyo5ile karşılaştırılabilir nedir içine değişiklikler hücreleri. Böylece, kromatin gevşekliği önemli hücresel farklılaşma potansiyeli için kapsamlı kromatin zigotları içinde açmak mümkün olduğu zygotic gelişim potansiyeli değerlendirme için yararlı gibi görünüyor.

Canlı görüntüleme sonraki geliştirme ve hatta tam dönemlik geliştirme6için bu yöntem sağlar beri moleküler olayların analizi için ontogeni sırasında sağlayan güçlü bir araçtır. Canlı görüntüleme yöntemlerinden birini kromatin gevşekliği Preimplantasyon embriyo ve ES hücreleri3,4,5incelemek için sıkı bağlamak Analizi kullanılmıştır. Zygotic kromatin gevşekliği tam dönemlik geliştirme üzerinde zararlı bir etkisi olmadan sıkı bağlamak analiz tarafından çözümlenebilir, embriyo kalitesi değerlendirme tek hücreli aşamada için değerli bir araç olabilir. Ancak, bu deneysel yöntem tarafından tam dönemlik geliştirme etkileri inceledik değil. Son zamanlarda, deneysel bir sistemi zygotic kromatin gevşekliği değerlendirmek için sıkı bağlamak kullanarak geliştirilmiştir. Çünkü bu zigotları için yeni bir gözlem sistemi, zygotic sıkı bağlamak (zFRAP) olarak adlandırdığı oldu. zFRAP eleştirel tam dönemlik geliştirme etkilemez mi ve oldu başka bir yerde7bildirdi. Bu raporda, bu deneysel yöntemin protokolü tanımlanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu çalışma Kılavuzu'nda bulunan öneriler için bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanları Yamanashi Üniversitesi ile sıkı uygun olarak gerçekleştirildi. Protokol ve Yamanashi Üniversitesi hayvan deneyleri Etik Komitesi tarafından kabul edildi (izin numarası: A24-50). Tüm ameliyat tribromoethanol anestezi altında gerçekleştirilen ve tüm çabaları acı en aza indirmek için yapılmıştır. Yordamlar ve saatleri resimli bir bakış gösterilir Şekil 1 ve Tablo 1, anılan sıraya göre.

1. mesajcı RNA (mRNA eGFP-H2B,In Vitro transkripsiyonu) hazırlık

  1. Şablon DNA pTOPO-eGFP-H2B3,7 5 µg ile 30 U değil / linearize ben 37 ° C'de 50 µL gecede.
  2. Onay sindirilir DNA'ın 1.5 µL olup olmadığını tamamen Elektroforez tarafından sindirilmiş toplamak.
    1. 1,5 µL ve 3-5 µL sindirilmemiş DNA boya de %2 özel jel, sırasıyla yükleme ile ve Elektroforez tabi geçerlidir.
      Not: Eğer tamamen sindirilmiş, tek bir bant (yaklaşık 5 kb) görülmektedir. Sindirilmemiş DNA farklı bir konumda görünür bir denetim olarak kullanılır.
  3. GKD2O 151.5 µL ekleyip 200 µL kalan için fenol/kloroform/izoamil alkol (25:24:1) DNA sindirilir.
    1. Gönderen vortex kuvvetle karıştırın.
    2. 15 dakika maksimum hızda santrifüj kapasitesi.
  4. Süpernatant kurtarmak ve kloroform 200 µL ekleyin.
    1. Gönderen vortex kuvvetle karıştırın.
    2. 15 dakika maksimum hızda santrifüj kapasitesi.
  5. Süpernatant yeniden elde etmek ve daha sonra 20 µL 3 M sodyum asetat ve ethachinmate 1,5 µL ekleyin.
    1. Gönderen vortex kuvvetle karıştırın.
    2. 550 µL % 100 etanol ekleyin ve sonra girdap tarafından kuvvetle karıştırın.
    3. 15 dakika maksimum hızda santrifüj kapasitesi.
    4. Süpernatant atın ve Öyleyse Pelet % 70 etanol ile yıkayın.
    5. Pelet buharlaşma için 5-10 dk tarafından kuru.
  6. Çöktürülmüş plazmid DNA nükleaz ücretsiz su 8 µL'geçiyoruz.
  7. Plazmid konsantrasyon değerlendirmek (beklenen konsantrasyonu olduğunu hakkında 300-500 ng/µL) üretici öğretim takip ederek nanodrop ile.
  8. Vitro transkripsiyon mRNA üreticinin yönergelerini izleyerek eGFP-H2B ile 1 µg saf DNA'ın bir şablonu olarak toplam reaksiyon hacminin 20 µL kodlama için gerçekleştirin.
    1. Vitro transkripsiyon sonra 36 μL su ekleyin sonra 1,5 µL analiz için sentezlenmiş mRNA 56 µL Elektroforez tarafından (olmadan poli gibi A) olarak kurtarılır.
  9. Poli A takip 100 µL tepki birimindeki sentezlenmiş mRNA için üreticinin yönergelerini izleyerek gerçekleştirin.
  10. Lityum klorür yağış çözüm 60 µL poly eGFP-H2B kuyruklu bir mRNA ekleyin ve sonra kuvvetle karıştırın.
    1. -30 ° c 30 dk için serin.
    2. 15 dakika maksimum hızda santrifüj kapasitesi.
    3. Süpernatant atın ve Öyleyse Pelet % 70 etanol ile yıkayın.
    4. Pelet buharlaşma için 5-10 dk tarafından kuru.
  11. Isıtma için 30 dk 55 ° C'de tarafından 20 µL nükleaz ücretsiz su ile Pelet geçiyoruz.
  12. Nanodrop ile zarlarını mRNA konsantrasyonu değerlendirmek. İçin 500 ng/µL nükleaz ücretsiz su ve mağaza-80 ° c kadar kullanmak oranında seyreltin.
  13. Tercih edilen mRNA üretim onaylamak; 1 µL/olmadan mRNA (1.8.1 ve 1.12 adımları sırasıyla elde) konu poli 0.1 mg/mL arasında etidyum bromür 1,5 µL ve Elektroforez analiz için örnek yükleme boya 3 µL ile karışık bir kuyruk. Uygulanan birim 5.5 µL yapıldı.
    Not: Poli A takip başarılı olursa, ötelenen grubun mRNA poli bir takip olmadan göre (Şekil 2A) dikkat edilmelidir.

2. Vasectomized erkek fareler hazırlanması

  1. ICR erkek fareler 8-12 ayda bir ağırlık ölçeği kullanarak tartın.
  2. İntraperitoneally erkek fareler 0.7 - 0.9 mL % 1.2 tribromoethanol anestezi ile enjekte et.
    Not: Anestezi fare boyutuna bağlıdır. Örneğin, 40 gr ağırlığında bir fare tribromoethanol anestezi ile 0.8 mL enjekte edilir.
  3. Berry % 70 etanol ile ıslak.
  4. Bir küçük berry (3-5 mm) kesilmiş ve sonra bir makas yardımı ile kas duvardaki bir kesi yapmak olun.
    Not: Makas ve forseps % 70 etanol ile ameliyat başlamadan önce temizlenmelidir.
  5. Forseps ile yağ yastığı kavrama ve yavaşça çekin. Daha sonra testis ve vas deferens görünür.
    Not: Vas deferens U şeklinde bir tüp olduğunu ve bir kırmızı kan damarı ile.
  6. Cerrahi sütür ile iki puan, vas deferens bağlayın ve sonra bağlı nokta arasındaki orta kısmını kesti.
  7. Yavaşça geri yağ yastığı ve testis berry itin.
    1. Kalan testisin ameliyatla yineleyin.
  8. Kas Duvar ile cerrahi sütür ile iki dikiş dikmek.

3. TÜP BEBEK

  1. 8 - 10 - hafta eski kadın B6D2F1 enjekte 7.5 IU at koryonik gonadotropin (EKG) ve 46-50 h aralığında insan korionik gonadotropin (hCG) ile intraperitoneally (BDF1) fareler.
  2. Capacitation ve döllenme 1 gün 30 mm çanak IVF öncesine damla 300 µL insan tubal sıvı (HTF)8 ortam hazırlamak, bu damlalar laboratuvar tezgah üzerinde mineral yağ ile kapak ve bir kuluçka makinesine bir gecede preincubate.
  3. Olgunlaştı erkek ICR fareler tarafından servikal çıkığı kurban. Kauda epididim 27-G iğne ile incelemek ve spermatozoon toplamak. Onları 1-2 h 38 ° C'de HTF medyasının 300 µL içinde capacitation için kültür
  4. hCG enjeksiyonu sonra 16 h tarafından servikal çıkık dişi fareler süper ovulated kurban. Mineral yağ HTF medya yanında içine ovidukt ampulla transfer ve kümülüs hücreleri ve yumurta karmaşık bu ovidukt ampulla tarafından 30-G iğne preincubated döllenme-HTF orta çizin.
    Not: Kadın bazı fareler genellikle yumurtlama süper yumurtlama tedaviye rağmen gösterme. Genişlemiş ovidukt ampulla yumurtlama belirtisidir.
  5. Capacitation sonra 2-3 µL capacitated spermatozoon, hangi ovulated yumurta toplanmıştır tohumlama HTF medya içine aktarın.
  6. 1 h tohumlama sonra döllenmiş zigotları toplamak ve onları 100 µg/mL CZB9 medya 10 dk, hyaluronidase ile tedavi.
    Not: Döllenme düzgün gerçekleştirildiğinde, tohumlama sonra 1 h 2nd kutup beden ile döllenmiş zigotları gözlenir. Daha az veya düşük kaliteli sperm kullandıysanız, yalnızca küçük zigotları 2nd kutup beden ile gözlenir. Ayrıca, birçok spermlerinin döllenme için kullanılması halinde, polyspermy oluşur. Uygun döllenme zigotları ile erkek ve dişi pronuclei yol açar. Bu ölçütleri kullanarak, tohumlama iyi ya da değil bitmiş bulmak mümkündür.
    1. CZB medya yıkandıktan sonra ikinci bir kutup gövdeli zigotları mikroenjeksiyon ile eGFP-H2B mRNA tabi.

4. Oda ve mikroenjeksiyon pipetler hazırlanması

  1. EGFP-H2B nükleaz ücretsiz su 250 ng/µL bir konsantrasyon elde etmek için kullanarak kodlama RNA sulandırmak.
  2. 2-3 damla PVP-HTF hazırlamak ve eGFP-H2B mRNA damla ve CZB (H-CZB) damla 60 mm çanak üzerinde 5-6 damla Hepes arabelleğe alınmış. Bu damla mineral yağ ile kapak.
    Not: Bu hazırlıklar laboratuvar tezgah üzerinde gerçekleştirilebilir. Laminer hava akımı kabine kullanmak için bir gereksinim vardır.
  3. Çek borosilikat cam micropipette çektirme ile (Örneğin, P = 500, ısı 825, çekme = = 30, vel = 120 ve saat = 200)
  4. Pipet Ucu kırdıktan sonra çekti cam mikroenjeksiyon pipet ucu (geri −300 µm) yakın bir microforge kullanarak yaklaşık 30 ° eğil.

5. mikroenjeksiyon

  1. Tabak ısıtıcı bir piezo ile zigotları öldürülmesi mRNA enjeksiyon sırasında önlemek için micromanipulator aşamasında açın.
  2. Yıkama ve enjeksiyon iğneler HEPES tampon HTF iç kat % 10 içeren PVP (PVP-HTF).
  3. 2nd kutup beden (Şekil 2B) ile döllenmiş zigotları toplamak ve 20-25 zigotları odası ile bir micromanipulator bağlı mikroskop sahne alanı'nın üzerine aktarın.
  4. Seyreltilmiş eGFP-H2B mRNA borosilikat cam kılcal ipuçları içine doldurun.
  5. Zigot holding pipet ile tutun ve sonra zona pelusida ve piezo sürücü ile sitozolik membran bölün.
  6. Yaklaşık 10 enjekte pL mRNA zigotları sitoplazma içine. MRNA-enjeksiyon uzun kuluçka makinesi dışında zigotları kültür tarafından hasarları önlemek için 10 dakika içinde bitirmek.
    Not: Enjeksiyon hacmi 2nd kutup gövde metni olarak büyük olması gerekir. MRNA enjekte miktarı çok büyük ise, mobil kesir etkileyebilir ücretsiz eGFP-H2B kesir neden mümkündür.
  7. 10 dakika sonra mikroenjeksiyon, en az 3 damla yıkama ve zFRAP analiz kadar 38 ° C'de CZB içinde zigotları enjekte kültür.

6. zFRAP Analizi

  1. Lazer ve confocal mikroskop sahne alanı'na bağlı Isıtma levhası 1s zFRAP Analizi önce açın. Sıcaklığı 38 ° C'de ayarlamak
  2. 6-10 µL HEPES tampon CZB medya 60 mm cam alt çanak üzerinde mineral yağ ile kaplıdır ve sıcak ısıtıcısını zigot koleksiyonu kadar koymak.
  3. 8 - 12 h tohumlama sonra toplamak 5-10 eGFP H2B ifade zigotları ve transfer içine 6-10 µL HEPES tampon CZB orta damla önceden ısındı.
    Not: uzun inkübatör dışında kültür önlemek için 5-10 eGFP H2B ifade zigotları her Analizi kullanılmıştır. 5-10 zigotları için 1s içinde analiz edilebilir.
  4. Ağartma ve görüntüleme koşulları üreticinin talimatlarına göre ayarlayın. Durumda confocal bir lazer mikroskop (Tablo reçetesi) tarama aşağıda gösterilmiştir:
    1. Kullanım 60 X Petrol mercek (60 X 60 X / 1,35 petrol).
      Not: Lensler daha yüksek büyütme (daha yüksek sayısal diyafram) gösteri daha yüksek hassasiyet ile.
    2. Tarama hızı 4.0 µs/piksel ve boyut "512" "Satın alma ayarı" (Tamamlayıcı Şekil 1) olarak ayarlayın.
    3. Dijital zoom "5" (Tamamlayıcı Şekil 1) artırın.
      Not: Daha yüksek zoom odak kayması ya da değil oluşur tanımak için gereklidir.
    4. Boya listesi (ek Şekil 1) ve sonra seçti "EGFP" açın. Set gözlem zaman 1.6 s (aralığı "ücretsiz Çalıştır" ayarı olarak ayarlanır) (Tamamlayıcı Şekil 1)
      Not: Daha fazla gözlem noktaları daha ayrıntılı veri neden olabilir, ancak aynı zamanda fototoksisite neden olabilir. ZFRAP analizde, 1.6 s gözlem vakit kromatin gevşekliği ebeveyn asimetri algılamak için yeterli gibi görünüyor.
    5. Fotoğraf sayısı 12 toplam (Tamamlayıcı Şekil 1) olarak ayarlayın.
    6. Start "Uyarıcı ayarı" paneli ve "Ana" UseScanner'ı tıklatın. Tarama hızı 10.0 µs/piksel olarak ayarlayın. "Harekete geçirmek içinde" serisini ve PreActivation "5 sn" (Tamamlayıcı Şekil 1) "3 kare" ve harekete geçirmek zaman ayarlayın.
    7. "Odak x 2" tıklayın ve odağı ayarlayın ve sonra "Dur".
    8. Ağartma ve lazer güç görüntüleme ayarla (477 nm) 110 ve 15 µW at, sırasıyla, tarafından ayarlama "gage güç lazer" (Tamamlayıcı Şekil 1).
      Not: Çok güçlü ağartma Nicel analiz zorluğa neden oluyor daha büyük bir ağartılmış alan neden olabilir. Lazer Güç ölçüm için bir güç ölçer kullanın. Lazer güç zamanla ilgili bir bozulma etkisini önlemek için lazer güç onaylamak önemlidir.
    9. "Küçük Rect" (Tamamlayıcı Şekil 1) uyarıcı ayar panelinde tıklatın. Faiz (ROI; kırmızı; bölgesi ayarlayın YG #1B) 40 x 40 piksel (7.6 µm2) olarak. Hazırlamak bir başvuru bölgesi (REF; yeşil; Yatırım getirisi #2) ve bir arka plan (BG; mavi; Yatırım getirisi #3) kullanarak "ROI" kopyalayıp "ROI" (fare sağ tıklatma düğmesi).
      Not: Piksel boyutunu imleç yatırım getirisi üzerinde olduğunda fare sağ tuşa basarak denilen "ROI Yöneticisi" aracılığıyla ayarlanabilir. Daha büyük ROIs zFRAP puan dağılımı standartlaştırmak bu yana daha iyi olduğu düşünülür. Çekirdekçik habercisi vücut (NEH) önlemek zorlaştırıyor çünkü ancak, çok büyük bir yatırım getirisi, bu çözümleme için kullanılamaz. eGFP-H2B bu yerde kromatin ücretsiz olduğu düşünülen ve dikkate değer daha yüksek hareketlilik3gösterdi. Yatırım getirisi ve REF alanları mümkün olduğunca ayrılmalıdır. Bu iki bölgeye yakın iseniz, ağartma REF bölge da etkileyebilir.
    10. "Canlı" araç çubuğunda tıklatın ve "Live çıkart" (Tamamlayıcı Şekil 1) başlatın.
      Not: Canlı çizim floresans sinyal yoğunluğu içinde her yatırım getirisini gösterir ve lazer güç HV kullanarak ayarlamak için kullanılır. Yatırım getirisi seçilmemişse, hiçbir yoğunluğu canlı Arsa panelde algılanan unutmayın.
    11. Yatırım getirisi konum belirleme
      Not: Yatırım getirisi pronuclei istediğiniz konuma sürükleyerek hareket edebilir. (1) olmak emin çekirdekçik önlemek ve uygun (2) tüm ROI nucleoplasm. ROI içinde nükleer membran (sitoplazma) alanı dışında bölge içermez. Böylece ROI sitoplazma içerir olup olmadığını ya da değil eGFP-H2B floresans bulmak kolay eGFP-H2B lokalizasyonu nucleoplasm son derece sınırlıdır. Erkek pronuclei kez 2nd kutup cesedin yanında lokalize kadın daha büyük olma eğilimindedirler. Bu kriterler kullanırken, erkek veya kadın pronuclei Yargıç.
    12. "Odak x 2" tıklatın (Tamamlayıcı Şekil 1) ve sonra HV güç gage kanal için EGFP içine floresan yoğunluğu yaklaşık 2000'e ayarlayın (floresan yoğunluğu "canlı komplo" penceresinde görülebilir).
  5. ZFRAP analiz başlamak için "Zaman" ve sonra "XY" (Tamamlayıcı Şekil 1)'i tıklatın.
    Not: "Zaman" düğmesini uygun seçtiyseniz, "t" "XY" butonunu görünür.
    1. "Sıkı bağlamak görüntüleme"XY düğmesi"yakın ve sıkı bağlamak analiz verileri elde etmek sonra görünen bitmiş serisi" (Tamamlayıcı Şekil 1),'ı tıklatın.
    2. Kurtarmak belgili tanımlık eğe "2B görünümü-görüntü XXXXX" tarafından tercih edilen adlandırılmış dosya (ÖİB. dosya biçimi) olarak "farklı kaydet" (Ctrl + Shift + S da kullanılabilir).
    3. Yatırım getirisi, REF ve BG seçin ve tıklatın (Ctrl + A da kullanılabilir) "2B görünümü görüntü" penceresinde "serisi analizi".
    4. Satır sıkı bağlamak veri elde etmek ve sonra "Kaydet" canlı çizim penceresinde düğmesini tıklatın.
      Not: Satır sıkı bağlamak nicel veri bir csv dosyası olarak kaydedilir.
  6. ZFRAP kontrol için bazı etkisi floresans gözlem önlemek için cam alt yemekleri kenarında yakın açılan mRNA ile enjekte zigotları koymak.

7. veri hesaplama

  1. Kullanırken elde edilen nicel veri olun "kurtarma eğrisi" ve "mobil kısmı" tarafından Excel grafiği (bkz. aşağıdaki ile tamamlayıcı excel dosyası) bazı değişikliklerle başvurular3,7 gösterildiği gibi.
  2. Göreli yoğunluğunu 12 resimleri her zaman için yatırım getirisi ve REF BG değerini çıkararak hesaplar.
  3. ROI değeri bu hakem tarafından bölün. Sonuç olarak, her zaman bir noktada 12 standart göreli yoğunluğunu puanları elde edilebilir.
  4. 3 görüntüleri ağartma fotoğraf daha önce alınan yatırım getirisi için göreli puan ortalamasını hesaplamak.
  5. Kurtarma oranını hesaplamak. 12 göreli puanları için yatırım getirisi, (7.1.2 elde edilen.) her zaman bir noktada (7.1.3 elde edilen.) fotoğraf beyazlatma daha önce göreli puanı ortalama tarafından çekilen görüntüler elde Böl. Bu sınavların kullanarak kurtarma eğri çizme (Şekil 2E).
  6. Ağartma oranını hesaplamak.
    Not: ağartma oranı (%) = 100 - 4th görüntü iyileşme oranı.
  7. Aşağıdaki10,11,12 olarak formül kullanarak mobil kesir (MF) hesaplama
    MF (%) = 12inci kurtarma oranı (bitiş noktası) - 4th iyileşme oranı / beyazlatma hızı × 100.

8. embriyo transferi

  1. 8-12 ayda bir gece embriyo transferi önce gecede aynı kafese olmalarına izin vererek vasectomized erkek ICR fareler ile olgunlaştı ICR kadın dostum.
  2. ZFRAP analiz edilmiş ve iki hücreli aşamaya geliştirmek için kararlı embriyo toplamak.
  3. İntraperitoneally dişi fareler 0,35 - 0.75/4/5mg/kg medetomidine/midazolam/butorphanol karışık ajanların embriyo transferi önce 0,45 mL veya 0.7 - 0.9 mL % 1.2 tribromoethanol anestezi ile enjekte.
    Not: Anestezi hacmi fareler vücut ağırlığı tarafından belirlenir. Tribromoethanol: 0.2 mL/10 g vücut ağırlığının; medetomidine/midazolam/butorphanol ajanlar karışık: vücut ağırlığı 0.1 mL/10 g.
    1. Oviducts 0,5 gün sonrası coitum (dpc), vajinal bir fiş ile pseudopregnant kadın ICR farelerin içine bu iki hücreli sahne embriyo transfer.
    2. Embriyo transferi sonra onlar uyanıncaya kadar 37 ° C'de ayarla ısıtıcı dişi fareler koyun.
  4. 18,5 dpc, taşıyıcı anne tarafından servikal çıkığı kurban ve zFRAP analiz zigotları sezaryenle türetilmiş pups kurtarmak. Bazı ve kurtarılan yavrularını üvey annesine teslim edildi ve kendi vücut ağırlıkları her hafta değerlendirildi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

eGFP-H2B ile zFRAP Analizi

Düzgün üretilen eGFP-H2B, ötelenen bir grup tarafından poly bir takip (Şekil 2A) neden olduğu gibi görülen kodlama mRNA zigotları 1-3 h 2 bir kutup gövdeli sitoplazma içine tohumlama (Şekil 2B) sonra enjekte ettiler. 8'e 12 h tohumlama sonra 2 pronuclei eGFP-H2B ifade gösterilen ile zigotları toplanmış ve zFRAP Analize (Şekil 2C) tabi. Sıkı bağlamak analiz ağartma ve kurtarma adımlardan oluşur. Önceden beyazlatma faz eGFP-H2B sinyal (Şekil 2B-1) gözlenen, ama bir kez ağartılmış, sinyal ihmal edilebilir bir seviyeye (Şekil 2B-2) reddetti. Ağartma başarılı olursa, karanlık bir delik yatırım getirisi gibi büyük yakında ağartma sonra ortaya çıktı. Sonra beyazlatma, eGFP-H2B floresans sinyalinin yoğunluğu biraz iyileşti; Floresan sinyal eGFP-H2B Ryslampa kısmını girişi nedeniyle yatırım getirisi nucleoplasm (Şekil 2B-3) Ryslampa alanından içine yavaş yavaş arttı. Kromatin gevşeklik zFRAP analizi başarı onay için ebeveyn asimetri kromatin gevşekliği kullanılması önerilir; Erkek pronuclei daha hızlı bir kurtarma eğrisi ve bu kadın (Şekil 2E ve F) daha fazla mobil kesirler gösterdi. ZFRAP analizi, yıkanmış ve kültürlü zigotları CZB medya, sonra (Şekil 2 g ve H) önemli zarar vermeden blastosist aşamasına geliştirebilir. Kesinlikle daha uzun süre ağartılmış bile, zigotları hala7blastosist aşamasında de geliştirebilir.

ZFRAP analiz zigotları tam dönem gelişimi Analizi

ZFRAP analiz zigotları elde edilen embriyolar tam dönemlik gelişimi analiz etmek için iki hücreli aşamada embriyo pseudopregnant anneler oviducts transfer edildi. Denetimleri sağlam embriyo ve mRNA ile ama değil zFRAP analiz edilmiş enjekte bir hazırlanmıştır. Doğum oranı zFRAP analiz edilmiş embriyoların (%41.0) biraz ama önemli ölçüde bu bozulmamış embriyo (%62.2) daha düşük, ama yok zFRAP denetimi ile aynı (%52.6) (Tablo 2). Böylece, zFRAP-analiz biraz tam dönemlik embriyonik gelişim için zararlı gibi görünüyor. Ancak, önemlisi, belgili tanımlık pups sağlıklı görünüyordu zFRAP analiz zigotları türetilmiş ve tam olarak gelişmiş (Şekil 3).

Figure 1
Resim 1: Bir şematik gösterimi deneyler için yordamlar akışını. Vitro fertilizasyon: taze toplanan metafaz II (MII) yumurta capacitated sperm ile tohumlanmış. Vitro transkripsiyon: mesajcı RNA (mRNA) eGFP erimiş histon H2B kodlama (eGFP-H2B) ile değil Doğrusallaştırılmış pTOPO-eGFP-H2B3 SP6 organizatörü dan transkripsiyonu ben. EGFP-H2B mRNA poli A takip ve sonra arıtma tabi. Saf eGFP-H2B mRNA mRNA enjeksiyon içinde kullanılır. mRNA enjeksiyon: hazır eGFP-H2B mRNA zigotları 2nd kutup beden ile sitoplazma içine enjekte edilir. zsıkı bağlamak Analizi: eGFP H2B ifade zigotları zFRAP analize tabi tutuldu. İlgi alanları (ROI; kırmızı dikdörtgen) bölgenin güçlü bir lazer ile ağartılmış ve eGFP-H2B sinyal ihmal edilebilir bir seviyeye düştü. Sonra beyazlatma, eGFP-H2B sinyalin yoğunluğunu giderek arttı. Vitro Geliştirme: ZFRAP analiz sonra zigotları blastosist sahne içine geliştirebilir. Embriyo transferi: iki hücreli aşamada pseudopregnant dişi fareler oviducts zFRAP analiz embriyo transfer. 18 gün sonra görüşürüz, sağlıklı canlı yavru zFRAP analiz embriyo elde. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: eGFP-H2B ile zigotları zFRAP analizi. (A) temsilcisi imge-in vitro transkripsiyon ve poli takip tarafından düzgün hazırlanmış mRNA. Lane 1: ön poli bir takip; Lane 2: poli A takip sonrası. EGFP-H2B kodlama (B) mRNA zigotları 2nd kutup vücut 1-3 h sonrası döllenme (HPI) ile sitoplazma içine enjekte ettiler. Ölçek çubuğu = 25 µm (C) eGFP H2B ifade zigotları 8-12 HPI toplanan. Beyaz yıldız çekirdekçik habercisi organları (NEH) göster. Ölçek çubuğu = 10 µm (D) eGFP-H2B ifade tespit bile neh içinde tüm nucleoplasm önceden beyazlatma aşamasında (D-1), kısa bir süre sonra (D-2) ağartma ve kurtarma (D-3) sonra. Nükleer membran (beyaz noktalı çizgiler) ve NF'leri (yıldızlar) gösterilir. Ölçek çubuğu = 10 µm. (E, F) kurtarma eğri ve mobil kesirler 5 bağımsız deneylerde 45 zigotları üzerinden elde. Mavi ve kırmızı sırasıyla erkek ve kadın, gösterir. Kurtarma eğrileri tek daire ölçüm noktasını belirtmek. Scatter araziler tek noktalar mobil kesirler pronuclei elde edilen puan gösterir. (G) temsilcisi zFRAP analiz zigotları Preimplantasyon gelişimi görüntülerini gösterilir. İki hücreli, 4-8 hücre ve Blastokist embriyo 24, 48 ve 96 HPI, sırasıyla sahne. Sarı daire iyi gelişmiş blastosist gösterir. Bu blastosist genişlemiş ve sağ panelde gösterilmektedir. Ölçek çubuğu 100 µm. (H) çubuk grafik zFRAP analiz edilmiş embriyoların gelişim oranları =. Bar zFRAP analiz (zFRAP) embriyo (beyaz) belirtmek ve embriyo (siyah) mRNA ama hiçbir zFRAP analiz (zFRAP) ile enjekte kontrol. Gösterilen veriler toplam en az 57 embriyo inceleyerek üç bağımsız deneyler gelmektedir. İki hücreli, 4-8 hücre, morula (Mo) ve blastosist (Bl) aşamaları 24, 48, 72 ve 96 HPI sırasıyla tespit edildi. Bu rakam [Ally ve ark 2017]7' den değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: sağlıklı büyüme ve yavrularını sıkı bağlamak analiz zigotları türetilmiş. (A) ve zFRAP analiz zigotları türetilmiş yavrularını resimler gösterilir. (B) zFRAP analiz pups bakım sırasında Normal büyüme gözlendi. (C) grafik Ryslampa denetim embriyo (kırmızı) ve zFRAP analiz edilmiş embriyoların (yeşil) olduğu gibi embriyo (mavi), ağırlık ve yavrularını türetilmiş gösterir. Vücut ağırlıkları ve 29 yavrularını sağlam embriyo elde edilen 24 no-zFRAP embriyo ve zFRAP analiz edilmiş embriyoların bir 8 haftalık süre içinde 15. Yıldız tarafından belirtilen sağlam denetiminden farklı değerlerdir. Bu rakam [Ally ve ark 2017]7' den değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı Şekil 1: sıkı bağlamak analiz için grafik kullanıcı arabirimi. (A) grafik kullanıcı arabiriminin genel bir bakışgösterildi. (B) büyütülmüş görüntüleri her pencere için gösterildi. (1) satın alma ayarı pencere resim alma koşulu ayarlamak için kullanılır. (2) uyarıcı ayarı pencere beyazlatma koşul ayarlamak için kullanılır. Görüntü alma pencere butonuna basarak bu pencereyi açabilirsiniz. (3) görüntü edinme denetimi penceresi sıkı bağlamak analizi için kullanılır. (4) Live View (mevcut görüntü odak x2 veya XY düğmesini tıkladıktan sonra görünür) mevcut görüntü gösterir. Kırmızı, yeşil ve açık mavi dikdörtgenler ROI (faiz bölgesi), REF (başvuru) ve BG (arka plan), sırasıyla gösterir. (5) 2B görünümü sıkı bağlamak analiz edilmiş görüntü gösterir ve "Bitmiş serisi" tıkladıktan sonra görünür düğme. Bu durumda, bir sıkı bağlamak analiz edilmiş erkek pronucleus örnek olarak gösterilir. 8 noktalı üç dikdörtgenler bu bölgeler seçildiğini gösterir. (6) Live Plot her bölge mevcut floresan yoğunlukta göstermektedir. X ve Y eksenleri süresi (ms) ve floresan yoğunluğu, sırasıyla gösterir. (7) serisi analizi her bölge yoğunlukta floresans parça gösterir ve 2B görünümü penceresi serisi analizi düğmesine tıkladıktan sonra görünür. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı Excel dosyası 1: örnek veri ve veri hesaplama. (Sayfa 1) Bir erkek pronucleus için bir örnek veriler gösterilir. No görüntünün üst üste sayısını gösterir. Satır yoğunluklarda her bölge (yatırım getirisi, Ref ve BG) için belirtilen. (Sayfa 2) Veri hesaplama için bir örnek gösterilmiştir. Protokol numarası Protokolü bölümünde ilgili yerleri gösterir. Notlar her puanı anlamını açıklar. Sayısal formülü hücreleri tıklatarak sevk edilebilir. Kurtarma eğrisi ve mobil kesir çubuk grafik örnekleri gösterilir. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Gün -3 Gün -2 Gün -1 Sıkı bağlamak günün Gün + 1 Gün 3 Gün +19
mRNA hazırlık Kesme şablonu plazmid
(gece)		 1). arıtma şablon plazmid
2). In vitro transkripsiyon
3). In vitro poli bir takip
4). mRNA kalite çek Elektroforez ile
SIKI BAĞLAMAK 1). manipülasyon damlalıklı ve odası hazırlanması
2). mRNA enjeksiyon
3). zFRAP Analizi
4). kurtarma eğrisi ve mobil Kesir* 2
Tüp bebek ve ön-implantasyon gelişimin Analizi EKG enjeksiyon 1). hCG enjeksiyonu 1). sperm capacitation
2). medya (HTF) ön kuluçka 2). In vitro fertilizasyon
Medya (HTF, CZB, H-CZB ve PVP-CZB) hazırlanması 3). değerlendirme Preimplantasyon geliştirme
Embriyo transferi Pseudopregnant erkek hazırlanması
(vasectomized Erkek çiftleşme* 1)		 Pseudopregnant erkek 2-hücre sahne embriyo transferi Doğum oranı değerlendirilmesi
* 1: vasectomized erkek fare çiftleşme önce en az 2 hafta hazır
* 2: hesaplama ertesi gün (gün 1) uzun

Tablo 1: saat tablo deneyler. Sıkı bağlamak analiz gün gün 0. gerçekleştirilmesi gereken deneyler her öğe için ilgili günlerinde gösterilir olarak kabul edilir.

Kategoriler No enjekte zigotları No mRNA enjeksiyon (%) sonra kurtarılan zigotları * No zigotları analiz No Transfer No alıcıları No ve yavrularını (%) *** Ağırlık ve yavrularını (g) No transgenik yavrular
2-hücre sahne embriyo (%) **
Sağlam - - 99 98 (99,0) 9 61 (62.2)bir 1.64±0.02 n.d
Hiçbir sıkı bağlamak 420 398 (94,8) 82 78 (95.1) 7 41 (52.6)a,b 1.66±0.03 n.d
SIKI BAĞLAMAK 79 78 (98.7) 7 32 (41.0)b 1.69±0.03 0
*: Hayır ile bölünmesi ile hesaplanır. enjekte zigotları; **: Hayır ile bölünmesi ile hesaplanır. analiz zigotları; : Hayır ile bölünmesi ile hesaplanır. Transfer edilen 2-hücre sahne embriyo. bir, b: üst simgeler gösteren önemli fark (P < 0,05). n.d: belirlenmemiştir. Bu tablo [Ally ve ark 2017]7' den değiştirildi.

Tablo 2: analiz embriyo Doğum oranı: Tam dönemlik sıkı bağlamak analiz edilmiş olsaydı, embriyoların gelişim potansiyeli incelenmiştir. Bu embriyo elde edilen Doğum oranı gösterilir. Denetimleri, sağlam ve sıkı bağlamak analiz edilmiş hiçbir embriyo da incelenmiş gibi. Bu transfer embriyoların türetilmiş pups ağırlıkları de gösterilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu çalışmada ortaya gibi zFRAP analiz bu yöntem Birliği arasında moleküler olaylar ve embriyonik gelişim potansiyeli ortaya çıkarmak için çok yararlı bir araçtır düşündüren tam dönemlik gelişmeye kritik hasar neden olmaz. , ES hücre hangi tarafından bu hücreleri fark potansiyeli bu iki hücreli sahne embriyolar, olarak yüksek olur, devlet gibi iki hücresine yeniden programlama sırasında kromatin gevşekliği bu iki hücreli sahne embriyo5ile karşılaştırılabilir değiştirir. Buna göre zygotic kromatin gevşekliği embriyonik gelişim potansiyeli için önemli olması mümkündür. Sadece baba tarafından pronuclei, aynı zamanda Anne pronuclei, somatik hücre nükleer transfer zigotları edinme açık kromatin olmaması düşündüren ile karşılaştırıldığında daha düşük kromatin gevşekliği gösterdi yumurta sitoplazma içine somatik hücre çekirdeği transfer Zavallı gelişim potansiyellerini dahil. Topluca, zFRAP analiz mekanizmaları yeniden programlama genom elucidating için yararlı olacak gibi görünüyor.

ZFRAP sistem zigotları yüksek gelişim potansiyeli olan seçilebilir yapabilir. SCNT, ek olarak ön çalışmada bu spermatid enjeksiyon (ROSI) yuvarlak ortaya çıktı-zigotları liman anormal kromatin gevşekliği türetilmiş. Ayrıca, bazıları kromatin gevşekliği düzeyinde IVF kaynaklı zigotları de, karşılaştırılabilir bu zigotları yüksek gelişim potansiyeli var düşündüren gösterdi bulundu. Önemlisi, hangi kromatin gevşeklik zFRAP tarafından değerlendirilmiştir zigotları terimi için geliştirebilir. Gelecekte, bu nedenle, daha yüksek gelişim potansiyeli olan SCNT ve ROSI türetilmiş zigotları kromatin gevşekliği değerlendirilmesi tarafından daha düşük olanlar zFRAP tarafından ayırt etmek mümkün olabilir.

Bugüne kadar önceki çalışmalar Preimplantasyon embriyo epigenetik devlet analizi için canlı görüntüleme yöntemi yarar göstermiştir. Bazı canlı görüntüleme yöntemleri, Preimplantasyon embriyo13,-14epigenetik her değişiklik (örneğin DNA/histon Modifikasyon) ortaya çıkarabilir, ama zFRAP kullanarak, bu olmadan zygotic kromatin gevşekliği değerlendirmek mümkündür hücreleri öldürmek. Kromatin gevşekliği epigenetik değişiklikler tarafından etkilenmiş gibi görünüyor. Örneğin, heterochromatin H3K9me3 ve H3K27me3 zenginleştirilmiş gibi hangi euchromatic bölge3,15' ten daha düşük histon hareketlilik baskıcı epigenetik değişiklik gösterdi. Gerçekten de, bir kimyasal bileşik, epigenetik devlet dönüştürür, tedaviyle kromatin gevşekliği İLETİMLERİNİZE zigotları içinde neden oldu. Bu nedenle, zFRAP kullanarak, kromatin yapısı geçerli summative epigenetik durumunu ortaya çıkarmak mümkündür. Bu zigotları gelişim potansiyelini değerlendirmek için bir avantaj olacaktır düşünüldü.

EGFP-H2B zFRAP için kodlama mRNA enjeksiyon bir ihtar var ama zFRAP çok yönlülük artırır. MRNA enjeksiyon ihtar mikroenjeksiyon tarafından neden olduğu zarar görmesi demek. Bunu önlemek için eGFP-H2B transgenik fareyi kullanmak çok etkilidir. EGFP-H2B transgenik fare çizgi kullandıysanız, çoluk çocuk oranı mRNA mikroenjeksiyon kullanarak olgu ile karşılaştırıldığında artırılabilir. Bunun tersi olarak, hak olan mRNA enjeksiyon o zFRAP farelerde vahşi-tip suşu her türlü kullanımına izin verir. ZFRAP fare zorlanma onların ilgi ile kullanmak isteyen araştırmacılar istenen fare gerilme eGFP-H2B transgene ile hazırlamak gerekmez. Bu hak transgenik analizinde daha belirgin hale gelir (Örn. overexpression/devirme) ya da nakavt fare çizgi. ZFRAP için araştırma konuları transgenik/nakavt hattı ile kullanmak isteyen araştırmacılar onların ilgi olanlar sınırlı sayıda eGFP-H2B transgenik satırından hazırlamak gerekmez. Bu araştırma ilerlemesi için bir avantaj olduğunu gösterir.

Canlı görüntüleme analizi Preimplantasyon embriyo ile özel bilgi ve çok pahalı ve ince ayarlı özel aygıtları gerektirir. Bu nedenle, bir deneysel bir sistemin getirilmesi kolay bir karar değil. Bu çalışmada kurulan deneysel sistem sadece bir termo-ısıtıcı mikroskobu tarama confocal lazer kenara ihtiyacı var. Bir acemi bir laboratuvar yöntemi zFRAP, 1 ay içinde edinmek için Ayrıca, yöntem öğrenme kolaydır. Ancak, hala dikkate gereken bazı sorunlar bulunmaktadır. Odak kayması ilkidir. Gözlem sırasında pronuclei veya zigotları nerede onlar gözlem başlamadan önce sunulan konumundan sapma mümkündür. Odak kayması meydana gelirse, ROIs doğru konumdan da sapma. Sonuç olarak, nicel veri değersiz olur. Bu sorunu önlemek için araştırmacı Klima havalandırma penceresinden karşı koruma için cam alt yemekleri kapağını kullanın ve objektif lens üzerinde petrol genişleme için beklemek zorunda. Odak kayması meydana gelirse sapmak zigotları verilerden atılmalıdır ve 2nd sıkı bağlamak analizi ile aynı zigotları tavsiye edilmez. Bu çalışmada, yaklaşık 25 s7 150 s3 gözlem vakti kısalma çok yardımcı oldu. İkincisi daha uzun Kuluçka kuluçka makinesi dışında 's. Dışarıda da kuluçka ortamına daha uzun pozlama embriyonik geliştirme için kesinlikle zararlı olduğu için toplu iş başına 1 saat içinde sıkı bağlamak analiz bitirmek için tavsiye edilmiştir. Zigotları sayısı 6-10 sıkı bağlamak analiz edilmiş cam alt yemekleri HEPES tampon medyada olmalıdır. Bu deneysel durumda en fazla 30 civarında 4 h için olabilir ama daha fazla zigotları gerekiyorsa, h başına 20 zigotları başvuru ve arka plan bölgede floresan yoğunluğu değerlendirilmesi ertelenmesi tarafından çözümlenebilir. Üçüncü "confocal lazer mikroskobu lazer bozulma zamanla ilgili" olduğunu. Beyazlatma Lazer yetersiz ise, doğru nicel verilerin yetersiz ağartma nedeniyle alınamıyor. Gerçekten de, zygotic kromatin gevşekliği ebeveyn asimetri ile zayıf bir beyazlatma lazer kazanılması olamaz. Bunu önlemek için bu fırsat doğar gibi lazer güç zayıflattı olup olmadığını kontrol etmek için tavsiye edilir. Bu çalışmada, 110-µW ağartma ebeveyn asimetri edinimi için yeterliydi.

zFRAP analiz yanı sıra çekirdek histon proteinleri diğer türleri için kullanılabilir. Çekirdek histon belirgin düşük hareketlilik göstermek beri artık bu gözlem saat toplam süre (yaklaşık 25 s Bu çalışmada) zFRAP analizi gereklidir. Bu nedenle, zigotları önemli sayıda analiz etmek, HEPES tampon medya ısıtıcı üzerinde uzun bir süre kültür kaçınılmazdır. Öte yandan, yüksek hareket kabiliyetine sahip proteinler zFRAP analiz için toplam gözlem zaman kısa, HEPES tampon medya kısa olmak ısıtıcı üzerinde kültür zaman etkinleştirme ayarlayabilirsiniz. Bu nedenle, dışında da kuluçka ortamına daha uzun pozlama embriyonik geliştirme için son derece zararlı olduğunu, zFRAP analiz için proteinler yüksek hareket kabiliyetine sahip doğası gereği var, çekirdek histonlarla dışında gibi görünüyor çekirdek histon daha düşük toksisite göstermek için . Bu deneysel sistem daha fazla çeşitli moleküler olaylar ve embriyonik gelişme arasındaki ilişkileri soruşturma yardımcı olacaktır umulmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Biz Satoshi Kishigami, Sayaka Wakayama, Hiroaki Nagatomo, Satoshi Kamimura ve Kana Kişida kritik yorum ve teknik destek verdiğiniz için teşekkür ederiz. Bu eser kısmen tarzı için ulusal üniversite reformu teşvik için Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve teknoloji programı tarafından finanse edildi; Bilim (16H 02593) tanıtım, Asada Bilim Vakfı ve Takeda Bilim Vakfı'na tw Japonya Derneği Fon çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, yayımlamaya karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal laser scaning microscope Olympus FV1200 FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7)
Thermo plate Tokai Hit TP-110RH26
Inverted microscope Olympus IX71
Micro manupilator Narishige MMO-202ND
Pieze Micro Micromanipulator Prime tech PMAS-CT150
35 mm culture dish Falcom 351008 35 x 100 mm style; for IVF
60 mm culture dish Falcom 351007 60 x 15 mm style; for embryo culture
50 mm culture dish Falcom 351006 50 x 9 mm style; for manipulation on the stage
50 mm glass bottom dish Matsunami D910400 50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis
Mineral oil Organic spceiality chemicals 625071 For FRAP analysis on the glass bottom dishes
Mineral oil Sigma M8410-1L For IVF and embryo culture
glass capillary Drummond 1-000-1000 For handling mouse zygotes
Borosilicate glass Prime tech B100-75-10-PT For microinjection of mRNA
Micropipett puller Sutter instrument P-97/IVF For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm) 
Microforge  Narishige MF-900
mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit Thermo
Fisher scientific		 AM1340
Poly (A) tailing kit Thermo
Fisher scientific		 AM1350
PVP solution 10% (PVP-HTF) IrvineSceientific 99311 HEPES buffered HTF containing 10% PVP
Sodium HEPES Sigma H3784
pTOPO eGFP-H2B Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6)
NorthernMax Gly Sample loading Dye  Thermo
Fisher scientific		 AM8551 For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA
Phenol chloroform isamyl alcohol nacalai tesque 25970-14
Chloroform nacalai tesque  08401-65
Not I TOYOBO NOT-111X
Ethachinmate WAKO 318-01793
3664 Otical power meter Hioki 3664  Power meter for laser power
Stereomicmicroscope Olympus SZX16

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Burton, A., Torres-Padilla, M. E. Epigenetic reprogramming and development: a unique heterochromatin organization in the preimplantation mouse embryo. Brief Funct Genomics. 9, 444-454 (2010).
  2. Okada, Y., Yamaguchi, K. Epigenetic modifications and reprogramming in paternal pronucleus: sperm, preimplantation embryo, and beyond. Cell Mol Life Sci. 74, 1957-1967 (2017).
  3. Ooga, M., Fulka, H., Hashimoto, S., Suzuki, M. G., Aoki, F. Analysis of chromatin structure in mouse preimplantation embryos by fluorescent recovery after photobleaching. Epigenetics. 11, 85-94 (2016).
  4. Meshorer, E., et al. Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells. Dev Cell. 10, 105-116 (2006).
  5. Boskovic, A., et al. Higher chromatin mobility supports totipotency and precedes pluripotency in vivo. Genes Dev. 28, 1042-1047 (2014).
  6. Yamagata, K., Ueda, J. Long-term live-cell imaging of mammalian preimplantation development and derivation process of pluripotent stem cells from the embryos. Dev Growth Differ. 55, 378-389 (2013).
  7. Ooga, M., Wakayama, T. FRAP analysis of chromatin looseness in mouse zygotes that allows full-term development. PLoS One. 12, e0178255 (2017).
  8. Quinn, P., Begley, A. Effect of human seminal plasma and mouse accessory gland extracts on mouse fertilization in vitro. Australian journal of biological sciences. 37, 147-152 (1984).
  9. Chatot, C. L., Lewis, J. L., Torres, I., Ziomek, C. A. Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium. Biology of reproduction. 42, 432-440 (1990).
  10. Bae, J., Sung, B. H., Cho, I. H., Song, W. K. F-actin-dependent regulation of NESH dynamics in rat hippocampal neurons. PLoS One. 7, e34514 (2012).
  11. Dieteren, C. E., et al. Defective mitochondrial translation differently affects the live cell dynamics of complex I subunits. Biochim Biophys Acta. 1807, 1624-1633 (2011).
  12. Subramanian, V., et al. H2A.Z acidic patch couples chromatin dynamics to regulation of gene expression programs during ESC differentiation. PLoS Genet. 9, e1003725 (2013).
  13. Hayashi-Takanaka, Y., et al. Tracking epigenetic histone modifications in single cells using Fab-based live endogenous modification labeling. Nucleic Acids Res. 39, 6475-6488 (2011).
  14. Yamazaki, T., Yamagata, K., Baba, T. Time-lapse and retrospective analysis of DNA methylation in mouse preimplantation embryos by live cell imaging. Dev Biol. 304, 409-419 (2007).
  15. Puschendorf, M., et al. PRC1 and Suv39h specify parental asymmetry at constitutive heterochromatin in early mouse embryos. Nat Genet. 40, 411-420 (2008).

Tags

Gelişim biyolojisi sayı: 136 zFRAP analiz zygotic kromatin yapısı açık kromatin kromatin gevşekliği histon hareketlilik gelişim potansiyeli
Zygotic floresan kurtarma fotoğraf ağartma sonra analiz için tam dönemlik geliştirme sağlar kromatin gevşeklik
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ooga, M., Funaya, S., Aoki, F.,… More

Ooga, M., Funaya, S., Aoki, F., Wakayama, T. Zygotic Fluorescence Recovery After Photo-bleaching Analysis for Chromatin Looseness That Allows Full-term Development. J. Vis. Exp. (136), e57068, doi:10.3791/57068 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter