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Chemistry

Optimiser la constitution génétique de produit chimique sondes dans RCPG pour Photo-réticulation cartographie et de la chimie de Bioorthogonal dans les cellules de mammifères vivants

Published: April 9, 2018 doi: 10.3791/57069
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Institute of Biochemistry, Faculty of Life Sciences, University of Leipzig
* These authors contributed equally

Summary

Un test facile de fluorescence est présenté afin d’évaluer l’efficacité des paires d’amino-acyl-ARNt-synthétase/ARNt intégrant les amino-acides non canoniques (ANAC) protéines exprimées dans des cellules de mammifères. L’application de l’ANAC à étudier G-récepteurs couplés aux protéines (RCPG) est décrite, y compris la cartographie photo-réticulation de liaison de sites et bioorthogonal GPCR étiquettes apposées sur des cellules vivantes.

Abstract

La constitution génétique des acides aminés non canoniques (ANAC) via la suppression de codon stop ambre est une technique puissante pour installer des sondes artificiels et réactives moitiés sur protéines directement dans les cellules vivantes. Chaque ncAA est constituée par deux (RAA) orthogonal dédié suppresseur-/ amino-acyl-ARNt-synthétase de tRNA qui est importé dans l’organisme hôte. L’efficacité de l’incorporation de différents ANAC peut diffèrent grandement et insatisfaisante dans certains cas. Orthogonaux paires peuvent être améliorées en manipulant les RAA ou l’ARNt. Cependant, évolution dirigée des ARNt ou RAA à l’aide de grandes bibliothèques et les méthodes de sélection morts/vivants ne sont pas réalisables dans les cellules de mammifères. Est présenté ici, un essai basés sur la fluorescence facile et robuste pour évaluer l’efficacité des paires orthogonales en cellules mammifères. Le test permet de dépistage des dizaines ou des centaines de variantes de RAA/ARNt avec un effort modéré et dans un délai raisonnable. Utilisation de ce test pour générer de nouveaux ARNt qui améliorent considérablement l’efficacité du système orthogonal pyrrolysine est décrite, ainsi que l’application de l’ANAC à l’étude des protéines G récepteurs couplés (RCPG), qui contestent les objets de la ncAA mutagenèse. Tout d’abord, en intégrant systématiquement les une ncAA photo-réticulation tout au long de la surface extracellulaire d’un récepteur, les sites de liaison des ligands différents sur le récepteur intact sont mappés directement dans les cellules vivantes. Deuxième, incorpore un RCPG de dernière génération ANAC, ultrarapide récepteur sans catalyseur marquage avec un colorant fluorescent est démontrée, qui exploite bioorthogonal cycloaddition contrainte-favorisé inverse Diels Alder (SPIEDAC) sur les cellules vivantes. ANAC peut être généralement appliquée à n’importe quelle protéine indépendamment sur sa taille, la méthode est d’intérêt général pour un certain nombre d’applications. En outre, incorporation de ncAA ne nécessite pas d’aucun équipement spécial et est facilement effectuée dans les laboratoires de biochimie standard.

Introduction

L’incorporation génétique des sondes chimiques dans les protéines est une méthode puissante pour faciliter l’étude des aspects structurels et dynamiques de la fonction des protéines directement dans le contexte autochtone de la cellules vivantes. De nos jours, des centaines d’amino-acides non canoniques (ANAC) équipés de groupes chimiques plus disparates peuvent être relativement incorporés dans les protéines par biosynthèse1,2,3,4. Entre eux, on trouve photosensibles ANAC comme photo-agents réticulants5, mis en cage-photo6,7,8,9 et photo-commutable acides aminés10, 11, acides aminés portant tendues alcènes et alcynes pour bioorthogonal sans catalyseur chimie2,12,13,14,15,16 ,,17acides aminés transportant dansyl18, coumarine9,19et fluorophores21 prodan20,et acides aminés équipés d’autres sondes biophysiques comme Bien que le post traductionnelle modifications1,2,3,4,22,23,24,25.

Le codage génétique d’un ncAA est activé par un dédié amino-acyl--synthétase de tRNA (RAA) couplé à un suppresseur-tRNA apparenté, qui incorpore la ncAA en réponse à un codon stop ambre pendant la synthèse ribosomique ordinaire. paires de ncAARS/ARNt sont conçus afin d’être orthogonal dans l’organisme hôte, c'est-à-dire pas la diaphonie avec les paires endogènes. La technique est bien établie en hôtes procaryotes et eucaryotes et cellules facilement applicables aux mammifères. Paires pour l’incorporation de la ncAA en cellules mammifères reposent sur trois principaux systèmes orthogonaux : le système de tyrosyl, qui combine la TyrRS d’e. coli26 avec un suppresseur de tyrosyl ambre de b. stearothermophilus27 (Ec TyrRS / paire YamBst), l’e. coli leucyl système (EcLeuRS/ARNtLeuCUA paire)6,18,28 et le système de pyrrolysyl d’archaea (PylRS/ARNt Pyl paire)3, auquel cas l’ARNtPyl est un suppresseur de l’ambre naturel. En général, chaque ncAA est reconnu par un ncAARS spécialisées. Selon la structure de la ncAA, le ncAARS est obtenu par évolution dirigée de la TyrRS, LeuRS ou PylRS, bien que certains synthétases peuvent accepter plusieurs ncAA.

La paire orthogonale est importée dans les cellules en utilisant simplement un vecteur plasmidique. Plus efficaces et communes de plasmides sont bicistronique et codent pour la synthétase et l’ARNt formant la paire orthogonale29. Un deuxième plasmide codant pour la protéine d’intérêt portant un codon ambre sur le site désigné pour la modification est co-transfectée. La ncAA est simplement ajouté au milieu de croissance cellulaire. Cependant, différents groupes spécialisés utilisent souvent les différentes variantes de constructions de plasmide même pour l’incorporation de la ncAA même. Constructions diffèrent par l’arrangement des gènes dans le vecteur, le type de la synthétase, l’utilisation de codon dans le gène de la synthétase, l’utilisation de promoteur, la variante de l’ARNt et le nombre de cassettes d’expression ARNt. En outre, l’efficacité de l’incorporation de différents ANAC peut varier considérablement en raison de l’efficacité catalytique différente les synthétases différentes, la qualité de l’ARNt et autres facteurs30. Par conséquent, il est important de disposer d’une méthode rapide et fiable pour évaluer l’efficacité d’une paire orthogonale, à choisir le système le plus approprié pour une application souhaitée tant pour effectuer certaines étapes d’optimisation qui améliorent l’expression protéique globale rendements.

Nous avons établi une analyse axée sur la fluorescence simple et robuste pour évaluer l’efficacité des paires orthogonales29 (Figure 1). Dans l’essai, les cellules sont transfectées conjointement avec le plasmide codant pour la paire orthogonale, ainsi que d’un plasmide de journaliste bicistronique codant pour la protéine fluorescente verte portant un codon d’arrêt ambre à une position permissive (EGFPTAG) et la gène mCherry. Fluorescence rouge et verte de lysats de cellules entières sont interprétées dans des canaux séparés sur un lecteur dans une plaque à 96 puits. L’intensité de la fluorescence verte est directement en corrélation avec l’efficacité de la répression ambre, alors que l’intensité de la fluorescence rouge donne une estimation directe de la taille de l’échantillon mesuré et l’efficacité de transfection. En ce qui concerne des études similaires basées sur la fluorescence assistée cellule triant (FACS) lecture31,32, le test donne une évaluation immédiate et complète de l’expression protéique dans la population de cellules entières, ce qui est plus représentatives des conditions expérimentales usuelles et propose une acquisition de données plus facile et le traitement avec le logiciel standard. Dans l’ensemble, le principal avantage du dosage est qu’un support pour un grand nombre d’échantillons peut être analysé en parallèle. À l’aide de ce test, nous avons projeté une bibliothèque conçue rationnellement des ARNt-suppresseur pour améliorer l’efficacité du système orthogonal Pyl30. Cet ouvrage décrit le protocole expérimental pour effectuer ce test et montrent des exemples de son application, y compris l’optimisation de la paire orthogonale pour l’incorporation de la photo-réticulation ncAA p-azido-L-phénylalanine (Azi) et la comparaison des efficacité de l’incorporation de différents acides aminés (Figure 2).

Au cours des dernières années, outils de ncAA sont sont avérées très puissants pour étudier la structure et les aspects fonctionnels de la G-protéine couplée récepteurs (RCPG)33,34,35,,du3637 , 38. chez les humains, les RCPG forment une grande famille de récepteurs membranaires (800 membres) et représentent les principales cibles des médicaments thérapeutiques. Il est toujours difficile de directe caractérisation structurale des RCPG et méthodes biochimiques complémentaires sont très nécessaires pour leur enquête. Nous avons mis au point l’utilisation de photo-réticulation ANAC pour cartographier les surfaces GPCR et découvrez le ligand liant poches34. Est-ce que nous en utilisant notre système optimisé pour l’incorporation de l’Azi, systématiquement intégrées Azi dans tout le domaine de juxtamembrane entier d’un RCPG directement dans les cellules de mammifères vivants. Lors de l’irradiation UV, Azi forme une espèce de nitrène fortement réactif qui capte par covalence molécules voisines. Quand le ligand est ajouté au système, Azi sert une sonde de proximité à révéler quels postes du récepteur se rapprochent du ligand lié. De cette façon, le mode de liaison de l’hormone de neuropeptide urocortine I (Ucn1) sur le récepteur de la classe B GPCR corticotropin-releasing-factor de type 1 (CRF1R)33 a d’abord été dévoilé. Dernièrement, nous avons divulgué modes de liaison distincte des agonistes et antagonistes sur les mêmes récepteurs38. Une approche similaire a été appliquée par les autres pour révéler des orthosteric et des sites de liaison allostérique d’autres peptides et des ligands de petites molécules autres RCPG39,40,41,42. Ce manuscrit décrit le protocole expérimental appliqué dans notre laboratoire photo-réticulation cartographie des surfaces des RCPG. La méthode est relativement rapide, simple et ne nécessite pas d’aucun équipement spécial, afin qu’elle s’applique dans les laboratoires de biochimie standard. Ce qui est important, l’approche fournit un outil précieux non seulement pour identifier les sites de liaison de ligand où les données structurales 3D sont rares, mais aussi pour compléter les données in vitro existantes avec les informations de récepteurs entièrement post-traductionnellement modifiées dans le environnement physiologique de la cellule en direct.

Le développement récent de nouveaux ANAC portant sur les côté chaîne des groupes chimiques convenant ultra-rapide sans catalyseur bioorthogonal chimie a ouvert la possibilité d’installer des fluorophores de dernière génération pour l’imagerie de Super-résolution en protéines directement sur la vie des cellules de2,43. Ces ancrages chimiques comprennent tendue cyclooctyne SCOK14, nonyne bicyclo [6.1.0] BCNK12,17et trans-cyclooctènes de TCO * K13,15,17 entre autres ANAC héberger un norbornène16,17,44 ou le cyclopropène45,46 portion. ANAC encombrants pour la chimie de bioorthogonal est intégrées par une variante de le PylRS généralement décrit comme PylRSAF (indiquant la mutation Y271A et Y349F en PylRS de M. barkeri ), ainsi que par d’autres ad hoc a évolué de ncAARSs17 , 44. les ancres bioorthogonal réagissent avec tetrazine réactifs47 par cycloaddition de Diels-Alder inverse électron-demande pour donner des rendements élevés et étiquetage dans quelques minutes43,48. Cependant, application de cette approche puissante pour étiquette RCPG a été difficile en raison d’une faible efficacité globale du système orthogonal ncAA incorporation. En utilisant notre système amélioré de Pyl, nous avons récemment démontré incorporation de haut rendement de ces acides aminés dans les RCPG et ultrarapide GPCR étiquetage sur la surface des cellules de mammifères vivants30. Récepteurs marqués étaient encore fonctionnels, car ils physiologiquement intériorisé dès l’activation du récepteur avec un agoniste. Le protocole expérimental pour l’incorporation de bioorthogonal ancres dans les RCPG et les étapes suivantes d’étiquetage sont décrites ici. Équiper les RCPG avec des fluorophores lumineux petits est la première étape fondamentale vers l’étude de la dynamique des structures RCPG dans les cellules vivantes par l’intermédiaire de techniques de microscopie avancées.

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Protocol

1. fluorescence-based Screening des efficacités d’Incorporation (Figure 1)

  1. Maintenir les cellules HEK293 dans le milieu de l’aigle de la modification de Dulbecco (DMEM ; taux de glycémie élevé, 4 mM de glutamine, pyruvate) additionné de 10 % (v/v) sérum fœtal (SVF), 100 U/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine à 37 ° C, humidité de 95 % et 5 % de CO2.
  2. Les cellules des graines la veille de la transfection.
    1. Détacher les cellules pendant 5 min à 37 ° C à 0.05 % trypsine/PBS additionné de 0,5 mM EDTA. Utiliser 1 mL trypsine/EDTA pour un plat de 10 cm. Étancher avec 10 volumes de milieu complet et remettre en suspension les cellules de pipetage. Compter le nombre de cellules dans la suspension à l’aide d’un hémocytomètre49.
    2. Semences 6.0 x 105 HEK293 cellules par puits de plaques 6 puits dans 2 mL de milieu de croissance complète. Préparer les puits autant comme le nombre d’échantillons et deux puits supplémentaires pour l’EGFP sauvage et un échantillon transfectées mock, respectivement.
  3. Contrôler la confluence (superficie occupée par les cellules) sous un microscope. Transfecter cellules à confluence ~ 70 % utilisant le réactif de POLYÉTHYLÈNEIMINE (PEI).
    1. 1h avant la transfection, ajouter la quantité appropriée de la solution fraîchement préparée ncAA dans toutes les loges pour une concentration finale de ncAA de 0,25 à 0,5 mM. Ajouter la ncAA dans toutes les loges, y compris du contrôle positif de type sauvage et les cellules transfectées mock, afin d’éviter des différences de signaux de fluorescence qui pourraient être causés par les effets de la ncAA sur la croissance cellulaire.
      Remarque : Pour préparer les solutions, dissoudre la ncAA de 0,1 à 0,5 M à l’aide de 0,2 à 0,5 M de NaOH. Toutefois, certains ANAC peut exiger initiale solubilisation dans le DMSO ou neutralisation en quatre volumes de 1 M HEPES (pH 7,4) avant utilisation. Communément, le fabricant recommande un protocole pour préparer une solution.
    2. Dans un tube de microcentrifuge, mélanger 1 µg d’ADN plasmide codant la paire ncAARS/ARNt à tester avec 1 µg de reporter l’ADN plasmidique (183TAG- mCherry pcDNA3.0-EGFP). Dans des tubes distincts, préparer une transfection identique à l’aide de la référence de type sauvage EGFP et une transfection simulée.
      Remarque : Nombre d’exemplaires de la cassette de tRNA intégré dans le plasmide codant pour la paire ncAARS/ARNt dépend de l’application. Afin de faciliter le clonage, 1 exemplaire de l’ARNt est recommandé lors de dépistage différents ARNt, tandis que 4 exemplaires sont recommandés (bien que pas strictement nécessaire) lorsque ncAARS différents tests ou l’incorporation de l’ANAC différentes de la même paire orthogonale.
    3. Chaque tube contenant l’ADN ajouter 100 µL de lactate une solution saline tamponnée (LBS) contenant du lactate de sodium 20 mM à pH 4,0 et 150 mM NaCl. Mélanger brièvement.
    4. Dans chaque tube contenant l’ADN en LBS ajouter 6 µL de 1 µg/µL PEI en LBS (ratio PEI/ADN = 3/1 w/w) et vortex immédiatement. Incuber à RT pendant 10-15 min.
    5. Prendre un milieu cellulaire 400 µL de chaque puits et ajoutez-le au mélange ADN-PEI pour neutraliser le pH. Dribble le mélange de l’ADN dans les cellules.
      Remarque : DMEM contient habituellement rouge de phénol comme indicateur de pH. Au cours de l’étape de neutralisation la couleur du mélange ajouté dans le tube passe du jaune (acide) au rouge (neutre). Bien que formant des complexes ADN lb à pH acide donne le plus haut des rendements transfection50, complexes ADN-PEI peuvent alternativement être formés directement à un pH de 7,4 (par exemple dans le milieu sans sérum DMEM). Si vous utilisez DMEM pour former des complexes ADN, sauter l’étape de neutralisation 1.3.5. Dans tous les cas, il est essentiel qu’aucun sérum n’est présent dans le mélange en formant des complexes.
  4. Récolter après transfection de cellules 48 h.
    1. Aspirer le milieu et rincer les cellules une fois avec 2 mL de PBS préchauffé (37 ° C). Ajouter 800 µL de PBS additionné de 0,5 mM EDTA et incuber pendant 20 min à 37 ° C. Détacher et suspendre les cellules par pipetage de haut en bas.
    2. Transférer la suspension cellulaire dans des tubes de 1,5 mL contenant 200 µL PBS additionné de 5 mM MgCl2.
    3. Centrifuger pendant 2 min à 800 x g et éliminer le surnageant.
      Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Dans ce cas, flash-solidification des granulés dans le liquide N2 et conserver à-80 ° C pendant environ un mois. Portez toujours des lunettes de protection.
  5. Ajouter 100 µL de tampon de lyse Tris (50 mM Tris-HCl de pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 % X-100 Triton, EDTA 1 mM et fraîchement ajouté PMSF) pour les granules cellulaires et incuber sur glace pendant 30 min. Pour faciliter la lyse, vortex toutes les 5 min.
  6. Tournez en bas les débris cellulaires pendant 10 min à 4 ° C et 14 000 x g et transférer 90 µL du liquide surnageant dans noirs plaques de 96 puits. Mesurer la fluorescence EGFP et mCherry à l’aide d’un lecteur équipé d’un module de fluorescence.
    Remarque : Utiliser des filtres appropriés d’excitation et d’émission pour EGFP (λabs: 488 nm, λem: 509 nm) et mCherry (λabs: 588 nm, λem: 611 nm). Valeurs mesurées de EGFP seront étendra sur une plage comprise entre la valeur minimale obtenue des cellules transfectées mock et une valeur maximale, qui provient habituellement de type sauvage EGFP. Prendre soin de mettre en place la fenêtre de mesure correcte de l’instrument.
  7. L’efficacité de l’incorporation de la ncAA est calculée comme le rapport entre la fluorescence de l’échantillon et la fluorescence provenant d’expression du type sauvage EGFP. Toutes les valeurs sont normalisées à fluorescence mCherry.
    Equation 1

2. génétique Incorporation d’ANAC RCPG pour Photo-réticulation cartographie des Interactions de Ligand-RCPG (Figure 3)

  1. Maintenir les cellules HEK293T DMEM supplémenté de 10 % (v/v) de SVF, 100 U/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine à 37 ° C, humidité de 95 % et 5 % de CO2.
  2. Cellules des graines la veille de la transfection.
    1. Détacher les cellules pendant 5 min à 37 ° C à 0.05 % trypsine/PBS additionné de 0,5 mM EDTA. Utiliser 1 mL trypsine/EDTA pour un plat de 10 cm. Étancher avec 10 volumes de milieu complet et remettre en suspension les cellules par pipetage de haut en bas. Compter le nombre de cellules dans la suspension à l’aide d’un hémocytomètre49.
    2. Semences 5.0 x 105 293 t cellules par puits dans 2 mL de milieu de croissance complète en plaques 6 puits. Pour chaque poste à être projeté, préparer 1 bien par le ligand, plus un puits pour la liaison contrôle33,38. Un puits d’appoint à transfected avec le récepteur de type sauvage (wt) peuvent être inclus pour vérifier le niveau d’expression du mutant.
  3. Le lendemain, contrôler la confluence (superficie occupée par les cellules) sous un microscope. Transfecter cellules à confluence d’environ 70 % à l’aide de PEI.
    1. 1h avant la transfection, ajouter Azi dans toutes les loges à une concentration finale de 0,5 mM.
      1. Préparer une solution 0,5 M de Azi. Par plaque 6 puits, peser 1,2 mg Azi dans un tube et dissoudre dans 15 µL 0,5 M NaOH. Diluer la solution mère en milieu complet de 1,2 mL et ajouter 200 µL du mélange dans chaque puits.
        Remarque : Préparer une solution fraîche de Azi pour chaque expérience. La portion de l’azoture a une demi-vie courte en solution aqueuse, en particulier à pH basique, et le AziRS intègre l’intact, mais aussi la forme dégradée.
    2. Transfecter un montant total de 2 µg ADN / puits : 1 µg de plasmide codant pour la GRCP drapeau-le tag portant un codon TAG à la position désirée et 1 µg du plasmide codant pour la paire orthogonale dédiée à Azi (E2AziRS51 et 4 copies de l’apparenté suppresseur-tRNA BstYam)33,38.
      Remarque : Lorsque vous incluez une comparaison de poids pour vérifier les niveaux d’expression, transfecter un montant inférieur de l’ADN de plasmide pour le récepteur de wt. Selon le GPCR, 0,2 à 0,5 µg de plasmide codant les niveaux semblables de rendement du récepteur wt 1,0 µg du plasmide mutant. Transfecter la même quantité d’ADN dans tous les puits, remplissant l’ADN manquant avec un simulacre (par exemple un vecteur vide).
    3. Procédez comme décrit dans 1.3.3-1.3.5.
    4. transfection après 48 h, continuez avec l’étape 2.4 pour photo-réticulation des ligands ou passez à l’étape 2.5 pour récolte directe et l’analyse de contrôle de l’expression des récepteurs.
  4. Photo-réticulation du ligand.
    1. Préparer une solution ligand 1 000 x. Dissoudre le ligand de peptide à une concentration de 100 µM dans le DMSO.
      Remarque : La concentration de ligand dépend de la constante de dissociation KD de l’interaction ligand-RCPG. Une concentration finale de 100 x KD est recommandable. Si le ligand de peptide est un sel d’acide trifluoroacétique (TFA), considérer le poids du TFA lors du calcul de la masse moléculaire (1 x TFA par les acides aminés basiques du peptide). Aussi, pensez que les peptides sont en général hygroscopique. Éviter le gel répétée de poudre de peptide et n’ouvrez jamais un récipient de peptide jusqu'à ce qu’il n’a pas atteint la température ambiante.
    2. Diluer la solution mère ligand 1 : 1 000 dans le tampon de liaison composé de 0,1 % de BSA, 0,01 % Triton X 100, 5 mM MgCl2 dans un tampon HEPES dissociation (HDB) contenant de l’acide-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 12,5 mM 4 (HEPES)-HCl pH 7,4, 140 mM NaCl et 5 mM KCl. Prepare 1 mL par mutant Azi-RCPG. Remplacer le milieu cellulaire avec 1 mL de la solution de ligand. Incuber pendant 10 min à température ambiante.
      Remarque : Régler le temps d’incubation de la GRCP spécifique, comptabilité d’internalisation de cinétique et récepteur ligand. Prolonger la période d’incubation n’améliore pas les rendements de réticulation.
    3. Irradier les échantillons pendant 20 min dans une RETICULATION UV 365 nm avec 5 x 8 W tubes et ~ 5 cm de distance aux cellules. Détacher les cellules en pipettant également et de les transférer dans un tube de réaction de 1,5 mL. Les cellules pendant 3 min à 800 g de granule et éliminer le surnageant.
    4. Dissoudre un comprimé d’inhibiteur de protéase (PI) en cocktail dans 1 mL 25 mM EDTA/H2O pour faire une solution mère de 50 x. Aliquoter le PI solution mère et conserver à-20 ° C. Diluer le stock 50 x 01:25 dans HDB et remettre en suspension les granules cellulaires dans 50 µL de 2 x PI en HDB. Flash-gel les cellules dans le liquide N2.
      Remarque : Porter des lunettes de protection. À ce stade, les échantillons peuvent être conservés à-80 ° C pour environ un mois. Passez à l’étape 2.6.
  5. Matériel de récolte directe de cellules.
    1. Aspirez le milieu. Ajouter 800 µL de 0,5 mM EDTA en HDB. Incuber pendant 10 min à la droite ou sur la glace.
    2. Détacher les cellules par pipetage de haut en bas et de les transférer dans un tube de réaction de 1,5 mL. Ajouter 200 µL de 5 mM MgCl2 en HDB. Les cellules pendant 3 min à 800 g de granule et éliminer le surnageant.
    3. Remettre en suspension les granules cellulaires dans 50 µL de 2 x PI en HDB et flash gel liquide N2. Porter des lunettes de protection.
      Remarque : À ce stade, les échantillons peuvent être conservés à-80 ° C pendant environ 1 mois.
  6. Lyse cellulaire.
    1. Décongeler les cellules dans un bain-marie à 37 ° C pendant 30 à 45 s et vortex brièvement. Conserver les échantillons froid à l’avenir. Membranes de pellet à 2 500 x g et 4 ° C pendant 10 min. éliminer le surnageant, qui contient la majeure partie des protéines cytosoliques.
    2. Remettre en suspension les pellets dans 50 µL de tampon de lyse HEPES contenant 50 mM HEPES-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, glycérol à 10 %, 1 % X-100 Triton, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1 millimètre DTT et fraîchement ajouté 2 x PI cocktail. Mélanger soigneusement. Lyse des cellules 30 min sur glace et vortex toutes les 5 min.
    3. Tournez en bas les débris cellulaires pendant 10 min à 14 000 x g et 4 ° C. Transférer immédiatement le surnageant dans un tube de réaction fraîches.
      Remarque : Procéder à l’analyse tout de suite. Les lysats peuvent être stockés à-20 ° C, cependant, chaque cycle gel-dégel altère la qualité des résultats.
  7. Analyse par Western blot.
    1. Préparation des échantillons, prendre 3-5 µL de lysat et le remplir jusqu'à 7 µL avec H2O. Ajouter 2 µL 1 M TNT et 3 µL de tampon d’échantillon 4 x contenant des pH de 63 mM Tris-HCl 6,8, SDS de 2 %, 10 % de glycérol et 0,04 % bromophénol bleu. Incuber 30 min à 37 ° C.
    2. Quand le GPCR est glycosylée et faibles ou maculées de bandes est un problème, échantillons de déglycosyler avec PNGase F pour augmenter l’intensité du signal et d’aiguiser les bandes. Utiliser les 3-5 µL de lysat et déglycosyler dans un volume total de 10 µL suivant le protocole du fournisseur. Ajouter 3 µL 4 x tampon échantillon.
      Remarque : Les protéines membranaires sont souvent glycosylée dans plusieurs sites et les États, qui altère la qualité de la résolution en analyse SDS-PAGE. Toutefois, ne pas déglycosyler les échantillons pour l’analyse du niveau expression des mutants Azi-GPCR utilisant des anticorps anti-drapeau parce qu’il est pertinent d’évaluer la partie de l’entièrement glycosylée, mature récepteurs à la surface cellulaire.
    3. Résoudre les échantillons par SDS-PAGE standard et épongez les protéines de transfert sur une membrane de PVDF.
      Mise en garde : L’acrylamide est neurotoxique. Porter des gants et des lunettes de protection.
    4. Bloquer la membrane pour 1 h à RT ou toute une nuit à 4 ° C à 5 % de lait écrémé dans TBS-T contenant 20 mM Tris-HCl à pH 7,4, 0,15 M de NaCl et 0,1 % Tween 20.
    5. La membrane de la sonde avec un anticorps anti-ligand, suivi de l’anticorps secondaire conjugué HRP. Laver dans l’intervalle à SCT-T. Pour détecter le niveau d’expression de l’Azi-RCPG, sonder la membrane avec un anticorps HRP commerciale (voir Table des matières).
    6. Effectuer la réaction de chimiluminescence améliorée (ECL) utilisant le réactif ECL fait maison et détecter des signaux pendant 5 min dans le noir.

3. ultrarapide Bioorthogonal étiquetage des RCPG sur cellules de mammifères vivants

Remarque : Le protocole est optimisé pour les 4 puits lamelle couvre-objet (évidement = 2,2 cm2). Pour des tailles bien différentes, le protocole doit être dimensionnée en conséquence.

  1. Revêtement de surface des lames de microscope. Réaliser l’ensemble de la procédure sous hotte stérile.
    1. Préparer un bromhydrate de poly-D-lysine (MW = 500-550 kDa) solution-mère (PDL) à une concentration de 1 mg/mL dans le tampon de borate de 50 mM (pH 8,5). Conserver à 4 ° C jusqu'à 6 mois. Ne pas congeler.
    2. Diluer le PDL solution mère 01:40 dans l’eau ultra pure stérile à une concentration finale de 25 µg/mL (solution de travail), puis filtrer la solution sur un filtre stérile de 0,22 µm.
      Remarque : La solution de travail peut être conservée à 4 ° C pendant 3 mois.
    3. Couvrir entièrement le fond de chaque puits de la lame de microscope avec 500 µL de solution de travail PDL. Incuber pendant 20 min à RT et aspirer la solution de travail PDL.
      Remarque : La solution de travail PDL peut être utilisée jusqu'à trois fois. Si la solution doit être réutilisé, transférer la solution utilisée de diapositives couchés dans un tube stérile fraîche et étiqueter le tube en conséquence. Ne jamais mélanger la solution recyclée avec une solution fraîche.
    4. Rincer chaque bien 3 x avec ~ 700 µl d’eau ultra pure stérile et laisser sécher pendant au moins 1 h.
      Remarque : Il est très important de rincer les puits avec précision, comme les résidus de la solution PDL sont toxiques pour les cellules. Les diapositives enduits peuvent être utilisés immédiatement pour la microscopie ou conserver jusqu'à une semaine à 4 ° C.
  2. Maintenir les cellules HEK293T DMEM supplémenté de 10 % (v/v) de SVF, 100 U/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine à 37 ° C, humidité de 95 % et 5 % de CO2.
  3. Cellules des graines la veille de la transfection.
    1. Détacher les cellules pendant 5 min à 37 ° C à 0.05 % trypsine/PBS additionné de 0,5 mM EDTA. Utiliser 1 mL trypsine/EDTA pour un plat de 10 cm. Étancher avec 10 volumes de milieu complet et remettre en suspension les cellules de pipetage. Compter le nombre de cellules dans la suspension à l’aide d’un hémocytomètre49.
    2. Semences 1,0 x 105 HEK293T cellules / puits (zone 2,2 cm²) dans 600 µL colorant libre DMEM complet.
      Remarque : Pour des fins d’imagerie documentaire, il est très commode travailler dès le début dans un milieu qui ne contient-elle aucun colorant. Colorant libre DMEM formulations sont disponibles dans le commerce.
  4. Contrôler la confluence (superficie occupée par les cellules) sous un microscope et transfecter les cellules à confluence d’environ 70 % à l’aide d’un réactif à base de lipides transfection.
    1. 1 h avant la transfection, préparer une solution fraîche de 100 mM du TCO * K à 0,2 M NaOH et 15 % (v/v) de DMSO.
    2. Par puits, mélanger 3 µl de l’arr * K solution-mère avec 12 µL de 1 M HEPES pH 7,4. Ajouter doucement la solution dans les puits pour un coût total de possession définitive * K concentration de 0,5 mM.
    3. Préparer un montant total de 500 ng ADN / puits. Dans un tube de microcentrifuge, diluer 200 ng de pcDNA3.1_CRF1R-95TAG-EGFP, 200 ng de plasmide codant pour la MoPylRSAF/tRNAPyl paire orthogonale (quatre cassettes de l’ARNtM15) et 100 ng de pcDNA3.1_Arrestin3 plasmide dans 50 µL de milieu (colorant libre, sans sérum, antibiotique libre).
      Remarque : En général, co transfection de Arrestin n’est pas nécessaire d’observer l’internalisation des RCPG. Cependant, Arrestin3 co-transfection accélère internalisation des CRF1R, qui est très pratique lorsqu’on analyse l’internalisation de nombreux mutants.
    4. Diluer 1,25 ml du réactif base de lipides transfection (2,5 µL par 1 µg d’ADN) dans 50 µL de milieu (colorant libre, sans sérum, antibiotique libre) et ajouter la solution au mélange de l’ADN. Vortex immédiatement et incuber pendant 5-10 min des complexes ADN RT. Add lipidiques aux cellules.
      Remarque : Dans notre expérience, la morphologie des cellules transfectées avec base de lipides transfection ressemble plus physiologique par rapport à celle des cellules transfectées avec PEI. Comme PEI donne une plus grande efficacité de transfection, PEI doit être préférée pour des utilisations en aval comme la tache occidentale, tandis que les lipides à base de transfection est un meilleur choix à transfecter de cellules pour des expériences d’imagerie.
  5. étiquette de 24 h après la transfection, le récepteur avec les colorants fluorescents.
    1. Préparer une solution teinture-tetrazine 0,5 mM dans le DMSO et un 10 mg/mL d’ADN coloration teinture solution mère ultra purs H2O.
    2. Transférer 100 µL de milieu de chaque puits dans un tube de réaction de 1,5 mL. Ajouter 1,8 µL de la solution mère de colorant-tetrazine et 0,3 µL de l’ADN de coloration de la solution mère de colorant. Transférer le support contenant les colorants vers le puits et incuber pendant 5 min à 37 ° C.
      Remarque : Tetrazine-orange-fluorescent colorant a une concentration finale de 1,5 µM.
    3. Aspirer le milieu et rincer doucement les cellules deux fois avec du PBS pour enlever le surplus de teinture. Ajouter 600 µL de colorant complet gratuit milieu préchauffé à 37 ° C.
  6. Internalisation de microscopie et de récepteurs de fluorescence.
    1. Visualiser les récepteurs étiquetées sous 63 x (ou similaire) grossissement en utilisant les filtres appropriés pour GFP (λabs: 488 nm, λem: 509 nm), colorant orange fluorescente (λabs: 550 nm, λem: 570 nm) et l’ADN coloration teinture (λ ABS: 350 nm ; Λem: 461 nm). Prenez une photo avec chaque filtre avant l’activation du récepteur.
    2. Promouvoir l’internalisation du récepteur à l’aide de 200 nM de Ucn1.
      1. Préparer une solution 1 000 x Ucn1 de 200 µM dans le DMSO.
        Remarque : Selon la solubilité du peptide, vous pouvez être en mesure de préparer le bouillon dans l’eau pure ou de la mémoire tampon.
      2. 100 µL de milieu de transfert provenant d’un puits dans un tube de réaction de 1,5 mL et ajouter 0,6 µL de la solution mère de peptide agoniste. Transfert au dos moyen dans le puits.
      3. Observer l’internalisation sous le microscope. Prendre des photos de survenance clairement décelables d’internalisation (10-15 min à heures, selon le receveur et la surexpression de Arrestins) en utilisant les filtres mentionnés précédemment.

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Representative Results

Les grandes lignes de l’essai de fluorescence sont représenté dans la Figure 1. Le dosage est utilisé dans trois applications. En premier lieu, un certain nombre de variantes de l’ARNt pour incorporation de Lys(Boc) par la paire orthogonale Pyl est examiné. Lys(BOC) est un acide aminé stériquement semblable à Pyl. Pyl n’étant pas disponible dans le commerce, Lys(Boc) est couramment utilisé comme substrat standard pour la PylRS. Les ARNt filtré sont basées sur l’ARNtPyl. Chaque variante de l’ARNt porte des mutations de bases simples ou de paires de bases dans les boucles et les tiges rationnellement conçus pour améliorer la stabilité de l’ARNt et compatibilité avec les machines translationnelle eucaryotes. Tous les détails sur la conception de l’ARNt sont décrits dans notre récent travail30. Résultats typiques sont décrits dans la Figure 2 a: différents ARNt donne efficacité suppression différents, ce qui ressort clairement d’un montant de fluorescence mesuré. Les barres d’erreur petite de réanalysés biologiques montrent que les valeurs sont hautement reproductibles. En second lieu, les deux variantes du gène de la E2AziRS26,51, qui intègre la photo-RETICULATION p-azido-Phe (Azi), sont évalués. E2AziRS est dérivé de la TyrRS d’e. coli . Un variant du gène employé natif d’e. coli utilisation du codon, tandis que le second a été optimisé pour l’utilisation chez H. sapienscodon. Le dosage de fluorescence montre que la variante codon optimisé donne des rendements plus élevés de protéine (Figure 2 b). Enfin, le taux d’incorporation d’acides aminés différents pour la chimie de clic de bioorthogonal sont comparés (Figure 2). Tous l’ANAC a présenté ici (BCNK, TCO * K et SCOK) sont incorporées par la même paire orthogonale de MbPylRSAF/tRNAPyl. Lys(Z) est également constituée par ce couple et a été utilisée comme témoin positif. Pour illustrer la fiabilité de l’analyse par fluorescence, des expériences d’incorporation ncAA parallèles ont été réalisés sur un RCPG, le CRF1R. Analyse par Western blot a été réalisée pour évaluer l’expression de GPCR (Figure 2 b, C). Les mêmes tendances observées avec EGFP dans le test de fluorescence ont été observés avec le CRF1R. Notamment, Azi incorporation CRF1R a été fortement améliorée lors de l’utilisation du gène E2AziRS codon optimisé par rapport au gène natif, montrant que même une amélioration modérée de 1,5 à 2 fois pour une protéine soluble (EGFP) selon le test de fluorescence peut avoir une plus d’impact sur le niveau d’expression des protéines de la membrane plus difficiles (Figure 2 b). Comme Remarque générale, en ce qui concerne le nombre de cassettes de tRNA à utiliser pour chaque application, qu’une seule cassette de tRNA est recommandée lorsque différents ARNt de dépistage afin de faciliter les procédures de clonage. Lorsque le dépistage des ncAARS différentes ou l’efficacité de l’incorporation de l’ANAC différentes de la même paire orthogonale, quatre de répétées en tandem le tRNA cassette sont préférées pour obtenir les rendements les plus élevés de l’incorporation de la ncAA.

Le système optimisé pour incorporation Azi incluant le gène humanisé de E2AziRS a été déployé pour mapper la poche de liaison de la CRF1R, puis définir les chemins de liaison de 5 différents ligands : les deux agonistes de peptide Ucn1 et CRF et les trois antagonistes de peptide Ucn1(8-40), CRF (9-41) et dFXCRF(12-41) (Figure 3). Alors que l’efficacité de l’incorporation de l’Azi a déjà été démontrée pour diminuer lorsque vous approchez les GPCR C-terminus33,34, notre système optimisé pour l’incorporation de l’Azi permet à des niveaux d’expression comparable de Azi-mutants avec TAG-sites dans différentes parties du gène GPCR (Figure 4 a). Les résultats dans la Figure 4 b montrent la projection de la boucle extracellulaire 2 (ECL2) et hélice V de CRF1R comme une partie représentative de la poche de liaison du ligand. Une bande à la taille appropriée du produit réticulation révèle qu’il se trouve à proximité du ligand dans le complexe ligand-récepteur, c'est-à-dire, il fait partie de la poche de liaison. Plusieurs hits de réticulation trouvées avec des ligands tous testés, révélant des modèles distincts de liaison pour les peptide agonistes et les antagonistes. Notamment, le patron de réticulation hits fournit des informations sur les éléments structuraux du récepteur. Un certain nombre de coups successifs, telle qu’observée dans le ECL2 (en association avec les antagonistes des postes F260-R263) suggère une région de la boucle souple. Un modèle de succès chaque trois ou quatre résidus trouvés dans conseils V (D269/Y270, Y272/Q273, I277) hélice vers une structure hélicoïdale. L’écran peut être étendu à tous les domaines pertinents de la GRCP. Si il existe une structure 3D ou un modèle moléculaire du récepteur, des empreintes de ligand peuvent être visualisées en soulignant les succès de réticulation pour chaque ligand (Figure 5).

Fluorescence et données Western blot (Figure 2) suggèrent que TCO * K est la ncAA pour la chimie de bioorthogonal obtient incorporé avec la plus grande efficacité de la MoPylRSAF. Différents mutants PylRS pourraient donner des rendements plus élevés de l’incorporation d’autres clic ANAC17, mais ils n’étaient pas testés dans cette étude. TCO * K fut incorporée à une protéine de fusion CRF1R-EGFP et activé l’installation via chimie SPIEDAC (Figure 6 a) un petit fluorophore lumineux sur le récepteur (Figure 6 b). Comme une preuve de marquage spécifique, la fluorescence de l’étiquette doit être visible uniquement dans les cellules exprimant le récepteur (cellules vertes en Figure 6 b) et non dans les cachots, qui fournissent donc un contrôle négatif interne dans chaque expérience. Les récepteurs étiquetés ultrarapide SPIEDAC chimie sont encore fonctionnels. Après avoir ajouté un agoniste de peptide, compartiments fluorescents ont été observés dans le cytosol, révélant le processus physiologique de l’internalisation des RCPG (Figure 6). Les signaux de la fondue EGFP localisée conjointement avec le colorant fluorescent en tout temps, confirmant l’étiquetage établies sélective de la GRCP.

Figure 1
Figure 1: dosage à base de Fluorescence pour évaluer l’efficacité de la suppression de codon stop. Les cellules HEK293 sont conjointement transfectées avec les deux plasmides en présence de la ncAA. Un plasmide codant pour la ncAARS désirée et suppresseur-ARNt. Le deuxième plasmide codant pour le gène EGFP portant un codon d’arrêt TAG à un site permissif avec un contrôle mCherry. Deux jours après la transfection, la fluorescence verte et rouge des lysats de cellules entières sont mesurées à l’aide d’un lecteur. Comme l’EGFP N segments en amont que du codon stop (gris) n’est pas fluorescent, le rendement de pleine longueur EGFP (vert) directement est corrélée à l’efficacité de l’incorporation de la ncAA, tandis que mCherry (rouge) fournit une référence indépendante pour la normalisation. L’efficacité du système orthogonal est donnée par le rapport entre la quantité de EGFP obtenu par suppression de codon stop et la quantité de EGFP sauvage obtenue par la traduction régulière (pas de suppression ambre). La figure est modifiée de Serfling, R. & de la pièce, j’ai ; Incorporation des acides aminés non naturels dans des protéines exprimées dans des cellules de mammifères, Methods in Enzymology, 2016, 580, 89-107. 29 reproduction a été autorisée par le Copyright Clearance Center d’Elsevier. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Applications représentatives de l’essai de fluorescence. (A) de dépistage de l’ARNtPyl variantes30. Les cellules HEK293 ont été transfectées conjointement avec le plasmide de journaliste et de plasmides codant pour la paire de PylRS/ARNt Mo(un exemplaire des ARNt). Les barres représentent la fluorescence relative de EGFP obtenue par l’incorporation de Lys(Boc) par rapport au type sauvage EGFP. (B) l’évaluation de l’influence du codon-utilisation des gènes ncAARS. (panneau de gauche) Test de fluorescence des cellules transfectées avec deux variantes du gène différent de E2AziRS. (1) utilisation de codon d’e. coli et gène (2) humanisé. (panneau de droite) Analyse par Western blot de CRF1R95Azi-drapeau. Le récepteur intégral est détecté par un anticorps anti-drapeau. Actine β a été utilisé comme contrôle de chargement. (C) évalue l’efficacité de l’incorporation de trois ANAC conçu pour la chimie de bioorthogonal. (panneau de gauche) Structures de l’ANAC utilisé dans cette expérience. (1) LysZ, qui a été utilisée comme témoin positif, (2) BCNK, TCO (3) * K et SCOK (4). (panneau central) Test de fluorescence des cellules HEK293 transfectées avec un plasmide codant pour MoPylRSAF et quatre exemplaires du tRNA15 de (A) pour incorporer (1), (2), (3) et (4). (panneau de droite) Western blot analyse d’un mutant CRF1R-drapeau portant l’une de le quatre ANAC postées sur 95. Actine β a été utilisé comme contrôle de chargement. Groupe A a été adapté de Serfling, R. et al. Designer ARNt pour une intégration efficace des aminoacides non canonique par le système pyrrolysine en cellules mammifères acides nucléiques res. 46 (1), 1-10 (2018) et sont reproduits selon Creative Commons Licence de paternité. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Représentation schématique de la cartographie de photo-réticulation Azi-mediated. Une fonction activable par photo azido (étoile jaune) est placée dans une position définie dans le récepteur (gris). Lorsque le groupe azido se trouve proximale pour le ligand lié (rouge), un produit de réticulation covalente est formé lors de l’irradiation UV (cercle jaune indique le site de réticulation). L’incorporation du groupe azido dans différentes positions du récepteur révèle la surface de liaison (violette) du ligand, qui représente la poche de liaison. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Incorporation de Azi tout au long de la CRF1R pour la photo-réticulation de cartographie de la poche de liaison. (A) comparaison des niveaux d’expression des mutants Azi-CRF1R-drapeau vers le récepteur de type sauvage. Les sites d’incorporation Azi sont répartis dans l’ensemble récepteur comme indiqué dans la rangée du haut. Anti-Flag Western blots de lysats de cellules entières sont indiqués. Actine β a été utilisé comme contrôle de chargement. (B) transferts Western sondés avec soit anti-CRF ou anticorps anti-Ucn1 sont affichés. Les résidus remplacés par Azi sont indiqués dans la rangée supérieure. Les cellules sont incubées avec les ligands figurant sur la droite, suivie par l’irradiation UV 365 nm et lyse. Les échantillons ont été réglées sur 10 % SDS-PAGE, déglycosylée à l’aide de PNGase F et analysés par Western Blot. Le complexe ligand-CRF1R de déglycosylée tourne à une apparente MW de ~ 40 kDa33. Le ligand non réticulé n’est pas détecté (MW ~ 3-4 kDa). Les deux panneaux de cette figure ont été modifiées par Seidel, L. et al. Structural aperçu l’activation d’un récepteur couplé aux protéines G de classe B par hormones peptidiques dans des cellules humaines vivantes. Elife. 6 10.7554/eLife.27711 et sont reproduits selon la licence Creative Commons Attribution. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Empreintes de peptides agonistes et antagonistes sur la classe B GPCR CRF1R. Représentation de surface du domaine transmembranaire CRF1R. Positions des CRF1R que réticulé le ligand quand remplacé par Azi sont mises en évidence. Empreintes des agonistes peptidiques CRF et Ucn1 apparaissent en magenta, empreintes des antagonistes CRF (9-41) et Ucn1(8-40) en bleu. L’empreinte de l’antagoniste dFXCRF(12-41) est surligné en orange. Les sept hélices transmembranaires I à VII sont indiquées par des chiffres romains. (A, B) Vues de côté de la poche de liaison entre le plan de la membrane. (C) Top view dans la poche de liaison du côté extracellulaire. Tiré à part de Seidel, L. et al. Structural aperçu l’activation d’un récepteur couplé aux protéines G de classe B par hormones peptidiques dans des cellules humaines vivantes. Elife. 6 10.7554/eLife.27711 et sont reproduits selon la licence Creative Commons Attribution. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : SPIEDAC étiquetage des CRF1R sur des cellules vivantes. (A) plan de réaction de cycloaddition contrainte-favorisé inverse demande d’électrons Diels-Alder (SPIEDAC) : le groupe trans-2-octène-cyclo de la ncAA TCO * K réagit avec le groupe tetrazine lié au fluorophore Cy3. (B, C) Les cellules HEK293T exprimant CRF1R95TCO * K- EGFP. Images représentatives du canal vert, rouge et bleu. La taille de la barre d’échelle est de 10 µm. (B) des cellules ont été traitées avec tetrazine-Cy3 (1,5 µM) pendant 5 min. Seulement les cellules exprimant le récepteur (vert) montrent la survenue d’étiquetage (rouge). (C) cellules ont été traitées avec 200 nM Ucn1 et imagés après 15 min. de vésicules intracellulaires correspondent au récepteur intériorisé. Groupes B et C sont modifiés de Serfling, R. et al. Designer ARNt pour incorporation efficace des aminoacides non canonique par le système pyrrolysine en cellules mammifères Nucleic Acid res. 46 (1) 1-10 (2018) (Oxford University Press) et sont reproduits selon la licence Creative Commons Attribution. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Le protocole décrit une analyse simple et fiable pour évaluer l’efficacité des paires orthogonales pour l’incorporation de l’ANAC protéines exprimées dans des cellules de mammifères. Le principal avantage de cette méthode en ce qui concerne les tests couramment issu des FACS est qu’il permet la préparation simultanée et la mesure d’un plus grand nombre d’échantillons et fournit des données qui sont analysées facilement à l’aide d’un logiciel ordinaire. La disponibilité d’une méthode de débit moyen pour analyser des paires orthogonales en cellules mammifères est très importante pour le développement de nouvelles paires orthogonales et l’amélioration de celles existantes. En effet, il n’est pas possible d’effectuer une évolution dirigée des paires orthogonales via la génération de grandes bibliothèques aléatoires et de sélection morts/vivants dans les systèmes mammaliens. Le test permet aux bibliothèques de dépistage de petite taille (plusieurs centaines de membres) en investissant un effort expérimental raisonnable dans un délai relativement court. Par conçu rationnellement tRNA ensembles, par l’intermédiaire de ce test de dépistage, nous pourrions générer roman ARNt qui augmenter considérablement l’efficacité du système pyrrolysine30. La combinaison classique EGFP/mCherry est utilisé pour l’affichage fluorescent, par lequel EGFP sert de journaliste d’efficacité de l’incorporation et mCherry que le contrôle interne. Le journaliste EGFP et le contrôle de mCherry sont logées dans le même plasmide mais sont inscrivent dans deux cassettes d’expression distincte portant deux promoteurs indépendants. De cette façon, mCherry expression a trait à l’efficacité de transfection et la numération des cellules, mais il est indépendante d’expression EGFP, afin que la fluorescence verte mesurée peut être normalisée à la fluorescence rouge. C’est pas exactement le cas des autres journalistes construit comme un tandem de deux protéines comme EGFP-TAG-mCherry7 et iRFP-GFPY39TAG (avec iRFP qui dénote de la protéine fluorescente infrarouge)52. Dans ces constructions, ces deux protéines sont sur la même transcription ARNm. Chez les eucaryotes, ARNm portant des codons stop prématurés subissent une surveillance et la dégradation par le mécanisme de désintégration induite par l’absurde (NMD)53. Par conséquent, tant la séquence de la journaliste et le contrôle sont simultanément dégradées et expression des deux gènes n’est pas strictement indépendante. Études similaires basées sur l’un journaliste luciférase au lieu d’un journaliste de fluorescence ont été décrites par d’autres,du5455. Alors que la luminescence enzymatique offre une sensibilité plus élevée que les mesures de fluorescence, ce dernier a montré supérieure reproductibilité entre lots de cellules différentes.

Les systèmes robustes pour l’incorporation de la ncAA en cellules mammifères sont absolument nécessaires lorsque vous travaillez avec exigeant des protéines cibles comme les protéines membranaires et faibles protéines abondantes. Nous montrons ici une paire orthogonale optimisée pour intégration robuste de la ncAA activable par photo Azi dans RCPG. Le système donne des taux d’incorporation Azi homogènes tout au long de l’ensemble récepteur qui permet la cartographie systématique de photo-réticulation des surfaces entières de GPCR et identification des sites de liaison de ligand. Les deux principaux points de force de la méthode sont que les différents ligands peuvent être analysées sur les mêmes récepteurs en parallèle et que les données proviennent du récepteur dans les cellules vivantes, qui complète les informations obtenues auprès des approches in vitro . La méthode est en principe applicable à n’importe quelle cible de protéine et convient également mapper les topologies d’interactions protéine-protéine. En outre, le sous-ensemble identifié des postes réticulé peut encore être analysé avec réticulation 2D à pin-point paires intermoléculaires d’amino-acides proximales dans le complexe associé à33,38. Ces paires d’acides aminés fournissent des contraintes spatiales qui sont appliqués aux silico expériences pour construire des modèles moléculaires précis de l’interaction33,38. Du point de vue méthodique, il convient de remarquer que des résultats positifs seulement des expériences de réticulation devraient être considérés. Une position qui n’a pas crosslink peut encore être dans le rayon critique de ligand. Faux négatifs peuvent se produire lorsque la mutation a présenté par la RETICULATION entrave l’interaction native, mais peut également se produire lorsque la portion de réticulation pointe loin du ligand, ou est piégée par le solvant ou subit une réticulation intramoléculaire. Une partie cruciale de la méthode consiste à détecter la présence de réticulation. En premier lieu, les lysats de cellules entières ont été réglés de SDS-PAGE à séparer un ligand qui n’est pas lié par covalence au récepteur. Deuxièmement, le complexe récepteur-ligand covalent est détecté par Western Blot à l’aide d’un anticorps anti-ligand. Pour les ligands peptidiques, haute affinité des anticorps polyclonaux contre le ligand sont le choix optimal. Comme alternative, ligands peptidiques peuvent être équipés avec une balise de drapeau à une position permissive, pourvu que la balise est rendue accessible à l’anticorps anti-drapeau par un espacement approprié. Tags de biotine permet également, bien que les résultats peuvent être difficiles à interpréter en raison de l’arrière-plan par les protéines biotinylées endogène. Ligands de petites molécules sont habituellement radioactif, bien que le marquage balise peut également être possible de56,57. Protocoles d’Azi incorporation dans les RCPG ont été publiés également par d’autres57,58,59. Toutefois, ces protocoles impliquent l’utilisation de trois plasmides pour l’incorporation de l’Azi, considérant que nous utilisons un système plus simple de deux-plasmide, incluant un gène humanisé pour E2AziRS, qui donne les meilleurs résultats en ce qui concerne la non-codon-optimisé un (Figure 2 b).

Techniques de microscopie moderne nécessitent l’installation fluorophores très lumineux et efficaces dans la protéine d’intérêt, comme protéine codée génétiquement fluorophores tels que l’EGFP classique ne conviennent pas pour les applications haut de gamme. Par conséquent, il y a une recherche constante de méthodes qui permettent l’installation des fluorophores biologiques sur les protéines, qui a conduit à l’élaboration de la populaire SNAP60 et balises de61 Halo, entre d’autres. Cependant, ces balises ont toujours une taille de plusieurs kDa, ce qui peut perturber la fonction de la protéine cible et laisse une grande incertitude sur la position exacte du fluorophore. Avec une taille minimale de quelques acides aminés, le motif de tétracystéine représente une alternative plus petite pour un étiquetage plus précis à l’aide de fluorescéine ou résorufine composés arsenicaux (FlAsH, Magali)62,63. Bien que cette approche a été appliquée avec beaucoup de succès également à GPCR études64,65,66, il nécessite un lavage étapes avec les thiols, il souffre souvent de fond élevé, et dans tous les cas, il ne permet pas positionnement de l’étiquette avec résolution seul résidu. Au lieu de cela, ANAC équipés d’ancres de bioorthogonal offre la possibilité d’installer des étiquettes fluorescentes placé seul acide aminé, minimisant ainsi le risque d’interférer avec la conformation native et la fonctionnalité de la protéine cible. ANAC de dernière génération pour la chimie de bioorthogonal, comme le TCO * K13 employés ici, ont permis à l’étiquetage de protéines directement sur des cellules vivantes17,43. La méthode est applicable aux protéines cibles sur la surface de la cellule, mais aussi sur des cibles intracellulaires, pourvu que les colorants perméable à la cellule appropriées sont disponibles17,67,,68. SPIEDAC chimie est de plusieurs ordres de grandeur plus rapidement à l’égard de cycloaddition contrainte-favorisé azido-alcyne (SPAAC) et Staudinger Bertozzi trompes sur azoture ancres2,13. En fait, plusieurs protocoles ont été publiés pour les GPCR étiquetage sur génétiquement constituée Azi, mais ils concernent uniquement les RCPG isolées in vitro37,59,69. Au lieu de cela, nous avons démontré ici lisse bioorthogonal étiquetage des RCPG fonctionnelle sur les cellules vivantes. Notre protocole est similaire aux protocoles existants en utilisant la même chimie43,48,70, mais notre système optimisé d’incorporation ncAA élargit la portée de la méthode aux études des RCPG. Une étape cruciale dans la procédure expérimentale est le choix de la position pour être échangé avec le TCO * K, que pas toutes les positions dans le récepteur sont permissifs pour un remplacement ou accessible pour le colorant fluorescent. Par conséquent, plusieurs postes devraient être testés dans un écran préliminaire pour trouver le plus adapté.

En conclusion, cet ouvrage présente des outils pour l’application générale de l’ANAC, y compris en appliquant aux difficiles protéines cibles tels que les RCPG. Nous prévoyons que photo-réticulation cartographie et bioorthogonal d’étiquetage, de nos jours les principales applications de l’ANAC aux études GPCR, trouverez nombreuses futures applications tant pour dévoiler les topologies d’interactions de GPCR avec des ligands ou d’autres protéines et étudier GPCR dynamique des structures dans les cellules vivantes.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit à déclarer.

Acknowledgments

Ce travail a été fondé par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) au titre de subventions CO822/2-1 (programme Emmy Noether) et CO822/3-1 à c. i.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1) Carl Roth 3029.1
Ammonium persulfate (APS) Carl Roth 9592.2
p-Azidophenylalanine (Azi) Bachem F-3075.0001
Boric acid Sigma Aldrich B6768
Bromphenolblue Sigma-Aldrich B0126-25G
Bovine serum albumine (BSA) Carl Roth 8076.2
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z)) NovaBiochem 8540430100
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK) Sichem SC-8000
DMEM Life Technologies 41966052
DMSO Carl Roth A994.2
DTT Carl Roth 6908.1
enhanced chemiluminescence reagent (ECL)  home-made 10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l  p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3)
EDTA Carl Roth 8043.1
EGTA Carl Roth 3054.1
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK) Sichem SC-8014
FBS Thermo Fisher (Gibco) 10270106
FluoroBrite DMEM Thermo Fisher (Gibco) A1896701
Glycerol Carl Roth 7533.1
Glycin Carl Roth 3908.3
HEPES Carl Roth 9105.3
Hoechst 33342 Sigma Aldrich B2261
KCl Carl Roth 6781.3
Lipofectamine 2000  Thermo Fisher 11668019
Luminol Applichem A2185,0005
Methanol Carl Roth 0082.3
MgCl2 Carl Roth 2189.2
NaCl Carl Roth HN00.2
Na-Lactate Sigma-Aldrich 71718-10G
NaOH Grüssing 121551000
PBS Sigma-Aldrich P5493-1L
p-Coumaric acid Sigma-Aldrich C9008-1G
poly-D-lysine hydrobromide Corning 354210
PEI Polysciences 23966
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher (Gibco) 11548876 (15140-122)
PMSF Carl Roth 6367.1
PNGase F NEB P0704L
Protease Inhibitor Roche 11873580001
PVDF membrane Immobilon-P Millipore IPVH00010
Skim Milk Powder  Sigma 70166
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Carl Roth CN30.2
Tetrazine-Cy3 Jena Bioscience CLK-014-05
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Carl Roth 2367.3
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K) Sichem SC-8008
TRIS Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Carl Roth 3051.4
Trypsin 2.5% Thermo Fisher (Gibco) 15090046
Tween 20 Carl Roth 9127.2
Wasserstoffperoxid (30%) Merck 1.07210.0250
Cell lines
HEK293 cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-305
HEK293T cells German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) ACC-635
Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nm Bio-Budget Technologies GmbH 40-BLX-E365 5 x 8 Watt tubes
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega  BMG LABTECH
Plasmids
Plasmid E2AziRS The huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies) Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter
POI-TAG mutant plasmids Plasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position 
CRF1R-95TAG-EGFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFP Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Arrestin3-FLAG Synthesized by Genart (Life Technologies) Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Antibodies
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate  Sigma-Aldrich A8592  monoclonal, produced in mouse clone M2
Goat-anti-rabbit-HRP antibody Santa Cruz sc-2004
Rabbit-anti-CRF antibody home-made PBL #rC69 polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)
Rabbit-anti-Ucn1 antibody home-made PBL #5779 polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)

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Chimie numéro 134 Non canonique suppression de codon stop acides aminés (ncAA) ambre efficacité de l’incorporation orthogonales amino-acyl-ARNt-synthétase/ARNt paires photo-réticulation cartographie interfaces de liaison protéique bioorthogonal chimie microscopie en fluorescence
Optimiser la constitution génétique de produit chimique sondes dans RCPG pour Photo-réticulation cartographie et de la chimie de Bioorthogonal dans les cellules de mammifères vivants
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Serfling, R., Seidel, L.,… More

Serfling, R., Seidel, L., Böttke, T., Coin, I. Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (134), e57069, doi:10.3791/57069 (2018).

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