Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול לייצור מבוקרת של חלבונים microcrystals. התהליך משתמש מכשיר אוטומטי המאפשר מניפולציה מבוקרת של מספר פרמטרים התגבשות. התגבשויות חלבון הוא נשא החוצה על ידי תוספת מבוקרת ואוטומטיים של התגבשות פתרונות תוך ניטור של חוקרים את רדיוס ההפצה של חלקיקי ה-droplet התגבשות.
Abstract
ההתקן התגבשות האוטומטי הוא פטנט1 שפותחה במיוחד עבור ניטור חלבון התגבשות ניסוייו לתמרן בדיוק את התגרענות ואת הצמיחה קריסטל לכיוון הרצוי בגדלים של גבישי החלבון. התגבשויות מבוקרת מבוסס על מדגם חקירה עם בחיי עיר פיזור אור דינאמי (DLS) בעוד כל השינויים החזותיים ה-droplet מנוטרים באינטרנט בעזרת מיקרוסקופ מצמידים מצלמה CCD, ובכך מאפשר מלא חקירת ה-droplet חלבון בכל שלבי התגבשות. השימוש בבאתרו DLS מדידות לאורך כל הניסוי כולו מאפשרת זיהוי מדויק של הפתרון חלבון מאוד supersaturated מעבר לשלב חדש – היווצרות של התגבשות. על ידי זיהוי שלב התגרענות חלבון, התגבשויות ניתן למטב מקריסטלים חלבון גדולה לייצור של חלבונים microcrystals. פרוטוקול הניסוי מראה התגבשות אינטראקטיבי גישה המבוססת על צעדים מדוייקים אוטומטיות כגון תוספת precipitant, אידוי מים עבור בתדר גבוה רוויית יתר, מדגם דילול על האטה המושרה התגרענות הומוגניות או היפוך פאזה מעברים.
Introduction
במהלך השנים האחרונות, הצמיחה של חלבון מיקרו - nanocrystals לכד את תשומת הלב של הקהילה חלבון-קריסטלוגרפיה, במיוחד עם פיתוח מתמשך של קריסטלוגרפיה בפמטושניות טורי (SFX). בשל הברק של הרנטגן הרומן קרינה ממקורות, בהתבסס על תוצאות מוצלחות שהושגו עד כה, הייצור של חלבון מיקרו, nanocrystals הפך רלוונטיות גבוהה, התחזות ביקוש גבוה על הכנת כזאת השעיות גבישי 2 , 3. עקב קריסטל קטנים בגודל-הטווח הדרושים עבור איסוף נתונים-לייזר אלקטרונים חופשיים (XFELs), המוגבל של beamtime ניסיוני, לדוגמה האפיון לפני איסוף נתונים הוא חיוני. הטכניקות הנפוצות ביותר לאפיון המתלים מיקרו - או nanocrystal חלבון הם עד עכשיו מיקרוסקופ אלקטרוני ו רנטגן אבקת עקיפה.
עד כה, מספר גישות כבר הסתגלו שיטות נפוצות התגבשות במטרה לייצר כמויות בכמות גדולה של חלבון קריסטלים עם ממדים בטווח קטן מיקרומטר. השיטה אצווה משמש עבור ערבוב מהיר של חלבון מרוכז ופתרונות precipitant, ובכך לאלץ את הפתרון הדגימה עד שלב מאוד supersaturated איפה nanocrystallization יכול להיות המועדף4. שיטות אחרות כוללות ריסוק חלבון גדולה גבישים כדי ליצור של slurry קריסטל, אשר יכול לשמש תכונות המתלים יש להשתמש עבור אוסף נתוני5. עם זאת, התוצאה עלולה לפעמים לגרום עקיפה ירידה באיכות, כפי הורע לקריסטלים לסדר הפנימי התחתון. Nanocrystallization מבוסס על ממשק חינם דיפוזיה היא גם אלטרנטיבה זמינה, איפה חלבון פתרון נוסף בכמויות קטנות פתרון precipitant מרוכז3. עם זאת, בקרב כל טכניקות, השיטה היעילה ביותר להיראות התגבשויות אצווה, טכניקות חדשניות מניפולטיבית יותר בשיטות אדי דיפוזיה כשהם יושבים טיפות6.
באופן כללי, עבור התגבשות של חלבון חייב חצה מחסום אנרגיה כדי לתמוך התגרענות - הצעד הראשון תרמודינמי במבנה הגביש. כדי להעביר את הפתרון חלבון מדינה יציבה למה רוויית יתר, סוף סוף לזירוז מעבר פאזה, משתנים מסוימים הקשורים הפתרון חלבון צריך להיות שונה. משתנים כגון בדרך כלל הריכוז של הפתרון חלבון, שינויים סביבתיים (למשל., טמפרטורה, לחות), מאפייני הממס (למשל, pH, כוח יונית), ריכוז ומאגר נכסים, וכו7 ,8 סקירה כללית של פרמטרים דוגמת אשר ניתן לשנות מיוצגת בדרך כלל באמצעות דיאגרמות שלב, אשר מאפשרים מצבים שונים של המצגת, כגון מסיסות דיאגרמות, דיאגרמות שלב התגרענות או אפילו יותר מפורט תיאורים איפה דיאגרמות תלת-ממדי או מורכבים יותר יכולים להיכנס שיקול8,9,10. סוגי דיאגרמות שלב היפה ביותר הם בדרך כלל דו מימדי, שם המשתנה העיקרי הוא ריכוז חלבון כפונקציה של פרמטר אחר, ואילו שאר הפרמטרים נשמרים קבועים6,11. ברגע אחד או כמה גרעינים נוצרים, גבישים גדולים יותר יכול לגדול על ידי לקיחת טיפול חלבונים נוספים מהפתרון בצובר. כאשר מכוון לייצור מיקרו - ו nanocrystal, כזה בגישה המקובלת התגבשות הוא לא ריאלי יותר עקב מספר קטן של בעלי ההווה בפתרון. תכונות המתלים בדרך כלל צריכה להיות עשירה הישויות גבישי, ובכך שמסלול התגבשות חייב להיות והשתלב, כך יש מקסימה של אירועים התגרענות נוכח במדגם. כתוצאה מכך, זה דורש החקירה של חלק חדש, עד עכשיו נחקרו התגרענות מסלולים עבור חלבונים, המהווה גם עדיין לא לגמרי מובן12,13. בהתבסס על היסודות תרשים שלב שהוזכר קודם לכן, התיאוריה הקלאסית הורחבה השערה חדשה, שבה התגרענות מתואר כמנגנון בשני שלבים: בשלב הראשון מעבר ריכוז חלבון גבוה יותר מתקיים (צפיפות הנוזל שלב) ושנית, מעבר בין שלב צפוף עשיר גבוה יותר לסדר הפנימי (התגבשות האדריכלות סריג)14,15,16. חלבון התגבשות רגישים לגורמים רבים, ולכן בעת התגבשות מתכונים הם והשתלב לגרום גבישים בגדלים שונים, המתכונים תמיד לסמוך על הידע הקודם. תובנות חדשות צריך שתוקם עבור כל מטרה חלבונים בודדים: התאמה של מאגר הרכב, טוהר, יציבות של הידע דוגמה, מדויקת של מסיסות חלבון, וכו '.
פיזור אור דינאמי הוא היום שיטה ומבוססת על ניתוח ואופטימיזציה של תהליכים התגבשות חלבון, בשל גודל-מגוון רחב של חלקיקים יכול ייחקרו: של חלבונים monomeric nanocrystals, microcrystals קטן. השיטה מנצלת חלקיקים בתמיסה עוברים תנועה בראונית, כי המהירות הממוצעת של תנועה זו נקבע לפי גודל החלקיקים, אנרגיה תרמית שלהם ולפי צמיגות של המדיום, את הגיאומטריה של חלקיק. בהתחלה, המדיום הנוזלי מואר על ידי מקור אור קוהרנטי עם השימוש של לייזר. האור מפוזר על ידי חלקיקים היא יצירת תבנית של התאבכות. כי החלקיקים נמצאים בתנועה קבועה תבנית ההתאבכות משנה גם לצמיתות. כאשר מסתכלים בכיוון מסוים, יכול להיות שנצפו עוצמת תנודות. תנודות אלה מוצגים כעת את תנועת החלקיקים הנגרמת על ידי תנועה בראונית. מפני תנודות נמדד בעוצמה תפקיד autocorrelation (ACF) מחושבת. ניתוח של ACF ייתן מדד להתפלגות מהירות (ליתר דיוק את מקדם דיפוזיה) של חלקיקים, באמצעות המשוואה סטוקס-איינשטיין, מומר חלקיקים רדיוס ההפצה17. מידע נוסף הקשור DLS פונקציונליות, עקרון הפעולה ניתן למצוא פרסומים שונים, ספרים18,19.
כאן נוכל להחיל. ומתארות מכשיר ייחודי התגבשות אוטומטיות, XtalController900, גרסה משודרגת של XtalController טכנולוגיה6, בדיוק שפותחו עבור ניטור ניסויים התגבשות חלבון אינטראקטיבי. טכניקה זו פוטנציאל זיהוי, מעקב אחר האירועים התגרענות בזמן אמת, המאפשר תמרון מדויקת באמצעות הדיאגרמה בשלב התגבשות גבוה. המטרה של הליך מסוים התגבשות היא לייעל את התגבשות חלבון כדי להשיג איכות גבוהה חלבון מיקרו - nanocrystals המתאימים עבור יישומים המנצלים מקורות synchrotron ממוקדות מיקרו רנטגן, אלקטרון עקיפה, או SFX.
Protocol
הערה: לאורך כל פרוטוקול כולו, מערכת המיקרו-מינון משמש תוספת של מים יכונו כמו Pump0 בעוד מערכת המיקרו-מינון משמש תוספת של precipitant ייקרא Pump1. התוצאות של הניסוי הזה ניתן נוספים שנדונו ואת המכונה THM2_micro-גבישים.
1. פרמטרים וההתקנה פתרון
- לסנן 16 מ"ל של Na-Tartrate פתרון (1.2 מ') ו- 16 מ ל מים מזוקקים באמצעות מסנן סטרילי מזרק 0.2 µm.
הערה: הפתרון Na-tartrate מייצג את הפתרון precipitant לניסוי. התגבשות. - למלא את precipitant ואת בקבוקי מים עם 5 מ של פתרונות מסוננים.
הערה: הבקבוקים יש קיבולת מקסימלית של 5 מ"ל. - הר הבקבוקים ב בעלי משאבת לשכת ניסיוני.
- קבע את הפרמטרים ניסיוני בחלון התוכנה בערכים הבאים: טמפרטורה 20 ° C, לחות יחסית-20, ו הממס כמים.
הערה: איור 2 מציג את חלון הראווה שבו המשתמש ניתן להוסיף את הערכים הנכונים עבור כל פרמטר כגון טמפרטורה, לחות יחסית, הממס. חלון התוכנה מציגה גם מספר פרמטרים נוספים כגון תוספים. . זה רק חשוב עבור ניסויים בו תוספים נמצאים בהפתרון precipitant. - פותחת את הדלת של החדר ניסיוני ולהסיר המוביל coverslip.
- במקום של coverslip siliconized ונקייה על המוביל ולמקם אותו חזרה המכשיר.
הערה: coverslip הוא בגודל 2.2 ס מ. - סגור את תא ניסיוני כדי לאבטח את התנאים הסביבתיים מהשלב 1.4.
הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן.
2. מיקרו-מינון מערכות התאמה
- לעבור על Pump0 הראשי באמצעות משאבה מאפיינים באיור 3 וליצור זרם מים.
הערה: מסלול זרם המים נוצר בהתבסס על כמה מאפיינים משאבת שניתן לכוונן. איור 3 מראה את המאפיינים המשאבה הראשית ואת הערכים אופטימלית צריך לשמש עבור ניסוי זה. - התאם את זרם המים מכוון ותנוחת לכיוון המרכז coverslip על ידי הפעלה ידנית בורג המיועד ההתאמה שלה. לעבור את Pump0.
- לעבור על Pump1 וליצור זרם נוזלי כאמור נעשה בשלב 2.1. להתאים את מיקום זרם Pump1 לכיוון העמדה קבוע עבור Pump0. לעבור את Pump1.
- להחליף את coverslip משומש חדש ולנקות אחד לניסוי. התגבשות.
הערה: מגבונים רכים מומלץ לניקוי את coverslip החדש מפני אבק שיורית, לפני בשימוש הניסוי התגבשות.
3. הגדרת את טיפה Thaumatin בבית הבליעה ניסיוני
- צור קובץ ניסיוני חדש באמצעות חבילת התוכנה. הזן את הפרטים הבאים בקובץ ניסיוני: חלבון (thaumatin מן Thaumatococcus daniellii), חלבונים (14 מ"ג/מ"ל), precipitant (Na-Tartrate) לריכוז ריכוז precipitant (1.2 מ').
הערה: מידע זה ישמש לחישוב האוטומטי של ריכוז precipitant וחלבון במהלך הניסוי התגבשות. - לטעון את הקובץ ניסוי חדש כדי להפעיל את כל המידע מכל שלב 3.1.
- סמן את המיקום של ה-droplet חלבונים על-ידי הוספת טיפה מים קטן באמצעות Pump0.
הערה: המטרה היא ליצור טיפה מים קטן אשר ישמש כנקודת ציון שבו יוצב המדגם חלבון. - לחץ על לחצן טרה לקביעת המשקל שניתנה על ידי microbalance אפס.
הערה: פעולה זו תסיר את נטל coverslip ואת המשקל העודף שנוספו על-ידי ציון דרך מים קטן שנוצר בשלב 3.3. - פתח את המכסה העליון של התא ניסיוני, פיפטה µL 8 thaumatin פתרון-ציון המים.
- רשום הירידה thaumatin חדש הפקודות הבא.
- לחץ על לחצן חדש זרוק לייחס את התנאים הראשוני מהקובץ ניסיוני.
- לחץ על לחצן Const לפיצוי אידוי טבעי של מים מן ה-droplet.
- בדוק עם מצלמת CCD אם Pump0 מכוון בתיבה הנפתחת חלבון. להתאים מחדש את המיקום של Pump0 אם זרם המים מכוון החוצה המסירה.
הערה: מרגע זה ואילך, חלבון ה-droplet יישאר במשקל קבוע, על ידי תוספת מים אוטומטיים אשר מפצה על אידוי מים טבעיים של חלבון ה-droplet. המשקל של ה-droplet חלבון, כמו גם הפרמטרים האחרים, כגון טמפרטורה, לחות יחסית ניתן לנטר בזמן אמת באמצעות חלון התצוגה. הניסוי ניתן להשהות כאן.
4. בחיי עיר DLS מדידות
- מתג על DLS לייזר במקום קרן הלייזר בתיבה הנפתחת חלבונים על ידי באופן ידני באמצעות הברגים ההתאמה.
- הזן את הפרמטרים DLS הבאים: משך מדידה (60 s), זמן ההמתנה בין שתי מדידות (10 s), ואת מספר מדידות (300).
הערה: המידות 30 ישמש מדידות הפניה לבדיקת-חלבון יציבות. שאר המדידות ישמש חקירה מלאה של חלבון ה-droplet במהלך האורך הכולל של תהליך התגבשות. - לחץ על לחצן התחל כדי להפעיל DLS המידות. בדוק את איכות המדגם על-ידי בחירה באחד ייצוגים גרפיים DLS.
הערה: המדגם צריך להראות רמה גבוהה של מונו-dispersity, ללא כל אגרגטים בפתרון. התוצאות DLS ניתן להציג ולקרוא כמו: רדיוס ההפצה, רדיוס היסטוגרמה, רדיוס מגרש, מדידות סיכום, או סקירה של עוצמת קצב הספירה.
5. שלב אידוי מדגם
- הזן את התנאים עבור השלב אידוי טבלת לוח הזמנים באמצעות הנתונים המוצגים בטבלה 1.
הערה: הסימן "-" הציג בעמודה "Molarity/אחוז" בשורה השניה מייצגת איבוד מים מן ה-droplet חלבון, ואילו הערך "25" אומר כי אמצעי האחסון droplet יסבול ירידה של 25%. משמעות הדבר היא כי ריכוז חלבון ה-droplet יגדל עם 25%. - להפעיל את הצעד אידוי מדגם על-ידי לחיצה על כפתור Autom. לחץ על לחצן עצור לאחר סיום השלב אידוי מדגם.
- הפעילו את כפתור Const כדי לשמור על יתרון קבוע לאחר עצירת אידוי מדגם.
6. שלב תוספת precipitant
- הזן את התנאים עבור השלב תוספת precipitant טבלת לוח הזמנים המוצגים באיור 4 שימוש, הנתונים המוצגים בטבלה מס ' 2.
הערה: בשורה הראשונה של הטבלה מייצג צעד כיול, שבמהלכו התוכנה מחשבת את קצב אידוי טבעי של ה-droplet חלבון מבוסס על כמות precipitant כי יש להוסיף חלבון ה-droplet. התוכנה extrapolates ערך זה, מכוונן באופן אוטומטי את תדירות ירי Pump0 כדי לפצות באופן אוטומטי אידוי המים לשלב תוספת precipitant הבא. - הפעל את הצעד תוספת precipitant על-ידי לחיצה על כפתור Autom.
הערה: התוספת של precipitant הוא תהליך אוטומטי, בעקבות הקלט מתוך טבלת לוח הזמנים.
7. מעקב את האבולוציה של ה-Droplet התגבשות לאורך זמן
- בדוק את המראה של הקריסטלים thaumatin על ידי באמצעות מצלמת ה-CCD.
- לבדוק את התפלגות גודל חלקיקים באמצעות ייצוגים גרפיים של DLS.
- לבדוק את ההתפתחות של פרמטרים הניסוי והמשקל באמצעות חלון התצוגה.
הערה: כאשר הפתרון Na-tartrate מגיע ריכוז של 0.74 מ' בתיבה הנפתחת חלבון, ה-droplet הופך להיות עשיר thaumatin מיקרו קריסטלים כפי שניתן לראות באיור 7.
8. שחזור של התגבשות רביב
- המעיל צלחת Terasaki נקי הרגיל בשמן פרפין.
- להוסיף 3 מ של שמן פראפין לצלחת.
- לפזר את שמן פרפין על הבארות צלחת מהזזה בעדינות את הצלחת בזוויות שונות, כך השמן מכסה כל הבארות 72 של הצלחת.
- להסיר את עודף של שמן פרפין על ידי שמוציא את השמן שצף על הצלחת.
- לחץ על הלחצן עצור כדי לסיים את הניסוי התגבשות. בזהירות להוציא המוביל מדגם המכיל את ה-droplet התגבשות.
- עם השימוש פיפטה, מקום נפח של 2 aliquots µL הירידה התגבשות הבארות של צלחת Terasaki.
הערה: על ידי שחזור ה-droplet התגבשות בצלחת תחת שמן, המדגם ניתן מפעם לפעם לבדוק עבור יציבות וצמיחה קריסטל עם השימוש של מיקרוסקופ או בטכניקות אחרות DLS שעובדים עם צלחות Terasaki רגיל.
Representative Results
התוצאות המתקבלות על ידי מדידות DLS במהלך הניסוי התגבשות מראים על האבולוציה מפורט של רדיוס חלקיקים hydrodynamic וכתוצאה מכך שני שברים התפלגות החלקיקים הראשי, אשר לפתח עם הזמן. בחלק הראשון של הניסוי, המדגם היה לאט התפוגגה, על מנת להשיג ריכוז חלבון גבוה יותר. כפי שמוצג באיור 5B, הירידה חלבון היה מרוכז מ 14 מ"ג/מ"ל ל 19.5 מ"ג/מ"ל. במהלך תקופה זו, על פי הדפוס הפצה רדיוס ב איור 5A, החלבון מראה התנהגות monomeric בתמיסה עם גודל החלקיקים קבועה של 2.5 ננומטר. כפי המדגם הוא להיות התאדו נוסף, החלבון monomeric נשאר יציב בפתרון, ללא כל סימנים של דנטורציה או צבירת הדגימה.
התוספת של precipitant פתרון לירידה חלבון מיד יזמה לאחר אידוי לדוגמה, מודגש עם גריי ב רדיוס ההפצה העקומות דפוס ואיזון עבור כאחראית (איור 5). על סמך החישובים נגזר מן המשקל לדוגמה, השבר חלקיקים המסומן מיוחס חניכה של קריסטל התגרענות, וכתוצאה מכך גודל הרדיוס של-200-400 nm. תופעה זו (המכונה התגרענות) הוא יזם-ריכוז precipitant של 0.6 מטר ה-droplet חלבון, פרק זמן כ- 66 דקות מן הקבלה של הניסוי, כ- 23 דקות בכל הנוגע אתחול של precipitant בנוסף. כמו הריכוז של גדל precipitant, רדיוס ההפצה מראה הפצה רחבה של חלקיקים בתמיסה. כמו גרעינים נוספים יוצרים, הראשונית גבישי ישויות גדלים בגודלם, להגיע התפלגות רדיוס בין 800-1,300 ננומטר. ניתן להסיק שמקדם כי בשלב זה התגבשות ממשיכים לצמוח, השבר חלבון הופך בהדרגה עניים כפי מולקולות חלבון הם לקחו-על ידי microcrystals. ריכוז precipitant בתיבה הנפתחת חלבון גודלת אט-אט, היווצרות של microcrystals מזוהה בקלות לאחר 75 דקות, כאשר התפלגות רדיוס וממשיכה להתפתח בין 500 ו- 1500 ננומטר. האבולוציה של ההתפלגות הרדיוס הוא אישר גם תמונות מצלמת CCD, איפה חלבון microcrystals גלויים-ריכוז precipitant של 0.7 מ' בתמיסה (איור 7). תוספת precipitant הסתיימה, הירידה התגבשות נשמר קבוע, התפלגות רדיוס מציגה שלב הדומיננטית בין 1,000 ל-3000 nm, בעוד השבר של אירועים התגרענות פוחתת עם הזמן. ברגע זה, הירידה התגבשות מלא רווי microcrystals, אין אירועים התגרענות נוספים נמצאים בתמיסה.
באמצעות קלט נסיוני את נתוני המשוב שניתן על ידי microbalance, דיאגרמה בשלב התגבשות צוירה להבנה מקיפה של תהליך התגבשות thaumatin. איור 6, הדיאגרמה שלב ניסויי מציגה 3 ניסויים התגבשות עצמאית, שבה הייצור של thaumatin טי דניאלי microcrystals נקראת כמו THM_2 מיקרו קריסטלים (פרוטוקול). שני ניסויים נוספים התגבשות שכותרתו THM_1 מאקרו-גבישים וקריסטלים THM_3 מאקרו-שימשו כמו נתוני קלט על מנת לקבל מיפוי נכון של האזורים השונים בדיאגרמה שלב (למשל., המסיסות או אזור והשלמת). מאז הפרוטוקולים עבור ניסויים אלו לעקוב מסלולים התגבשות שונים, זיהוי האזור התגרענות הופך להיות קל יותר, ומכאן מדויקת יותר. עבור ניסוי, הנתיב התגבשות מודגשת על ידי מספרים על מנת להדגיש את הגישות השונות ואת מספר צעדים התגבשות ששימשו לתוצאה מסוימת, בעוד אפור החצים מייצגים הערכה של החלבון הסופי ריכוז כאשר הצמיחה קריסטל uptakes מולקולות חלבון מהפתרון היווצרות מוגדרים היטב יציבה חלבון קריסטלים.
3 ניסויים thaumatin המוצגים באיור 6 להראות תנאים שונים בעת הזנת האזור התגרענות, התגבשות הסופי שונה ולכן התוצאות כפי שהוא ניתן לראות את התמונות מתחת הדיאגרמה שלב. במקרה של THM1, THM3, הפתרון חלבון עובר שלב התגרענות וכניסה מחדש באזור והשלמת, שם הוא נח עד גבישים. כתוצאה מכך, הניסויים להוביל קריסטלים בצורת גדול, מוגדרים היטב מוקף אמא המשקאות. עם זאת, עבור הניסוי המוצג באזור ' ' פרוטוקול, THM2_micro-גבישים, הנתיב התגבשות עוקב אחר בגישה מסוימת. במקטע הקודם הזכרנו כי עבור מדגם לתת microcrystals, הפתרון חלבון יש להיות ממוקם עמוק בשלב התגרענות, כך האירועים התגרענות שיכולים להיווצר בקצב מרבי. במקרה של THM2_micro-גבישים, היחס בין חלבון כדי ריכוז precipitant הותאם באופן כזה כי המדגם לא רק מזין את אזור התגרענות, אבל כמו precipitant הוא הוסיף, לפתרון של חלבון, ולעבור התנאים לא אזור אחרים בדיאגרמה שלב, אבל להישאר במצב מאוד supersaturated בתוך אזור התגרענות. כתוצאה מכך, האנטרופיה של הפתרון פוחתת באופן דרסטי כמו ה-droplet חלבון יהיה רווי מיד ישויות הקטן גבישי.
איור 1. ייצוג סכמטי של הניסוי התגבשות. הציור מציג סקירה של תא ניסיוני התגבשות עם כל החלקים הטכניים הדרושים לביצוע ניסוי התגבשות אוטומטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: חלון התוכנה של DLS מדגם בפרמטרים הרלוונטיים עבור ניסוי התגבשות. פרמטרים כוללים טמפרטורה, לחות יחסית, צמיגות, וכו '.
איור 3: חלון שליטה תוכנה עבור מערכות המיקרו-מינון מעורב הניסוי התגבשות. התכונות מאפשרים התאמה של פרמטרים ספציפיים לדור של טיפות או פתרון זרם.
איור 4: חלון התוכנה עבור טבלת לוח הזמנים המתארת את השלבים התגבשות מעורב בניסוי. התנאים הראשוני של ה-droplet התגבשות משולבים גם בחלון זה.
איור 5. סקירה של thaumatin ייצור microcrystals ט daniellii . (א) רדיוס ההפצה של גודל החלקיקים בתיבה הנפתחת חלבון במהלך תהליך התגבשות כולו. (B) מבוקרים סקירה של פרמטרים ניסיוני. החלקות מייצגים את ההתפתחות לאורך זמן למשקל של חלבון ה-droplet (עיקול שחור) יחד עם ריכוז חלבון מחושב (עיקול אדום) וריכוז precipitant (עיקול כחול). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: התגבשות ניסיוני דיאגרמה שלב של thaumatin טי דניאלי יחד עם התוצאות המתקבלת. כל המגרשים נגזרים מתוך נתוני הניסוי, בהתבסס על המידע המשוב שניתן על ידי microbalance. המספרים לייחס ניסוי הגלויים בין סוגריים מייצגים את הסדר ואת מספר הצעדים שננקטו במהלך פרוטוקול התגבשות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7: תצלום מוקלטות עבור THM2_Micro-גבישים (פרוטוקול) מציג מספר שופע של microcrystals ספוג בתמיסה. התמונה צולמה ב- 4 שעות (240 דקות) לאחר הגדרת ה-droplet חלבון בבית הבליעה ניסיוני עבור התגבשות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 8: תצלום מוקלטות עבור מאקרו THM_1-מראה כמה גבישים גדולים thaumatin יציב בפתרון גבישים. התמונה צולמה 20 h לאחר הגדרת ה-droplet חלבון בבית הבליעה ניסיוני עבור התגבשות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 9: תצלום מוקלטות עבור מאקרו THM_3-מציג בגדלים שונים של גבישים thaumatin בתמיסה גבישים. התמונה צולמה 20 h לאחר הגדרת ה-droplet חלבון בבית הבליעה ניסיוני עבור התגבשות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| חומר | Molarity/אחוז | הזמן (s) |
| מים | 0 | 100 |
| מים | --25 | 2100 |
| מים | 0 | 2100 |
טבלה 1: קלט לוח זמנים אוטומטי עבור אידוי מדגם שלב בייצור של thaumatin microcrystals.
| חומר | Molarity/אחוז | הזמן (s) |
| מים | 0 | 100 |
| prec | 0.8 | 1800 |
| מים | 0 | 18000 |
בטבלה 2: קלט לוח זמנים אוטומטי עבור התוספת precipitant שלב בייצור של thaumatin microcrystals.
Discussion
המכשיר התגבשות נועד לפקח ולטפל פרמטרים קריטיים במהלך ניסוי התגבשות המבוסס על שיטה אדי דיפוזיה שונה. טכניקה זו מאפשרת מעקב וניקוד ניסוי התגבשות חלבון בכל שלביו, המאפשר למשתמש יש ידע מדויק ושליטה של הפתרון חלבון לאורך כל הדיאגרמה בשלב התגבשות, בהתבסס על בחיי עיר ניתוח DLS של ההשעיה הדגימה.
המכשיר התגבשות כוללת חדר ניסיוני (איור 1) מחוברת מצלמת CCD המאפשר ניטור בזמן אמת של ה-droplet התגבשות. המצלמה הוא מותאם מיקרוסקופ מצויד עם עדשות שונות הגדלה, המספק רזולוציה מרחבית מקסימלי של 2.5 מיקרומטר. הליבה של התא ניסיוני הוא microbalance העדינה למעקב אחר ההתפתחות של המשקל מדגם לאורך זמן. ההליך התגבשות מקביל ניסוי ישיבה-שחרור קיטור דיפוזיה, איפה הירידה חלבון מושם על coverslip siliconized, אשר ממוקם על microbalance. בהתבסס על שינויים במשקל של ה-droplet, אשר נגרמות על-ידי precipitant, תוספת מים/תוסף או מדגם אידוי, microbalance נותן קלט מדויקים כדי אלגוריתם לחישוב מיידית של ריכוז חלבון ו precipitant לאורך זמן . בנוסף, חשוב התגבשות פרמטרים כגון טמפרטורה, לחות יחסית בדיוק תחת פיקוח, מבוקר.
על מנת לבצע ניסוי התגבשות, המכשיר מצויד עם מערכות המיקרו-מינון שני (לפנות משאבות פיזואלקטריים חינם) שעובדים בקנה מידה picoliter עבור תוספת precipitant ומים. על ידי עובד עם כאלה כמויות קטנות של החומר, מעברי הצבע ריכוז והתופעה הולכת חום בתוך ה-droplet חלבון הן מזעריות. התפקיד העיקרי של משאבות פיזואלקטריים הוא התוספת של precipitant או מים, שהאחרון למשל בשימוש כמו פיצוי אידוי טבעי של חלבון ה-droplet. מערכת המיקרו-מינון יש קבוצה של תכונות, אשר יכולה להכתיב התוספת של חומר. כוללות תכונות כגון: שיעור החזרה עבור הוספת חומר, מספר טיפות הוסיף לכל שניה, את הרוחב והגובה מסלול זרם החומר, וכו '. יתר על כן, המיקום של המשאבות ניתן להתאימם באופן ידני, המאפשר למשתמש יש מיקום מדויק עבור תוספת של חומרים לתוך חלבון ה-droplet.
מניפולציה משוב ייחודית נשלט של הטיפה התגבשות מושגת על ידי בחיי עיר DLS נתונים, אשר יכול להציג שינויים אפשריים במדינה oligomeric חלבון לאורך כל תהליך ניסיוני. הטכניקה מאפשרת הערכה קבועה של פילוג גודל החלקיקים לאורך זמן, לכן חשיפת המנגנונים הקשורים חלבון לא ידוע. ציוד אופטיקה DLS ממוקם אסטרטגית מתחת השטח coverslip, המאפשר את קרן גלאי ולייזר לקרב עוברים coverslip דרך ה-droplet חלבון באופן בחיי עיר ; לכן, רק שינויים בתוך ה-droplet נרשמים מהנתיב DLS. כדי לאפשר טיפול קל, למכשיר יש שני פתחים: דלת כניסה מיקום אופטימלי בין coverslip את המכסה העליון אשר ניתן להסירו, כך המשתמש יכול לשנות את עמדת הירי של מערכות מיקרו-המינון כמו גם הגדרת עם דיוק של dro חלבון חדש plet-coverslip.
השיטה התגבשות אינטראקטיבית באמצעות המכשיר הנ ל היא טכניקה אמין לייצור שבשליטת בגודל של חלבון קריסטלים. למרות שיטות התגבשות רבות זמין כעת, בתוך מידע אודות התגבשויות מנגנון עצמו הוא לא בר השגה בקלות. באופן כללי, יישום שיטות קונבנציונליות התגבשות מאפשר בקרה מוגבלת בלבד פתרון בדיאגרמה בשלב התגבשות, עם רק כמה אפשרויות של שינוי מסלולו ברגע ניסוי החלה. תוך כדי ביצוע התגבשות של הניסוי, החלת כזה של התגבשות אוטומטית עם טכנולוגיית מצמידים בחיי עיר DLS, נהדר הידע מתווסף על מעברים בדיאגרמה שלב. באופן כללי, האזורים וכתוצאה מכך התמיסה אמורפי של אינדוקציה של הומוגניות התגרענות הם קרובים אחד לשני בדיאגרמה שלב. על-ידי מניפולציה הקורס של droplet התגבשות בהתבסס על מידע בזמן אמת על תפוצתו של חלקיקים, לכן ניתן למנוע משקעים של חלבון באמצעות בהדרגה התאמת התנאים התגבשות לכיוון התגרענות ו קריסטל-צורה.
כיום, תנאים התגבשות רבים כוללים precipitant פתרונות היכן פוליאתילן גליקול (PEG) נגזרים נוכחים באופן נרחב. תרכובות כאלה יש בדרך כלל של צמיגות גבוהה אשר שיכולה להיות קשיים pipetting או מחלק. במקרה שלפנינו, להחיל מערכות המיקרו-מינון המשמשות מחלק precipitant נימים דקיקים שהופכים את התוספת של picolitre במרווחים אפשרי. כתוצאה מכך, ישנן כמה מגבלות בעבודה עם חומרים בעלי צמיגות גבוהה. בתוך סדרה של ניסויים קודמים, המערכת נתן תוצאות חיוביות באמצעות של derivates פג הבאים: PEG200 50%, PEG3000 20%, PEG6000 10%, PEG800010%. למרות כה נבדקו רק הפתרונות הנ ל, מערכות המיקרו-מינון מכילות מנגנון חימום מיוחד אשר יכול לשמש כדי להפחית את צמיגות של פתרון. גורם נוסף הוא פתרונות מלח צריך להיחשב כאשר הוא משמש חלבון precipitant. בעת עבודה עם מלחי מרוכז, כמות קטנה יכולה להתגבש על הצינור של מערכת המיקרו-מינון, גורם חוסם שטחית של המשאבה המיקרו-מינון במהלך הוספת precipitant; גם כאשר הלחות היחסית גבוהה מאוד מציגים בבית הבליעה ניסיוני. כדי להתגבר על בעיה זו, הניסוי צריך יצתרך לחכות כך שניתן יהיה להסיר את המלח מן הצינור. זה עשוי לדרוש טיפול מיוחד, עשוי לייצר שגיאות בשלב בנוסף precipitant.
בהתבסס על מידע בעל ערך ניתן להשיג בעת ביצוע ניסויים אלה התגבשות אוטומטיות, טכניקה זו גם ניתן להרחיב מחקרים חוקרת את ההיבטים כימיה פיזיקלית של התגבשות חלבון. שיעורי התגובה צמיחה התגרענות וקריסטל תופעות קינטי אשר ניתן לגזור מחושב על בסיס המידע זמן-התלות מתואר ניסוי כגון טמפרטורה, הצמיחה של גודל החלקיקים, חלבון ו- precipitant ריכוז.
Disclosures
אנו מצהירים כי המחברים ארן מאייר Karsten Dierks, כריסטיאן מלון הם בעלי המניות של חברת Xtal-מושגים GmbH, המפיק של טכנולוגיית XtalController900.
Acknowledgments
המחברים לאשר מימון של האיחוד האירופי אופק 2020 מחקר, חדשנות תוכנית תחת מארי קירי Sklodowska ראשי תיבות "X-בדיקה" גרנט הסכם מס 637295 ותמיכה באמצעות BMBF גרנט 05K16GUA, ולא את "המבורג מרכז עבור מרביים הדמיה – מבנה, דינמיקה, שליטה של החומר את המשקל האטומי"מצוינות האשכול פתוח דויטשה (DFG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | 1002365940 | Protein for protocol |
| Bis-Tris 14880 | Sigma-Aldrich | 2302377 | Buffer for protein solution |
| di-Sodium tartrate dihydrate | AppliChem | A0451,0500 | Precipitant for protein solution |
| Silliconized coverslips | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1051203 | Coverslips for crystallization |
| Syringe filter | Starstedt | 831826001 | Filter pore 0.2 µm |
| Syringe | Omnifix | 4617207V | Luer Lock Solo 20 mL |
| Paraffin oil | Sigma-Aldrich | 2323842 | Oil for coating the plate |
| Standard Terakasi plate | Sigma-Aldrich | M5812270EA | Plate for recovering the crystallization droplet |
| Soft wipes | KIMTECH Science | ||
| XtalController900 | Xtal-Concepts GmbH | XTC900 | Crystallization device |
References
- Xtal Concepts GmbH, Germany . Patent "Vorrichtung und Verfahren zur Kontrolle der Kristallisation". , EP 2 588 649 (11754824.8) and US 9,284,659 B2 (2010).
- Chapman, H. M., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
- Kupitz, C., Grotjohann, I., Conrad, C. E., Roy-Chowdhury, S., Fromme, R., Fromme, P. Microcrystallization techniques for serial femtosecond crystallography using photosystem II from Thermosynechococcuselongatus as a model system. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 369 (1647), 20130316 (2014).
- Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. IUCrJ. 2 (2052-2525), 246-255 (2015).
- Stevenson, H. P., et al. Use of transmission electron microscopy to identify nanocrystals of challenging protein targets. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (23), 8470-8475 (2014).
- Meyer, A., et al. Single-drop optimization of protein crystallization. Acta. Crystallogr. Sect. F. Biol. Cryst. Commun. 68 (Pt 8), 994-998 (2012).
- Ferré-D'Amaré, A. R. Crystallization of Biological Macromolecules. 5 (7), Cold Spring Harbor Laboratory Press. 847-848 (1999).
- Asherie, N. Protein crystallization and phase diagrams. Methods. 34 (3), 266-272 (2004).
- Sauter, C., Lorber, B., Kern, D., Cavarelli, J., Moras, D., Giege, R. Crystallogenesis studies on yeast aspartyl-tRNAsynthetase: use of phase diagram to improve crystal quality. Acta. Cystallogr. D. Biol. Crystallogr. 55 (Pt 1), 149-156 (1999).
- Ewing, F., Forsythe, E., Pusey, M. Orthorhombic lysozyme solubility. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 50 (Pt 4), 424-428 (1994).
- Saridakis, E. E. G., Steward, P. D. S., Lloyd, L. F., Blow, D. M. Phase diagram and dilution experiments in the crystallization of carboxypeptidase G2. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 50 (Pt 3), 293-297 (1994).
- McPherson, A., Cudney, B. Optimization of crystallization conditions for biological macromolecules. Acta. Crystallogr. F. Struct. Biol. Commun. 70 (Pt 11), 1445-1467 (2014).
- Sleutel, M., Van Driessche, A. E. S. Role of clusters in nanoclassical nucleation and growth of protein crystals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (5), 546-553 (2014).
- Schubert, R., Meyer, A., Baitan, D., Dierks, K., Perbandt, M., Betzel, C. Real-time observation of protein dense liquid cluster evolution during nucleation in protein crystallization. Cryst. Growth Des. 17 (3), 954-958 (2017).
- Vekilov, P. G. The two-step mechanism of nucleation of crystals in solution. Nanoscale. 2 (11), 2346-2357 (2010).
- Vekilov, P. G. Dense liquid precursor for the nucleation of ordered solid phases from solution. Crystal Growth & Design. 4 (4), 671-685 (2004).
- Dierks, K., Meyer, A., Einspahr, H., Betzel, C. Dynamic light scattering in protein crystallization droplets: adaptations for analysis and optimization of crystallization processes. Cryst. Growth Des. 8 (5), 1628-1634 (2008).
- Schubert, R., et al. Reliably distinguishing protein nanocrystals from amorphous precipitate by means of depolarized dynamic light scattering. J. Appl. Cryst. 48, 1476-1484 (2015).
- Brown, W. Dynamic light scattering: the method and some applications. , Clarendon Press: Oxford. ISBN-13: 978-0198539421 978 (1993).
