Summary
여기 선물이 단백질 microcrystals의 제어 생산을 위한 프로토콜. 프로세스의 여러 결정 화 매개 변수 제어 조작 수 있도록 자동화 된 장치를 사용 합니다. 단백질 결정 화는 수행-아웃 모니터링 및 결정 화 방울 입자의 반경 분포를 조사 하는 동안 결정 화 솔루션의 제어 및 자동화 된 추가 의해.
Abstract
자동화 된 결정 화 장치는 특히 nucleation 및 단백질 결정의 결정 성장으로 원하는 크기를 정확 하 게 기동 하는 목적으로 단백질 결정 화 실험 모니터링 용으로 개발 된 특허 기술1 . 샘플 조사에서 현장에서 동적 빛 분산 (DLS) 제어 결정 화 기반 모든 시각적인 변화는 작은 물방울은 전체 활성화 CCD 카메라를 결합 하는 현미경의 도움으로 온라인 모니터링 하는 동안 결정의 모든 단계 동안 단백질 방울의 조사. 전체 실험 통해 DL 측정 현장에서 의 사용 새로운 단계-결정 핵의 형성에 전환 높은 포화 단백질 해결책의 정확한 식별 수 있습니다. 단백질 nucleation 단계를 식별 하 여 결정 화 단백질 microcrystals의 생산에 큰 단백질 결정에서 최적화 수 있습니다. Precipitant 또한, 물이 증발 유도 높은 포화에 대 한 정확한 자동된 단계를 기반으로 하는 접근 둔화에 대 한 샘플 희석 유도 균질 nucleation 실험 프로토콜 대화형 결정 화 보여줍니다 또는 상전이 반전 하 고
Introduction
지난 몇 년 동안 성장 단백질 마이크로 포커스 및 나노의 직렬 펨 결정학 (SFX)의 지속적인 개발으로 특히 단백질 결정학 커뮤니티의 관심을 점령 했다. 나노 포즈 같은 결정 정지의 준비에 수요가 높은 관련성의 되고있다 및 소설 엑스레이의 광채로 인해 방사선 및 생산의 단백질 마이크로-지금까지 얻은 성공적인 결과에 따라 2 , 3. 작은 크리스탈 크기-범위 때문에 자유 전자 레이저 (XFELs) 데이터 수집 및 실험 beamtime의 한정 된 가용성에 필요한, 데이터 수집 전에 샘플 특성은 필수적입니다. 단백질 마이크로-또는 nanocrystal 정지 하는 가장 일반적인 기술 지금 전자 현미경과 x 선 분말 회절까지 있습니다.
지금까지 몇 가지 방법은 작은 마이크로미터 범위에서 크기와 단백질 결정의 대량 양을 생성 하는 목적으로 일반적인 결정 화 방법에서 적응 되어 있다. 일괄 처리 메서드는 집중 고 샘플 솔루션 nanocrystallization 선호4수도 높은 포화 단계에 따라서 강제로 precipitant 솔루션의 빠른 혼합을 위해 사용 됩니다. 다른 방법은 분쇄 하는 데 사용할 데이터 컬렉션5nanocrystalline 정지로 봉사 할 수 있는 크리스탈 슬러리를 형성 하기 위하여 큰 단백질 결정을 포함 합니다. 그러나, 결과 발생할 수 있습니다 때때로 감소 회절 품질 악화 결정 낮은 내부 순서 대로. Nanocrystallization 무료 인터페이스 확산에 따라은 또한 사용 가능한 대안, 어디 단백질 해결책 농축된 precipitant 솔루션3작은 금액에 추가 됩니다. 그러나, 모든 기술 중에서 가장 효율적인 방법을 일괄 결정 화 기술과 더 많은 혁신적인 속임수 앉아 방울6에 증기 확산 방법을 사용 하 여 것 처럼.
일반적으로, 단백질의 결정 화에 대 한 에너지 배리어는 nucleation-크리스탈 형성의 첫 번째 열역학 단계를 지원 하기 위해 교차 해야 합니다. 열역학으로 안정 된 상태에서과 포화 단백질 해결책을 이동 하기 위하여 그리고 마지막으로 상전이 유도, 단백질 해결책에 관련 된 몇 가지 변수 수정할 수 있습니다. 이러한 변수는 일반적으로 환경 변화 단백질 용액의 농도 (예., 온도, 습도), 용 매 특성 (예를들면, pH, 이온 강도), 농도 및 버퍼 속성, 등7 ,8 샘플 매개 변수를 변경할 수 있습니다에 대 한 개요는 대개 단계 다이어그램, 용 해도 다이어그램, nucleation 단계 다이어그램 등 더욱 상세한 프레 젠 테이 션의 다른 모드를 허용 하는 의하여 표현 대 한 설명 3 차원 또는 더 복잡 한 다이어그램 고려8,,910으로 올 수 있다. 주요 변수는 다른 매개 변수의 기능으로 단백질 농도 동안 나머지 매개 변수 상수6,11단계 다이어그램의 가장 매력적인 종류는 일반적으로 2 차원. 하나 또는 몇 가지 핵 형성 되 면 더 큰 결정 대량 솔루션에서 추가적인 단백질을 취 함으로써 성장할 수 있습니다. 마이크로-및 nanocrystal 생산 목표로, 같은 기존의 결정 화 접근 가능한 솔루션에 존재 하는 결정의 작은 수 때문에 더 이상 않습니다. Nanocrystalline 정지는 보통 부자가 되려면 결정 요소에 따라서 결정 화 통로 재조정 될 nucleation 이벤트 샘플에 존재의 맥시 마는 그런 있다. 결과이 단백질, 또한 아직 되지 않은 완전히 이해12,13지금 미개척된 nucleation 경로까지 새로운, 일부 조사를 요구 한다. 앞에서 설명한 단계 다이어그램 기본을 바탕으로, 고전 이론 확장 되었습니다 새로운 가설 nucleation 2 단계 메커니즘으로 설명 되어: 처음에, 더 높은 단백질 농도 전환 일어난다 (조밀한 액체 단계) 및 두 번째, 더 높은 내부 순서 (격자 구조와 크리스털 핵)14,15,16밀도 풍부한 단계에서 전환. 단백질 결정 화는 많은 요인, 그리고 따라서 결정 화 조리법 다른 크기의 결정 결과를 재정리는 때 조리법 수 없습니다 항상 의존 이전 지식. 새로운 통찰력을 각 개별 단백질 대상에 대 한 설정 필요: 버퍼 구성, 순도, 단백질 용 해도, 등의 샘플, 정확한 지식의 안정성의 조정.
동적 산란 분석 및 크기-다양 한 조사 수 입자 인 단백질 결정 화 공정의 최적화에 대 한 기초가 튼튼한 방법입니다 오늘: 나노 및 작은 microcrystals 단위체 단백질에서. 방법을 악용 솔루션에서 입자 브라운 모션을 받아야 하 고이 운동의 평균 속도 매체 및 입자 형상의 점성에 의해 입자의 크기, 그들의 열 에너지에 의해 결정 됩니다. 처음에, 액체 매체는 레이저의 사용으로 일관 된 광원에 의해 조명입니다. 입자에 의해 흩어져 빛 간섭 패턴을 형성 합니다. 입자 영구 모션에서 때문에 간섭 패턴 변경 영구적으로 됩니다. 때 특정 방향에서 찾고, 강도 변화를 관찰할 수 있습니다. 이러한 변동 지금 브라운 모션으로 인 한 입자 움직임을 보이고 있다. 측정된 농도 변동에서 자기 상관 함수 (ACF) 계산 됩니다. 피 오의 분석 및 스톡-아인슈타인 방정식을 사용 하 여 입자의 속도 분포 (더 정확 하 게 확산 계수)에 대 한 측정값을 줄 것 이다, 입자 반경 유통17로 변환 됩니다. 다양 한 간행물 및도 서18,19DLS 기능 및 작동 원리와 관련 된 추가 정보를 찾을 수 있습니다.
여기 우리가 적용 하 고 독특한 자동된 결정 화 장치, XtalController900, XtalController 기술6, 정확 하 게 상호 작용 단백질 결정 화 실험 모니터링에 대 한 개발의 업그레이드 된 버전을 설명. 이 기술은 높은 식별 및 실시간 nucleation 이벤트의 추적, 결정 화 단계 다이어그램을 통해 정확한 기동 시키기 허용에 대 한 잠재적인 보여줍니다. 이 특정 결정 절차의 목표는 고품질 단백질 마이크로-및 나노 마이크로 초점을 맞춘 싱크 로트 론 엑스레이 근원, 전자 회절, 활용 하는 응용 프로그램에 대 한 적합 한 단백질 결정 화를 최적화 하거나 SFX입니다.
Protocol
참고: 전체 프로토콜을 통해 물의 추가 위해 사용 되는 마이크로-복용량 시스템 것입니다 라고 하 Pump0 비례적의 추가 위해 사용 되는 마이크로-복용량 시스템 Pump1 라는 것입니다. 이 실험의 결과 추가 논의 되며 THM2_micro 결정 하 라고.
1. 매개 변수 및 솔루션 설치
- 16 mL 나 주석산 솔루션 (1.2 M) 및 16 mL 증류수 0.2 µ m 무 균 주사기 필터를 사용 하 여 필터링 합니다.
참고: 없음-주석산 솔루션을 결정 화 실험에 대 한 precipitant 솔루션을 나타냅니다. - 필터링된 솔루션의 5 mL을 채울 비례적 및 물 병.
참고: 병 5 mL의 최대 용량을가지고. - 실험 챔버의 펌프 소지자에 병을 탑재 합니다.
- 실험적인 매개 변수 창에서에서 설정 소프트웨어는 다음 값으로: 온도 20 ° C, 상대 습도 20, 및 물 용 매에서.
참고: 그림 2 는 디스플레이 창 사용자 온도, 상대 습도, 용 매 등 각 매개 변수에 대 한 올바른 값을 삽입할 수 있습니다. 소프트웨어 창 또한 첨가제 등의 몇 가지 추가 매개 변수를 표시합니다. 이것은 단지 실험에 대 한 중요 한 첨가제는 precipitant 솔루션 에입니다. - 실험 챔버의 현관 문을 열고 coverslip 캐리어를 제거 합니다.
- 캐리어에 깨끗 하 고 시 coverslip 놓고 장치에 다시 배치 합니다.
참고:는 coverslip 2.2 c m의 크기는. - 1.4 단계에서 환경 조건을 확보 하기 위해 실험 챔버를 닫습니다.
참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.
2. 마이크로-복용량 시스템 조정
- 에 Pump0 전환 주를 사용 하 여 그림 3 에 특성을 펌프 하 고 물 스트림을 만들.
참고: 물 스트림 궤도 조정 될 수 있는 몇 가지 펌프 특성 기반으로 생성 됩니다. 그림 3 주요 펌프 특성 및이 실험을 위해 사용 해야 하는 최적의 값을 보여 줍니다. - 수동으로 지정 된 조정 나사를 운영 하 여는 coverslip의 중심을 향해 위치를 목표로 물 흐름을 조정 합니다. Pump0에서 전환 합니다.
- 에 Pump1 전환 하 고 이전 단계 2.1에에서 일 액체 스트림을 생성 합니다. Pump0에 대 한 고정 위치 쪽으로 Pump1의 스트림 위치를 조정 합니다. Pump1에서 전환 합니다.
- 새로운 사용된 coverslip를 장착 하 고 결정 화 실험 한 청소.
참고: 부드러운 잎사귀는 일반적으로 이전에 결정 화 실험에 사용 되 고 잔여 먼지에서 새로운 coverslip 청소를 위해 권장 됩니다.
3. 실험 실에서 Thaumatin 드롭 설정
- 소프트웨어 패키지를 사용 하 여 새로운 실험 파일을 만듭니다. 실험 파일에 다음 정보를 입력: ( Thaumatococcus daniellii-thaumatin), 단백질 농도 (14 mg/mL), 비례적 (Na-주석산) 단백질과 precipitant 농도 (1.2 M).
참고:이 정보는 비례적 및 단백질 농도 결정 실험 중의 자동된 계산에 대 한 될 것입니다. - 모든 단계의 정보를 3.1 활성화에 있는 새로운 실험 파일을 로드 합니다.
- Pump0를 사용 하 여 작은 물 방울을 추가 하 여 단백질 방울의 위치를 표시 합니다.
참고: 목표는 단백질 샘플 배치 됩니다 랜드마크 역할을 하는 작은 물방울을 만드는 것입니다. - 0는 중량에 의해 주어진 무게를 설정 하려면 자체 버튼을 누릅니다.
참고:이 coverslip의 무게와 단계 3.3에서에서 만든 작은 물 랜드마크에 의해 추가 된 여분의 무게를 제거 합니다. - 실험 챔버의 상단 뚜껑을 열고 물 랜드마크에 thaumatin 솔루션의 8 µ L 플라스틱.
- 다음 명령을 수행 하 여 새로운 thaumatin 드롭 등록.
- 뉴 드롭 실험 파일에서 초기 조건 속성 버튼을 누릅니다.
- Const 는 작은 물방울에서 물의 자연 증발을 보상 하기 위해 버튼을 누릅니다.
- Pump0 단백질 드롭에서 목표로 하는 경우 CCD 카메라와 함께 확인 하십시오. 물 흐름이 방울 밖에 서 목표로 하는 경우 Pump0의 위치를 재조정.
참고:이 순간 이후부터 단백질 방울 유지 됩니다 일정 무게에 자동된 물 추가 단백질 방울에서 자연 물 증발에 대 한 보상에 의해. 온도 및 상대 습도 같은 다른 매개 변수 뿐 아니라 단백질 물방울의 무게 표시 창을 사용 하 여 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. 실험 여기 일시 중지 될 수 있습니다.
4. DL 측정 현장에서
- 스위치에 에 DL 레이저 수동으로 조정 나사를 사용 하 여 단백질 드롭에서 레이저 광선을 배치.
- 다음 DL 매개 변수 입력: 측정 기간 (60 s), 두 측정 사이의 대기 시간 (10 s), 및 측정 (300)의 수.
참고: 먼저 30 측정 단백질 안정성 확인에 대 한 기준 측정 될 것입니다. 측정의 나머지 결정 화 과정의 전체 길이 중 단백질 방울의 전체 조사 될 것입니다. - DLS 측정을 시작 하려면 시작 단추를 누릅니다. DL 그래픽 표현 중 하나를 선택 하 여 샘플의 품질을 확인 하십시오.
참고: 샘플 솔루션에 모든 집계 없이 모노-dispersity 높은 수준의 표시 해야 합니다. DLS 결과 표시 하 고로 읽을 수: 반경 배급, 반경 히스토그램, 반경 줄거리, 요약, 또는 카운트 속도 강도 대 한 개요로 측정.
5. 샘플 증발 단계
- 표 1에 표시 된 데이터를 사용 하 여 일정 테이블 에 증발 단계에 대 한 조건을 입력 합니다.
참고: 기호 "-" 열에 도입 "몰/비율" 두 번째 행에는 손실을 나타냅니다 물의 단백질 방울에서 값 "25" 의미 물방울 볼륨 25%의 감소를 겪게 될 것 이다. 즉,는 물방울의 단백질 농도 25% 증가 합니다. - Autom버튼을 눌러 샘플 증발 단계를 활성화 합니다. 샘플 증발 단계 끝나면 중지 단추를 누릅니다.
- Const 드롭 샘플 증발을 중지 한 후 지속적인 유지 버튼을 활성화 합니다.
6. precipitant 추가 단계
- 표 2에서 제공 하는 데이터를 사용 하 여 그림 4 에 나와 있는 일정 테이블 에 precipitant 추가 단계에 대 한 조건을 입력 합니다.
참고: 테이블의 첫 번째 행은 소프트웨어 계산 비례적 단백질 방울에 추가 되는 금액에 따라 단백질 방울의 자연 증발 속도 보정 단계를 나타냅니다. 소프트웨어이 값이이 연산의 고 자동으로 Pump0에 대 한 총격 사건 주파수를 조정 하 여 자동으로 다음 precipitant 추가 단계에 대 한 물 증발을 보상 하기 위하여. - Precipitant 추가 단계 Autom버튼을 눌러 활성화 합니다.
참고: 비례적 추가 일정 테이블에서 입력 다음과 같은 자동화 된 프로세스입니다.
7. 시간이 지남에 따라 결정 화 방울의 진화를 추적
- CCD 카메라를 사용 하 여 thaumatin 결정의 모양을 확인 합니다.
- DL 그래픽 표현을 사용 하 여 입자 크기 분포를 확인 하십시오.
- 표시 창을 사용 하 여 무게와 실험적인 매개 변수의 진화를 확인 합니다.
참고: 나 주석산 솔루션에 도달 하면 0.74 M의 농도에 단백질 드롭 드롭릿에 풍부한 thaumatin 마이크로-크리스탈 그림 7에서 보이는 것과 같이 된다.
8입니다. 결정 화 방울의 복구
- 파라핀 기름 깨끗 한 표준 Terasaki 플레이트 코트.
- 플레이트에 파라핀 오일의 3 mL를 추가 합니다.
- 부드럽게 기름 접시의 모든 72 웰 스 커버를 다른 각도에서 접시를 이동 하 여 격판덮개 우물에 파라핀 오일 분산.
- 밖으로 접시에 기름 붓는 여 파라핀 오일의 과잉을 제거 합니다.
- 결정 화 실험을 완료 중지 버튼을 누릅니다. 신중 하 게 결정 화 방울을 포함 하는 샘플 캐리어를 꺼내.
- 피 펫의 사용으로 결정 화 방울의 2 µ L aliquots의 볼륨 Terasaki 격판덮개의 우물에 놓습니다.
참고: 오일 아래 접시에 결정 화 방울, 복구 하 여 샘플 수 주기적으로 검사 안정성과 현미경 또는 표준 Terasaki 격판덮개로 작동 하는 다른 DL 기술을의 사용 하 여 결정 성장.
Representative Results
결정 화 실험 기간 동안 DL 측정 하 여 얻은 결과 결과 시간이 지남에 개발 하는 두 주요 입자 분포 분수에 유체 입자 반지름의 상세한 진화를 보여줍니다. 실험의 첫 번째 부분에는 샘플은 천천히 증발, 높은 단백질 농도 달성 하기 위하여. 그림 5B같이 단백질 드롭 19.5 mg/mL에 14 mg/mL에서 집중 했다. 이 시간 동안, 그림 5A, radius 배포 패턴에 따라 단백질에서는 단위체 동작 솔루션 일정 한 입자 크기의 약 2.5 nm. 샘플은 더 이상 증발 되 고, 단위체 단백질 변성 또는 샘플 집계의 어떤 표시 없이 솔루션에서 안정적인 남아 있습니다.
단백질 드롭 precipitant 솔루션의 추가 즉시 샘플 증발 후에 시작 하 고 더 나은 시각화 (그림 5)에 대 한 radius 배포 패턴 및 균형 곡선에 회색으로 강조 표시 됩니다. 샘플 중량에서 파생 된 계산을 기반으로, 강조 표시 된 입자 분수 크리스탈 nucleation, 약 200-400 nm의 반지름 크기 결과의 개시에 기인 된다. (Nucleation 라고도 함)이이 현상은 실험 하 고 비례적의 개시에 약 23 분의 개시에서 약 66 분의 기간에 단백질 방울에 0.6 M의 precipitant 농도에서 시작 됩니다. 또한입니다. Precipitant 증가의 농도, 반경 배포 솔루션에서 입자의 광범위 한 배포를 보여 줍니다. 더 많은 핵 형성, 결정 초기 엔터티 800-1300 nm 사이의 radius 분포에 도달 하는 크기에서 성장 하 고. 그것은이 단계에서 결정 핵 성장, 계속 고 단백질 분수 가난한으로 단백질 분자는 찍은 업 microcrystals에 의해 점차 종결 될 수 있다. 단백질 드롭에서 precipitant 농도 천천히 증가, microcrystals의 형성은 때 radius 분포 500 및 1, 500 nm 사이 개발 하 고 쉽게 75 분 후 식별 됩니다. Radius 유통의 진화 또한 CCD 카메라 이미지, 어디 단백질 microcrystals 솔루션 (그림 7)에서 0.7 M의 precipitant 농도에서 볼 수 있습니다 의해 확인 된다. Precipitant 추가 완료 되 고 결정 화 방울 일정 하 게 유지 됩니다, 반경 배포 nucleation 이벤트의 일부 시간이 지남에 따라 감소 하는 동안 1, 000와 3000 nm 사이의 주된 단계를 표시 합니다. 이 순간, 결정 화 방울은 완전히 microcrystals 포화 그리고 더 nucleation 이벤트가 없습니다는 솔루션에 존재.
피드백 데이터는 중량에 의해 주어진 실험적인 입력으로 사용 하 여, 결정 화 단계 도표는 thaumatin 결정 화 과정의 포괄적인 이해를 위해 그려 했다. 그림 6, 실험 단계 다이어그램 thaumatin T. danielli microcrystals의 생산 THM_2 마이크로 결정 (프로토콜)으로 표시 됩니다 3 개의 독립적인 결정 화 실험을 보여줍니다. 두 가지 추가 결정 화 실험 레이블된 THM_1 매크로 결정 및 THM_3 매크로-크리스탈으로 사용 되었습니다 단계 도표에 다른 분야의 올바른 매핑을 하려면 데이터를 입력 (예., 가용성 또는 준 지역). 이후이 실험에 대 한 프로토콜 다른 결정 경로 따라, 따라서 더 정확 하 고 쉽게, nucleation 지역 식별이 된다. 각 실험에 대 한 결정 화 경로 강조 표시 됩니다 다른 접근을 강조 하는 주문 번호와 회색 화살표 대표 최종 단백질의 추정 하는 동안 특정 결과 대 한 사용 된 결정 화 단계 크리스탈 성장 uptakes 단백질 분자 형성의 잘 정의 된 솔루션에서 안정적인 단백질 결정 때 농도.
그림 6 에 제시 하는 3 개의 thaumatin 실험 nucleation 영역을 입력할 때 다른 정보를 표시 하 고 그것으로 따라서 다른 최종 결정 결과 단계 다이어그램 아래 사진에서 볼 수 있습니다. THM1 및 THM3, 단백질 해결책 nucleation 단계를 전달 하 고 재입력 한다 지역, 어디 결정 형태까지 달려있다. 따라서, 실험 어머니 주류에 의해 포위 하는 큰, 잘 정의 된 모양의 크리스탈 리드. 그러나, THM2_micro-크리스탈, 프로토콜 섹션에서 제시 하는 실험에 대 한 결정 화 경로 특정 접근을 다음과 같습니다. 이전 섹션에서 우리는 microcrystals에 게 샘플을 단백질 해결책 있다는 nucleation 위상에 깊은 nucleation 이벤트 최대 속도로 형성할 수 있도록 말 하였다. THM2_micro-크리스탈의 경우 precipitant 농도 단백질의 비율이 조정 되었습니다 같은 패션에 샘플 뿐만 아니라 nucleation 지역을 입력 하지만,는 비례적 추가 단백질 해결책에 추가 되는 조건에 이동 하지 않습니다 단계 도표에 다른 지역의 하지만 nucleation 지역 내에서 높은 포화 상태에 남아 있습니다. 결과적으로, 솔루션의 엔트로피 감소 크게으로 단백질 방울 즉시 작은 결정 엔터티와의 포화 된다.
그림 1입니다. 결정 화 실험의 도식 대표. 그리기 자동된 결정 화 실험 수행에 필요한 모든 기술 부분 결정 화 실험 챔버의 개요를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: DL에 대 한 소프트웨어 창 및 결정 화 실험에 대 한 관련 된 예제 매개 변수. 매개 변수는 온도, 상대 습도, 점도 등을 포함합니다.
그림 3: 결정 화 실험에 관련 된 마이크로 복용량 시스템 소프트웨어 제어 창. 기능 방울 또는 솔루션 스트림을 생성에 대 한 특정 매개 변수 조정을 허용합니다.
그림 4: 결정 화 단계는 실험에 관련 된 설명 일정 테이블에 대 한 소프트웨어 창. 결정 화 방울의 초기 조건 또한이 창에 통합 됩니다.
그림 5입니다. Thaumatin T. daniellii microcrystals 생산의 개요. (A) 전체 결정 화 과정에서 단백질 드롭에서 입자 크기의 반경 배포. (B) 실험 매개 변수 모니터 드 개요. 음모는 계산된 단백질 농도 (빨간 곡선) 및 precipitant 농도 (파란색 곡선) 단백질 방울 (검은색 곡선)의 무게에 대 한 시간이 지남에 진화를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 결과 결과 함께 T. danielli thaumatin에 대 한 실험 결정 화 단계 다이어그램. 모든 음모는 중량에 의해 주어진 피드백 정보에 따라 실험 데이터에서 파생 됩니다. 괄호 사이 표시 되는 숫자 각 실험에 순서와 단계 결정 프로토콜 중 수를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: THM2_Micro-크리스탈 (프로토콜) microcrystals 솔루션에서 포화의 풍부한 번호에 대 한 기록된 사진. 그림 4 h (240 분)에서 결정 화에 대 한 실험 실에서 단백질 방울을 설정한 후 찍은. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8: THM_1 매크로 결정 안정적인 솔루션에 몇 가지 큰 thaumatin 결정을 보여주는 대 한 기록된 사진. 그림 결정 화에 대 한 실험 실에서 단백질 드롭릿 설정 후 20 h 찍은. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 9: THM_3 매크로 결정 솔루션에서 thaumatin 결정의 다양 한 크기를 보여주는 대 한 기록된 사진. 그림 결정 화에 대 한 실험 실에서 단백질 드롭릿 설정 후 20 h 찍은. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 물질 | 몰/비율 | 시간 (s) |
| 물 | 0 | 100 |
| 물 | -25 | 2100 |
| 물 | 0 | 2100 |
표 1: 샘플 증발에 대 한 자동화 된 일정 입력 thaumatin microcrystals의 생산에서 단계.
| 물질 | 몰/비율 | 시간 (s) |
| 물 | 0 | 100 |
| prec | 0.8 | 1800 |
| 물 | 0 | 18000 |
표 2: precipitant 추가 대 한 자동화 된 일정 입력 단계 thaumatin의 생산에서 microcrystals.
Discussion
결정 화 장치 모니터링 하 고 수정 된 증기 확산 방법에 따라 결정 화 실험 동안 중요 한 매개 변수를 조작 하는 설계 되었습니다. 이 기술은 수 모니터링 하 고 사용자가 정확한 지식과 결정 화 단계 다이어그램을 통해 단백질 해결책의 제어를 사용 하는 모든 단계에서 단백질 결정 화 실험 점수 기반 현장에서 DL 분석 샘플 현 탁 액.
결정 화 장치 구성 실험 챔버 (그림 1)가 결정 화 방울의 실시간 모니터링을 허용 하는 CCD 카메라에 연결 됩니다. 카메라는 약 2.5 µ m의 최대 해상도 제공 하는 다른 확대 렌즈를 장착 하는 현미경에 적응. 실험 챔버의 핵심은 시간이 지남에 샘플 무게의 진화를 추적 하기 위한 磁 중량. 결정 화 절차 앉아 드롭 증기 확산 실험, 단백질 드롭은 중량에 시 coverslip에 배치 되는 위치에 해당 합니다. 중량 시간이 지남에 단백질과 비례적 농도의 즉시 계산 알고리즘을 정확 하 게 입력을 제공 precipitant 뿐만 아니라, 물/첨가제 추가, 또는 샘플 증발에 의해 발생 하는 작은 물방울의 무게 변화에 따라 . 또한, 중요 한 결정 화 온도 및 상대 습도 같은 매개 변수는 정확 하 게 모니터링 하 고 제어.
결정 화 실험을 수행 하기 위해 장치는 비례적와 물 또한 picoliter 규모에서 작동 (무료 압 전 펌프 문의) 두 마이크로 복용량 시스템을 갖추고 있습니다. 그런 적은 양의 물질을 사용 하 여 농도 기울기 및 단백질 방울 내의 대류 현상이 최소화 됩니다. 압 전 펌프의 주요 역할은 비례적 또는 물, 예를 들면 단백질 방울의 자연 증발에 대 한 보상으로 사용 되 고 후자. 마이크로-복용량 시스템 물질의 추가 지시할 수 있는 기능 집합이 있다. 같은 기능을 포함: 물질, 작은 물방울의 수 초, 너비 및 높이 물질 스트림 궤적 등의 추가 추가 하기 위한 반복 속도. 또한, 펌프의 위치 수 수동으로 조정할 수, 단백질 방울으로 물질의 추가 대 한 정확한 위치를 사용자를 사용.
결정 화 방울의 독특한 피드백 제어 조작 전체 실험 절차 동안 단백질 oligomeric 상태에서 가능한 한 변화를 보여줄 수 있는 DL 데이터 제자리에 의해 이루어집니다. 기술은 입자 크기 분포, 시간이 지남에 따라서 알 수 없는 단백질 관련 메커니즘을 드러내는의 지속적인 평가 허용 한다. DLS 광학 장비 허용 하는 coverslip 통과 고 제자리에서 패션; 단백질 방울을 통해 추가 검출기 및 레이저 빔 coverslip 영역 아래 전략적으로 배치 따라서,는 물방울 내에서 변경 내용만 DL 경로에서 기록 됩니다. 쉬운 취급을 허용 하려면 장치는 2 개의 구멍:는 사용자 마이크로 복용량 시스템의 촬영 위치를 조정할 수는 coverslip 및 제거 될 수 있는 최고 뚜껑의 최적의 위치 뿐 아니라 새로운 단백질 dro 정확도 설정에 대 한 정문 에 coverslip plet입니다.
위에서 언급 한 장치를 사용 하 여 대화형 결정 화 방법 단백질 결정의 크기 제어 생산에 대 한 신뢰할 수 있는 기술입니다. 많은 결정 화 방법이 현재 사용할 수 있지만, 내부는 결정 화에 대 한 정보 자체 메커니즘이 아니다 쉽게 달성. 일반적으로, 기존의 결정 화 방법을 적용 결정 화 단계 다이어그램의 실험 시작 되 면 그 과정을 변경만 몇 가지 가능성에 제한 된 제어를 솔루션의 수 있습니다. 결정 화를 수행 하는 동안 실험 하 고 지식의 거래 단계 다이어그램의 전환에 대 한 얻은 제자리에서 DL, 좋은 함께 이러한 자동된 결정 화 기술을 적용. 일반적으로 비정 질 침전 하 고 균질 nucleation 유도 지역 단계 다이어그램에서 서로 가까이 됩니다. 따라서, 그것의 입자 분포에 대 한 실시간 정보에 따라 결정 화 방울의 과정을 조작 하 여 그것은 점차 nucleation 쪽으로 결정 화 조건을 조정 하 여 단백질의 강 수를 피할 수 및 크리스탈 형성입니다.
요즘, 많은 결정 화 조건에는 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) 유도체는 광범위 하 게 존재 하는 precipitant 솔루션 포함 됩니다. 이러한 화합물은 보통 pipetting 또는 분배에 대 한 어려움을가지고 수 있는 점도 있다. 현재 사례 연구에서 precipitant 분배에 사용 되는 마이크로-복용량 시스템 picolitre 증가의 추가 가능 하 게 매우 얇은 모 세관을 적용 합니다. 결과적으로, 높은 점성 물질 작업에 몇 가지 제한이 있습니다. 지난 실험의 시리즈 내에서 시스템 다음 말뚝에서 파생 된을 사용 하 여 긍정적인 결과 부여 하고있다: PEG200 50%, PEG3000, PEG6000 20% 10%, PEG800010%. 지금까지 언급 한 솔루션만 테스트 했다, 비록 마이크로 복용량 시스템 솔루션의 점성을 줄이기 위하여 이용 될 수 있는 특별 한 난방 장치를 포함. 또 다른 요인은 단백질 precipitant로 사용 하는 경우 고려해 야 할 소금 솔루션입니다. 작은 금액 precipitant 추가; 동안 마이크로 정량 펌프의 피상적인 차단 일으키는 마이크로 복용량 시스템의 노즐에서 구체화 수 농축된 염을 작업할 때 경우에 매우 높은 상대 습도 실험 챔버에 존재 합니다. 이 문제를 해결 하려면 실험을 보류 노즐에서 소금을 제거 될 수 있도록 해야 합니다. 이 특수 처리가 필요할 수 있습니다 그리고 precipitant 추가 단계에서 오류를 생성할 수 있습니다.
이러한 자동화 된 결정 화 실험을 수행할 때 얻을 수 있는 귀중 한 정보를 바탕으로,이 기술은 확장할 수 있습니다 또한 단백질 결정의 물리 화학 측면을 조사 연구 하. Nucleation 및 크리스탈 성장 반응 속도 파생 하 고 온도, 입자 크기, 그리고 단백질의 성장 실험에서 묘사 하는 시간-의존 정보에 기반 하 고 precipitant를 계산 수 있는 키네틱 현상 농도입니다.
Disclosures
이로써 작가 아르네 메이어, Karsten 더크 스, 및 기독교 Betzel Xtal 개념 GmbH, 프로듀서 XtalController900 기술 회사의 주주가 선언 합니다.
Acknowledgments
저자는 유럽 연합의 수평선 2020 연구와 혁신 프로그램을 통해 BMBF 그랜트 05K16GUA는 "The 함부르크 센터에 대 한 초고속 지원과 마리 퀴리 Sklodowska 약어" X-프로브 "부여 계약 번호 637295에서 자금 인정 이미징-구조, 역학 및 제어 물질의 원자 규모에서 "우수 클러스터 도이치 가운데 (DFG)의.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | 1002365940 | Protein for protocol |
| Bis-Tris 14880 | Sigma-Aldrich | 2302377 | Buffer for protein solution |
| di-Sodium tartrate dihydrate | AppliChem | A0451,0500 | Precipitant for protein solution |
| Silliconized coverslips | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1051203 | Coverslips for crystallization |
| Syringe filter | Starstedt | 831826001 | Filter pore 0.2 µm |
| Syringe | Omnifix | 4617207V | Luer Lock Solo 20 mL |
| Paraffin oil | Sigma-Aldrich | 2323842 | Oil for coating the plate |
| Standard Terakasi plate | Sigma-Aldrich | M5812270EA | Plate for recovering the crystallization droplet |
| Soft wipes | KIMTECH Science | ||
| XtalController900 | Xtal-Concepts GmbH | XTC900 | Crystallization device |
References
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