Summary
Her presenterer vi en protokoll for kontrollert produksjon av protein microcrystals. Prosessen bruker en automatisert enhet slik at kontrollert manipulering av flere krystallisering parametere. Protein krystallisering er båret ut av kontrollert og automatiske tillegg krystallisering løsninger mens overvåking og undersøke radius fordelingen av partikler i krystallisering slippverktøyet.
Abstract
Automatisert krystallisering enheten er en patentert teknikk1 spesielt utviklet for å overvåke protein krystallisering eksperimenter med sikte på å manøvrere nøyaktig nucleation og krystall veksten mot ønskede størrelsene av protein krystaller. Kontrollert krystallisering er basert på prøven granskingen i situ dynamisk lys spredning (DLS) mens alle visuelle endringer i slippverktøyet overvåkes online ved hjelp av et mikroskop kombinert til en CCD kamera, dermed muliggjør full undersøkelse av protein slippverktøyet under alle faser av krystallisering. Bruk av i situ DLS mål gjennom hele eksperimentet lar en nøyaktig identifikasjon av svært overmettet protein løsningen overgangen til en ny fase-dannelsen av krystall kjerner. Ved å identifisere protein nucleation scenen, kan krystallisering optimaliseres fra store protein krystaller til produksjon av protein microcrystals. Eksperimentell protokollen viser en interaktiv krystallisering tilnærming basert på nøyaktige automatiserte trinn som precipitant tillegg, fordampning for indusere høy supersaturation, og prøve fortynning for å senke indusert homogen nucleation eller reversere fase overganger.
Introduction
De siste årene, har veksten av protein mikro- og nanokrystaller fanget oppmerksomheten av protein-krystallografi samfunnet, spesielt med kontinuerlig utvikling av føljetong Femtosecond krystallografi (SFX). Glansen av romanen X-ray stråling kilder og basert på de vellykkede resultatene så langt, produksjon av protein mikro - og nanokrystaller har blitt av høy relevans, poserer en høy etterspørsel om utarbeidelse av slike krystallinsk suspensjoner 2 , 3. på grunn av det lite krystall størrelse-området kreves for datainnsamling på gratis elektron lasere (XFELs) og den begrensede tilgjengeligheten av eksperimentell beamtime, prøve karakterisering før datainnsamlingen er viktig. De fleste vanlig teknikkene å karakterisere protein mikro- eller nanocrystal suspensjoner er inntil nå elektronmikroskop og X-ray pulver Diffraksjon.
Så langt har flere tilnærminger blitt tilpasset fra vanlige krystallisering metoder med sikte på å produsere bulk mengder protein krystaller med dimensjoner i området liten mikrometer. Metoden satsvise brukes til rask blanding av høy konsentrert protein og precipitant løsninger, dermed tvinge prøve løsningen til en svært overmettet fase der nanocrystallization kan være favoriserte4. Andre metoder inkluderer knusing store protein krystaller for å danne en krystall slurry, som kan tjene som nanocrystalline suspensjoner som skal brukes for data samling5. Men kan resultatene noen ganger resultere i redusert Diffraksjon kvalitet, som forverret krystaller har lavere innbyrdes rekkefølge. Nanocrystallization basert på gratis grensesnitt spredning er også et tilgjengelig alternativ, der protein løsning er lagt i små mengder til svært konsentrert precipitant løsning3. Blant alle teknikker vises imidlertid de mest effektive metodene satsvise krystallisering og mer innovative manipulerende teknikker med damp-diffusjon metoder i sittende drops6.
Generelt for krystallisering av et protein må en energi barriere krysses for å støtte nucleation - termodynamisk steg i krystall-formasjonen. For å flytte den protein-løsningen fra en thermodynamically stabil tilstand til supersaturation og til slutt for å indusere en fase-overgang, noen variabler knyttet til protein løsningen må endres. Slike variabler er vanligvis konsentrasjonen av protein løsningen, miljøendringer (f.eks., temperatur, fuktighet), løsemiddel egenskaper (f.eks, pH, ionisk styrke), konsentrasjon og buffer egenskaper, etc.7 ,8 oversikt over eksempel parametere som kan endres representeres vanligvis med fase diagrammer, som tillater forskjellige moduser av presentasjonen, for eksempel løselighet diagrammer, nucleation fase diagrammer eller enda mer detaljert beskrivelser hvor tredimensjonale eller mer komplekse diagrammer kan komme i betraktning8,9,10. De mest tiltalende diagramtypene fase er vanligvis todimensjonale, der den viktigste variabelen er protein konsentrasjonen som en funksjon av en annen parameter, mens de gjenværende parameterne holdes konstant6,11. Når en eller noen få kjerner er dannet, kan større krystaller vokse ved å ta opp ekstra protein fra bulk løsning. Når mikro - og nanocrystal, er en slik vanlig krystallisering tilnærming ikke mulig lenger på grunn av lite antall krystaller som finnes i løsningen. Nanocrystalline suspensjoner har vanligvis å være rik i krystallinsk enheter, dermed krystallisering veien må justeres, slik at det er en maxima nucleation hendelsesforløpet i utvalget. I følge krever dette etterforskning av noen nye, inntil nå uutforsket nucleation trasé for proteiner, som også er ennå ikke fullt ut forstått12,13. Basert på fase diagrammet grunnleggende nevnt tidligere, klassisk teorien har blitt utvidet til en ny hypotese, der nucleation er beskrevet som en to-trinns mekanisme: først en overgang til en høyere protein konsentrasjon foregår (tett væske fase) og andre, en overgang fra en tett-rik fase til en høyere innbyrdes rekkefølge (krystall kjerner med gitter arkitektur)14,15,16. Protein krystallisering er følsom for mange faktorer, og derfor når krystallisering oppskrifter er readjusted for å resultere i forskjellige størrelser krystaller, oppskrifter kan alltid stole på forkunnskaper. Ny innsikt må etableres for hvert individuelle protein mål: justering av buffer komposisjon, renhet og stabilitet av eksempel, nøyaktig kunnskap om protein løselighet, etc.
Dynamisk lysspredning er i dag veletablert metode for analyse og optimalisering av protein krystallisering prosesser grunnet en størrelse-rekke partikler som kan undersøkes: fra monomerisk proteiner til nanokrystaller og små microcrystals. Metoden utnytter at partikler i løsningen gjennomgå Brownsk bevegelse og at gjennomsnittlige hastigheten av denne bevegelsen bestemmes av partikkelstørrelse, termisk energi og viskositet medium og partikkel geometrien. Først, er det flytende mediet opplyst av en sammenhengende lyskilde med bruk av en laser. Lys spredt av partikler danner en interferens mønster. Fordi partikler i fast bevegelse endres Forstyrrelsen mønsteret også permanent. Når du ser i en bestemt retning, kan intensitet svingninger observeres. Disse svingningene er nå viser partikkel bevegelsen forårsaket av Brownsk bevegelse. Fra målt intensitet svingningene beregnes en autokorrelasjon funksjon (ACF). En analyse av ACF vil gi et mål for hastighet distribusjon (mer presist diffusjon koeffisient) partikler og ved hjelp av Stokes-Einstein ligning, konverteres til en partikkel radius distribusjon17. Tilleggsinformasjon om DLS funksjonalitet og Arbeidsprinsipp kan finnes i ulike publikasjoner og bøker18,19.
Her vi bruker og beskrive en unik automatisert krystallisering enhet, XtalController900, en oppgradert versjon av XtalController teknologi6, nettopp utviklet for å overvåke interaktive protein krystallisering eksperimenter. Denne teknikken viser et høyt potensial for identifikasjon og sporing av nucleation hendelser i sanntid, slik at en presis manøvrering gjennom krystallisering fase diagrammet. Målet med denne bestemte krystallisering prosedyren er å optimalisere protein krystallisering for å få høykvalitets protein mikro- og nanokrystaller som er egnet for applikasjoner som bruker micro-fokusert synchrotron X-ray kilder, elektron Diffraksjon, eller SFX.
Protocol
Merk: Gjennom hele protokollen, mikro-dosering systemet brukes for tilsetting av vann vil bli referert til som Pump0 mens mikro-dosering systemet brukes for tillegg av precipitant vil bli kalt Pump1. Resultatet av dette eksperimentet vil være ytterligere diskutert og omtales som THM2_micro-krystaller.
1. parametere og løsning oppsett
- Filtrere 16 mL Na-Tartrate løsning (1,2 M) og 16 mL destillert vann bruke filtere 0,2 µm sterile sprøyter.
Merk: Na-tartrate løsningen representerer den precipitant løsningen for krystallisering eksperimentet. - Fyll precipitant og vann flasker med 5 mL av filtrerte løsninger.
Merk: Flaskene har en maksimal kapasitet på 5 mL. - Montere flasker i pumpen innehaverne av eksperimentelle chamber.
- Angi eksperimentelle parametere i vinduet programvare til følgende verdier: temperatur på 20 ° C, relativ fuktighet på 20, og løsemiddel som vann.
Merk: Figur 2 viser visningsvinduet der brukeren kan sette inn riktige verdier for hver parameter som temperatur, relativ fuktighet og løsemidler. Vinduet programvare viser også noen ekstra parametre som tilsetningsstoffer. Dette er bare viktig for eksperimenter hvor tilsetningsstoffer finnes i precipitant løsningen. - Åpne døra til eksperimentelle kammeret og fjern dekkglassvæske transportøren.
- Plasser en ren og silikoniserte dekkglassvæske på holderen og sett den tilbake i enheten.
NOTE Dekkglassvæske har en størrelse på 2,2 cm. - Lukk det eksperimentelle kammeret å sikre miljøforholdene fra trinn 1.4.
Merk: Protokollen kan pauses her.
2. micro-dosering systemer justering
- Skru ON Pump0 bruker viktigste pumpe egenskaper i Figur 3 og opprette en vannstråle.
Merk: Vann stream banen opprettes basert på noen pumpe egenskaper som kan justeres. Figur 3 viser den viktigste pumpe egenskaper og optimale verdiene som skal brukes for dette eksperimentet. - Justere vannet bekken satsing posisjon mot midten av dekkglassvæske av manuell betje sin utpekte justeringsskruen. Bytte av Pump0.
- Skru ON Pump1 og lage en flytende strøm som tidligere gjort i trinn 2.1. Justere strømmen plasseringen av Pump1 mot plasseringen fast for Pump0. Bytte av Pump1.
- Erstatte den brukte dekkglassvæske med et nytt og rent for krystallisering eksperimentet.
Merk: Myk kluter anbefales vanligvis for rengjøring av nye dekkglassvæske fra gjenværende støv, før den brukes i krystallisering eksperimentet.
3. sette en Thaumatin nedgang i eksperimentell kammeret
- Opprette en ny eksperimentell fil med programvarepakken. Angi følgende informasjon i filen eksperimentelle: protein (thaumatin fra Thaumatococcus daniellii), protein konsentrasjon (14 mg/mL), precipitant (Na-Tartrate) og precipitant konsentrasjon (1,2 M).
Merk: Denne informasjonen vil tjene for automatiske beregninger av precipitant og protein konsentrasjon under krystallisering eksperimentet. - Last filen for nye forsøk for å aktivere all informasjon fra trinn 3.1.
- Merke posisjonen av protein slippverktøyet ved å legge en liten vanndråpe med Pump0.
Merk: Målet er å lage en liten vanndråpe som skal fungere som et landemerke som protein prøven vil bli plassert. - Trykk på knappen Tare angi vekt gitt av microbalance til null.
Merk: Dette vil fjerne vekten av dekkglassvæske og den ekstra vekten lagt til av små vann landemerket opprettet i trinn 3.3. - Åpne det øvre lokket på eksperimentell kammeret og Pipetter 8 µL thaumatin løsning på vann landemerke.
- Registrere nye thaumatin drop etter neste kommandoene.
- Trykk ny slippe å tillegge den første vilkår fra experimental filen.
- Trykk på knappen Const å kompensere naturlig fordampning av vann fra droplet.
- Sjekk med CCD kameraet hvis Pump0 er satsing i protein rullegardinmenyen. Justere plasseringen av Pump0 hvis vannet bekken sikter utenfor slippe.
Merk: Fra dette øyeblikk fremover, protein slippverktøyet vil forbli på en konstant vekt, av automatiserte vann tillegg som kompenserer for naturlig fordampning fra protein slippverktøyet. Vekten av protein slippverktøyet, samt de andre parameterne som temperaturen og luftfuktigheten overvåkes i sanntid i vinduet displayet. Eksperimentet kan pauses her.
4. i Situ DLS målinger
- Slå på DLS laser og plassere laserstrålen i protein rullegardinmenyen ved manuelt bruker justeringen skruene.
- Angi følgende DLS parametere: måling varighet (60 s), ventetid mellom to målinger (10 s), og antall mål (300).
Merk: Første 30 målene vil tjene som referanse mål for protein stabilitet-sjekk. Resten av målene vil tjene som en full gransking av protein slippverktøyet under den totale lengden på krystallisering prosessen. - Trykk på knappen Start å starte DLS målinger. Sjekk kvaliteten på prøven ved å velge ett av DLS grafiske representasjoner.
Merk: Utvalget skal vise en høy grad av mono-dispersity, uten noen aggregater i løsningen. DLS resultatene kan vises og leses som: radius distribusjon, radius histogrammet, radius tomten, målinger Sammendrag, eller som en oversikt over antall rate intensiteten.
5. eksempel fordampning trinn
- Skriv inn betingelsene for fordampning trinn i plan-tabellen med dataene vist i tabell 1.
Merk: Tegn "-" i kolonnen "Molarity/prosentpoeng" i den andre raden representerer tap av vann fra protein slippverktøyet, mens verdien "25" betyr at slippverktøy volumet vil lide en reduksjon på 25%. Dette betyr at protein konsentrasjonen av slippverktøyet vil øke med 25%. - Aktivere eksempel fordampning trinn ved å trykke på knappen Autom. Trykk Stop når prøven fordampning trinnet er ferdig.
- Aktivere knappen Const å holde drop konstant etter avsluttet eksempel fordampning.
6. precipitant tillegg steg
- Angi betingelsene for precipitant tillegg steg i plan-tabellen vises i Figur 4 bruke oppgitt i tabell 2.
Merk: Den første raden i tabellen representerer en kalibrering trinn, der programvaren beregner den naturlige Fordampningshastighet av protein slippverktøyet basert på mengden av precipitant som skal legges til protein slippverktøyet. Programvaren extrapolates denne verdien, og justerer automatisk skyting frekvensen for Pump0 for å automatisk kompensere vannet fordamper for neste precipitant tillegg trinn. - Aktivere precipitant tillegg steg ved å trykke på knappen Autom.
NOTE Addisjonen av precipitant er en automatisert prosess, etter inndataene fra tabellen tidsplan.
7. spore utviklingen av krystallisering slippverktøyet Over tid
- Kontrollere utseendet på thaumatin krystaller ved hjelp CCD kameraet.
- Kontrollere størrelsesDistribusjon partikkel ved hjelp DLS grafiske representasjoner.
- Kontrollere utviklingen av vekt og eksperimentelle parametere ved hjelp visningsvinduet.
Merknad: Når Na-tartrate løsningen når en konsentrasjon av 0.74 M i protein rullegardinmenyen, slippverktøyet blir rik på thaumatin mikro-krystaller som vist i figur 7.
8. utvinning av krystallisering slippverktøy
- Lag en feilfri målestokk Terasaki plate med parafinolje.
- Legge 3 mL parafinolje til platen.
- Spre parafinolje på plate brønnene forsiktig flytting platen med forskjellige vinkler slik at oljen dekker alle 72 brønnene av platen.
- Fjerne overflødig parafin olje ved å helle ut oljen som flyter på tallerkenen.
- Trykk på Stopp til slutt krystallisering eksperimentet. Forsiktig ta ut eksempel transportøren som inneholder krystallisering slippverktøyet.
- Med bruk av en pipette, plassere et volum på 2 µL dele krystallisering drop i brønnene av Terasaki plate.
Merk: Ved å utvinne krystallisering slippverktøyet i en plate under olje, prøven kan regelmessig kontrolleres for stabilitet og krystall veksten med bruk av mikroskop eller andre DLS teknikker som fungerer med standard Terasaki plater.
Representative Results
Resultatene av DLS målinger under krystallisering eksperimentet viser en detaljert utvikling av etter particle radier resulterer i to viktigste partikkel distribusjon fraksjoner, som utvikler seg over tid. I den første delen av eksperimentet, ble prøven sakte fordampet, for å oppnå en høyere protein konsentrasjon. Som vist i figur 5B, ble protein fall konsentrert fra 14 mg/mL til 19,5 mg/mL. Samtidig etter radius fordelingsmønster i figur 5A, protein viser en monomerisk oppførsel i løsning med en konstant partikkelstørrelse på ca 2,5 nm. Som eksemplet er blir ytterligere fordampet, forblir monomerisk protein stabil i løsning, uten tegn på rødsprit eller prøve aggregering.
Tillegg av precipitant løsning til protein drop er umiddelbart startet etter eksempel fordampning og merket med grå i radius fordelingen mønster og balanse kurvene for bedre visualisering (figur 5). Basert på beregninger fra prøven vekten, tilskrives uthevede partikkel brøken initiering av krystall nucleation, noe som resulterer i en radius størrelse på ca 200-400 nm. Dette fenomenet (kjent som nucleation) startes i en precipitant konsentrasjon av 0.6 M i protein slippverktøyet, i en periode på ca 66 min fra initiering av eksperimentet og ca 23 min i forhold til oppstart av precipitant tillegg. Som konsentrasjonen av precipitant øker viser radius fordelingen en bred distribusjon av partikler i løsningen. Som flere kjerner danner, første krystallinsk enheter vokser i størrelse, nådde en radius fordeling mellom 800-1300 nm. Det kan konkluderes at på dette stadiet, crystal kjerner fortsetter å vokse, og protein fraksjon blir gradvis dårligere som protein molekyler er tatt opp av microcrystals. Som precipitant konsentrasjonen i protein rullegardinmenyen øker sakte, er dannelsen av microcrystals lett identifiseres etter 75 min, når radius fordelingen fortsetter å utvikle mellom 500 og 1500 nm. Utviklingen av radius fordelingen er også bekreftet av CCD kamerabilder, der protein microcrystals er synlige i en precipitant konsentrasjon av 0,7 M i løsning (figur 7). Precipitant tillegg er ferdig og krystallisering drop holdes konstant, viser radius fordelingen en dominerende fase mellom 1000 og 3000 nm, mens brøkdel av nucleation hendelser avtar over tid. I dette øyeblikk, krystallisering drop er fullstendig mettet med microcrystals og ingen ytterligere nucleation hendelser er tilstede i løsningen.
Bruker som eksperimentelle tilbakemeldingene gitt av microbalance, ble en krystallisering fase diagrammet trukket for en omfattende forståelse av thaumatin krystallisering prosessen. I figur 6viser eksperimentelle fasen diagrammet tre uavhengige krystallisering eksperimenter, hvor produksjonen av thaumatin T. danielli microcrystals er merket som THM_2 mikro-krystaller (Protocol). To ekstra krystallisering eksperimenter merket THM_1 makro-krystaller og THM_3 makro-krystaller har vært brukt som legger inn data for å få riktig tilordning av de ulike områdene i fase diagrammet (f.eks., løselighet eller metastable område). Siden protokollene for disse eksperimentene følger forskjellige krystallisering veier, blir identifikasjon av regionen nucleation enklere, og dermed mer nøyaktig. For hver eksperimentet er krystallisering banen markert med tallene for å fremheve de ulike tilnærmingene og antall krystallisering trinn som ble brukt for et bestemt resultat, mens grå pilene representerer en vurdering av siste protein konsentrasjon når krystall veksten uptakes protein molekyler fra løsning i dannelsen av veldefinerte stabil protein krystaller.
Tre thaumatin eksperimenter i figur 6 viser ulike forhold ved angivelse nucleation regionen, og dermed ulike siste krystallisering resultater som det kan sees fra bildene nedenfor fase diagrammet. THM1 og THM3, den protein-løsningen passerer nucleation fasen og inn regionen metastable, der den hviler inntil krystaller form. Følgelig føre eksperimenter til store, veldefinerte formet krystaller omgitt av mor brennevin. Men for eksperimentet presentert i delen protokollen THM2_micro-krystaller, følger krystallisering banen en bestemt tilnærming. I forrige avsnitt nevnte vi at et eksempel å gi microcrystals, protein løsningen må plasseres dypt i nucleation fase, slik at nucleation hendelsene kan danne med en maksimal hastighet. Ved THM2_micro-krystaller, forholdet protein precipitant konsentrasjon ble justert på en slik måte at prøven ikke bare inn nucleation regionen, men som en precipitant legges ytterligere protein løsningen, og forholdene flyttes ikke til en annen region i fase diagrammet, men forblir i en svært overmettet tilstand i nucleation regionen. Resultatet reduseres entropien i løsningen drastisk som protein slippverktøyet blir umiddelbart mettet med små krystallinsk enheter.
Figur 1. Skjematisk fremstilling av krystallisering eksperimentet. Tegningen viser en oversikt over krystallisering eksperimentelle kammeret med alle tekniske deler kreves for å utføre et automatisert krystallisering eksperiment. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: vinduet for Distribusjonslister og eksempel parametere som er relevante for en krystallisering eksperiment. Parametere inkluderer temperatur, relativ fuktighet, viskositet, etc.
Figur 3: programvare kontrollvinduet for mikro-dosering systemer involvert i krystallisering eksperimentet. Funksjonene tillater justering av bestemte parametere for generering av dråper eller løsning stream.
Figur 4: vinduet for tidsplan tabellen beskriver krystallisering trinnene involvert i forsøket. Den første vilkår av krystallisering slippverktøyet er også integrert i dette vinduet.
Figur 5. Oversikt over thaumatin T. daniellii microcrystals produksjon. (A) Radius distribusjon av partikkelstørrelse i protein rullegardinmenyen under hele krystallisering prosessen. (B) Overvåkte oversikt over eksperimentell parametere. Tomter representerer utviklingen over tid for vekten av protein slippverktøyet (svart kurve) beregnet protein konsentrasjon (rød kurve) og precipitant konsentrasjon (blå kurve). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: eksperimentell krystallisering fase diagrammet for thaumatin T. danielli sammen med de resulterende utfallene. Alle tomtene er avledet fra eksperimentelle data, basert på tilbakemelding informasjon gitt av microbalance. Tallene knyttet til hvert eksperiment som vises mellom klammeparentesene representerer rekkefølgen og antall trinn tatt under en krystallisering protokoll. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: innspilt bilde for THM2_Micro-krystaller (Protocol) viser et rikt antall microcrystals mettet i løsning. Bildet ble tatt på 4 h (240 min) etter protein slippverktøyet i eksperimentell kammeret for krystallisering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: innspilte fotografi til THM_1 makro-krystaller viser noen store thaumatin krystaller stabil i løsning. Bildet ble tatt 20 h etter protein slippverktøyet i eksperimentell kammeret for krystallisering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9: innspilte fotografi til THM_3 makro-krystaller viser ulike størrelser av thaumatin krystaller i løsning. Bildet ble tatt 20 h etter protein slippverktøyet i eksperimentell kammeret for krystallisering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Stoff | Molarity/prosent | Tid (s) |
| vann | 0 | 100 |
| vann | -25 | 2100 |
| vann | 0 | 2100 |
Tabell 1: Automatisert tidsplan inngang for eksempel fordampning trinn i produksjonen av thaumatin microcrystals.
| Stoff | Molarity/prosent | Tid (s) |
| vann | 0 | 100 |
| presedens | 0,8 | 1800 |
| vann | 0 | 18000 |
Tabell 2: automatisert tidsplan inndata for precipitant tillegg trinn i produksjonen av thaumatin microcrystals.
Discussion
Krystallisering enheten er utviklet for å overvåke og manipulere avgjørende parametere under en krystallisering eksperimentet basert på en modifisert damp-diffusjon metode. Denne teknikken kan overvåke og scoring et protein krystallisering eksperiment i alle stadier, slik at brukeren kan ha kunnskap og kontroll av protein løsningen gjennom krystallisering fase diagrammet basert på i situ DLS analyse for eksempel suspensjon.
Krystallisering enheten består av en eksperimentell kammer (figur 1) koblet til en CCD kamera som lar real-time overvåkning av krystallisering slippverktøyet. Kameraet er tilpasset et mikroskop utstyrt med forskjellige forstørrelse linser, gir en maksimal romlig oppløsning på omtrent 2,5 µm. Kjernen i eksperimentell kammeret er en ultrasensitive microbalance for å spore utviklingen av prøven vekten over tid. Krystallisering prosedyren tilsvarer et sittende-slipp damp-diffusjon eksperiment, der protein drop er plassert på en silikoniserte dekkglassvæske, som er plassert på microbalance. Basert på vekt endringer av slippverktøyet, som er forårsaket av precipitant tillegg, vann/additiv tillegg eller prøve fordampning, gir microbalance en presis inngang til en algoritme for umiddelbar beregning av protein og precipitant konsentrasjon over tid . I tillegg viktig krystallisering parametre som temperatur og relativ luftfuktighet nettopp overvåkes og kontrolleres.
For å utføre en krystallisering eksperiment, er enheten utstyrt med to mikro-dosering systemer (kontakt gratis piezoelectric pumper) som arbeider på picoliter skala for precipitant og vann tillegg. Ved å arbeide med slike små mengder substans, minimeres konsentrasjon graderingene og konveksjon fenomenet i protein slippverktøyet. Hovedrollen piezoelectric pumpene er tillegg av precipitant eller vann, sistnevnte for eksempel brukes som erstatning for naturlig fordampning av protein slippverktøyet. Mikro-dosering systemer har en rekke funksjoner, som kan diktere tillegg av et stoff. Disse funksjonene omfatter: gjentakelseshastigheten for å legge til en substans, antall dråper lagt per sekund, bredden og høyden av stoffet strømmen bane, etc. Videre kan plasseringen av pumpene justeres manuelt, slik at brukeren kan ha en nøyaktig posisjon for tillegg av stoffer i protein slippverktøyet.
Unik tilbakemelding kontrollert manipulering av krystallisering drop oppnås ved i situ DLS data, som viser mulige endringer i protein oligomeric staten gjennom hele eksperimentelle prosedyren. Teknikken gjør konstant evaluering av partikkel størrelsesDistribusjon over tid, dermed avslører ukjent protein-relaterte mekanismer. DLS optikk utstyret er plassert strategisk under dekkglassvæske området, slik at detektor og laser strålen passere gjennom dekkglassvæske og videre gjennom protein slippverktøyet i en i situ mote; Derfor registreres bare endringene innen slippverktøyet fra DLS banen. For å tillate enkel håndtering, enheten har to åpninger: en inngangsdør for en optimal plassering av dekkglassvæske og en topp lokk som kan fjernes, slik at brukeren kan justere skyte posisjon av mikro-dosering systemer samt angi nøyaktig en ny protein dro PLET på dekkglassvæske.
Metoden interaktiv krystallisering med nevnte enhet er en pålitelig teknikk for størrelse-kontrollerte produksjon av protein krystaller. Selv om mange krystallisering metoder er tilgjengelige, innsideinformasjon om krystallisering er mekanismen i seg selv ikke lett oppnåelig. Generelt, kan anvende konvensjonelle krystallisering metoder bare begrenset kontroll over en løsning i krystallisering fase diagrammet med bare noen få muligheter til å endre kurs når et eksperiment har startet. Når du utfører en krystallisering eksperimenter og bruke slik en automatisert krystallisering teknologi kombinert med i situ DLS, en stor mengde kunnskap oppnås om overganger i fase diagrammet. Generelt, er regionene amorfe utløse og induksjon av homogen nucleation nær hverandre i fase diagrammet. Derfor, ved å manipulere i løpet av en krystallisering dråpe basert på sanntidsinformasjon om partikkel distribusjon, er det mulig å unngå nedbør av et protein ved å justere gradvis krystallisering forholdene mot nucleation og krystall-formasjonen.
I dag, omfatter mange krystallisering tilstandene precipitant løsninger hvor polyetylenglykol (PEG) derivater er allment tilstede. Slike forbindelser har vanligvis en høy viskositet som kan ha vanskeligheter for pipettering eller utlevering. Sak studien gjelder mikro-dosering systemene som brukes for den precipitant dispensing svært tynn kapillærene som gjør tillegg av picolitre trinn mulig. Som konsekvensen, finnes det noen begrensninger i arbeidet med svært tyktflytende stoffer. I en siste eksperimenter, systemet har gitt positive resultater med den følgende PEG derivater: PEG200 50%, PEG3000 20%, PEG6000 10% PEG800010%. Selv så langt bare nevnte løsningene er testet, inneholder mikro-dosering systemene en spesiell oppvarming mekanisme som kan brukes for å redusere viskositeten av en løsning. En annen faktor er salt løsninger som må vurderes når det brukes som protein precipitant. Når du arbeider med svært konsentrert salter, kan litt utkrystallisere ved munnstykket av mikro-dosering system, forårsaker overfladisk blokkering av mikro-dosering pumpen under precipitant tillegg; selv når luftfuktigheten er svært høy finnes i eksperimentell kammeret. For å overvinne problemet, må eksperimentet settes på vent slik at salt fra munnstykket kan fjernes. Dette kan kreve spesialbehandling kan gi feil i precipitant tillegg fase.
Basert på verdifull informasjon som kan oppnås når slike automatisert krystallisering eksperimenter, kan denne teknikken også utvides til studier undersøker Fysikalsk kjemi aspekter av protein krystallisering. Reaksjon nucleation og krystall vekstratene er kinetisk fenomener som kan være avledet og beregnet basert på tid-hvordan informasjonen skildres et eksperiment som temperatur, partikkelstørrelse, og protein og precipitant konsentrasjon.
Disclosures
Vi erklærer herved at forfatterne Arne Meyer, Karsten Dierks og Christian Betzel er aksjonærene i selskapet Xtal-konsepter GmbH, produsent av XtalController900 teknologi.
Acknowledgments
Forfatterne bekrefter finansiering fra EUs horisonten 2020 forskning og innovasjon programmet under Marie Sklodowska-Curie Acronym "X-Probe" Grant avtalen nr 637295 og støtte via BMBF grant 05K16GUA, og den "The Hamburg sentrum for lynraske Imaging-struktur, dynamikk og kontroll av saken i Atomic skalaen"excellence klynge av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | 1002365940 | Protein for protocol |
| Bis-Tris 14880 | Sigma-Aldrich | 2302377 | Buffer for protein solution |
| di-Sodium tartrate dihydrate | AppliChem | A0451,0500 | Precipitant for protein solution |
| Silliconized coverslips | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1051203 | Coverslips for crystallization |
| Syringe filter | Starstedt | 831826001 | Filter pore 0.2 µm |
| Syringe | Omnifix | 4617207V | Luer Lock Solo 20 mL |
| Paraffin oil | Sigma-Aldrich | 2323842 | Oil for coating the plate |
| Standard Terakasi plate | Sigma-Aldrich | M5812270EA | Plate for recovering the crystallization droplet |
| Soft wipes | KIMTECH Science | ||
| XtalController900 | Xtal-Concepts GmbH | XTC900 | Crystallization device |
References
- Xtal Concepts GmbH, Germany . Patent "Vorrichtung und Verfahren zur Kontrolle der Kristallisation". , EP 2 588 649 (11754824.8) and US 9,284,659 B2 (2010).
- Chapman, H. M., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
- Kupitz, C., Grotjohann, I., Conrad, C. E., Roy-Chowdhury, S., Fromme, R., Fromme, P. Microcrystallization techniques for serial femtosecond crystallography using photosystem II from Thermosynechococcuselongatus as a model system. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 369 (1647), 20130316 (2014).
- Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. IUCrJ. 2 (2052-2525), 246-255 (2015).
- Stevenson, H. P., et al. Use of transmission electron microscopy to identify nanocrystals of challenging protein targets. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (23), 8470-8475 (2014).
- Meyer, A., et al. Single-drop optimization of protein crystallization. Acta. Crystallogr. Sect. F. Biol. Cryst. Commun. 68 (Pt 8), 994-998 (2012).
- Ferré-D'Amaré, A. R. Crystallization of Biological Macromolecules. 5 (7), Cold Spring Harbor Laboratory Press. 847-848 (1999).
- Asherie, N. Protein crystallization and phase diagrams. Methods. 34 (3), 266-272 (2004).
- Sauter, C., Lorber, B., Kern, D., Cavarelli, J., Moras, D., Giege, R. Crystallogenesis studies on yeast aspartyl-tRNAsynthetase: use of phase diagram to improve crystal quality. Acta. Cystallogr. D. Biol. Crystallogr. 55 (Pt 1), 149-156 (1999).
- Ewing, F., Forsythe, E., Pusey, M. Orthorhombic lysozyme solubility. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 50 (Pt 4), 424-428 (1994).
- Saridakis, E. E. G., Steward, P. D. S., Lloyd, L. F., Blow, D. M. Phase diagram and dilution experiments in the crystallization of carboxypeptidase G2. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 50 (Pt 3), 293-297 (1994).
- McPherson, A., Cudney, B. Optimization of crystallization conditions for biological macromolecules. Acta. Crystallogr. F. Struct. Biol. Commun. 70 (Pt 11), 1445-1467 (2014).
- Sleutel, M., Van Driessche, A. E. S. Role of clusters in nanoclassical nucleation and growth of protein crystals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (5), 546-553 (2014).
- Schubert, R., Meyer, A., Baitan, D., Dierks, K., Perbandt, M., Betzel, C. Real-time observation of protein dense liquid cluster evolution during nucleation in protein crystallization. Cryst. Growth Des. 17 (3), 954-958 (2017).
- Vekilov, P. G. The two-step mechanism of nucleation of crystals in solution. Nanoscale. 2 (11), 2346-2357 (2010).
- Vekilov, P. G. Dense liquid precursor for the nucleation of ordered solid phases from solution. Crystal Growth & Design. 4 (4), 671-685 (2004).
- Dierks, K., Meyer, A., Einspahr, H., Betzel, C. Dynamic light scattering in protein crystallization droplets: adaptations for analysis and optimization of crystallization processes. Cryst. Growth Des. 8 (5), 1628-1634 (2008).
- Schubert, R., et al. Reliably distinguishing protein nanocrystals from amorphous precipitate by means of depolarized dynamic light scattering. J. Appl. Cryst. 48, 1476-1484 (2015).
- Brown, W. Dynamic light scattering: the method and some applications. , Clarendon Press: Oxford. ISBN-13: 978-0198539421 978 (1993).
