Summary
نقدم هنا بروتوكولا للإنتاج الخاضع للرقابة للبروتين ميكروكريستالس. تقوم العملية باستخدام جهاز الآلي يسمح للتلاعب التي تسيطر عليها لبلورة العديد من المعلمات. تبلور البروتين هو نفذتها الخاضعة للرقابة والآلي بالإضافة لبلورة الحلول أثناء الرصد والتحقيق في دائرة نصف قطرها توزيع الجسيمات في الحبرية تبلور.
Abstract
الجهاز الآلي التبلور هو تقنية براءة اختراع1 لا سيما المتقدمة لرصد التجارب تبلور البروتين بهدف التحديد المناورة التنو ونمو البلورات نحو الأحجام المطلوبة من بلورات البروتين. تبلور التي تسيطر عليها يستند إلى عينة التحقيق في عين المكان ونثر الضوء الحيوي (DLS) بينما يتم رصد كل التغييرات المرئية في الحبرية على الإنترنت بمساعدة المجهر بالإضافة إلى كاميرا CCD، مما مكن كامل تحقيق الحبرية البروتين خلال جميع مراحل التبلور. يسمح استخدام القياسات في الموقع DLS طوال كامل التجربة تعريف دقيق للحل الأرضية العالية البروتين الانتقال إلى مرحلة جديدة – تشكيل نواة الكريستال. بتحديد مرحلة التنو البروتين، يمكن أن يكون الأمثل البلورة من بلورات البروتين الكبيرة لإنتاج البروتين ميكروكريستالس. بروتوكول تجريبي يبين بلورة تفاعلية نهج يستند إلى الخطوات الآلي الدقيقة مثل مرسب الإضافة، تبخر الماء لحمل سوبيرساتوريشن عالية، وتمييع عينة للتباطؤ الناجم عن نويات متجانسة أو عكس مسار المرحلة الانتقالية.
Introduction
على مدى السنوات القليلة الماضية، استحوذت نمو البروتين المشاريع المتناهية الصغر ونانوكريستالس انتباه المجتمع البروتين-علم البلورات، لا سيما مع التطور المستمر لعلم البلورات Femtosecond التسلسلي (SFX). بسبب تألق الأشعة السينية رواية مصادر الإشعاع واستنادا إلى النتائج الناجحة التي تحققت حتى الآن، إنتاج البروتين الصغرى وأصبحت نانوكريستالس ذات أهمية عالية، مما يشكل ارتفاع طلب على إعداد مثل هذا التعليق البلورية 2 , 3-سبب كريستال صغيرة الحجم-النطاق المطلوبة لجمع البيانات في ليزر الإلكترون الحر (إكسفيلس) ومحدودية بيمتيمي التجريبية، وصف العينة قبل جمع البيانات أمر ضروري. الأساليب الأكثر شيوعاً لتوصيف البروتين تعليق المشاريع المتناهية الصغر أو نانوكريستال حتى الآن الميكروسكوب الإلكتروني وحيود الأشعة السينية مسحوق.
حتى الآن، قد تم تكييف عدة نهج من أساليب بلورة مشتركة بهدف إنتاج كميات الجزء الأكبر من بلورات البروتين مع الأبعاد في نطاق صغير ميكرومتر. يتم استخدام الأسلوب دفعة لخلط سريع من البروتينات المركزة ومرسب الحلول، وبالتالي فرض الحل عينة إلى مرحلة الأرضية العالية التي قد تكون فيها نانوكريستاليزيشن يفضل4. وتشمل أساليب أخرى سحق البلورات البروتينية الكبيرة لتشكيل الطين كريستال، التي يمكن أن تكون بمثابة تعليق خوصات التي ستستخدم ل جمع البيانات5. ومع ذلك، أحياناً قد يؤدي النتائج في حيود انخفاض الجودة، كبلورات تدهور النظام الداخلي أقل. نانوكريستاليزيشن استناداً إلى نشر واجهة مجانية أيضا بديل متاح، حيث يتم إضافة حل البروتين بكميات صغيرة إلى حل مرسب مركزة للغاية3. بيد أنه يبدو الأساليب الأكثر فعالية بين جميع التقنيات، بلورة دفعة وأكثر تقنيات التلاعب مبتكرة باستخدام أساليب نشر بخار في الجلوس قطرات6.
وبصفة عامة، لبلورة البروتين يجب أن عبرت حاجز الطاقة لدعم نويات-الخطوة الأولى في تشكيل الكريستال دينامي حراري. من أجل نقل الحل البروتين من دولة مستقرة [ثرمودنميكلي] إلى سوبيرساتوريشن وأخيراً للحث مرحلة انتقال، بعض المتغيرات ذات الصلة بحل البروتين تحتاج إلى تعديل. هذه المتغيرات هي عادة ما تركز حل البروتين، والتغيرات البيئية (على سبيل المثال-، درجة الحرارة والرطوبة)، خصائص المذيبات (مثلاً، الرقم الهيدروجيني، قوة الأيونية)، خصائص تركيز والمخزن المؤقت، إلخ7 ،8 عادة تمثل لمحة عامة عن عينة المعلمات التي يمكن تغييرها عن طريق مخططات المرحلة، التي تسمح لأنماط مختلفة من العرض التقديمي، مثل القابلية للذوبان في المخططات أو الرسومات التخطيطية لمرحلة التنو حتى أكثر تفصيلاً وصف فيها مخططات ثلاثية الأبعاد أو أكثر تعقيداً يمكن أن تأتي إلى النظر في8،،من910. أنواع الرسومات التخطيطية للمرحلة الأكثر جاذبية عادة ما تكون ثنائية الأبعاد، حيث المتغير الرئيسي هو تركيز البروتين كدالة لمعلمة أخرى، في حين يتم الاحتفاظ المعلمات المتبقية مستمر6،11. حالما يتم تشكيل نواة واحدة أو عدد قليل، يمكن أن تنمو بلورات أكبر بتناول البروتين الإضافي من حل الجزء الأكبر. عندما تهدف لإنتاج نانوكريستال والصغرى، نهجاً تبلور تقليدية ليس ممكناً بعد الآن نظراً للعدد الصغير من البلورات الموجودة في الحل. عادة ما يكون معلقات خوصات أن تكون غنية في الكيانات البلورية، وبالتالي مسار تبلور يجب أن يمكن تعديلها، مثل أن يكون هناك ماكسيما التنو الأحداث الموجودة في العينة. ونتيجة لذلك، يتطلب هذا التحقيق بعض جديدة، حتى الآن غير مستكشفة التنو مسارات للبروتينات، والتي هي أيضا حتى الآن غير مفهومة تماما12،13. استناداً إلى أسس رسم تخطيطي للمرحلة المذكورة سابقا، النظرية الكلاسيكية قد مددت إلى فرضية جديدة، حيث يرد وصف التنو كآلية خطوتين: أولاً، انتقال إلى أعلى تركيز بروتين يأخذ مكان (كثافة السائل المرحلة) والثانية، وانتقال من مرحلة الغني بكثافة إلى أعلى نظام داخلي (نويات كريستال مع بنية شعرية)14،،من1516. تبلور البروتين حساس للعديد من العوامل، وذلك عندما يتم تعديل وصفات التبلور ينتج بلورات مختلفة الحجم، الوصفات لا يمكن دائماً الاعتماد على المعرفة السابقة. رؤى جديدة تحتاج إلى إنشاء لكل هدف البروتين الفردية: تعديل تكوين المخزن المؤقت والنقاء والاستقرار المعارف عينة ودقة للذوبان في البروتين، إلخ.
تشتت الضوء الحيوي هو اليوم طريقة راسخة للتحليل والتحسين من عمليات تبلور البروتين، نظراً لحجم مجموعة واسعة من الجزيئات التي يمكن أن تحقق: من البروتينات أحادي نانوكريستالس وميكروكريستالس الصغيرة. الأسلوب الذي يستغل خضوع البراونية الجسيمات في الحل، وأن متوسط سرعة هذه الحركة يتحدد حجم الجسيمات، من الطاقة الحرارية، واللزوجة المتوسطة وهندسة الجسيمات. في البداية، مضاءة المتوسطة السائل بمصدر ضوء متماسك باستخدام الليزر. على ضوء متناثرة في جزيئات تشكيل نمط تدخل. لأن الجزيئات في حركة دائمة أيضا تغيير نمط التدخل بشكل دائم. عندما تبحث في اتجاه معين، يمكن ملاحظة شدة التقلبات. يتم عرض هذه التقلبات الآن حركة الجسيمات الناتجة عن الحركة البراونية. ويحسب من تقلبات قياس كثافة دالة ترابط تلقائي (ACF). تحليلاً للجوع سوف تعطي مقياسا لتوزيع السرعة (معامل نشر مزيد من الدقة) الجسيمات وعن طريق استخدام المعادلة ستوكس-اينشتاين، يتم تحويلها إلى توزيع جسيمات نصف قطرها17. يمكن الاطلاع على معلومات إضافية تتعلق بوظائف دائرة الأراضي والمساحة، ومبدأ العمل في مختلف المنشورات والكتب18،19.
هنا يمكننا تطبيق ووصف جهاز بلورة إليه فريدة من نوعها، XtalController900، نسخة مطورة من إكستالكونترولير التكنولوجيا6، وضعت تحديداً لرصد التجارب تبلور البروتين التفاعلي. ويبين هذا الأسلوب عالية المحتملة لتحديد وتعقب الأحداث التنو في الوقت الحقيقي، مما يسمح المناورة الدقيقة من خلال الرسم التخطيطي مرحلة التبلور. ويهدف هذا الإجراء خاصة تبلور الأمثل تبلور البروتينات للحصول على جودة عالية البروتين الصغرى ونانوكريستالس التي مناسبة للتطبيقات استخدام مصادر الأشعة السينية السنكروتروني تركز على الصغير، حيود الإلكترونات، أو سفاكس.
Protocol
ملاحظة: في جميع أنحاء كامل البروتوكول، نظام الجرعات الصغيرة المستخدمة لإضافة المياه سوف يشار إليها باسم Pump0 بينما سيطلب النظام الجزئي-الجرعة المستخدمة لإضافة مرسب Pump1. سوف تناقش نتائج هذه التجربة كذلك والمشار إليها كبلورات THM2_micro.
1-المعلمات وإعداد الحل
- تصفية 16 مل نا طرطرات الحل (1.2 متر) و 16 مل من الماء المقطر استخدام عامل تصفية المحاقن معقمة 0.2 ميكرون.
ملاحظة: يمثل الحل طرطرات نا الحل مرسب لبلورة التجربة. - ملء مرسب وزجاجات المياه مع 5 مل الحلول التي تمت تصفيتها.
ملاحظة: قد الزجاجات سعة 5 مل كحد أقصى. - جبل الزجاجات في حوامل مضخة الدائرة التجريبية.
- تعيين معلمات التجريبية في إطار البرنامج إلى القيم التالية: درجة الحرارة 20 درجة مئوية، والرطوبة النسبية في 20، ومذيب كالماء.
ملاحظة: ويبين الشكل 2 عرض نافذة حيث يمكن للمستخدم إدراج القيم الصحيحة لكل معلمة مثل درجة الحرارة والرطوبة النسبية، والمذيبات. يظهر إطار البرنامج أيضا بعض معلمات إضافية مثل المواد المضافة. هذا مهم فقط للتجارب التي تتواجد فيها إضافات في الحل مرسب. - فتح الباب الأمامي من قاعة التجريبية وإزالة الناقل ساترة.
- مكان ساترة سيليكونيزيد ونظيفة على الناقل ووضعه مرة أخرى في الجهاز.
ملاحظة: قد ساترة حجم 2.2 سم. - إغلاق قاعة تجريبية لتأمين ظروف بيئية من الخطوة 1، 4.
ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.
2-تعديل أنظمة مايكرو-الجرعة
- التبديل على Pump0 الرئيسية باستخدام مضخة الخصائص في الشكل 3 ، وخلق تيار مياه.
ملاحظة: يتم إنشاء مسار تيار المياه استناداً إلى بعض خصائص المضخة التي يمكن تعديلها. ويبين الشكل 3 خصائص المضخة الرئيسية والقيم المثلى التي ينبغي أن تستخدم لهذه التجربة. - ضبط تيار المياه تهدف موقف نحو المركز ساترة التي تعمل به المسمار التكيف المعينة يدوياً. التبديل قبالة Pump0.
- التبديل على Pump1 وخلق تيار سائل كما سبق القيام به في الخطوة 2، 1. ضبط موضع تيار Pump1 نحو موقف ثابت ل Pump0. التبديل قبالة Pump1.
- استبدال ساترة المستخدمة مع جديدة ونظيفة واحد للتجربة التبلور.
ملاحظة: عادة ما ينصح بمناديل ناعمة لتنظيف ساترة جديدة من الغبار المتبقي، قبل المستخدمة في التجربة تبلور.
3-وضع قطره ثوماتين في قاعة التجريبية
- قم بإنشاء ملف تجريبي جديد باستخدام حزمة البرامج. أدخل المعلومات التالية في ملف تجريبي: البروتين (ثوماتين من دانييلي ثوماتوكوككوس) وتركيز البروتين (14 ملغ/مل) ومرسب (غ-طرطرات)، وتركيز مرسب (1.2 متر).
ملاحظة: هذه المعلومات سيعمل للحسابات الآلي لتركيز البروتين ومرسب خلال التجربة بالتبلور. - تحميل ملف تجربة جديدة لتنشيط جميع المعلومات من الخطوة 3.1.
- وضع علامة على موضع الحبرية البروتين بإضافة قطره ماء صغيرة باستخدام Pump0.
ملاحظة: الهدف هو إنشاء قطره ماء صغيرة التي ستكون بمثابة معلما التي سوف توضع العينة البروتين. - اضغط على الزر الفارغ لتعيين الوزن الذي يعطي قبل ميكروبالانسي إلى الصفر.
ملاحظة: هذا سيزيل وزن ساترة والوزن الزائد أضيفت من قبل المعلم المياه الصغيرة التي تم إنشاؤها في الخطوة 3، 3. - افتح الغطاء العلوي من قاعة التجريبية و "الماصة؛" 8 ميليلتر ثوماتين الحل التاريخي المياه.
- سجل انخفاض ثوماتين الجديدة باتباع الأوامر التالية.
- اضغط على الزر جديد إسقاط سمة الشروط الأولية من ملف تجريبي ل.
- اضغط على زر Const لتعويض التبخر الطبيعي للماء من الحبرية.
- تحقق مع كاميرا CCD إذا تهدف إلى Pump0 في إسقاط البروتين. إعادة ضبط موضع Pump0 إذا كانت تهدف إلى مجرى المياه خارج القطرة.
ملاحظة: من هذه اللحظة فصاعدا، الحبرية البروتين ستبقى في وزن ثابت، بإضافة المياه الآلي الذي يعوض عن تبخر المياه الطبيعية من البروتين الحبرية. يمكن مراقبة وزن الحبرية البروتين، فضلا عن معايير أخرى مثل درجة الحرارة والرطوبة النسبية في الوقت الحقيقي باستخدام إطار العرض. يمكن أن يكون مؤقتاً التجربة هنا.
4-القياسات في الموقع DLS
- التبديل على DLS الليزر ووضع شعاع الليزر في انخفاض البروتين باستخدام مسامير التسوية يدوياً.
- أدخل المعلمات التالية DLS: قياس مدة (60 s)، وقت الانتظار بين القياسات اثنين (10 ق)، وعدد من القياسات (300).
ملاحظة: القياسات أولاً 30 سيكون بمثابة القياسات المرجعية للاستقرار-التحقق من البروتين. باقي القياسات ستكون بمثابة إجراء تحقيق كامل في الحبرية البروتين خلال الطول الإجمالي لعملية التبلور. - اضغط على زر ابدأ لبدء القياسات DLS. التحقق من جودة العينة عن طريق تحديد أحد تمثيلات رسومية DLS.
ملاحظة: يجب أن تظهر العينة على درجة عالية من مونو-ديسبيرسيتي، دون أي المجاميع في الحل. يمكن أن تظهر نتائج DLS وقراءة ك: توزيع نصف قطرها، الرسم البياني دائرة نصف قطرها، ارسم دائرة نصف قطرها، وقياسات موجزة، أو كنظرة عامة على كثافة معدل العد.
5-عينة خطوة التبخر
- أدخل الشروط للخطوة التبخر في الجدول الجدول باستخدام البيانات الموجودة في الجدول 1.
ملاحظة: العلامة "-" عرض في العمود "مولاريتي/النسبة المئوية" في الصف الثاني يمثل خسارة المياه من الحبرية البروتين، في حين أن قيمة "25" يعني أن حجم القطرة سوف تعاني انخفاضا بنسبة 25%. وهذا يعني أن تركيز البروتين الحبرية سيزيد بنسبة 25 في المائة. - تفعيل خطوة تبخر العينة عن طريق الضغط على زر الاكترونيك. اضغط على زر إيقاف عند الانتهاء من هذه الخطوة تبخر العينة.
- قم بتنشيط الزر Const للحفاظ على الانخفاض مستمر بعد وقف تبخر العينة.
6-مرسب إضافة خطوة
- أدخل الشروط لخطوة إضافة مرسب في الجدول الجدول الزمني المبين في الشكل 4 باستخدام البيانات الواردة في الجدول 2.
ملاحظة: الصف الأول من الجدول يمثل خطوة معايرة، خلالها البرنامج يحسب معدل التبخر الطبيعي من البروتين الحبرية استناداً إلى مقدار مرسب التي قد تضاف إلى الحبرية البروتين. البرنامج يستنبط هذه القيمة وتلقائياً بضبط وتيرة إطلاق النار على Pump0 بغية تعويض تبخر المياه لإضافة مرسب الخطوة التالية تلقائياً. - تنشيط هذه الخطوة إضافة مرسب بالضغط على زر الاكترونيك.
ملاحظة: إضافة مرسب عملية تلقائية، بعد الإدخال من جدول الجدول الزمني.
7-تتبع تطور الحبرية تبلور على مر الزمن
- تحقق من ظهور بلورات ثوماتين باستخدام الكاميرا اتفاقية مكافحة التصحر.
- تحقق توزيع حجم الجسيمات باستخدام تمثيلات رسومية DLS.
- تحقق تطور الوزن ومعلمات تجريبية باستخدام إطار العرض.
ملاحظة: عندما يصل الحل طرطرات نا بتركيز م 0.74 في انخفاض البروتين، يصبح الحبرية غنية بالبلورات الصغيرة ثوماتين كما هو موضح في الشكل 7.
8-استرداد تبلور الحبرية
- معطف صفيحة تيرازاكي نظيفة قياسية مع زيت البارافين.
- أضف 3 مل زيت البارافين اللوحة.
- تفريق زيت البارافين في الآبار لوحة بلطف تحريك اللوحة في زوايا مختلفة حيث أن الزيت يغطي جميع الآبار 72 من اللوحة.
- إزالة فائض زيت البارافين بصب الزيت الذي يطفو على اللوحة.
- اضغط على زر إيقاف للانتهاء من بلورة التجربة. أخرج بعناية الناقل عينة تحتوي على بلورة الحبرية.
- مع استخدام ماصة، وضع وحدة تخزين 2 ميليلتر مختبرين لإسقاط تبلور في آبار لوحة تيرازاكي.
ملاحظة: باسترجاع الحبرية تبلور في صفيحة تحت النفط، العينة يمكن بشكل دوري التحقق لاستقرار ونمو البلورات بالاستخدام مجهر أو التقنيات DLS الأخرى التي تعمل مع معيار تيرازاكي لوحات.
Representative Results
تظهر النتائج التي حصل عليها القياسات DLS خلال التجربة ببلورة تطورا مفصلة لإنصاف أقطار الجسيمات هيدرودينامية أسفر عن الجسيمات الرئيسية هما توزيع الكسور التي تتطور مع مرور الوقت. في الجزء الأول من التجربة، تبخرت العينة كان ببطء، بغية تحقيق أعلى تركيز بروتين. كما هو موضح في الشكل 5 (ب)، وانخفاض البروتين كان مركزة من 14 ملغ/مل إلى 19.5 ملغ/مل. خلال هذا الوقت، وفقا لنمط توزيع دائرة نصف قطرها في الشكل 5A، يظهر البروتين أحادي وسلوك في الحل مع حجم جسيمات مستمر لما يقرب من 2.5 نانومتر. كما يجري كذلك يتبخر العينة، البروتين أحادي لا تزال مستقرة في الحل، دون أي علامات تمسخ أو تجميع العينة.
إضافة حل مرسب لانخفاض البروتين فورا بدأت بعد تبخر العينة وأبرزت مع غراي في دائرة نصف قطرها التوزيع منحنيات التوازن ونمط للتصور أفضل (الشكل 5). استناداً إلى الحسابات المستمدة من وزن العينة، تعزى الكسر الجسيمات المميزة للشروع في نويات كريستال، أسفر عن حجم دائرة نصف قطرها حوالي 200-400 نانومتر. هذه الظاهرة (المعروفة باسم نويات) يتم البدء بتركيز 0.6 م مرسب في الحبرية البروتين، في فترة زمنية من حوالي 66 دقيقة من البدء التجربة وحوالي 23 دقيقة فيما يتعلق بالشروع في مرسب علاوة على ذلك. كما أن تركيز هذه الزيادات مرسب، يبين توزيع دائرة نصف قطرها توزيع واسع للجسيمات في الحل. كما تشكل أنوية أكثر، الأولى البلورية الكيانات تتزايد في الحجم، التوصل إلى توزيع نصف قطرها بين 800-1,300 شمال البحر الأبيض المتوسط. يمكن استنتاج أنه في هذه المرحلة، الأنوية كريستال لا تزال تنمو، والكسر البروتين يصبح تدريجيا أكثر فقراً كما الجزيئات البروتينية هي اتخاذ المتابعة من قبل ميكروكريستالس. كما أن تركيز مرسب في إسقاط البروتين يزيد ببطء، تشكيل ميكروكريستالس هو التعرف عليها بسهولة بعد 75 دقيقة، عندما تواصل توزيع نصف قطرها بين 500 و 1500 نانومتر. تطور توزيع نصف قطرها تؤكده أيضا صور الكاميرا اتفاقية مكافحة التصحر، حيث تكون مرئية بتركيز مرسب 0.7 متر ميكروكريستالس البروتين في الحل (الشكل 7). الانتهاء من إضافة مرسب وإسقاط تبلور تظل ثابتة، ويبين توزيع نصف قطرها مرحلة الغالبة بين 1,000 و 3000 نانومتر، بينما جزء صغير الأحداث التنو تتضاءل مع مرور الوقت. في هذه اللحظة، قطره تبلور مشبعة تماما مع ميكروكريستالس وأية أحداث نويات أخرى موجودة في الحل.
تستخدم كمدخل تجريبي البيانات ملاحظات قدمها في ميكروبالانسي، رسم تخطيطي مرحلة تبلور الانتباه لفهم شامل لعملية تبلور ثوماتين. في الشكل 6، يوضح المخطط المرحلة التجريبية ثلاث تجارب التبلور المستقل، حيث يسمى إنتاج ثوماتين دانييلي ت. ميكروكريستالس ك THM_2 الصغرى-بلورات (البروتوكول). تجربتين بلورة إضافية المسمى THM_1 الماكرو-بلورات و THM_3 الماكرو-بلورات قد استخدمت كإدخال البيانات بغية تعيين صحيح من مناطق مختلفة في الرسم التخطيطي للمرحلة (على سبيل المثال-، الذوبان أو منطقة يتواجد). منذ بروتوكولات لهذه التجارب تتبع مسارات التبلور مختلفة، يصبح تحديد منطقة التنو أسهل، ومن ثم أكثر دقة. لكل تجربة، وهو أبرز مسار تبلور بالأرقام لكي تؤكد على النهج المختلفة وعدد من بلورة الخطوات التي تم استخدامها لتحقيق نتائج محددة، بينما تمثل الأسهم الرمادية تقدير البروتين النهائي التركيز عند كريستال نمو الجزيئات البروتينية جرعات من الحل في تشكيل المعالم مستقرة البلورات البروتينية.
ثلاث تجارب ثوماتين المعروضة في الشكل 6 تظهر ظروف مختلفة عند دخول منطقة نويات، ونتائج مختلفة ومن ثم تبلور النهائي كما تبينه الصور أدناه رسم تخطيطي للمرحلة. وفي حالة THM1 و THM3، الحل البروتين يمر في مرحلة التنو وإعادة دخول المنطقة يتواجد، حيث أنها تقع على حتى شكل بلورات. ونتيجة لذلك، التجارب التي تؤدي إلى بلورات على شكل كبيرة ومحددة تحديداً جيدا محاطة بالخمور الأم. ومع ذلك، يتبع مسار تبلور في التجربة المعروضة في المقطع بروتوكول، THM2_micro-بلورات، نهج معين. في مقطع سابق ذكرنا أن عينة لإعطاء ميكروكريستالس، حل البروتين قد تقع عميقا في مرحلة التنو، حتى أنه يمكن أن تشكل الأحداث التنو بمعدل الحد أقصى. في حالة THM2_micro-بلورات، تعديل نسبة البروتين إلى تركيز مرسب بهذه طريقة أن العينة لا يدخل المنطقة نويات، ولكن كذلك إضافة مرسب للحل البروتين، والشروط التي لا تنتقل إلى منطقة أخرى في الرسم التخطيطي للمرحلة، لكن تظل في حالة الأرضية العالية داخل منطقة نويات. كنتيجة لذلك، يتناقص الانتروبيا الحل جذريا كما الحبرية البروتين يصبح مشبعة فورا مع كيانات صغيرة بلورية.
رقم 1. التمثيل التخطيطي لبلورة التجربة. الرسم يظهر لمحة عامة عن الدائرة التجريبية تبلور مع جميع الأجزاء التقنية المطلوبة لإجراء تجربة تبلور الآلي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: نافذة البرنامج لدائرة الأراضي والمساحة ومعلمات النموذج ذات الصلة لتجربة تبلور. معلمات تشمل درجة الحرارة والرطوبة النسبية، واللزوجة، إلخ.
الشكل 3: نافذة التحكم برمجيات لنظم الجرعات الصغيرة المشاركة في التجربة التبلور. تسمح الميزات تعديل معلمات محددة للجيل من قطرات أو تيار الحل.
الشكل 4: نافذة البرنامج للجدول جدول يصف بلورة الخطوات المتبعة في التجربة- كما تتكامل الشروط الأولية لبلورة الحبرية في هذا الإطار.
الشكل 5. نظرة عامة على ثوماتين دانييلي ت. ميكروكريستالس الإنتاج. (أ) نصف قطر توزيع حجم الجسيمات في إسقاط البروتين أثناء عملية بلورة كاملة. (ب) نظرة عامة يتم معلمات التجريبية. القطع تمثل التطور على مر الزمن لوزن الحبرية البروتين (المنحنى الأسود) إلى جانب تركيز البروتين المحسوبة (المنحنى الأحمر) وتركيز مرسب (المنحنى الأزرق). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: الرسم التخطيطي للمرحلة تبلور التجريبية ثوماتين ت. دانييلي جنبا إلى جنب مع النتائج الناجمة عن ذلك. قطع جميع مستمدة من البيانات التجريبية، استناداً إلى ردود فعل المعلومات المعطاة من قبل ميكروبالانسي. تمثل الأرقام المنسوبة لكل تجربة تظهر بين قوسين بالترتيب والعدد من الخطوات التي اتخذت خلال بروتوكول تبلور. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 7: الصورة المسجلة لبلورات THM2_Micro (بروتوكول) عرض إعداد وفيرة من ميكروكريستالس المشبعة في الحل- التقطت الصورة في 4 ح (240 دقيقة) بعد تعيين الحبرية البروتين في قاعة تجريبية لبلورة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 8: صورة مسجل ل THM_1 الماكرو-بلورات عرض بضع بلورات ثوماتين كبيرة مستقرة في الحل- لقد التقطت الصورة ح 20 بعد تعيين الحبرية البروتين في قاعة تجريبية لبلورة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 9: صورة مسجل ل THM_3 الماكرو-بلورات عرض أحجام مختلفة من بلورات ثوماتين في الحل- لقد التقطت الصورة ح 20 بعد تعيين الحبرية البروتين في قاعة تجريبية لبلورة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| مادة | مولاريتي/النسبة المئوية | الوقت (s) |
| المياه | 0 | 100 |
| المياه | -25 | 2100 |
| المياه | 0 | 2100 |
الجدول 1: إدخال الجدول الآلي لتبخر عينة خطوة في إنتاج ميكروكريستالس ثوماتين.
| مادة | مولاريتي/النسبة المئوية | الوقت (s) |
| المياه | 0 | 100 |
| التفاضلي | 0.8 | 1800 |
| المياه | 0 | 18000 |
الجدول 2: إدخال الجدول الآلي لإضافة مرسب خطوة في إنتاج ثوماتين ميكروكريستالس-
Discussion
تم تصميم الجهاز التبلور لرصد والتعامل مع المعلمات حاسمة خلال تجربة تبلور استناداً إلى أسلوب نشر بخار معدلة. هذا الأسلوب يتيح الرصد والتهديف تجربة تبلور بروتين في جميع المراحل، مما يتيح للمستخدم لمعرفة دقيقة والسيطرة لحل البروتين طوال مرحلة تبلور الرسم التخطيطي، استناداً إلى في الموقع تحليل DLS تعليق عينة.
ويتألف الجهاز تبلور دائرة تجريبية (الشكل 1) متصل بكاميرا CCD يتيح الرصد في الوقت الحقيقي لبلورة الحبرية. الكاميرا تكييف مجهر مجهزة بعدسات تكبير مختلفة، توفير حل مكانية قصوى لما يقرب من 2.5 ميكرون. جوهر الدائرة التجريبية ميكروبالانسي أولتراسينسيتيفي لتتبع تطور وزن العينة بمرور الوقت. الإجراء تبلور يناظر تجربة الجلوس-قطره بخار-نشر، حيث يتم وضع انخفاض البروتين في ساترة سيليكونيزيد، التي يتم وضعها على ميكروبالانسي. استناداً إلى التغيرات الوزن من الحبرية، التي هي سبب مرسب إضافة أو إضافة الماء/مضافة أو تبخر العينة، ميكروبالانسي يعطي مدخلاً دقيقة إلى خوارزمية لحساب فوري لتركيز البروتين ومرسب على مر الزمن . وباﻹضافة إلى ذلك، المعلمات بلورة هامة مثل درجة الحرارة والرطوبة النسبية دقة رصد وتسيطر.
من أجل إجراء تجربة تبلور، مجهز الجهاز مع اثنين من أنظمة الجرعة الصغرى (اتصل بمضخات كهرضغطية مجاناً) التي تعمل في نطاق بيكوليتير لإضافة مرسب والمياه. من خلال العمل مع مثل هذه الكميات الصغيرة من المواد، يتم تصغير التدرجات تركيز وظاهرة الحمل الحراري داخل الحبرية البروتين. أن الدور الرئيسي للمضخات كهرضغطية هو إضافة مرسب أو المياه، فعلى سبيل المثال تستخدم كتعويض عن التبخر الطبيعي من الحبرية البروتين. وقد نظم الجرعات الصغيرة مجموعة من الميزات التي يمكن أن تملي إضافة مادة. تتضمن هذه الميزات: معدل التكرار لإضافة مادة، أضيف عدد قطرات الواحدة والثانية، والعرض والارتفاع لمسار تيار الجوهر، إلخ. وعلاوة على ذلك، موقف المضخات يمكن يدوياً تعديل، مما يتيح للمستخدم أن يكون موقفا دقيقا لإضافة المواد إلى الحبرية البروتين.
ردود الفعل فريدة من نوعها تسيطر التلاعب بإسقاط تبلور يتحقق عن طريق في الموقع DLS البيانات، التي يمكن أن تظهر التغييرات المحتملة في حالة oligomeric البروتين طوال الإجراءات التجريبية بأكملها. يسمح الأسلوب التقييم المستمر لتوزيع حجم الجسيمات مع مرور الوقت، مما يكشف عن الآليات المتعلقة بالبروتين غير معروف. يتم وضع معدات البصريات DLS استراتيجيا أسفل منطقة ساترة، والسماح لشعاع الليزر وكاشف يمر ساترة وكذلك عن طريق الحبرية البروتين بطريقة في الموقع ؛ ولذلك، يتم تسجيل التغييرات فقط داخل الحبرية عن طريق دائرة الأراضي والمساحة. للسماح لسهولة التعامل، الجهاز يحتوي على فتحتين: باب الأمامي للموضع الأمثل ساترة وعلى غطاء العلوي الذي يمكن إزالته، حيث أنه يمكن للمستخدم ضبط موقف إطلاق النار نظم الجرعات الصغيرة، فضلا عن الإعداد بدقة درو بروتين جديد بليت في ساترة.
الأسلوب تبلور التفاعلية باستخدام الجهاز المذكور أعلاه تقنية موثوقة للتحكم في حجم الإنتاج من البلورات البروتينية. على الرغم من أن العديد من بلورة الأساليب المتاحة حاليا، داخل معلومات حول البلورة الآلية نفسها لا يمكن تحقيقها بسهولة. بشكل عام، تطبيق الأساليب التقليدية تبلور يسمح سوى سيطرة محدودة للتوصل إلى حل في الرسم التخطيطي لمرحلة التبلور، مع إمكانيات قليلة فقط تغيير مجراه وقد بدأت تجربة مرة واحدة. أثناء أدائهم لبلورة التجربة وتطبيق هذه تكنولوجيا تبلور الآلي يقترن في الموقع DLS، عظيم اكتساب قدر من المعارف حول التحولات في الرسم التخطيطي للمرحلة. وبصفة عامة، المناطق مما يؤدي إلى ترسبات غير متبلور واستحثاث التنو متجانسة قريبة من بعضها البعض في الرسم التخطيطي للمرحلة. ذلك، عن طريق التلاعب في مجرى معالجة تجميعية تبلور استناداً إلى المعلومات في الوقت الحقيقي حول توزيع الجسيمات، فمن الممكن تجنب ترسيب البروتين عن طريق تعديل شروط تبلور اتجاه التنو تدريجيا و تشكيل الكريستال.
في الوقت الحاضر، تشمل العديد من بلورة شروط الحلول مرسب فيها مشتقات البولي إثيلين غليكول (شماعة) موجودة على نطاق واسع. عادة ما تكون هذه المركبات من لزوجة عالية التي يمكن أن تمتلك صعوبات بالنسبة بيبيتينج أو الاستغناء عن. في دراسة الحالة الراهنة، تطبيق نظم الجرعات الصغيرة التي يتم استخدامها لصرف مرسب الشعيرات الدموية رقيقة جداً التي تجعل من الممكن إضافة زيادات بيكوليتري. نتيجة لذلك، توجد بعض القيود في العمل مع المواد عالية اللزوجة. ضمن سلسلة من التجارب الماضية، النظام قد أعطى نتائج إيجابية باستخدام مشتقات شماعة التالية: PEG200 50%، PEG3000 20%، PEG6000 10%، PEG800010%. على الرغم من أن حتى الآن تم اختبار فقط الحلول المذكورة أعلاه، يتضمن نظم الجرعات الصغيرة إليه تدفئة خاصة التي يمكن استخدامها لتقليل اللزوجة من الحل. وهناك عامل آخر هو الملح الحلول التي يتعين النظر فيها عند استخدامها مرسب البروتين. عند العمل مع أملاح عالية التركيز، كمية صغيرة يمكن أن تتبلور في فوهة نظام الجرعة الصغرى، مما تسبب في عرقلة سطحية مضخة الجرعة الصغرى أثناء إضافة مرسب؛ حتى عندما تكون رطوبة النسبية عالية جداً الحاضرين في القاعة التجريبية. للتغلب على هذه المشكلة، يلزم التجربة يتم تأجيلها بحيث أنه يمكن إزالة الملح من الفوهة. وهذا قد تتطلب معالجة خاصة، وقد تنتج أخطاء في مرحلة إضافة مرسب.
استناداً إلى المعلومات القيمة التي يمكن تحقيقها عند إجراء مثل هذه التجارب تبلور الآلي، كما يمكن توسيع هذه التقنية لدراسات التحقيق في الجوانب الكيمياء الفيزيائية لبلورة البروتينات. معدلات رد فعل نمو نويات وكريستال هي الظواهر الحركية التي يمكن أن تستمد وتحسب على أساس المعلومات الاعتماد على الوقت يصور من تجربة مثل درجة الحرارة، ونمو حجم الجسيمات، والبروتين ومرسب التركيز.
Disclosures
ونحن نعلن أن الكتاب أرني ماير وديريك كارستن بيتزيل المسيحية حملة أسهم شركة شتال-مفاهيم GmbH، منتج للتكنولوجيا XtalController900.
Acknowledgments
الكتاب نعترف بتمويل من أفق 2020 البحث الاتحاد الأوروبي في والابتكار برنامج تحت رقم اتفاق منحة ماري سكلودوفسكا كوري المختصر "X-المسبار" 637295 والدعم عن طريق 05K16GUA المنح الفدرالية، و "هامبورغ المركز لفائق السرعة تصوير – هيكل، وديناميات ومراقبة هذه المسألة على الصعيد الذري "الكتلة التميز الأوقيانوغرافية الألمانية (DFG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | 1002365940 | Protein for protocol |
| Bis-Tris 14880 | Sigma-Aldrich | 2302377 | Buffer for protein solution |
| di-Sodium tartrate dihydrate | AppliChem | A0451,0500 | Precipitant for protein solution |
| Silliconized coverslips | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1051203 | Coverslips for crystallization |
| Syringe filter | Starstedt | 831826001 | Filter pore 0.2 µm |
| Syringe | Omnifix | 4617207V | Luer Lock Solo 20 mL |
| Paraffin oil | Sigma-Aldrich | 2323842 | Oil for coating the plate |
| Standard Terakasi plate | Sigma-Aldrich | M5812270EA | Plate for recovering the crystallization droplet |
| Soft wipes | KIMTECH Science | ||
| XtalController900 | Xtal-Concepts GmbH | XTC900 | Crystallization device |
References
- Xtal Concepts GmbH, Germany . Patent "Vorrichtung und Verfahren zur Kontrolle der Kristallisation". , EP 2 588 649 (11754824.8) and US 9,284,659 B2 (2010).
- Chapman, H. M., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
- Kupitz, C., Grotjohann, I., Conrad, C. E., Roy-Chowdhury, S., Fromme, R., Fromme, P. Microcrystallization techniques for serial femtosecond crystallography using photosystem II from Thermosynechococcuselongatus as a model system. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 369 (1647), 20130316 (2014).
- Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. IUCrJ. 2 (2052-2525), 246-255 (2015).
- Stevenson, H. P., et al. Use of transmission electron microscopy to identify nanocrystals of challenging protein targets. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (23), 8470-8475 (2014).
- Meyer, A., et al. Single-drop optimization of protein crystallization. Acta. Crystallogr. Sect. F. Biol. Cryst. Commun. 68 (Pt 8), 994-998 (2012).
- Ferré-D'Amaré, A. R. Crystallization of Biological Macromolecules. 5 (7), Cold Spring Harbor Laboratory Press. 847-848 (1999).
- Asherie, N. Protein crystallization and phase diagrams. Methods. 34 (3), 266-272 (2004).
- Sauter, C., Lorber, B., Kern, D., Cavarelli, J., Moras, D., Giege, R. Crystallogenesis studies on yeast aspartyl-tRNAsynthetase: use of phase diagram to improve crystal quality. Acta. Cystallogr. D. Biol. Crystallogr. 55 (Pt 1), 149-156 (1999).
- Ewing, F., Forsythe, E., Pusey, M. Orthorhombic lysozyme solubility. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 50 (Pt 4), 424-428 (1994).
- Saridakis, E. E. G., Steward, P. D. S., Lloyd, L. F., Blow, D. M. Phase diagram and dilution experiments in the crystallization of carboxypeptidase G2. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 50 (Pt 3), 293-297 (1994).
- McPherson, A., Cudney, B. Optimization of crystallization conditions for biological macromolecules. Acta. Crystallogr. F. Struct. Biol. Commun. 70 (Pt 11), 1445-1467 (2014).
- Sleutel, M., Van Driessche, A. E. S. Role of clusters in nanoclassical nucleation and growth of protein crystals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (5), 546-553 (2014).
- Schubert, R., Meyer, A., Baitan, D., Dierks, K., Perbandt, M., Betzel, C. Real-time observation of protein dense liquid cluster evolution during nucleation in protein crystallization. Cryst. Growth Des. 17 (3), 954-958 (2017).
- Vekilov, P. G. The two-step mechanism of nucleation of crystals in solution. Nanoscale. 2 (11), 2346-2357 (2010).
- Vekilov, P. G. Dense liquid precursor for the nucleation of ordered solid phases from solution. Crystal Growth & Design. 4 (4), 671-685 (2004).
- Dierks, K., Meyer, A., Einspahr, H., Betzel, C. Dynamic light scattering in protein crystallization droplets: adaptations for analysis and optimization of crystallization processes. Cryst. Growth Des. 8 (5), 1628-1634 (2008).
- Schubert, R., et al. Reliably distinguishing protein nanocrystals from amorphous precipitate by means of depolarized dynamic light scattering. J. Appl. Cryst. 48, 1476-1484 (2015).
- Brown, W. Dynamic light scattering: the method and some applications. , Clarendon Press: Oxford. ISBN-13: 978-0198539421 978 (1993).
