Summary
Nous présentons ici un protocole pour la production contrôlée de microcristaux de protéine. Le procédé utilise un dispositif automatisé permettant la manipulation contrôlée de plusieurs paramètres de cristallisation. La cristallisation de protéines s’effectue par addition contrôlée et automatisée des solutions de cristallisation tandis que le suivi et l’enquête sur la distribution de rayon de particules dans la goutte de cristallisation.
Abstract
Le dispositif de cristallisation automatisé est une technique brevetée1 spécialement conçu pour la surveillance des expériences de cristallisation de protéines dans le but de manoeuvrer avec précision la nucléation et croissance de cristaux vers les tailles souhaitées de cristaux de protéines. La cristallisation contrôlée est basée sur échantillon enquête avec in situ Dynamic Light Scattering (DLS), alors que tous les changements visuels dans les gouttelettes sont surveillés en ligne à l’aide d’un microscope couplé à une caméra CCD, permettant ainsi une pleine enquête de la gouttelette de protéine durant toutes les étapes de cristallisation. L’utilisation de in situ DLS mesures tout au long de l’expérience entière permet une identification précise de la solution de protéines hautement sursaturée en transition vers une nouvelle phase – la formation des noyaux de cristal. En identifiant la phase de nucléation de protéine, la cristallisation peut être optimisée de cristaux de protéines importantes pour la production de protéine microcristaux. Le protocole expérimental montre une cristallisation interactive approche fondée sur des mesures automatisées précis comme ajout precipitant, évaporation de l’eau pour sursaturation induisant en haute, et de dilution de l’échantillon pour le ralentissement induit par nucléation homogène ou transitions de phase d’inversion.
Introduction
Au cours de ces dernières années, la croissance des protéines micro et nanocristaux a capté l’attention de la communauté de cristallographie des protéines, en particulier avec le développement continu de cristallographie de la femtoseconde Serial (SFX). En raison de l’éclat de la nouvel x-ray radiation sources et basé sur les résultats positifs obtenus jusqu'à présent, la production de protéine micro - et nanocristaux est devenue de grande pertinence, posant une forte demande sur la préparation de ces suspensions cristallines 2 , 3. en raison de la petit cristal taille-gamme requise pour la collecte de données sur les lasers à électrons libres (XFELs) et de la disponibilité limitée de beamtime expérimentale, caractérisation des échantillons avant la collecte des données est essentielle. Les techniques les plus courantes pour caractériser les suspensions micro - ou nanocristaux de protéine sont jusqu'à maintenant la microscopie électronique et par diffraction de poudre.
Jusqu’ici, plusieurs approches ont été adaptés de méthodes communes de cristallisation dans le but de produire des quantités en vrac de cristaux de protéines avec des dimensions de l’ordre du micromètre petit. La méthode de traitement par lots est utilisée pour le mélange rapide des concentrés riches en protéines et solutions precipitant, forçant ainsi la solution de l’échantillon à une phase très sursaturée, où nanocrystallization peut être favorisée4. Autres méthodes incluent écrasant des cristaux de protéines importantes pour former une pâte de cristal, qui peut servir de suspensions nanocristallins à utiliser pour la collecte de données5. Toutefois, les résultats peuvent parfois entraîner qualité diminuée de diffraction, comme cristaux détériorés ont ordre interne inférieur. Nanocrystallization basée sur la diffusion des interface libre est aussi une alternative disponible, où la solution protéique est ajoutée en petites quantités pour une solution precipitant hautement concentrée3. Cependant, parmi toutes les techniques, les méthodes les plus efficaces semblent la cristallisation par lots et plus techniques manipulatoires innovantes utilisant des méthodes de diffusion de la vapeur en séance gouttes6.
En général, pour la cristallisation d’une protéine, une barrière d’énergie doit être franchie pour prendre en charge la nucléation - la première étape thermodynamique de formation de cristaux. Afin de passer la solution protéique d’un État thermodynamiquement stable à sursaturation et enfin pour induire une transition de phase, certaines variables associés à la solution de protéines doivent être modifiées. Ces variables sont généralement la concentration de la solution de protéine, les changements environnementaux (p. ex.., température, humidité), solvants caractéristiques (p. ex., pH, force ionique), les propriétés de concentration et de mémoire tampon, etc.7 ,8 , une vue d’ensemble des paramètres de l’échantillon qui peut être changé est habituellement représenté au moyen de diagrammes de phase, qui permettent à différents modes de présentation, tels que les diagrammes de solubilité, diagrammes de phase de nucléation ou même plus détaillées descriptions où les schémas en trois dimensions ou plus complexes peuvent entrer en compte8,9,10. Les types plus attrayantes des diagrammes de phase sont généralement à deux dimensions, où la principale variable est la concentration de protéine en fonction d’un autre paramètre, alors que les autres paramètres sont gardés constants6,11. Une fois un ou plusieurs noyaux sont formés, cristaux plus grands peut se développer en reprenant d’autres protéines de la solution en vrac. Lorsque le but pour la production de micro et nanocristallins, une telle approche de cristallisation classique n’est pas possible plus en raison du petit nombre de cristaux qui sont présents dans la solution. Nanocristallins suspensions ont généralement être riches en entités cristallines, donc que la voie de cristallisation a être réajustées, tel qu’il existe un maxima des événements de nucléation présents dans l’échantillon. En conséquence, cela exige l’enquête de certains nouveaux, jusqu'à ce que les voies de nucléation maintenant inexploré pour les protéines, qui sont aussi encore pas bien compris12,13. Basé sur les fondamentaux de diagramme de phase a été mentionnés précédemment, la théorie classique a été étendue à une nouvelle hypothèse, où la nucléation est décrit comme un mécanisme en deux étapes : dans un premier temps, une transition vers une concentration plus élevée de la protéine se déroule (liquide dense phase) et d’autre part, une transition d’une phase dense riche à un ordre interne plus élevée (noyaux de cristal avec une architecture réseau)14,15,16. La cristallisation de protéines est sensible à de nombreux facteurs, et donc lorsque les recettes de cristallisation sont réajustées causera des cristaux de tailles différentes, les recettes ne peut pas toujours compter sur les connaissances antérieures. Nouvelles connaissances doivent être établies pour chaque cible de protéines individuelles : ajustement de la composition du tampon, la pureté et la stabilité de la connaissance de l’échantillon, précise de solubilité des protéines, etc..
Diffusion dynamique de la lumière est aujourd'hui une méthode bien établie pour l’analyse et l’optimisation des processus de cristallisation de protéines, en raison d’une large plage de taille de particules qui peuvent être l’objet d’une enquête : des protéines monomériques à nanocristaux et petit microcristaux. La méthode exploite que les particules en solution subissent un mouvement brownien et que la vitesse moyenne de la présente requête est déterminée par la taille des particules, leur énergie thermique et la viscosité du milieu et de la géométrie de la particule. Au début, le milieu liquide est éclairé par une source de lumière cohérente avec l’utilisation d’un laser. La lumière diffusée par les particules est formant une figure d’interférence. Comme les particules sont en mouvement permanent la figure d’interférence affecte également en permanence. Quand on regarde dans une direction donnée, les fluctuations d’intensité peuvent être observées. Ces fluctuations sont maintenant montrer le mouvement de particules provoqué par le mouvement brownien. Les fluctuations d’intensité mesurée correspond à une fonction d’autocorrélation (ACF). Une analyse de l’ACF donnera une mesure pour la distribution de vitesse (plus précisément le coefficient de diffusion), de particules et en utilisant l’équation de Stokes-Einstein, est transformée en une particule rayon distribution17. On trouvera des informations supplémentaires liées à la fonctionnalité de listes de distribution et principe de fonctionnement dans diverses publications et livres18,19.
Ici nous appliquons et décrire un dispositif unique de cristallisation automatisé, le XtalController900, une version améliorée de la XtalController technologie6, précisément développé pour la surveillance des expériences de cristallisation de protéines interactive. Cette technique présente un haut potentiel pour l’identification et de suivi des événements de nucléation en temps réel, permettant ainsi des manoeuvres précises à travers le diagramme de phase de cristallisation. L’objectif de cette procédure particulière de cristallisation est d’optimiser la cristallisation de protéines pour obtenir des protéines de haute qualité micro - et nanocristaux qui conviennent aux applications utilisant des sources de rayons x de synchrotron axés sur le micro, diffraction d’électrons, ou SFX.
Protocol
Remarque : Tout au long de l’ensemble du protocole, le système de micro-dosage utilisé pour l’ajout d’eau sera être dénommé Pump0 tandis que le système de micro-dosage utilisé pour l’ajout de précipitant s’appellera Pump1. Les résultats de cette expérience vont être discutés et dénommés THM2_micro-cristaux.
1. paramètres et la configuration de la Solution
- Filtre 16 mL de solution de Na-Tartrate (1,2 M) et 16 mL d’eau distillée à l’aide d’un filtre de seringue stérile 0,2 µm.
Remarque : La solution Na-tartrate représente la solution precipitant pour l’expérience de la cristallisation. - Remplir le précipitant et bouteilles d’eau 5 ml des solutions filtrées.
Remarque : Les bouteilles ont une capacité maximale de 5 mL. - Monter les bouteilles dans la porte-pompe de la chambre expérimentale.
- Définir les paramètres expérimentaux dans la fenêtre du logiciel aux valeurs suivantes : température à 20 ° C, humidité relative à 20 et solvant comme l’eau.
Remarque : La Figure 2 montre la fenêtre d’affichage où l’utilisateur peut insérer les valeurs correctes pour chaque paramètre comme la température, humidité relative et solvant. La fenêtre du logiciel montre aussi quelques paramètres supplémentaires tels que les additifs. C’est seulement important pour les expériences où les additifs sont présents dans la solution precipitant. - Ouvrez la porte de la chambre expérimentale et retirez le support de la lamelle couvre-objet.
- Placez un lamelle couvre-objet propre et mastic sur le support et le placer dans l’appareil.
NOTE : Le couvre-objet a une taille de 2,2 cm. - Fermer la chambre expérimentale pour sécuriser les conditions environnementales de l’étape 1.4.
Remarque : Le protocole peut être suspendu ici.
2. micro-dosage systèmes réglage
- Commutateur ON Pump0 en utilisant les principales caractéristiques de la pompe à la Figure 3 et créer un courant d’eau.
Remarque : La trajectoire de flux d’eau est créée selon certaines caractéristiques de la pompe qui peuvent être ajustés. La figure 3 montre les caractéristiques de la pompe principale et les valeurs optimales qui doivent être utilisés pour cette expérience. - Ajuster le jet d’eau visant la position vers le centre de la lamelle en actionnant manuellement sa vis de réglage désigné. Passer au large de Pump0.
- Commutateur ON Pump1 et créer un flux de liquid fait comme précédemment à l’étape 2.1. Ajuster la position du flux de Pump1 vers la position fixée pour Pump0. Passer au large de Pump1.
- Remplacer la lamelle couvre-objet utilisé par un nouveau et nettoyer l’un pour l’expérience de la cristallisation.
NOTE : Lingettes Soft sont généralement recommandées pour le nettoyage de la lamelle de nouveau de la poussière résiduelle, avant d’être utilisés dans l’expérience de la cristallisation.
3. réglage thaumatine une goutte d’eau dans la chambre expérimentale
- Créez un nouveau fichier expérimental à l’aide du progiciel. Entrez les informations suivantes dans le fichier expérimental : protéines (thaumatine de Thaumatococcus daniellii), concentration en protéines (14 mg/mL), précipitant (Na-Tartrate) et precipitant concentration (1,2 M).
NOTE : Cette information servira pour le calcul automatisé des précipitant et la concentration protéique au cours de l’expérience de la cristallisation. - Charger le nouveau fichier d’expérience pour activer toutes les informations de l’étape 3.1.
- Marquer la position de la gouttelette de protéines en ajoutant une goutte d’eau petit à l’aide de Pump0.
Remarque : Le but est de créer une goutte d’eau petit qui servira comme point de repère sur lequel l’échantillon de protéine sera placé. - Appuyez sur le bouton Tare pour définir le poids donné par la microbalance à zéro.
Remarque : Cela enlèvera le poids de la lamelle couvre-objet et le poids supplémentaire ajouté par l’emblème de la petite eau créé à l’étape 3.3. - Ouvrir le couvercle de la chambre expérimentale et distribuer 8 µL de solution de la thaumatine sur le point de repère de l’eau.
- Enregistrer la nouvelle perte thaumatine en suivant les prochaines commandes.
- Appuyez sur le bouton New drop d’attribuer les conditions initiales du fichier expérimental.
- Appuyez sur le bouton Const pour compenser l’évaporation naturelle de l’eau de la goutte.
- Vérifiez avec la caméra CCD si Pump0 a pour objectif la chute de la protéine. Réajuster la position de Pump0 si le jet d’eau est le but à l’extérieur de la goutte.
Remarque : Partir de ce moment, la gouttelette de protéines reste à un poids constant, par adjonction d’eau automatisé qui compense l’évaporation d’eau naturelle de la gouttelette de protéine. Le poids de la goutte de protéines, ainsi que les autres paramètres comme la température et l’humidité relative peut être surveillé en temps réel à l’aide de la fenêtre d’affichage. L’expérience peut être suspendue ici.
4. les mesures in Situ DLS
- Commutateur sur les DLS laser et placer le faisceau laser dans la baisse de la protéine manuellement à l’aide des vis de réglage.
- Entrez les paramètres de listes de distribution suivants : durée de la mesure (60 s), temps d’attente entre deux mesures (10 s) et nombre des mesures (300).
NOTE : Les 30 premières mesures servira de mesures de référence pour la stabilité-vérification de la protéine. Le reste des mesures servira une enquête approfondie de la gouttelette de protéines au cours de la durée totale du processus de cristallisation. - Appuyez sur le bouton Démarrer pour lancer les mesures de DLS. Vérifier la qualité de l’échantillon en sélectionnant l’une des représentations graphiques de DLS.
Remarque : L’échantillon doit montrer un degré élevé de mono-polydispersité, sans n’importe quel agrégat dans la solution. Les résultats de listes de distribution peuvent être montrés et lu comme : mesures sommaires, ou comme un aperçu de l’intensité de taux de comptage, tracé de rayon, histogramme de rayon, distribution de rayon.
5. échantillon évaporation étape
- Entrez les conditions pour l’étape d’évaporation dans le tableau de l’annexe en utilisant les données indiquées au tableau 1.
Remarque : Le signe «- » introduit dans la colonne « Molarité/pourcentage » dans la deuxième rangée représente une perte d’eau de la goutte de protéines, tandis que la valeur « 25 » signifie que le volume de la goutte subira une réduction de 25 %. Cela signifie que le taux protéique de la gouttelette augmentera de 25 %. - Active l’étape d’évaporation sample en appuyant sur le bouton Autom. Appuyez sur le bouton arrêter une fois terminée l’étape d’évaporation échantillon.
- Activez le bouton Const pour maintenir la chute constante après l’arrêt de l’évaporation de l’échantillon.
6. étape d’Addition precipitant
- Entrez les conditions pour l’étape d’addition precipitant dans le tableau calendrier illustré à la Figure 4 , en utilisant les données fournies dans le tableau 2.
Remarque : La première ligne du tableau représente une étape de calibrage, au cours de laquelle le logiciel calcule le taux d’évaporation naturelle de la gouttelette de protéines basé sur le montant de précipitant qui doit être ajoutée à la goutte de protéine. Le logiciel extrapole cette valeur et ajuste automatiquement la fréquence de tir pour Pump0 pour compenser automatiquement l’évaporation de l’eau pour la prochaine étape d’addition precipitant. - Activer l’étape d’addition precipitant en appuyant sur le bouton Autom.
Remarque : L’ajout de précipitant est un processus automatisé, suite à l’entrée de la table de l’annexe.
7. suivre l’évolution de la gouttelette de cristallisation au fil du temps
- Vérifier l’apparence des thaumatine cristaux à l’aide de la caméra CCD.
- Vérifier la distribution granulométrique en utilisant les représentations graphiques de DLS.
- Vérifier l’évolution du poids et des paramètres expérimentaux à l’aide de la fenêtre d’affichage.
Remarque : Lorsque la solution Na-tartrate atteint une concentration de 0,74 M dans la baisse de la protéine, la goutte devient riche en thaumatine micro-cristaux comme on le voit à la Figure 7.
8. récupération des gouttelettes de cristallisation
- Recouvrir une plaque Terasaki propre standard avec du pétrole.
- Ajouter 3 mL d’huile de paraffine à la plaque.
- Disperser l’huile de paraffine sur les puits de la plaque en déplaçant légèrement la plaque avec des angles différents afin que l’huile recouvre tous les 72 puits de la plaque.
- Enlever l’excès d’huile de paraffine en versant l’huile qui flotte sur la plaque.
- Appuyez sur le bouton arrêter à la fin de l’expérience de la cristallisation. Retirer avec précaution le transporteur échantillon contenant la gouttelette de cristallisation.
- À l’aide d’une pipette, placer un volume de 2 µL d’extraits de la goutte de cristallisation dans les puits de la plaque Terasaki.
Remarque : En récupérant la goutte de cristallisation sur une plaque dans l’huile, l’échantillon peut être vérifié périodiquement pour la stabilité et la croissance des cristaux à l’aide d’un microscope ou d’autres techniques DLS qui fonctionnent avec des plaques Terasaki standard.
Representative Results
Les résultats obtenus par des mesures de DLS pendant l’expérience de cristallisation montrent une évolution détaillée des rayons particules hydrodynamiques résultant en deux fractions principales particules distribution, qui se développent au fil du temps. Dans la première partie de l’expérience, l’échantillon a été lentement évaporé, afin d’atteindre une concentration plus élevée de la protéine. Comme illustré à la Figure 5 b, la baisse de la protéine a été concentrée de 14 mg/mL à 19,5 mg/mL. Pendant ce temps, selon le mode de répartition de rayon dans la Figure 5 a, la protéine présente un comportement de monomère en solution avec une granulométrie constante d’environ 2,5 nm. Comme l’échantillon est en outre évaporée, la protéine monomérique reste stable en solution, sans aucun signe de dénaturation ou d’agrégation de l’échantillon.
L’addition de solution precipitant à la baisse de la protéine est immédiatement initiée après évaporation de l’échantillon et a mis en évidence avec le fil gris dans les courbes rayon distribution pattern et équilibre pour une meilleure visualisation (Figure 5). Selon les calculs de dérivées de poids de l’échantillon, la fraction particulaire en surbrillance est attribuée à l’initiation de nucléation de cristal, résultant en une taille de rayon d’environ 200 à 400 nm. Ce phénomène (appelé nucléation) est initié à une concentration precipitant de 0,6 M dans la goutte de protéine, à une période de temps d’environ 66 min du début de l’expérience et environ 23 min en ce qui concerne l’ouverture de précipitant ajout. Comme la concentration des augmentations precipitant, la distribution de rayon présente une large distribution de particules en solution. Comme les noyaux plus former, l’initiale cristalline entités gagnent en taille, pour atteindre une distribution de rayon entre 800-1 300 nm. On peut conclure que, à ce stade, les noyaux de cristal continuent à croître, et la fraction protéique devient progressivement plus pauvre que les molécules de protéine sont prises de microcristaux. Comme la concentration precipitant dans la baisse de la protéine augmente lentement, la formation des microcristaux est facilement identifiable après 75 min, lorsque la distribution de rayon continue à se développer entre 500 et 1 500 nm. L’évolution de la distribution de rayon est également confirmée par les images de caméras CCD, où les microcristaux de protéine est visibles à une concentration precipitant de 0,7 M en solution (Figure 7). Comme l’ajout precipitant est terminé et la chute de cristallisation est maintenue constante, la distribution de rayon montre une phase prépondérante entre 1 000 et 3 000 nm, tandis que la fraction des événements de nucléation diminue avec le temps. En ce moment, la baisse de cristallisation est entièrement saturée de microcristaux et aucun autre événement de nucléation n’est présents dans la solution.
En utilisant comme entrée expérimentale des données de rétroaction données par la microbalance, un diagramme de phase de cristallisation a été dessiné pour une compréhension globale des processus de cristallisation de la thaumatine. Dans la Figure 6, le diagramme de phase expérimentale montre trois expériences de cristallisation indépendant, où la production de la thaumatine danielli T. microcristaux est étiquetée comme THM_2 micro-cristaux (protocole). Deux expériences de cristallisation supplémentaire étiqueté THM_1 Macro-cristaux et THM_3 Macro-cristaux ont été utilisés comme données d’entrée afin d’avoir une cartographie correcte des différentes zones dans le diagramme de phase (e.g., solubilité ou région métastable). Étant donné que les protocoles pour ces expériences suivent des voies différentes de la cristallisation, l’identification de la région de nucléation devient plus facile et donc plus précis. Pour chaque expérience, le chemin de cristallisation est mis en évidence par des numéros de commande pour mettre l’accent sur les différentes approches et nombre d’étapes de cristallisation qui ont été utilisés pour obtenir un résultat spécifique, tandis que les flèches grises représentent une estimation de la protéine finale concentration pour les molécules de protéines crystal croissance absorption de la solution dans la formation du bien définis stable des cristaux de protéine.
Les trois expériences thaumatine présentés dans la Figure 6 montrent différentes conditions lors de l’arrivée dans la région de nucléation, et résultats de cristallisation final donc différent car il peuvent être vu sur les photos ci-dessous le diagramme de phase. Dans le cas de THM1 et THM3, la solution protéique passe la phase de nucléation et rentre dans la région métastable, où il repose jusqu’en forme de cristaux. Par conséquent, les expériences conduisent à des cristaux en forme large et bien définies, entourés de liqueur mère. Toutefois, pour l’expérience présentée dans la section protocole, THM2_micro-cristaux, le chemin de cristallisation suit une approche particulière. Dans une section précédente, nous avons mentionné que pour obtenir un exemple de microcristaux de donner la solution de protéines doit être situé en profondeur dans la phase de nucléation, afin que les événements de nucléation peuvent se former à un débit maximal. Dans le cas de THM2_micro-cristaux, le ratio de protéine à concentration precipitant a été ajusté de telle façon que l’échantillon n’entre pas seulement dans la région de nucléation, mais comme un précipitant est également ajouté à la solution de protéines, et les conditions ne se déplacent pas à une autre région dans le diagramme de phase, tout en demeurant dans un état très sursaturé dans la région de nucléation. Ainsi, l’entropie de la solution diminue considérablement à mesure que la gouttelette de protéine devient immédiatement imprégnée de petites entités cristallines.
Figure 1. Représentation schématique de l’expérience de la cristallisation. Le dessin montre une vue d’ensemble de la chambre expérimentale de cristallisation avec toutes les parties techniques nécessaires pour mener une expérience de cristallisation automatisé. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : fenêtre du logiciel pour les listes de distribution et les paramètres d’échantillon qui sont pertinents pour une expérience de cristallisation. Les paramètres comprennent la température, hygrométrie, viscosité, etc..
Figure 3 : fenêtre de contrôle de logiciel pour les systèmes de micro-dosage impliqués dans l’expérience de la cristallisation. Les fonctionnalités permettent l’ajustement des paramètres spécifiques pour la production de gouttelettes ou de flux de la solution.
Figure 4 : fenêtre du logiciel pour le tableau de l’annexe décrivant les étapes de cristallisation dans l’expérience. Les conditions initiales de la gouttelette de cristallisation sont également intégrées dans cette fenêtre.
La figure 5. Vue d’ensemble de la thaumatine daniellii T. production de microcristaux. (A) distribution de rayon de la taille des particules dans la baisse de la protéine au cours du processus de cristallisation complète. (B) monitoré aperçu des paramètres expérimentaux. Les parcelles représentent l’évolution au fil du temps pour le poids de la goutte de protéine (courbe noire) ainsi que la concentration en protéines calculée (courbe rouge) et la concentration precipitant (courbe bleue). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : diagramme de phase de cristallisation expérimentale pour thaumatine danielli T. ainsi que les résultats qui en résulte. Toutes les parcelles sont dérivés de données expérimentales, basées sur l’information de rétroaction donnée par la microbalance. Les numéros attribués à chaque expérience qui n’apparaissent pas entre parenthèses représentent l’ordre et le nombre de mesures prises au cours d’un protocole de cristallisation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : photographie enregistré pour THM2_Micro-cristaux (protocole) montrant un nombre abondant de microcristaux saturé de solution. La photo a été prise à 4 h (240 min) après le réglage de la gouttelette de protéine dans la chambre expérimentale pour la cristallisation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : photo enregistré pour THM_1 Macro-cristaux montrant quelques cristaux de gros thaumatine stable en solution. La photo a été prise à 20 h après avoir réglé la gouttelette de protéine dans la chambre expérimentale pour la cristallisation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 9 : photo enregistré pour THM_3 Macro-cristaux montrant les différentes tailles de cristaux thaumatine dans solution. La photo a été prise à 20 h après avoir réglé la gouttelette de protéine dans la chambre expérimentale pour la cristallisation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Substance | Molarité/pourcentage | Heure (s) |
| eau | 0 | 100 |
| eau | -25 | 2100 |
| eau | 0 | 2100 |
Tableau 1 : Entrée de calendrier automatisé pour l’évaporation de l’échantillon étape dans la production de microcristaux de la thaumatine.
| Substance | Molarité/pourcentage | Heure (s) |
| eau | 0 | 100 |
| PREC | 0,8 | 1800 |
| eau | 0 | 18000 |
Tableau 2 : entrée de calendrier automatisé pour l’ajout precipitant étape dans la production de la thaumatine microcristaux.
Discussion
Le dispositif de cristallisation est conçu pour contrôler et manipuler des paramètres cruciaux au cours d’une expérience de cristallisation basée sur une méthode de diffusion de la vapeur mis à jour le. Cette technique permet de surveiller et marquant une expérience de la cristallisation de protéines à tous les stades, permettant à l’utilisateur d’avoir une connaissance précise et le contrôle de la solution de protéines dans le diagramme de phase de cristallisation, fondé sur in situ DLS analyse de la suspension de l’échantillon.
Le dispositif de cristallisation comprend une chambre expérimentale (Figure 1) reliée à une caméra CCD qui permet une surveillance en temps réel de la gouttelette de cristallisation. L’appareil est adapté à un microscope équipé de lentilles de grossissement différents, offrant une résolution spatiale maximale d’environ 2,5 µm. Le noyau de la chambre expérimentale est une microbalance ultrasensible pour suivre l’évolution du poids de l’échantillon au fil du temps. La procédure de cristallisation correspond à une expérience de diffusion de la vapeur-séance-goutte, où la baisse de la protéine est placée sur une lamelle de mastic, qui est placée sur la microbalance. Basé sur les changements de poids de la goutte, qui sont causés par addition precipitant, ajout de l’eau/additif ou évaporation d’échantillon, la microbalance donne une entrée précise à un algorithme pour le calcul immédiat de concentration protéique et précipitant au fil du temps . En outre, les paramètres cristallisation importants tels que la température et l’humidité relative sont précisément surveillés et contrôlés.
Afin de réaliser une expérience de cristallisation, l’appareil est équipé de deux systèmes de micro-dosage (contacter gratuites pompes piézo-électriques) qui fonctionnent à l’échelle picolitres pour addition précipitant et l’eau. En travaillant avec ces faibles quantités de substance, les gradients de concentration et le phénomène de convection au sein de la gouttelette de protéine sont réduits au minimum. Le rôle principal des pompes piézoélectriques est l’ajout d’eau, celui-ci par exemple utilisé en compensation de l’évaporation naturelle de la gouttelette de protéine ou précipitant. Les systèmes de micro-dosage ont un ensemble de fonctionnalités qui peut dicter l’ajout d’une substance. Ces caractéristiques comprennent : le taux de répétition pour l’inscription d’une substance, le nombre de gouttes ajoutées par seconde, la largeur et la hauteur de la trajectoire du flux matière, etc.. En outre, la position des pompes peut être réglée manuellement, permettant à l’utilisateur d’avoir une position précise pour l’addition de substances dans les gouttelettes de protéines.
La manipulation de rétroaction unique contrôlée de la goutte de cristallisation est obtenue par in situ données de listes de distribution, qui peuvent montrer des changements possibles dans l’état de protéine oligomérique pendant toute la procédure expérimentale. Cette technique permet une évaluation permanente de la distribution granulométrique au fil du temps, révélant ainsi les mécanismes inconnus axés sur les protéines. L’équipement optique DLS est placé stratégiquement au-dessous de la zone de la lamelle couvre-objet, ce qui permet du faisceau laser et détecteur à passent par le biais de la lamelle couvre-objet et ensuite dans la goutte de protéine dans un mode in situ ; par conséquent, que des changements au sein de la goutte sont enregistrées dans le chemin d’accès DLS. Pour permettre une manipulation facile, l’appareil possède deux ouvertures : une porte d’entrée pour un positionnement optimal de la lamelle couvre-objet et d’un couvercle qui peut être retiré, afin que l’utilisateur peut ajuster la position de tir des systèmes micro-dosage comme définissant avec précision un scrutateur de protéine nouvelle plet sur la lamelle couvre-objet.
La méthode de cristallisation interactive à l’aide de l’appareil susmentionné est une technique fiable pour la production contrôlée par taille des cristaux de protéine. Bien que de nombreuses méthodes de cristallisation sont disponibles, à l’intérieur des informations sur la cristallisation mécanisme lui-même n’est pas facilement réalisable. En général, appliquant les méthodes classiques de cristallisation ne permet qu’un contrôle limité de la solution dans le diagramme de phase de cristallisation, avec seulement quelques possibilités de changer de son cours une fois une expérience commencée. Tout en effectuant une cristallisation expérimenter et appliquant telle une technologie automatisée de cristallisation couplée avec in situ DLS, un grand nombre de connaissances est acquise sur les transitions dans le diagramme de phase. En général, les régions d'où précipité amorphe et l’induction de nucléation homogène sont rapprochées dans le diagramme de phase. Par conséquent, en manipulant le parcours d’une goutte de cristallisation sur base des informations en temps réel sur sa distribution de particules, il est possible d’éviter la précipitation d’une protéine en ajustant progressivement les conditions de cristallisation vers la nucléation et formation de cristaux.
De nos jours, plusieurs conditions de cristallisation incluent des solutions precipitant où dérivés de polyéthylène glycol (PEG) sont largement présents. Ces composés ont généralement une viscosité élevée qui peut posséder des difficultés pour la pipette ou la distribution. Dans la présente étude de cas, les systèmes de micro-dosage qui sont utilisés pour la distribution precipitant s’appliquent très minces capillaires qui permettent l’ajout d’incréments picolitres. En conséquence, il y a quelques limitations dans le travail avec des substances hautement visqueux. Dans une série d’expériences passées, le système a donné des résultats positifs en utilisant les dérivés suivants de PEG : PEG200 50 % PEG3000 20 %, PEG6000 10 %, PEG800010 %. Bien que jusqu'à présent seuls les solutions susmentionnées ont été testées, les systèmes de micro-dosage contiennent un mécanisme de chauffage spécial qui peut être utilisé afin de diminuer la viscosité d’une solution. Un autre facteur est solutions salines qui doivent être considérés lorsqu’il est utilisé comme protéine precipitant. Lorsque vous travaillez avec des sels très concentrés, une petite quantité peut se cristalliser à la buse du système micro-dosage, provoquant le blocage superficiel de la pompe micro-posologie pendant precipitant addition ; même lorsqu’une humidité relative très élevée est présente dans la chambre expérimentale. Pour résoudre ce problème, l’expérience doit être mis en attente afin que le sel de la buse peut être enlevé. Cela peut nécessiter un traitement spécial et peut générer des erreurs lors de la phase d’addition precipitant.
Basé sur les informations précieuses qui peuvent être obtenues lors de l’exécution de telles expériences de cristallisation automatisé, cette technique peut être étendue aux études portant sur les aspects de la chimie physique de la cristallisation de protéines. Les taux de réaction de croissance nucléation et crystal sont des phénomènes de cinétiques qui peuvent être dérivés et calculés basé sur les informations de dépendance temporelle décrits à partir d’une expérience comme la température, la croissance de la taille des particules et des protéines et precipitant concentration.
Disclosures
Nous déclarons par la présente que les auteurs Arne Meyer, Karsten Dierks et Christian Betzel sont actionnaires de la société Xtal-Concepts GmbH, producteur de la technologie XtalController900.
Acknowledgments
Les auteurs reconnaissent le financement provenant de l’Union européenne Horizon 2020 programme de recherche et l’Innovation sous le Marie Sklodowska-Curie acronyme « X-sonde » Grant entente no 637295 et le support par le BMBF grant 05K16GUA et le « The Hambourg Centre pour ultrarapide Imagerie – Structure, dynamique et contrôle de la matière à l’échelle atomique » cluster d’excellence de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | 1002365940 | Protein for protocol |
| Bis-Tris 14880 | Sigma-Aldrich | 2302377 | Buffer for protein solution |
| di-Sodium tartrate dihydrate | AppliChem | A0451,0500 | Precipitant for protein solution |
| Silliconized coverslips | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1051203 | Coverslips for crystallization |
| Syringe filter | Starstedt | 831826001 | Filter pore 0.2 µm |
| Syringe | Omnifix | 4617207V | Luer Lock Solo 20 mL |
| Paraffin oil | Sigma-Aldrich | 2323842 | Oil for coating the plate |
| Standard Terakasi plate | Sigma-Aldrich | M5812270EA | Plate for recovering the crystallization droplet |
| Soft wipes | KIMTECH Science | ||
| XtalController900 | Xtal-Concepts GmbH | XTC900 | Crystallization device |
References
- Xtal Concepts GmbH, Germany . Patent "Vorrichtung und Verfahren zur Kontrolle der Kristallisation". , EP 2 588 649 (11754824.8) and US 9,284,659 B2 (2010).
- Chapman, H. M., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
- Kupitz, C., Grotjohann, I., Conrad, C. E., Roy-Chowdhury, S., Fromme, R., Fromme, P. Microcrystallization techniques for serial femtosecond crystallography using photosystem II from Thermosynechococcuselongatus as a model system. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 369 (1647), 20130316 (2014).
- Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. IUCrJ. 2 (2052-2525), 246-255 (2015).
- Stevenson, H. P., et al. Use of transmission electron microscopy to identify nanocrystals of challenging protein targets. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (23), 8470-8475 (2014).
- Meyer, A., et al. Single-drop optimization of protein crystallization. Acta. Crystallogr. Sect. F. Biol. Cryst. Commun. 68 (Pt 8), 994-998 (2012).
- Ferré-D'Amaré, A. R. Crystallization of Biological Macromolecules. 5 (7), Cold Spring Harbor Laboratory Press. 847-848 (1999).
- Asherie, N. Protein crystallization and phase diagrams. Methods. 34 (3), 266-272 (2004).
- Sauter, C., Lorber, B., Kern, D., Cavarelli, J., Moras, D., Giege, R. Crystallogenesis studies on yeast aspartyl-tRNAsynthetase: use of phase diagram to improve crystal quality. Acta. Cystallogr. D. Biol. Crystallogr. 55 (Pt 1), 149-156 (1999).
- Ewing, F., Forsythe, E., Pusey, M. Orthorhombic lysozyme solubility. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 50 (Pt 4), 424-428 (1994).
- Saridakis, E. E. G., Steward, P. D. S., Lloyd, L. F., Blow, D. M. Phase diagram and dilution experiments in the crystallization of carboxypeptidase G2. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 50 (Pt 3), 293-297 (1994).
- McPherson, A., Cudney, B. Optimization of crystallization conditions for biological macromolecules. Acta. Crystallogr. F. Struct. Biol. Commun. 70 (Pt 11), 1445-1467 (2014).
- Sleutel, M., Van Driessche, A. E. S. Role of clusters in nanoclassical nucleation and growth of protein crystals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (5), 546-553 (2014).
- Schubert, R., Meyer, A., Baitan, D., Dierks, K., Perbandt, M., Betzel, C. Real-time observation of protein dense liquid cluster evolution during nucleation in protein crystallization. Cryst. Growth Des. 17 (3), 954-958 (2017).
- Vekilov, P. G. The two-step mechanism of nucleation of crystals in solution. Nanoscale. 2 (11), 2346-2357 (2010).
- Vekilov, P. G. Dense liquid precursor for the nucleation of ordered solid phases from solution. Crystal Growth & Design. 4 (4), 671-685 (2004).
- Dierks, K., Meyer, A., Einspahr, H., Betzel, C. Dynamic light scattering in protein crystallization droplets: adaptations for analysis and optimization of crystallization processes. Cryst. Growth Des. 8 (5), 1628-1634 (2008).
- Schubert, R., et al. Reliably distinguishing protein nanocrystals from amorphous precipitate by means of depolarized dynamic light scattering. J. Appl. Cryst. 48, 1476-1484 (2015).
- Brown, W. Dynamic light scattering: the method and some applications. , Clarendon Press: Oxford. ISBN-13: 978-0198539421 978 (1993).
