Summary
Aquí presentamos un protocolo para la producción controlada de microcristales de proteína. El proceso utiliza un dispositivo automatizado que permita manipulación controlada de varios parámetros de cristalización. La cristalización de proteínas es realizados por adición controlada y automatizada de soluciones de la cristalización mientras que vigilar e investigar la distribución de radio de las partículas en la gota de cristalización.
Abstract
El dispositivo automatizado de la cristalización es una técnica patentada1 desarrollada especialmente para el control de experimentos de cristalización de proteínas con el objetivo de maniobrar precisamente la nucleación y crecimiento cristalino hacia tamaños deseados de cristales proteicos. La cristalización controlada se basa en investigación muestra en situ dispersión dinámica de luz (DLS) mientras que todos los cambios visuales en la gota son monitoreados en línea con la ayuda de un microscopio acoplado a una cámara CCD, lo que permite una completa investigación de la gota de proteína durante todas las etapas de cristalización. El uso de mediciones en situ de DLS a lo largo de todo el experimento permite una identificación precisa de la solución de proteína altamente sobresaturada la transición a una nueva etapa – la formación de núcleos de cristal. Mediante la identificación de la etapa de nucleación de la proteína, se puede optimizar la cristalización de cristales de proteína grande a la producción de proteína microcristales. El protocolo experimental muestra una cristalización interactiva enfoque basa en precisos pasos automatizados como precipitante además, la evaporación del agua para inducir alta sobresaturación, y dilución de la muestra de desaceleración inducida por nucleación homogénea o transiciones de la fase de inversión.
Introduction
En los últimos años, el crecimiento de proteína micro - y nanocristales ha captado la atención de la comunidad de Cristalografía de proteínas, especialmente con el continuo desarrollo de la cristalografía del femtosegundo Serial (SFX). Debido a la brillantez de la novela radiografía radiación fuentes y basado en los resultados exitosos obtenidos hasta el momento, la producción de proteína micro - y se ha convertido en nanocristales de alta relevancia, planteando una alta demanda en la preparación de tales suspensiones cristalinas 2 , 3. debido al pequeño cristal-gama del tamaño requerida para la recolección de datos en láseres de electrones libres (XFELs) y la limitada disponibilidad de beamtime experimental, caracterización de la muestra antes de la recogida de datos es esencial. Las técnicas más comunes para caracterizar suspensiones de micro o nanocristales de proteínas son hasta ahora la microscopia electrónica y difracción de polvo de rayos x.
Hasta ahora, se han adaptado varios enfoques de métodos comunes de cristalización con el fin de producir cantidades a granel de cristales proteicos con dimensiones en la gama del micrómetro pequeño. El método por lotes se utiliza para la mezcla rápida de proteínas concentrado y soluciones precipitante, obligando así a la solución de la muestra a una fase altamente sobresaturada donde nanocrystallization puede ser favorecido4. Otros métodos incluyen trituración cristales grandes de la proteína para formar una mezcla de cristal, que puede servir como suspensiones nanocristalinos para colección de datos5. Sin embargo, los resultados pueden algunas veces ocasionar calidad disminuida de la difracción, como cristales deteriorados tienen orden interna más baja. Nanocrystallization basado en la difusión libre de la interfaz también es una alternativa disponible, donde solución de proteína se agrega en pequeñas cantidades en una solución altamente concentrada, precipitante3. Sin embargo, entre todas las técnicas, los métodos más eficientes parecen ser la cristalización batch y más innovadoras técnicas manipulativas utilizando métodos de difusión de vapor en la sala gotas6.
En general, para la cristalización de una proteína hay que cruzar una barrera de energía para apoyar nucleación - el primer paso termodinámico en la formación de cristales. Pasar la solución de proteína de un estado termodinámicamente estable a sobresaturación y finalmente para inducir una transición de fase, deben modificarse algunas variables relacionadas con la solución de proteína. Dichas variables son generalmente la concentración de la solución de la proteína, cambios ambientales (por ej., temperatura, humedad), características solventes (e.g., pH, fuerza iónica), tampón y la concentración de propiedades, etc.7 ,8 un resumen de los parámetros de la muestra que se puede cambiar se representa generalmente por medio de diagramas de fases, que permiten diferentes modos de presentación, tales como diagramas de solubilidad, diagramas de fase de nucleación o incluso más detallada descripciones de donde diagramas tridimensionales o más complejos pueden entrar en consideración8,9,10. Los tipos más atractivos de diagramas de fases son generalmente de dos dimensiones, donde la variable principal es la concentración de proteína en función de otro parámetro, mientras que los restantes parámetros se mantienen constantes6,11. Una vez que se forman uno o varios núcleos, cristales más grandes pueden crecer tomando adicionales de la proteína de la solución a granel. Cuando con el objetivo de producción micro y de nanocristales, un enfoque convencional de la cristalización no es factible ya debido al pequeño número de cristales que están presentes en la solución. Nanocristalinos suspensiones usualmente tienen que ser rico en entidades cristalinas, por lo tanto que la vía de cristalización tiene que reajustarse, tales que hay una maxima de eventos de nucleación en la muestra. En consecuencia, esto requiere la investigación de algunos nuevos, hasta vías de nucleación ahora inexplorado para las proteínas, que también todavía no son completamente entendidos12,13. Basado en los fundamentos de diagrama de fase anteriormente mencionados, la teoría clásica se ha extendido a una nueva hipótesis, donde la nucleación se describe como un mecanismo de dos etapas: en primer lugar, una transición a una mayor concentración de proteína lleva a cabo (líquido denso fase) y en segundo lugar, una transición de una fase densa ricos a un mayor orden interno (núcleos de cristal con arquitectura de entramado)14,15,16. Cristalización de proteínas es sensible a muchos factores, y por lo tanto cuando sean reajustados recetas de cristalización en cristales de tamaño diferentes, las recetas no siempre dependen de conocimientos previos. Nuevos conocimientos necesitan ser establecidos para cada destino de la proteína individual: ajuste de tampón composición, pureza y estabilidad del muestra, precisa conocimiento de la solubilidad de la proteína, etcetera.
Dispersión ligera dinámica es hoy un método bien establecido para análisis y optimización de procesos de cristalización de proteínas, debido a una amplia gama de tamaño de partículas que pueden investigarse: proteínas monoméricas a nanocristales y pequeños microcristales. El método aprovecha que las partículas en solución se someten a movimiento browniano y que la velocidad media de este movimiento está determinada por el tamaño de partícula, su energía térmica y la viscosidad del medio y la geometría de la partícula. Al principio, el medio líquido está iluminado por una fuente de luz coherente con el uso de un láser. La luz dispersada por las partículas es formando un patrón de interferencia. Porque las partículas están en movimiento permanente del patrón de interferencia también cambia permanentemente. Cuando se mira en una dirección determinada, se pueden observar las fluctuaciones de intensidad. Estas fluctuaciones están mostrando ahora el movimiento de la partícula causado por el movimiento browniano. De las fluctuaciones de intensidad medidos se calcula una función de autocorrelación (ACF). Un análisis del ACF dará una medida para la distribución de la velocidad (más precisamente el coeficiente de difusión) de las partículas y utilizando la ecuación de Stokes-Einstein, se convierte en una partícula radio distribución17. Información adicional relacionada con la funcionalidad DLS y principio de funcionamiento puede encontrarse en diversas publicaciones y libros18,19.
Aquí aplicamos y describir un dispositivo único automatizado cristalización, el XtalController900, una versión mejorada de la XtalController tecnología6, desarrollado precisamente para control de experimentos de cristalización de proteínas interactivas. Esta técnica muestra un alto potencial para la identificación y seguimiento de eventos de nucleación en tiempo real, permitiendo una maniobra precisa mediante el diagrama de fases de cristalización. El objetivo de este procedimiento de cristalización particular es optimizar la cristalización de proteínas para obtener alta calidad proteína micro - y nanocristales que son adecuados para aplicaciones que utilizan fuentes de rayos x de sincrotrón micro-centrada, difracción de electrones, o SFX.
Protocol
Nota: En el conjunto del Protocolo, el sistema de micro dosis de adición de agua se referirán a como Pump0 mientras que el sistema de micro dosis de adición de precipitado se llamará Pump1. Los resultados de este experimento serán discutidos y contemplados como THM2_micro-cristales.
1. los parámetros y configuración de la solución
- Filtro de 16 mL de solución de tartrato de Na (1,2 M) y 16 mL de agua destilada usando un filtro de jeringa estéril de 0.2 μm.
Nota: La solución de tartrato de Na-representa la solución precipitante para el experimento de cristalización. - Llenar las botellas de agua y precipitado con 5 mL de las soluciones de filtrado.
Nota: Las botellas tienen una capacidad máxima de 5 mL. - Montar las botellas en los soportes de la bomba de la cámara experimental.
- Establecer los parámetros experimentales en la ventana del software a los siguientes valores: temperatura de 20 ° C, humedad relativa a 20 y el solvente como el agua.
Nota: La figura 2 muestra la pantalla donde el usuario puede introducir los valores correctos para cada parámetro como temperatura, humedad relativa y solvente. La ventana del software muestra también algunos parámetros adicionales como aditivos. Esto sólo es importante para los experimentos donde los aditivos están presentes en la solución precipitante. - Abra la puerta frontal de la cámara experimental y quite el portador de cubreobjetos.
- Coloque un cubreobjetos limpio y siliconado en el portador y colóquelo en el dispositivo.
Nota: El cubreobjetos tiene un tamaño de 2,2 cm. - Cerca de la cámara experimental para garantizar las condiciones ambientales del paso 1.4.
Nota: El protocolo se puede detener aquí.
2. dosificación de micro sistemas ajuste
- Interruptor ON Pump0 con las principales características de la bomba en la figura 3 y crear una corriente de agua.
Nota: La trayectoria de la corriente de agua se crea en base a algunas características de la bomba que se pueden ajustar. La figura 3 muestra las características de la bomba principal y de los valores óptimos que pueden usarse para este experimento. - Ajustar la corriente de agua con el objetivo de posición hacia el centro del cubreobjetos accionando manualmente el tornillo de ajuste señalado. Interruptor de Pump0.
- Interruptor ON Pump1 y crear una corriente de líquido como se ha hecho en el paso 2.1. Ajustar la posición de la secuencia de Pump1 hacia la posición de Pump0. Interruptor de apagado Pump1.
- Vuelva a colocar el cubreobjetos usado con una nueva y limpia para el experimento de cristalización.
Nota: Toallitas suaves generalmente se recomiendan para limpiar el nuevo cubreobjetos del polvo residual, antes de ser utilizados en el experimento de cristalización.
3. configuración de una gota de extractos de plantas en la cámara Experimental
- Crear un nuevo archivo experimental utilizando el paquete de software. Introduzca la siguiente información en el archivo experimental: proteínas (extractos de plantas de Thaumatococcus daniellii), concentración de proteínas (14 mg/mL), precipitado (tartrato de Na) y concentración de precipitante (1,2 M).
Nota: Esta información servirá para el cálculo automatizado de precipitado y proteína la concentración durante el experimento de cristalización. - Cargar el nuevo archivo de experimento para activar toda la información del paso 3.1.
- Marque la posición de la gota de proteínas mediante la adición de una gota de agua pequeña con Pump0.
Nota: El objetivo es crear una gota de agua pequeña que servirá como un punto de referencia en el cual se colocará la muestra de proteína. - Presione el botón Tara para establecer el peso dado por la microbalanza a cero.
Nota: Esto eliminará el peso del cubreobjetos y el peso extra añadido por la señal de agua creada en el paso 3.3. - Abra la tapa superior de la cámara experimental y pipetear 8 μl de la solución de extractos de plantas sobre la señal de agua.
- Registrar la nueva gota de taumatina siguiendo los siguiente comandos.
- Pulse el botón nueva de la gota para atribuir a las condiciones iniciales del archivo experimental.
- Presione el botón Const para compensar la evaporación natural del agua de la gota.
- Consulte con la cámara CCD si es con el objetivo de Pump0 en la caída de la proteína. Si es con el objetivo de la corriente de agua fuera de la gota, reajuste la posición de Pump0.
Nota: A partir de este momento la gota de la proteína se mantendrá en un peso constante, por la adición de agua automatizado que compensa la evaporación natural del agua de la gota de la proteína. El peso de la gota de la proteína, así como los otros parámetros como la temperatura y humedad relativa puede ser monitoreado en tiempo real usando la ventana de visualización. El experimento puede hacer una pausa aquí.
4. in Situ medidas de DLS
- Interruptor en las DLS del laser y el rayo láser en la caída de la proteína manualmente usando los tornillos de ajuste.
- Especifique los siguientes parámetros DLS: duración de la medida (60 s), tiempo de espera entre dos medidas (10 s) y el número de mediciones (300).
Nota: Las primeras 30 medidas servirá como medidas de referencia para la comprobación de estabilidad de la proteína. El resto de las medidas será una investigación completa de la gota de proteína durante la duración total del proceso de cristalización. - Presione el botón comenzar para iniciar las mediciones de DLS. Compruebe la calidad de la muestra seleccionando una de las representaciones gráficas de DLS.
Nota: La muestra debe mostrar un alto grado de mono-dispersity, sin cualquier agregados en la solución. Los resultados DLS pueden ser demostrados y leer como: distribución de radio, radio histograma, diagrama de radio, medidas Resumen, o como un resumen de la intensidad de la tasa de conteo.
5. muestra paso de evaporación
- Ingrese las condiciones para el paso de evaporación en la tabla de planificación de uso de los datos mostrados en la tabla 1.
Nota: El signo "-" introducidas en la columna "Molaridad/porcentaje" en la segunda fila representa una pérdida de agua de la gota de la proteína, mientras que el valor "25" significa que el volumen de la gota va a sufrir una reducción del 25%. Esto significa que aumentará la concentración de proteína de la gotita con un 25%. - Active el paso de evaporación de la muestra pulsando el botón Autom. Pulse el botón detener cuando haya finalizado la etapa de evaporación de la muestra.
- Activar el botón Const para mantener la gota constante después de dejar la evaporación de la muestra.
6. precipitante además paso
- Ingrese las condiciones para el paso de la adición del precipitante en la tabla de planificación que se muestra en la figura 4 usando los datos proporcionados en la tabla 2.
Nota: La primera fila de la tabla representa un paso de la calibración, durante el cual el software calcula la tasa de evaporación natural de la gota de proteína basada en la cantidad de precipitado que debe añadirse a la gota de la proteína. El software permite extrapolar este valor y la frecuencia de dispara de Pump0 ajusta automáticamente para compensar automáticamente la evaporación del agua para el siguiente paso de la adición del precipitante. - Activar el paso precipitante además pulsando el botón Autom.
Nota: La adición de precipitado es un proceso automatizado, después de la entrada de la tabla de planificación.
7. seguimiento de la evolución de la gota de cristalización en el tiempo
- Compruebe el aspecto de los cristales de extractos de plantas mediante el uso de la cámara CCD.
- Comprobar la distribución de tamaño de partícula mediante las representaciones gráficas de DLS.
- Comprobar la evolución de peso y parámetros experimentales mediante la ventana de visualización.
Nota: Cuando la solución de tartrato de Na-alcanza una concentración de 0,74 M en la caída de la proteína, la gota se convierte en rica en microcristales de extractos de plantas como se ve en la figura 7.
8. recuperación de la cristalización de la gotita
- Cubrir una placa de Terasaki limpio estándar con aceite de parafina.
- Añadir 3 mL de aceite de parafina a la placa.
- Dispersar el aceite de parafina en los pocillos de la placa moviendo suavemente la placa en diferentes ángulos para que el aceite cubra todos los 72 pozos de la placa.
- Retirar el exceso de aceite de parafina vertiendo el aceite que flota en la placa.
- Presione el botón Stop para terminar el experimento de cristalización. Cuidadosamente saque el portamuestras que contiene la gota de cristalización.
- Con el uso de una pipeta, colocar un volumen de 2 alícuotas de μl de la gota de cristalización en los pocillos de la placa de Terasaki.
Nota: Mediante la recuperación de la gota de la cristalización en una placa con aceite, la muestra puede ser revisada periódicamente para la estabilidad y crecimiento de cristales con el uso de un microscopio o de otras técnicas DLS que funcionan con placas de Terasaki estándar.
Representative Results
Los resultados obtenidos por las mediciones DLS durante el experimento de cristalización muestran una evolución detallada de los radios de la hidrodinámica de partículas resultando en dos fracciones de la distribución principal de la partícula, que se desarrollan con el tiempo. En la primera parte del experimento, la muestra se evaporó lentamente, con el fin de lograr una mayor concentración de proteína. Como se muestra en la figura 5B, la caída de la proteína se concentró de 14 mg/mL a 19,5 mg/mL. Durante este tiempo, según el patrón de distribución de radio en la figura 5A, la proteína muestra un comportamiento monomérico en solución con un tamaño de partícula constante de aproximadamente 2.5 nm. Como la muestra se se evapora más, la proteína monomérica se mantiene estable en solución, sin signos de desnaturalización o de agregación de la muestra.
La adición de solución precipitante a la caída de la proteína inmediatamente se inicia después de la evaporación de la muestra y destacó con gris en las radio equilibrio y patrón de las curvas de distribución para mejor visualización (figura 5). Basado en los cálculos derivados del peso de la muestra, la fracción de partícula resaltada se atribuye al inicio de la nucleación del cristal, dando como resultado un tamaño de radio de aproximadamente de 200-400 nm. Este fenómeno (conocido como nucleación) se inicia en una concentración de precipitante de 0,6 M en la gota de la proteína, en un período de tiempo de aproximadamente 66 min. desde el inicio del experimento y aproximadamente 23 minutos con respecto a la iniciación de precipitado Además. Como la concentración de los aumentos de precipitante, la distribución de radio muestra una amplia distribución de partículas en solución. Como forma más núcleos, la inicial cristalina entidades están creciendo en tamaño, llegando a una distribución de radio entre 800-1.300 nm. Se puede concluir que en esta etapa, los núcleos de cristal continúan creciendo, y la fracción de proteína poco a poco se está volviendo más pobre como las moléculas de proteína son tomadas por microcristales. Como la concentración de precipitante en la caída de la proteína aumenta lentamente, la formación de microcristales se identifica fácilmente después del minuto 75, cuando la distribución de radio continúa entre 500 y 1.500 nm. La evolución de la distribución de radio también es confirmada por imágenes de las cámaras CCD, donde son visibles en una concentración de precipitante de los 0.7m proteína microcristales en solución (figura 7). Como la adición del precipitante está terminada y la caída de la cristalización se mantiene constante, la distribución de radio muestra una fase predominante entre 1.000 y 3.000 nm, mientras que la fracción de eventos de nucleación disminuye con el tiempo. En este momento, la caída de la cristalización se satura completamente con microcristales y no hay más eventos de nucleación están presentes en la solución.
Usando como entrada experimental los datos de retroalimentación dados la microbalanza, un diagrama de fase de la cristalización fue dibujado para una comprensión integral del proceso de cristalización de extractos de plantas. En la figura 6, el diagrama de fases experimental muestra tres experimentos de cristalización independiente, donde la producción de extractos de plantas T. danielli microcristales se etiqueta como THM_2 Micro cristales (Protocolo). Dos experimentos de cristalización adicional etiquetado THM_1 Macro-cristales y THM_3 Macro-cristales se han utilizado como datos de entrada para tener una correcta asignación de las diferentes áreas en el diagrama de fases (por ej., solubilidad o región metaestable). Puesto que los protocolos para estos experimentos siguen caminos diferentes de la cristalización, la identificación de la región de nucleación se convierte en más fácil y por lo tanto más precisa. Para cada experimento, el camino de la cristalización se destaca por el número de orden para enfatizar los diferentes enfoques y varios pasos de cristalización que se utilizaron para un resultado específico, mientras que las flechas grises representan una estimación de la proteína final concentración cuando moléculas de la proteína de cristal crecimiento consumo de solución en la formación de definidas estables cristales proteicos.
Los tres experimentos la taumatina presentados en la figura 6 muestran diferentes condiciones al entrar en la región de nucleación, y los resultados de la cristalización final por lo tanto diferentes como pueden verse en los cuadros a continuación el diagrama de fases. En el caso de THM1 y THM3, la solución de proteínas pasa a la fase de nucleación y vuelve a entrar en la región metaestable, donde descansa hasta que se formen cristales. En consecuencia, los experimentos conducen a cristales en forma grandes, bien definidos rodeados por licor de madre. Sin embargo, para el experimento presentado en la sección de protocolo, cristales de THM2_micro, el sendero de cristalización sigue un enfoque particular. En una sección anterior mencionamos que para que una muestra dar microcristales, la solución de proteína tiene que se encuentra en la fase de nucleación, por lo que los eventos de nucleación pueden formar a una velocidad máxima. En el caso de cristales de THM2_micro, la proporción de proteína a concentración de precipitante se ajustó de tal manera que la muestra no sólo entra en la región de nucleación, pero como un precipitado más se agrega a la solución de proteína, y las condiciones no se mueven a otra región en el diagrama de fase, pero permanecen en un estado altamente sobresaturado en la región de nucleación. En consecuencia, la entropía de la solución disminuye drásticamente como la gota de la proteína se satura inmediatamente con pequeñas entidades cristalinas.
Figura 1. Representación esquemática del experimento de cristalización. El dibujo muestra una visión general de la cámara experimental de cristalización con todas las partes técnicas necesarias para llevar a cabo un experimento de cristalización automatizado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: ventana del Software de DLS y muestra los parámetros que son relevantes para un experimento de cristalización. Los parámetros incluyen la temperatura, humedad relativa, viscosidad, etcetera.
Figura 3: ventana de control del Software para los sistemas de dosificación de micro involucrados en el experimento de cristalización. Las características permiten ajuste de parámetros específicos para la generación de gotas o flujo de solución.
Figura 4: ventana de Software para la tabla de planificación que describe las etapas de cristalización en el experimento de. Las condiciones iniciales de la gota de cristalización también están integradas en esta ventana.
Figura 5. Resumen de extractos de plantas producción de microcristales de T. daniellii . (A) distribución de radio de tamaño de partícula en la caída de la proteína durante el proceso de cristalización completa. (B) Resumen de monitoreo de parámetros experimentales. Los diagramas representan la evolución en el tiempo por el peso de la gota de la proteína (curva negra) junto con la concentración calculada (curva roja) y la concentración de precipitante (curva azul). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Diagrama de fases Experimental cristalización de taumatina danielli T. junto con los resultados que. Todas las parcelas se derivan de datos experimentales, basados en la información de retroalimentación de la microbalanza. Los números atribuidos a cada experimento que son visibles entre paréntesis representan el orden y el número de pasos durante un protocolo de cristalización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: fotografía grabado de cristales THM2_Micro (Protocolo) que muestra un número abundante de microcristales en solución. La foto fue tomada en 4 horas (240 minutos) después de poner la gota de proteínas en la cámara experimental para la cristalización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: fotografía grabado para THM_1 Macro-cristales algunos extractos de plantas grandes cristales estables en solución. La foto fue tomada 20 h después de poner la gota de proteínas en la cámara experimental para la cristalización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: fotografía grabado para THM_3 Macro-cristales varios tamaños de cristales de extractos de plantas en solución. La foto fue tomada 20 h después de poner la gota de proteínas en la cámara experimental para la cristalización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Sustancia | Molaridad/porcentaje | Tiempo (s) |
| agua | 0 | 100 |
| agua | -25 | 2100 |
| agua | 0 | 2100 |
Tabla 1: Entrada de calendario automatizado para la evaporación de la muestra paso en la producción de microcristales de extractos de plantas.
| Sustancia | Molaridad/porcentaje | Tiempo (s) |
| agua | 0 | 100 |
| PREC | 0,8 | 1800 |
| agua | 0 | 18000 |
Tabla 2: paso de entrada de programa automatizado para la adición del precipitante en la producción de extractos de plantas microcristales.
Discussion
El dispositivo de cristalización está diseñado para controlar y manipular parámetros cruciales durante un experimento de cristalización basado en un método de difusión de vapor modificada. Esta técnica permite monitoreo y anotando un experimento de cristalización de proteínas en todas las etapas, lo que permite al usuario tener un conocimiento preciso y control de la solución de la proteína en el diagrama de fases de cristalización, en el in situ análisis DLS de la suspensión de la muestra.
El dispositivo de cristalización comprende una cámara experimental (figura 1) conectada a una cámara CCD que permite monitorizar en tiempo real de la gota de cristalización. La cámara está adaptada a un microscopio equipado con lentes de diferentes aumentos, proporcionando una resolución espacial máxima de aproximadamente 2.5 μm. El núcleo de la cámara experimental es una Microbalanza ultrasensible para el seguimiento de la evolución del peso de muestra con el tiempo. El procedimiento de cristalización corresponde a un experimento de sentarse y soltar vapor difusión, donde la caída de la proteína se pone en un cubreobjetos siliconado, que se coloca en la microbalanza. Basado en los cambios de peso de la gota, que son causadas por la adición del precipitante, adición de aditivo de agua o evaporación de la muestra, la microbalanza da una entrada precisa de un algoritmo para el cálculo inmediato de la concentración de proteína y precipitado con el tiempo . Además, cristalización importante parámetros tales como temperatura y humedad relativa precisamente son monitoreados y controlados.
Para llevar a cabo un experimento de cristalización, el dispositivo está equipado con dos sistemas de micro dosificación (bombas piezoeléctricas libres de contacto) que funcionan en una escala de picolitros para precipitado y agua. Al trabajar con cantidades tan pequeñas de sustancia, los gradientes de concentración y el fenómeno de la convección dentro de la gota de proteína se reducen al mínimo. El papel principal de las bombas piezoeléctricos es la adición de agua, este último por ejemplo se utiliza como compensación por evaporación natural de la gota de proteína o precipitado. Los sistemas de dosificación de micro tienen un conjunto de características, que puede dictar la adición de una sustancia. Tales características incluyen: la tasa de repetición para la adición de una sustancia, ha añadido el número de gotas por segundo, el ancho y alto de la trayectoria de la corriente de sustancia, etcetera. Además, la posición de las bombas puede ser ajustada manualmente, permitiendo al usuario tener una posición precisa para la adición de sustancias a la gota de la proteína.
La manipulación de la única retroalimentación controlada de la gota de cristalización se logra en situ DLS los datos, que pueden demostrar posibles cambios en el estado oligomeric proteína a lo largo de todo el procedimiento experimental. La técnica permite la evaluación constante de la distribución de tamaño de partícula con el tiempo, revelando así desconoce los mecanismos relacionados con la proteína. El equipo de óptica DLS es coloca estratégicamente por debajo del cubreobjetos, permitiendo que el detector y laser rayo pase a través de cubreobjetos y más a través de la gota de la proteína de una moda en situ ; por lo tanto, se registran sólo cambios dentro de la gota de la trayectoria DLS. Para permitir el fácil manejo, el dispositivo tiene dos aberturas: una puerta para una colocación óptima del cubreobjetos y una tapa que se puede quitar, para que el usuario puede ajustar la posición de tiro de los sistemas de dosificación de micro así como establecer con precisión una nueva dro de proteína Plet en el cubreobjetos.
El método de cristalización interactiva utilizando el dispositivo mencionado es una técnica confiable para la producción controlada por el tamaño de cristales proteicos. Aunque actualmente existen muchos métodos de cristalización, información acerca de la cristalización mecanismo en sí no es fácilmente alcanzable. En general, aplicación de métodos de cristalización convencional permite solamente un control limitado de una solución en el diagrama de fases de cristalización, con sólo algunas posibilidades de cambiar su curso una vez comenzado un experimento. Al realizar una cristalización experimentar y aplicar una tecnología cristalización automatizado juntada con en situ DLS, un gran cantidad de conocimiento se obtiene sobre las transiciones en el diagrama de fases. En general, las regiones, dando por resultado precipitado amorfo y la inducción de la nucleación homogénea están cerca uno del otro en el diagrama de fases. Por lo tanto, al manipular el curso de una gotita de cristalización basada en tiempo real información sobre su distribución de partícula, es posible evitar la precipitación de una proteína ajustando gradualmente las condiciones de cristalización hacia la nucleación y formación de cristales.
Hoy en día, muchas condiciones de cristalización incluyen soluciones precipitante donde están extensamente presentes derivados de glicol polietileno (PEG). Dichos compuestos tienen generalmente una alta viscosidad que puede poseer dificultades para pipeteo o dispensación. En el presente estudio de caso, los sistemas de micro dosis que se utilizan para la erogación del precipitante aplicarán capilares muy finos que permiten la adición de incrementos de picolitros. En consecuencia, existen algunas limitaciones en el trabajo con sustancias altamente viscosas. Dentro de una serie de experimentos anteriores, el sistema ha dado resultados positivos usando los siguientes derivados de PEG: PEG200 50%, PEG3000 20%, PEG6000 10%, PEG800010%. Aunque hasta ahora sólo las soluciones mencionadas fueron probadas, los sistemas de dosificación de micro contienen un mecanismo de calentamiento especial que puede ser utilizado para disminuir la viscosidad de una solución. Otro factor es soluciones de sal que habrían que considerar cuando se utiliza como precipitante de proteínas. Cuando se trabaja con sales altamente concentradas, una pequeña cantidad puede cristalizar en la boquilla de dosificación de micro, causando bloqueo superficial de la bomba de dosificación de micro durante la adición del precipitante; incluso cuando una humedad relativa muy alta está presente en la cámara experimental. Para resolver este problema, el experimento debe ser puesto en espera para que la sal de la boquilla se puede quitar. Esto podría requerir un tratamiento especial y puede producir errores en la fase de la adición del precipitante.
Basado en la información valiosa que puede obtenerse al realizar tales experimentos de cristalización automatizado, esta técnica puede también extenderse a estudios que investigaron los aspectos de química física de la cristalización de proteínas. Las tasas de reacción de nucleación y cristal crecimiento son fenómenos cinéticos que pueden ser derivados y calculados en base a la información de dependencia de tiempo representada de un experimento como la temperatura, el crecimiento de tamaño de partícula y la proteína y precipitante concentración.
Disclosures
Por la presente declaramos que los autores Arne Meyer, Karsten Dierks y Christian Betzel son accionistas de la compañía GmbH Xtal-conceptos, productor de la tecnología de XtalController900.
Acknowledgments
Los autores reconocen que la financiación de la Unión Europea Horizon 2020 programa de investigación e innovación Marie Sklodowska-Curie Acronym "X-sonda" beca Convenio Nº 637295 y soporte a través de BMBF grant 05K16GUA y el "el Hamburgo centro de ultrarrápida La proyección de imagen, estructura, dinámica y Control de la materia a escala atómica"racimo de la excelencia de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | 1002365940 | Protein for protocol |
| Bis-Tris 14880 | Sigma-Aldrich | 2302377 | Buffer for protein solution |
| di-Sodium tartrate dihydrate | AppliChem | A0451,0500 | Precipitant for protein solution |
| Silliconized coverslips | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1051203 | Coverslips for crystallization |
| Syringe filter | Starstedt | 831826001 | Filter pore 0.2 µm |
| Syringe | Omnifix | 4617207V | Luer Lock Solo 20 mL |
| Paraffin oil | Sigma-Aldrich | 2323842 | Oil for coating the plate |
| Standard Terakasi plate | Sigma-Aldrich | M5812270EA | Plate for recovering the crystallization droplet |
| Soft wipes | KIMTECH Science | ||
| XtalController900 | Xtal-Concepts GmbH | XTC900 | Crystallization device |
References
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