Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

रिकॉमबिनेंट प्रोटीन के विकास के लिए पुराने दर्द का इलाज

Published: April 11, 2018 doi: 10.3791/57071
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 1,3
1Laboratory of Translational Immunology, University Medical Center Utrecht, Utrecht University, 2Department of Rheumatology & Clinical Immunology, University Medical Center Utrecht, Utrecht University, 3Laboratory of Neuroimmunology and Developmental Origins of Disease, University Medical Center Utrecht, Utrecht University

Summary

इस पत्र में हम एक IL4-10 रिकॉमबिनेंट फ्यूजन प्रोटीन के उत्पादन और गुणवत्ता नियंत्रण के तरीकों के लिए विवरण प्रदान करते हैं । हम यह भी दिखाने के लिए इस प्रोटीन की प्रभावशीलता का परीक्षण करने के लिए भड़काऊ दर्द का एक माउस मॉडल में दर्द को हल करने के लिए ।

Abstract

पुराने दर्द का इलाज करने के लिए मुश्किल है और लगातार दर्द को हल करने के लिए नए दृष्टिकोण तत्काल जरूरत है । विरोधी भड़काऊ साइटोकिंस ंयायपालिका न्यूरो प्रतिरक्षा बातचीत को विनियमित करने के लिए उनकी क्षमता के कारण दुर्बल दर्द की स्थिति के इलाज के लिए उंमीदवारों का वादा कर रहे हैं । हालांकि, शारीरिक रूप से वे विभिंन साइटोकिंस के एक नेटवर्क में काम करते हैं, और इसलिए उनके उपचारात्मक प्रभाव इष्टतम नहीं किया जा सकता है जब स्टैंड-अलोन दवाओं के रूप में इस्तेमाल किया । इस सीमा को दूर करने के लिए, हम विरोधी भड़काऊ साइटोकिंस IL4 और IL10 का फ्यूजन प्रोटीन विकसित की है । यहां, हम उत्पादन और IL4 के गुणवत्ता नियंत्रण-10 रिकॉमबिनेंट फ्यूजन प्रोटीन के लिए तरीकों का वर्णन है और हम लगातार भड़काऊ दर्द का एक माउस मॉडल में दर्द को हल करने के लिए IL4-10 संलयन प्रोटीन की प्रभावशीलता का परीक्षण ।

Introduction

पुराने दर्द 21 वीं सदी के सबसे दुर्बल और इलाज चिकित्सा समस्याओं में से एक बनी हुई है, प्रभावित > वयस्क आबादी1के 20%,2। हालांकि, उपचार पुराने दर्द से राहत प्रदान करने के लिए अक्सर अप्रभावी या गंभीर साइड इफेक्ट के कारण बंद किया जाना चाहिए3. महत्वपूर्ण बात, वर्तमान में उपलब्ध दवाओं केवल रोगसूचक राहत प्रदान करते हैं, लेकिन काफी संशोधित या पुराने दर्द का इलाज नहीं है । हालांकि पुराने दर्द के लिए एक स्नायविक विकार प्रतीत होता है, सबूत पुराने दर्द विकास में प्रतिरक्षा प्रणाली की भागीदारी4पता चलता है,5। इसके अलावा, प्रतिरक्षा आधारित दृष्टिकोण दर्द का इलाज करने के लिए उभर रहे हैं । उदाहरण के लिए, विरोधी भड़काऊ साइटोकिंस पुराने दर्द6,7,8के कई मॉडलों में दर्द को बाधित । हालांकि, विरोधी भड़काऊ साइटोकिंस एक छोटी आधा जीवन है, उनके संभावित दर्द बाधा प्रभाव को कम करने । इसके अलावा, विरोधी भड़काऊ साइटोकिंस एक दूसरे के साथ संगीत कार्यक्रम में सबसे बेहतर काम करते हैं । इन सीमाओं को दूर करने के लिए, हम हाल ही में विरोधी भड़काऊ साइटोकिंस interleukin-4 (IL4) और interleukin-10 (IL10) एक अणु में जुड़े । IL4-10 फ्यूजन प्रोटीन व्यक्ति साइटोकिंस9की तुलना में जीर्ण भड़काऊ और neuropathic दर्द को बाधित करने में बेहतर प्रभावकारिता से पता चलता है । यहां हम वर्णन कैसे ऐसे फ्यूजन प्रोटीन का उत्पादन किया है, शुद्ध, और कैसे अपनी गुणवत्ता नियंत्रित है ।

IL4-10 संलयन प्रोटीन एक ुपे अभिव्यक्ति वेक्टर सीडीएनए-10 फ्यूजन प्रोटीन कोडिंग ले जाने के साथ HEK293-एफ कोशिकाओं के क्षणिक अभिकर्मक द्वारा मानव कोशिकाओं में उत्पादित है । HEK293-F कोशिकाओं प्रोटीन के बाद अनुवाद के संशोधन के लिए अनुमति देने के लिए चुना जाता है, कुछ है कि बैक्टीरियल अभिव्यक्ति प्रणालियों में नहीं होती है । sialic एसिड के साथ कैपिंग glycan का अनुकूलन करने के लिए, सीडीएनए कोडिंग बीटा-galactoside-2, 3-sialyl-ट्रांस्फ़्रेज़ वेक्टर में एक दूसरे transgene के रूप में शामिल किया गया है । फ्यूजन प्रोटीन संस्कृति supernatant के संबध प्रोटीन शुद्धि का उपयोग कर शुद्ध है क्योंकि यह अंय तरीकों से शुद्धि से अधिक शक्तिशाली है जैसे आकार अपवर्जन या आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी10,11। IL4-10 फ्यूजन प्रोटीन शुद्ध करने के लिए, हम में इस्तेमाल किया घर IL4 के खिलाफ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी बनाया. शुद्धता और शुद्ध IL4 की गैर-गतिविधि का मूल्यांकन-10 संलयन प्रोटीन गुणवत्ता नियंत्रण के एक भाग के रूप में किया जाता है । उत्पादित बैचों की पवित्रता सोडियम Dodecyl सल्फेट Polyacrylamide जेल ट्रो (एसडीएस-पृष्ठ) और उच्च दबाव आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (HP-SEC) द्वारा मूल्यांकन किया जाता है । IL4-10 फ्यूजन प्रोटीन की एक पूरी रक्त संस्कृतियों में lipopolysaccharide (एलपीएस)-प्रेरित ट्यूमर परिगलन कारक-अल्फा (TNFα) उत्पादन को बाधित करने की क्षमता को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया जाता है, और यह व्यक्ति के संयोजन के लिए तुलना साइटोकिन्स.

अंत में, आदेश में IL4 की क्षमता का परीक्षण करने के लिए-10 फ्यूजन प्रोटीन पुराने दर्द को बाधित करने के लिए, हम का वर्णन कैसे फ्यूजन प्रोटीन लगातार भड़काऊ दर्द के व्यापक रूप से इस्तेमाल किया माउस मॉडल में एनाल्जेसिक के रूप में परीक्षण किया जा सकता है12,13,14 . यहां हम एक भड़काऊ दर्द मॉडल के तरीकों का वर्णन । हालांकि, यह महत्वपूर्ण है ध्यान दें कि अंय दर्द मॉडलों का इस्तेमाल किया जा सकता है (जैसे, neuropathic दर्द मॉडल), अनुसंधान के सवालों के आधार पर है कि उत्तर की जरूरत है । इन मॉडलों में दर्द का आकलन करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है व्यवहार उपाय है कि पैदा हुआ और गैर पैदा दर्द उपायों की एक किस्म का उपयोग करें । यहां, हम यांत्रिक और थर्मल में व्यवहार प्रतिक्रियाओं में परिवर्तन के लिए मूल्यांकन के तरीकों का वर्णन किया । अहानिकर उत्तेजनाओं के लिए यांत्रिक संवेदनशीलता वॉन Frey परीक्षण का उपयोग कर मूल्यांकन किया है, whilst थर्मल संवेदनशीलता Hargreaves परीक्षण का उपयोग कर मूल्यांकन किया है । महत्वपूर्ण बात, गैर पैदा hyperalgesia/allodynia गतिशील वजन असर परीक्षण का उपयोग कर मापा जाता है । इन उपायों को व्यापक रूप से दर्द के उपाय के रूप में स्वीकार किए जाते है और दर्द थ्रेसहोल्ड और संभावित जानवरों द्वारा अनुभवी दर्द पर महत्वपूर्ण जानकारी उपज15,16,17। अंय उपायों गैर पैदा दर्द का आकलन करने के लिए (जैसे, उत्तेजना स्वतंत्र), जैसे वातानुकूलित जगह वरीयता परीक्षण के रूप में,18मूल्यवान हो सकता है । दर्द को बाधित करने के लिए दवा की क्षमता का आकलन करने के लिए, हम फ्यूजन प्रोटीन के intrathecal प्रशासन प्रदर्शन किया, के रूप में प्रशासन के इस मार्ग के साथ कम प्रोटीन खुराक दर्द से संबंधित क्षेत्रों तक पहुँचने के लिए और प्रणालीगत (साइड) प्रभाव से बचने की जरूरत है19, 20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी पशु प्रयोगों के अंतरराष्ट्रीय दिशानिर्देशों और स्थानीय प्रायोगिक नैतिक समिति से पूर्व अनुमोदन के अनुसार प्रदर्शन किया गया. पूरे रक्त नीदरलैंड में विश्वविद्यालय के मेडिकल सेंटर Utrecht (UMCU) में मिनी दाता सेवा (मिनी दाता Dienst, MDD) से प्राप्त किया गया था । MDD को UMCU (Medisch Ethische Toetscommissie) की चिकित्सा आचार समिति से सकारात्मक अनुमोदन प्राप्त हुआ है इसके लिए प्रोटोकॉल संख्या 07-125/

1. प्रोटीन उत्पादन और लक्षण वर्णन

  1. सेल संस्कृति
    नोट: संस्कृति माध्यम इस्तेमाल के लिए सामग्री की तालिका देखें ।
    1. ३७ ° c पर HEK293-F कोशिकाओं गल जब तक वहां बर्फ का एक छोटा सा झुरमुट है । पिघला हुआ कोशिकाओं को तुरंत बर्फ-ठंडा मध्यम (4 डिग्री सेल्सियस) के 10 मिलीलीटर स्थानांतरण और कमरे के तापमान (आरटी) पर सेल निलंबन के लिए 4 मिनट (मिनट) ५०० x g पर ।
    2. मध्यम निकालें और RT पर ताजा माध्यम के 10 मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पेंड, 4 मिनट के लिए ५०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा पीछा किया ।
    3. supernatant निकालें और आरटी पर मध्यम के 5 मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पेंड । सेल सस्पेंशन को सीधे प्री-वार्म्ड मीडियम (३७ डिग्री सेल्सियस) के 25 मिलीलीटर वाली १२५ एमएल की कुप्पी में डालें । संस्कृति ३७ ° c, 8% CO2, और ९५% आर्द्रता एक कक्षीय शेखर पर १२५ rpm की गति से घूर्णन पर कोशिकाओं ।
    4. उपसंस्कृति सप्ताह में दो बार कोशिकाओं । कक्ष संख्या और कक्ष व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए स्वचालित सेल काउंटर ( सामग्री तालिकादेखें) का उपयोग करें । बीज Erlenmeyer कुप्पी में 3 x 105 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता पर व्यवहार्य कोशिकाओं । संस्कृति के कुल मात्रा के 1/5 पर संस्कृति माध्यम के कुल मात्रा में रखें Erlenmeyer कुप्पी हर समय वातन इष्टतम रखने के लिए ।
  2. अभिकर्मक
    नोट: उपसंस्कृति कोशिकाओं को तीन से चार बार पहले अभिकर्मक और उंहें transfect जब सेल व्यवहार्यता है > 90% । कोशिका व्यवहार्यता एक स्वचालित (इलेक्ट्रिक फील्ड मल्टी चैनल) cellcounting प्लाज्मा झिल्ली की अखंडता पर आधारित प्रणाली द्वारा मूल्यांकन किया है । अभिकर्मक एजेंट के लिए सामग्री की तालिका देखें ।
    1. 4 मिनट के लिए RT पर ५०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक; पूर्व गर्म संस्कृति मध्यम (३७ डिग्री सेल्सियस) के 10 मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पैंड और सेल निलंबन को पतला ~ १.० x 106 कोशिकाओं/एमएल Aliquot की कुल मात्रा में सेल सस्पेंशन ५०० एमएल Erlenmeyer कुप्पी में १०० मिलीलीटर की 10 aliquots में है ।
    2. पतला 1 ३३ मिलीलीटर में प्लाज्मिड डीएनए की मिलीग्राम कम-सीरम न्यूनतम आवश्यक माध्यम (मेम, सामग्री की तालिकादेखें) कोमल मिश्रण से. एक अलग ट्यूब में पतला १,३३० µ l मेम में अभिकर्मक रिएजेंट का कोमल मिश्रण करके. 5 min. Add और मेम में अभिकर्मक एजेंट को मेम में पतला डीएनए मिश्रण और आर टी में 30 मिनट के लिए मिश्रण गर्मी के लिए आर टी पर दोनों समाधान की मशीन ।
    3. कोशिकाओं (खंड 1 में संस्कृति) के लिए डीएनए अभिकर्मक एजेंट मिश्रण जोड़ें; प्रत्येक ५०० मिलीलीटर Erlenmeyer कुप्पी के लिए मिश्रण के ६.६ मिलीलीटर जोड़ें संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं की १०० मिलीलीटर से युक्त । पहले उल्लेखित culture स्थितियों में कक्षों को बनाए रखें । अभिकर्मक के बाद तीन दिन स्रावित IL4-10 फ्यूजन प्रोटीन युक्त संस्कृति supernatant फसल ।
    4. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक IL10 एलिसा प्रदर्शन करके संस्कृति supernatant में IL4-10 फ्यूजन प्रोटीन की एकाग्रता का निर्धारण ( सामग्री की तालिकादेखें).
      नोट: इष्टतम संस्कृति की स्थिति में, फ्यूजन प्रोटीन की एकाग्रता २.५ और 5 µ g/एमएल के बीच होने की उम्मीद की जा सकती है ।
  3. अपनत्व क्रोमैटोग्राफी द्वारा प्रोटीन शुद्धिकरण
    नोट: अपनत्व क्रोमैटोग्राफी कमरे के तापमान पर किया जाता है । हालांकि, सभी अंशों (कल्चर supernatant, लोड, प्रवाह के माध्यम से, और रेफरेंस अंशों) को प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर रखा जाता है ।
    1. जोड़ा 10 एक घर में निर्मित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के खिलाफ IL4 के 1 जी CNBr के खिलाफ-सक्रिय sepharose 4B, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार ( सामग्री की तालिकादेखें). कांच क्रोमैटोग्राफी कॉलम (30 सेमी लंबाई और १.५ सेमी भीतरी व्यास में धीरे युग्मित sepharose मोतियों की २.५ मिलीलीटर डालो, सामग्री की तालिकादेखें) ।
    2. इस स्तंभ के माध्यम से 1% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन युक्त फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के ५० मिलीलीटर गुजर द्वारा मोतियों की शेष बाध्यकारी साइटों को ब्लॉक । पंजाब के 25 मिलीलीटर (पीएच = ७.४) के साथ कॉलम धो ०.१ मीटर Glycine बफर के १२.५ मिलीलीटर (पीएच = २.५) और पंजाब के 25 मिलीलीटर (पीएच = ७.४) के बाद ।
    3. 10 गुना केंद्रित HEK293 सेल संस्कृति supernatant के पास १०० मिलीलीटर की एक प्रवाह दर पर कॉलम के माध्यम से 1 मिलीलीटर/पंजाब के ५० मिलीलीटर के साथ कॉलम धो लो ।
    4. Elute ०.१ मीटर Glycine बफर की १२.५ मिलीलीटर के साथ बाउंड IL4-10 फ्यूजन प्रोटीन (pH = २.५) 1 मिलीलीटर/मिनट की एक प्रवाह दर पर और २.५ मिलीलीटर के अंशों को इकट्ठा करें । 7 के लिए पीएच लाने के लिए प्रत्येक अंश के लिए 1 मीटर Tris बफर (पीएच = 9) के ३५० µ एल जोड़ें । Dialyze बेअसर पंजाब के 2 एल के खिलाफ रातोंरात अंश (पीएच = ७.४) ।
      1. 16 मिमी शुष्क व्यास और एक ३.५ K आणविक वजन कट-ऑफ के साथ डायलिसिस टयूबिंग का उपयोग करें । बाँझ फिल्टर ०.४५ µ मीटर ताकना व्यास के साथ प्रयोज्य फिल्टर का उपयोग कर dialyzed अंश । स्टोर बाँझ IL4-८० डिग्री सेल्सियस पर aliquots में 10 संलयन प्रोटीन समाधान ।
    5. Coomassie-सना हुआ 12% एसडीएस-PAGE जेल और HP-sec (3 µm सेकंड-२००० कॉलम) द्वारा eluted IL4-10 संलयन प्रोटीन की शुद्धता का मूल्यांकन करें । HP-SEC विश्लेषण के लिए, स्तंभ पर ~ 1 मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता में प्रोटीन का लोड ४० µ एल । एक मोबाइल चरण के रूप में १५० mm सोडियम क्लोराइड (पीएच = ६.८) के साथ १०० mm सोडियम फॉस्फेट बफर का प्रयोग करें । 1 मिलीलीटर/मिनट पर प्रवाह की दर निर्धारित करें ।
    6. IL10 एलिसा और Bicinchoninic एसिड प्रोटीन परख (बीसीए प्रोटीन परख किट द्वारा शुद्ध IL4-10 फ्यूजन प्रोटीन के प्रत्येक बैच की एकाग्रता का निर्धारण, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार सामग्री की तालिकादेखें) ।
    7. एलिसा परख में मानक वक्र बनाने के लिए रिकॉमबिनेंट मानव IL10 का प्रयोग करें । रिकॉमबिनेंट IL10 (18 केडीए) और IL4-10 फ्यूजन प्रोटीन के बीच के आकार के अंतर के लिए सही करने के लिए (३४ केडीए), १.८ के एक कारक द्वारा प्राप्त एकाग्रता गुणा.
  4. IL4 की गैर-गतिविधि-10 संलयन प्रोटीन
    नोट: पूरे रक्त परख IL4 के प्रत्येक बैच के लिए किया जाता है-10 संलयन प्रोटीन का उत्पादन और विभिंन बैचों की गतिविधि गुणवत्ता नियंत्रण के एक भाग के रूप में तुलना में है । पूरे रक्त परख ताजा मानव रक्त में प्रदर्शन किया है हेपरिन ट्यूबों में परख के दिन एकत्र । रक्त हमारे घर में दाता सेवा में स्वस्थ स्वयंसेवकों से प्राप्त किया गया था । नमूनों को संभावित जैविक खतरों के रूप में संभाला जाना चाहिए ।
    1. तैयार 3-गुना सीरियल पूर्व-कमजोर पड़ने के शुद्ध IL4-10 RPMI मध्यम में फ्यूजन प्रोटीन ( सामग्री की तालिकादेखें) एक एकाग्रता सीमा से अधिक 5-१,२१५ एनजी/
    2. एलपीएस की पूर्व-कमजोरियां तैयार करें (१०० एनजी/एमएल) और मानव रक्त है कि RPMI मध्यम में 4 बार पतला है ।
    3. IL4-10 फ्यूजन प्रोटीन, एलपीएस, और एक ४८-अच्छी तरह से थाली में मानव रक्त के पूर्व कमजोर पड़ने पिपेट । एक अच्छी तरह से करने के लिए, जोड़ें ५० µ l IL4-10 संलयन प्रोटीन (अंतिम एकाग्रता 1-243 एनजी/एमएल), ७५ µ एल RPMI मध्यम, 25 µ एल एलपीएस (अंतिम एकाग्रता 10 एनजी/एमएल), और १०० µ एल मानव रक्त (अंतिम पतला) ।
      नोट: कुल मात्रा प्रति अच्छी तरह से २५० µ एल है ।
    4. ३७ ° c, 8% CO2, और ९५% आर्द्रता के लिए 18 एच में थाली मशीन ।
    5. एक TNFα एलिसा का उपयोग संस्कृति supernatants में TNFα की एकाग्रता का मूल्यांकन, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार ।
    6. IL4 द्वारा भड़काऊ प्रतिक्रिया के निषेध की गणना-10 संलयन प्रोटीन सूत्र के अनुसार:% निषेध = (1-(A-b)/(C-b)) x १००
      नोट: यहां एक = एलपीएस में TNFα के स्तर को उत्तेजित संस्कृतियों IL4-10 फ्यूजन प्रोटीन के साथ इलाज किया, बी = उत्तेजित संस्कृति में TNFα स्तर, और सी = TNFα को उत्तेजित संस्कृति में स्तर ।

2. लगातार भड़काऊ दर्द के लिए माउस मॉडल

नोट: यह महत्वपूर्ण है के लिए पुरुष और मादा दोनों चूहों का उपयोग करें (C57Bl 6) क्योंकि यह सेक्स पर निर्भर प्रभाव की पहचान कर सकेंगे । सामांय में, इस्तेमाल चूहों 8-16 सप्ताह के बीच पुराने हैं । आवश्यक पशुओं की संख्या निर्धारित करने के लिए, बिजली की गणना प्रदर्शन किया जाना चाहिए । वेब आधारित उपकरण ऐसी गणना करने के लिए आसानी से इंटरनेट पर पाए जाते हैं (उदा, http://www.powerandsamplesize.com; http://www.sample-size.net) ।

  1. जीर्ण भड़काऊ दर्द की प्रेरण
    नोट: carrageenan या पूरा फ्रायड सहायक (intraplantar) के इंजेक्शन के साथ वयस्क चूहों में लगातार भड़काऊ दर्द प्रेरित । विभिंन परीक्षणों में एक दूसरे के साथ हस्तक्षेप नहीं करते ।
    1. λ-carrageenan को भंग करके (2% w/v) carrageenan तैयार करें ( सामग्री की तालिकादेखें) ०.९% NaCl में एक 23 गेज सुई के माध्यम से समाधान पारित करके सुनिश्चित करें कि carrageenan ठीक से भंग हो रहा है । इंजेक्शन के प्रदर्शन से पहले सीधे नए सिरे से समाधान तैयार करें ।
    2. वैकल्पिक रूप से, यदि एक प्रकार का प्रयोग किया जाता है, तो यह intraplantarly इंजेक्शन से पहले, ठीक से एक पानी में तेल पायस माइकोबैक्टीरियम तपेदिक (H37Ra) की गर्मी और सूखे, ०.८५ मिलीलीटर आयल तेल, और ०.१५ एमएल mannide के 1 मिलीग्राम युक्त इमल्शन है । monooleate ( सामग्री की तालिकादेखें).
      नोट: ग्लास हैमिल्टन सीरिंज धातु plungers के साथ इस यौगिक इंजेक्शन के लिए सिफारिश कर रहे हैं क्योंकि रबर plungers सहायक में तेल के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं.
    3. Intraplantar इंजेक्शन
      1. यौगिक को बनाए रखने (2.1.1 या 2.1.2 कदम) आर टी पर सिरिंज के लिए आरटी में इंजेक्शन के लिए समायोजन की अनुमति के लिए आर टी से पहले (या एक नियंत्रण के रूप में विज्ञानी) यौगिक के 20 µ एल इंजेक्षन गैर के हिंद पंजा में चमड़े-anesthetized माउस एक 30 गेज का उपयोग सुई.
      2. एड़ी के लिए निर्देशन अंगूठे के आधार पर सुई डालें और जब सुई लगभग ०.५ सेमी डाला जाता है यौगिक सुई । इंजेक्शन के बाद, धीरे सुई whilst थोड़ा इंजेक्शन साइट से बाहर समाधान के रिसाव से बचने के लिए घूर्णन को वापस लेना ।

3. दर्द माप

नोट: सुनिश्चित करें कि शोधकर्ताओं व्यवहार प्रयोगों प्रदर्शन माउस उपचार के लिए अंधा कर रहे हैं । किसी भी माप का प्रदर्शन करने से पहले जानवरों को टेस्टिंग के माहौल में acclimatize करना जरूरी है । अधिमानतः, प्रयोग शुरू करने से पहले सप्ताह, जानवरों के लिए विभिंन परीक्षण प्रदर्शन के लिए इस्तेमाल किया उपकरणों में से प्रत्येक में 15-30 मिनट के लिए 1-2 बार रखा जाता है । जब एक ही प्रयोग में पुरुषों और महिलाओं से निपटने, पुरुषों का स्वतंत्र रूप से महिलाओं का मूल्यांकन । साफ पिंजरों और विभिन्न समूहों के बीच बड़े पैमाने पर सतहों विभिन्न लिंगों के व्यवहार पर संभावित अवांछित प्रभाव से बचने के लिए. आधार रेखा आहरण विलंब या यांत्रिक थ्रेशोल्ड को मापने के लिए दो से तीन बार सटीक रूप से आधारभूत थ्रेशोल्ड निर्धारित करें और पहचानें कि क्या ये किसी भी यौगिक के intraplantar इंजेक्शन से पहले स्थिर हैं ।

  1. वॉन Frey टेस्ट: अहानिकर उत्तेजनाओं के लिए यांत्रिक संवेदनशीलता
    1. एक तार मेष स्टैंड पर एक्रिलिक पिंजरों में व्यक्तिगत रूप से जानवरों प्लेस और चूहों को माप करने से पहले कम से 15 मिनट के लिए acclimatize करने की अनुमति ।
    2. ०.०२ से लेकर वॉन Frey हेयर्स की एक नपे श्रृंखला के जवाब में पंजा वापसी सीमा को मापने के द्वारा यांत्रिक संवेदनशीलता का आकलन 4 जी. एक सकारात्मक वापसी प्रतिक्रिया के रूप में लागू बालों से दूर पंजा के किसी भी आंदोलन पर विचार करें । पर्याप्त बल के साथ पंजा सतह के लिए सीधा रेशा लागू करने के लिए त्वचा के खिलाफ थोड़ा झुकने का कारण है और के लिए पकड़ ~ 3 एस । सुनिश्चित करें कि पंजा के लिए आवेदन के दौरान बाल मोड़ नहीं है ।
    3. ऊपर-और-नीचे विधि का उपयोग कर ५०% पंजा-आहरण सीमा की गणनाकरें15,21.
      नोट: लागू करने के लिए पहला रेशा ०.४ g (अन्य प्रारंभिक रेशा उपयोग किया जा सकता है सीमा के आधार पर इन चूहों आधारभूत पर प्रदर्शित). एक रेशा के जवाब की कमी इंगित करता है कि अगले मोटा रेशा निम्नलिखित उत्तेजना में प्रयोग किया जाता है, जबकि एक सकारात्मक प्रतिक्रिया अगले पतले रेशा के उपयोग को इंगित करता है. बाल प्रस्तुतियों की संख्या पहले अंतर प्रतिक्रिया द्वारा निर्धारित किया जाता है; उसके बाद 5 और आवेदनों का प्रदर्शन किया जाता है । ५०% थ्रेशोल्ड की गणना पहले वर्णित विधियों के अनुसार15,21.
  2. थर्मल संवेदनशीलता: Hargreaves टेस्ट
    1. एक पूर्व गर्म (30 डिग्री सेल्सियस) कांच की थाली पर पिंजरों में जानवरों प्लेस और चूहों को माप करने से पहले कम से 15 मिनट के लिए acclimatize करने के लिए अनुमति देते हैं, जब तक जानवरों अभी भी बैठते हैं इंतज़ार कर.
    2. एक Hargreaves तंत्र का उपयोग कर एक केंद्रित दृश्य प्रकाश बीम द्वारा जानवरों का पंजा हीटिंग द्वारा गर्मी वापसी विलंबता बार निर्धारित ( सामग्री की तालिकादेखें).
      नोट: बीम की तीव्रता 12% करने के लिए सेट है, क्योंकि यह प्रयोग निर्धारित तीव्रता सेटिंग के साथ, प्रकाश बीम C57Bl/6 चूहों पर आधार रेखा पर 8 एस की एक औसत समय की एक वापसी प्रतिक्रिया उदाहरण देते हैं । तीव्रता सेटिंग व्यक्तिगत मशीन और माउस तनाव के प्रति निर्धारित किया जाना चाहिए । अधिक से अधिक कट-ऑफ बार 20 एस या अधिक जानवरों के लिए चोट से बचने के लिए उपयोग किया जाता है ।
    3. निकासी विलंबता समय उपाय ~ पशु प्रति 4 बार । औसत सभी प्रतिक्रियाओं मापा । प्रत्येक पंजा को स्वतंत्र रूप से मापने, और एक ही पंजा में बाद में माप के बीच कम से कम 1 मिनट के अंतराल के साथ ।
  3. रुख घाटा: गतिशील वजन परीक्षण असर
    1. परीक्षण से पहले प्रत्येक जानवर के शरीर के वजन को मापने, वजन असर विश्लेषण के बाद से एक इनपुट पैरामीटर के रूप में प्रत्येक व्यक्ति जानवर के शरीर के वजन की आवश्यकता है ।
    2. एक मंजिल साधन गतिशील वजन असर प्रणाली एक कैमरा है कि माउस आंदोलनों रिकॉर्ड होगा समर्थन कवर पर इकट्ठे में व्यक्तिगत रूप से जानवरों प्लेस । 5 मिनट के लिए रिकॉर्डिंग से पहले ०.५ के लिए 1 मिनट के लिए पशु acclimatize चलो ।
      नोट: इस परीक्षण में, केवल एक स्वतंत्र रूप से चलती पशु एक समय में मूल्यांकन किया जा सकता है.
    3. वजन असर प्रदर्शन और डेटा का विश्लेषण करने के लिए सेटिंग्स समायोजित करें ।
      नोट: इन प्रयोगों में, हम निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करें: (i) कम वजन ०.६ जी की दहलीज: यह सेंसर की कोशिकाओं में से एक को सक्रिय करने के लिए आवश्यक न्यूनतम वजन है. (ii) 1 जी की उच्च वजन सीमा: यह संख्या पूरी तरह से एक कोशिका को सक्रिय करने के लिए आवश्यक वजन इंगित करता है । (iii) 2 कोशिकाओं की सतह दहलीज: यह संख्या एक दूसरे को ध्यान में रखा जा करने के लिए सक्रिय करने की जरूरत है कि कोशिकाओं की संख्या को इंगित करता है. (iv) छवियों की ंयूनतम संख्या 5 है: यह हर छवि पर कब्जा करने के लिए ०.१ s लेता है । संख्या फ़्रेम में माउस नहीं ले जाने की ंयूनतम संख्या को इंगित करता है । जैसे, 5 के एक मूल्य का मतलब है कि माउस मुद्रा > 0.5 एस के लिए स्थिर होने की जरूरत है एक माप है कि विश्लेषण के लिए ध्यान में रखा जाता है प्राप्त करने के लिए ।
    4. वीडियो को फिर से चलाने के द्वारा प्रत्येक वीडियो का विश्लेषण करें, और सुनिश्चित करें कि सॉफ़्टवेयर द्वारा दर्शाई गई समय सीमा में प्रत्येक अंग को सही ढंग से सॉफ़्टवेयर द्वारा पहचाना गया है.
      नोट: रिकॉर्ड किए गए समय की ंयूनतम 1 मिनट की आवश्यकता को मांय किया जा सकता है । गतिशील वजन असर सॉफ्टवेयर की गणना करता है और निंनलिखित मानकों को उपलब्ध कराता है: (i) वजन ग्राम में प्रत्येक व्यक्ति पंजा द्वारा वहन, और पूरे शरीर के वजन के एक प्रतिशत के रूप में । (ii) संयुक्त सामने पंजा या ग्राम में संयुक्त रियर पंजे द्वारा वहन वजन और पूरे शरीर के वजन के एक प्रतिशत के रूप में । (iii) बाएँ/दाएँ पंजे वजन असर या सामने/रियर वजन असर का अनुपात । (iv) प्रत्येक पंजा या संयुक्त मोर्चे/रियर पंजे कि दबाव संवेदनशील पैड सक्रिय की सतह क्षेत्र । (v) प्रत्येक पैरामीटर के लिए माध्य और मानक विचलन । (vi) पूरे प्रयोग के दौरान विभिंन मुद्राओं (पालन, 3 पंजे, या 4 पंजे) की अवधि । (vii) समय (ओं) प्रत्येक पंजा पूरे प्रयोग के दौरान वजन वहन करती है ।

4. IL4 के Intrathecal इंजेक्शन-analgesia के लिए 10 संलयन प्रोटीन

ध्यान दें: पुष्टि करें कि कमरे में वेंटिलेशन के लिए उचित हवा का प्रवाह सुनिश्चित करने के लिए खुला है । IL4-10 संलयन प्रोटीन की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए (1 µ g/5 µ l कुल इंजेक्शन मात्रा) यह वाहन इंजेक्शन और व्यक्तिगत साइटोकिंस के संयोजन के इंजेक्शन के खिलाफ परीक्षण किया जाना चाहिए (IL4 + IL10, ०.५ µ g + ०.५ µ g/माउस, 5 µ l कुल इंजेक्शन मात्रा).

  1. Anesthetize 3-4% के साथ एक ऑक्सीजन प्रवाह की दर के साथ isoflurane% 2 एल/ जाँच करें कि माउस ठीक से पंजा चुटकी से anesthetized है सुनिश्चित करें कि पशु उत्तरदायी नहीं है.
  2. अपने सिर के साथ मेज पर माउस प्लेस तंत्र की नाक शंकु में रखा और १.५ के साथ माउस बेहोशी-2% isoflurane के साथ 2 L/intrathecal इंजेक्शन प्रदर्शन whilst के एक ऑक्सीजन के प्रवाह की दर को बनाए रखने ।
  3. वापस-एक साफ 25 µ एल ग्लास हैमिल्टन सिरिंज एक 27 गेज सुई से जुड़े में इंजेक्शन यौगिकों भरें ।
  4. पसलियों के पीछे रीढ़ की हड्डी और थोड़ा माउस उठा द्वारा दृढ़ता से माउस पकड़ो । काठ की कशेरुकाओं L5 और L6 के बीच खड़ी सुई रखें और ध्यान से यह काठ की कशेरुकाओं के बीच में सही त्वचा के माध्यम से डालें । सुई को intervertebral अंतरिक्ष में रखें ।
    नोट: intervertebral अंतरिक्ष ढूँढना rostral ventral धुरी के साथ सुई चाल से कुछ ' खोज ' की आवश्यकता हो सकती है, हल्के से हड्डी ऊतक के प्रतिरोध का एक नुकसान जब तक सुई दबाने लगा है.
    1. एक पूंछ फ़्लिक हुआ कि सत्यापित करके सही लक्ष्यीकरण की पुष्टि करें । यौगिक के 5 µ एल सुई धीरे, सेकंड के एक जोड़े रुको, और फिर धीरे सुई वापस लेना. केवल एक पंजा झटका मनाया जाता है, तो सुई सही ढंग से नहीं रखा संभावना है ।
  5. इंजेक्शन के बाद, किसी भी मोटर हानि के अभाव सुनिश्चित करने के लिए संज्ञाहरण से वसूली के बाद पहले 30 मिनट के लिए बारीकी से माउस की जांच/
    नोट: दर्द व्यवहार मापा जा सकता है (के रूप में खंड 3 में वर्णित) 15 वसूली के बाद मिनट ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

अपनत्व क्रोमैटोग्राफी शुद्धिकरण के दौरान प्राप्त विभिन्न भिन्न अंशों से युक्त एक एसडीएस-पृष्ठ जेल का एक प्रतिनिधि चित्र चित्रा 1एमें दिखाया गया है । लोड (एल) में और (फुट) भागों के माध्यम से प्रवाह, HEK293 supernatant में मौजूद सभी प्रोटीन मनाया जाता है । कोई प्रोटीन वॉश (डब्ल्यू) अंश में मनाया जाता है । इस रेफरेंस (ई) अंश में, ३५ और ३७ केडीए के दो बैंड IL4-10 फ्यूजन प्रोटीन (तीरों) के दो अलग glycoforms के अनुरूप मनाया जाता है । चित्रा 1मेंबी, दो अलग IL4 के एक पूरे रक्त परख में एक प्रतिनिधि शक्ति परख-10 फ्यूजन प्रोटीन बैचों दिखाया गया है । एलपीएस प्रेरित TNFα रिहाई के एक खुराक पर निर्भर निषेध मनाया जाता है, दो IL4 के लिए तुलनीय गतिविधि दिखा-10 संलयन प्रोटीन बैचों.

अगले, प्रतिनिधि प्रयोगों जिसमें IL4-10 फ्यूजन प्रोटीन लगातार भड़काऊ दर्द को बाधित करने के लिए परीक्षण किया है के परीक्षण के परिणाम का एक उदाहरण (चित्र 2) दिखाया गया है । लगातार भड़काऊ दर्द 2% carrageenan के intraplantar इंजेक्शन द्वारा प्रेरित किया गया था । मैकेनिकल (चित्रा 2ए) के रूप में अच्छी तरह से थर्मल (चित्रा 2बी) hyperalgesia समय के बाद किया गया था । 6 दिन में भड़काऊ दर्द के प्रेरण के बाद, चूहों एक नियंत्रण के रूप में IL4-10 फ्यूजन प्रोटीन या वाहन के साथ intrathecally इंजेक्शन थे । IL4-10 काफी दोनों यांत्रिक (चित्रा 2ए) और थर्मल (चित्रा 2बी) hyperalgesia हल, और इंजेक्शन के बाद 24 एच के बाद अपने अधिक से अधिक प्रभाव तक पहुंच । आदर्श रूप में, दर्द निषेध में फ्यूजन प्रोटीन की प्रभावकारिता भी व्यक्तिगत साइटोकिंस के equimolar सांद्रता के खिलाफ परीक्षण किया जाना चाहिए परीक्षण करने के लिए कि क्या अपनी क्षमता दर्द को बाधित करने के लिए व्यक्तिगत साइटोकिंस के योग से बेहतर है । ये डेटा यहां प्रदर्शित नहीं होते हैं, लेकिन हम हाल ही के प्रकाशन को संदर्भित करते है जो यह डेटा9प्रदर्शित करता है ।

IL4-10 फ्यूजन प्रोटीन की प्रभावशीलता हाल ही में किया गया था में जांच की गई-प्रेरित भड़काऊ दर्द मॉडल9। इस प्रयोग में, IL4 के कई इंजेक्शन-10 फ्यूजन प्रोटीन intrathecally प्रशासित किया गया । एकाधिक इंजेक्शन पूरी तरह से हल कर रहे हैं, एक एनाल्जेसिक उपचार के रूप में IL4-10 फ्यूजन प्रोटीन की क्षमता का प्रदर्शन वॉन Frey और Hargreaves परीक्षणों का उपयोग कर मापा, hyperalgesia-प्रेरित लगातार भड़काऊ सूजन,9। यहां हम बताते है कि intraplantar के इंजेक्शन भी प्रभावित पंजा (चित्रा 3a-B) के वजन में कमी प्रेरित । IL4 के Intrathecal इंजेक्शन-10 फ्यूजन प्रोटीन के बाद 7 दिन में intraplantar के बाद इंजेक्शन तनु के वजन में कमी से प्रभावित पंजा का असर वाहन की तुलना में इंजेक्शन चूहों 2 दिनों के बाद IL4-10 फ्यूजन प्रोटीन प्रशासन (चित्रा 3बी ).

Figure 1
चित्र 1 : शुद्धि और IL4 के लक्षण वर्णन-10 संलयन प्रोटीन । (A) Coomassie-सना एसडीएस-पृष्ठ विश्लेषण के संबध क्रोमैटोग्राफी अंशों: L: लोड, FT: के माध्यम से प्रवाह, W: वाश, E: रेफरेंस. (ख) कार्यात्मक परख: IL4-10 संलयन प्रोटीन खुराक निर्भर एलपीएस में TNFα उत्पादन को रोकता है पूरे रक्त संस्कृति उत्तेजित (एलपीएस अकेले के साथ उत्तेजित संस्कृतियों की तुलना में प्रतिशत अवरोध के रूप में व्यक्त) । डेटा मतलब ± एसडी के रूप में प्रतिनिधित्व किया है । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : IL4 द्वारा भड़काऊ hyperalgesia के निषेध-10 फ्यूजन प्रोटीन. भड़काऊ दर्द 2% carrageenan (कार) के 20 µ एल की एक intraplantar इंजेक्शन द्वारा प्रेरित किया गया था । छह दिनों के बाद intraplantar इंजेक्शन चूहों 1 µ जी IL4 के एक intrathecal इंजेक्शन (तीर) प्राप्त-10 फ्यूजन प्रोटीन या वाहन (पंजाब). (एक) यांत्रिक अतिसंवेदनशीलता (लॉग ५०% दहलीज (जी)) वॉन Frey परीक्षण का उपयोग कर समय के साथ मापा गया था और (ख) थर्मल संवेदनशीलता (विलंबता (ओं)) Hargreaves परीक्षण का उपयोग कर मापा गया था. डाटा मतलब ± SEM के रूप में प्रतिनिधित्व किया है । तारक दो तरह ANOVA द्वारा विश्लेषण महत्वपूर्ण अंतर का प्रतिनिधित्व करते हैं, वाहन और IL4 के बीच-10 इंजेक्शन जानवरों । * *, * * * = p < 0.01 और p < 0.001, क्रमशः । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : वजन में सूजन प्रेरित परिवर्तन असर । भड़काऊ दर्द पूरा फ्रायड सहायक के 20 µ एल के एक intraplantar इंजेक्शन द्वारा प्रेरित किया गया था । प्रत्येक पंजा पर वजन असर गतिशील वजन उपकरण का उपयोग कर मापा गया था । प्रभावित पंजा (ipsilateral हिंद पंजा) और गैर-प्रभावित पंजे (सामने के पंजे और contralateral पंजा) के कुल वजन असर के ग्राम में वजन असर, साथ ही अन्य 3 पंजे की तुलना में ipsilateral पंजा के वजन के असर का अनुपात प्रदर्शित किया जाता है । (एक) के दौरान वजन असर के पाठ्यक्रम-प्रेरित सूजन (n = 10) । (ख) 7 दिन में intraplantar के बाद, चूहों 1 µ जी IL4 के एक intrathecal इंजेक्शन-10 फ्यूजन प्रोटीन या वाहन (पंजाब) प्राप्त किया । वजन असर 0 पर मापा गया था और 7 intraplantar के बाद दिन, और 2 दिन IL4 के प्रशासन के बाद-10 संलयन प्रोटीन । ipsilateral पंजा के वजन का असर अंय 3 पंजे की तुलना में प्रतिनिधित्व किया है (n = 3-4) । डेटा मतलब ± SEM के रूप में प्रतिनिधित्व किया है. * * * = p < 0.001; * * = p < 0.01; * = p < 0.05 की तुलना में आधारभूत (दिन 0) । # = p < 0.05 वाहन स्वास्थ्यकर्मी पशुओं की तुलना में । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस पांडुलिपि के उत्पादन और एक रिकॉमबिनेंट IL4 के लक्षण वर्णन के लिए तरीके बताता है-10 संलयन प्रोटीन, और तरीके लगातार भड़काऊ दर्द के माउस मॉडल में बाधा भड़काऊ hyperalgesia में इसकी प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए । IL4-10 फ्यूजन प्रोटीन का उत्पादन और शुद्धि एक छोटे पैमाने पर किया जाता है । HEK293 कोशिकाओं प्रोटीन उत्पादन के लिए एक अभिव्यक्ति प्रणाली के रूप में चुना जाता है क्योंकि वे prokaryotic अभिव्यक्ति प्रणालियों में प्राप्त नहीं किया जा सकता है कि पोस्ट-शोधों संशोधनों को सक्षम करें । बाद अनुवाद संशोधन प्रोटीन समारोह के लिए प्रासंगिक हैं, और इस तरह के संशोधनों के अभाव संभावित IL4-10 संलयन प्रोटीन की चिकित्सीय प्रभावकारिता को प्रभावित कर सकता है । प्रोटीन से अपनत्व क्रोमैटोग्राफी द्वारा संस्कृति supernatant से शुद्ध होती है. हम अपनत्व शोधन के लिए IL4 के खिलाफ घर में निर्मित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए और एक IL4-10 फ्यूजन प्रोटीन एक टैग युक्त एक संबध टैग प्रणाली के साथ शुद्धि के लिए अनुमति देने के लिए उत्पादन करने के लिए चुना है । इस के लिए कारण के लिए टैग की संभावना से बचने के प्रोटीन तह और समारोह में परिवर्तन से संबंधित था । फिर भी, अगर एक उच्च चयनात्मक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी कमी है, एक टैग के साथ एक प्रोटीन के लिए विकसित की जरूरत है, एक अपने टैग उदा । उस मामले में, यह निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण होगा कि सी या N-प्रोटीन के टर्मिनस के लिए उपयुक्त है सबसे अच्छा टैग प्रोटीन समारोह को प्रभावित करने से बचने के लिए ।

HEK293 supernatant के 1 एल से, लगभग शुद्ध IL4 के 3 मिलीग्राम-10 संलयन प्रोटीन प्राप्त की है, लेकिन यह बैच बैच से भिंन हो सकते हैं । संबध शुद्धि के लिए कॉलम त्यागने से पहले कई शुद्धि चक्र के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । शुद्धि प्रक्रिया में सबसे संवेदनशील कदम कम पीएच द्वारा कॉलम से IL4-10 संलयन प्रोटीन का रेफरेंस है, क्योंकि कम पीएच अपरिवर्तनीय प्रोटीन विकार और प्रोटीन वर्षण पैदा कर सकता है । इस प्रकार, देशी प्रोटीन संरचना और प्रोटीन समुच्चय के अभाव के रखरखाव अच्छी गुणवत्ता बैचों के लिए आवश्यक है । कि अंत करने के लिए, फ्यूजन प्रोटीन की मात्रा का मूल्यांकन करने से पहले और अलग रेफरेंस बफ़र्स के साथ शुद्धि के बाद इन विट्रो में परीक्षण किया जाना चाहिए । IL4-10 फ्यूजन प्रोटीन के शुद्धिकरण के बाद, गैर-शुद्ध प्रोटीन की तुलना में, प्रतिक्रिया में कमी नहीं आई । इसके अलावा, कुल गठन अनुपस्थित था जब रेफरेंस कदम ०.१ मीटर glycine बफर (पीएच = २.५) के साथ प्रदर्शन किया गया था, और रेफरेंस अंशों का पीएच तुरंत 1 मीटर Tris बफर (पीएच = 9) के साथ बेअसर हो गया था ।

शुद्ध IL4 की एकाग्रता-10 संलयन प्रोटीन मानव IL10 एलिसा परिणामों के आधार पर अनुमान है । बीसीए प्रोटीन परख प्रोटीन सांद्रता की पुष्टि करने के लिए प्रयोग किया जाता है । शुद्धि के बाद प्रोटीन की वसूली के माध्यम से लोड में मापा सांद्रता के आधार पर मूल्यांकन किया जाता है, के माध्यम से, धोने और IL10 एलिसा द्वारा रेफरेंस अंशों । IL4-10 फ्यूजन प्रोटीन का बीसीए प्रोटीन एकाग्रता निर्धारण केवल dialyzed रेफरेंस अंशों में मूल्यांकित किया जा सकता है । नॉन-dialyzed रेफरेंस अंशों में imidazole, एक यौगिक होता है जो बीसीए माप को प्रभावित करता है । गैर शुद्ध अंश HEK293 संस्कृति माध्यम से अंय प्रोटीन होते हैं ।

IL4-10 फ्यूजन प्रोटीन की एक पूरी रक्त परख में किया जाता है की एक गैर-सक्रियता का निर्धारण । IL4 की गैर-10 संलयन प्रोटीन के कारण कई दाताओं के पूरे रक्त में मूल्यांकन किया जाना चाहिए निर्धारित करने के लिए कि कार्यात्मक गतिविधि बनाए रखा है । कई दाताओं की आवश्यकता है क्योंकि दाता विचरण करने के लिए दाता IL10 और IL4 की क्षमता में मौजूद है एलपीएस प्रेरित TNFα रिलीज को बाधित । इसके अलावा, IL4R और IL10R की अभिव्यक्ति दाताओं के बीच अलग हो सकता है, IL4-10 फ्यूजन प्रोटीन की क्षमता को प्रभावित करने एलपीएस प्रेरित TNFα उत्पादन को बाधित ।

वर्णित तरीकों में, हम लगातार भड़काऊ दर्द के 2 माउस मॉडल IL4-10 फ्यूजन प्रोटीन की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए vivo मेंदर्द को हल करने के लिए विस्तृत । फिर भी, रिकॉमबिनेंट फ्यूजन प्रोटीन की एनाल्जेसिक क्षमता के पूर्ण मूल्यांकन के लिए, अणुओं के रूप में अच्छी तरह से पुराने दर्द के अन्य मॉडलों में परीक्षण किया जाना चाहिए. इन मॉडलों में शामिल हैं, लेकिन सीमित नहीं हैं, तंत्रिका चोट और कीमोथेरेपी के मॉडल-प्रेरित neuropathic दर्द9,22। हालांकि वॉन Frey परीक्षण और Hargreaves परीक्षण आमतौर पर एनाल्जेसिक दवाओं के परीक्षण के लिए प्रयोग किया जाता है, यह स्पष्ट हो गया है कि एक अतिरिक्त परीक्षण (उदा. गतिशील वजन असर परीक्षण) गैर पैदा दर्द पर प्रभाव का आकलन करने के लिए शामिल किया जाना चाहिए behaviorsand भी साथ operant दर्द परख (उदा वातानुकूलित जगह वरीयता (CPP) कि गैर का पता लगाने दर्द व्यवहार17,18) । CPP प्रदर्शन करने के लिए, दर्द से बाधा के प्रभाव की शुरुआत, फ्यूजन प्रोटीन खाते में लिया जाना चाहिए, क्योंकि दर्द से राहत के द्वारा जानवरों की कंडीशनिंग जल्दी अभिनय एनाल्जेसिक की आवश्यकता है (जो 15 मिनट से कम समय में प्रभाव डालती है) । फिर भी, अगर परीक्षण यौगिक एक धीमी एनाल्जेसिक शुरुआत है, लेकिन लंबे समय तक चलने दर्द निषेध (4 दिन से अधिक) के लिए प्रेरित करने की संभावना है, CPP अभी तक परीक्षण है कि क्या यौगिक दर्द बाधित किया जा सकता है । इस मामले में, तेजी से अभिनय एनाल्जेसिक के साथ कंडीशनिंग के यौगिक प्रेरित नुकसान का आकलन करने की जरूरत है ।

Intrathecal इंजेक्शन प्रशासन के एक मार्ग के रूप में चयनित कर रहे हैं, यौगिक जैसे पृष्ठीय रूट गैंग्लिया और रीढ़ की हड्डी के रूप में दर्द प्रासंगिक क्षेत्रों तक पहुँच जाएगा. इस दृष्टिकोण एनाल्जेसिक दवा की जरूरत की खुराक कम कर देता है और विषाक्तता और प्रणालीगत दुष्प्रभाव कम हो जाती है के रूप में विशेष रूप से, एनाल्जेसिक दवाओं की intrathecal प्रसव, पुराने दर्द के साथ रोगियों के उपचार के रूप में आम बात हो गई है । फिर भी, इस प्रशासन मार्ग कुछ सीमाएं हैं; यह अच्छी तरह से प्रशिक्षित कर्मियों की आवश्यकता है और, छोटे अवजालतनिका अंतरिक्ष के कारण, इंजेक्शन की मात्रा चूहों में 5 µ एल तक ही सीमित होना चाहिए, फ्यूजन प्रोटीन के अत्यधिक ध्यान केंद्रित समाधान की आवश्यकता. intrathecal इंजेक्शन की तकनीक से प्रशिक्षण की आवश्यकता है । इस तरह के प्रशिक्षण सही intrathecal इंजेक्शन की पुष्टि करने के लिए एक डाई के इंजेक्शन के साथ गैर-उबर anesthetized जानवरों पर प्रदर्शन किया जा सकता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम का हिस्सा एक Utrecht विश्वविद्यालय जीवन विज्ञान अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया है

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FreeStyle 293-F cells Invitrogen R790-07 Human embryonic kidney cells 
GIBCO FreeStyle 293 Expression Medium Life technologies 12338018 Culture medium
293fectin Reagent Invitrogen 12347019 Transfection reagent
GIBCO Opti-MEM + GlutaMAX Life technologies 51985026 Reduced Serum Medium for use during cationic lipid transfections 
GIBCO RPMI Medium 1640 (1x) Life technologies 52400-025
CNBr-Activated Sepharose 4B GE Healthcare 17-0430-01 pre-activated media for coupling antibodies or other large proteins
Hydrochloric acid fuming 37%  Merck 1003171000
Sodium chloride Sigma S7653-1kg
Sodium bicarbonate  Sigma 31437
Trizma hydrochloride Sigma T3253-500G TRIS hydrochloride 
Acetic Acid 100%                                Merck 1.00063.1000 
Glycin-HCl                                           Sigma G2879             
PBS                                                     Pharmacie, UMCU Phosphate-Buffered Saline
10X TGS BIO-RAD 161-0772 Tris/Glycine/SDS Buffer for SDS electrophoresis
Mini-PROTEAN TGX Gels BIO-RAD 456-1046 12% SDS precast gels
Trans-Blot Turbo Transfer Pack BIO-RAD 170-4157 Western blot transfer packs
Yarra 3u SEC-2000 column Phenomenex
InstantBlue Protein Stain Expedeon ISB1L ready to use Coomassie protein stain for polyacrylamide gels
Human IL-10 DuoSet ELISA R&D DY217B
Human TNFα ELISA Set Diaclone 851570020
BCA Pierce Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23227
Carrageenan Sigma-Aldrich 22049 plant mucopolysaccharide
CFA Sigma-Aldrich F5881 vaccine adjuvant
Hamilton syringe Sigma-Aldrich 20779 glass syringe
Animal Enclosure IITC Life Science 433 Animal Enclosure
Von Frey mesh stand IITC Life Science 410 Mesh Stand
von Frey hairs  Stoelting 58011 touch test sensory probes
Plantar Test (Hargreaves Method) IITC Life Science 390G plantar test with heated glass
Dynamic Weight Bearing test Bioseb BIO-DWB-AUTO-M postural deficit test
Glass Econo-Column Columns, 1.5 × 30 cm BIO-RAD 7371532 glass chromatography column  
SnakeSkin Dialysis Tubing  Thermo Scientific 88242
Minisart NML Syringe Filter  Sartorius 16555-K single use filter unit, 0.45 μM
CASY Cell Counter and Analyzer Roche

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Breivik, H., Collett, B., Ventafridda, V., Cohen, R., Gallacher, D. Survey of chronic pain in Europe: prevalence, impact on daily life, and treatment. Eur J Pain. 10 (4), 287-333 (2006).
  2. Gerdle, B., et al. Prevalence of widespread pain and associations with work status: a population study. BMC Musculoskelet Disord. 9, 102 (2008).
  3. Borsook, D., Aasted, C. M., Burstein, R., Becerra, L. Migraine Mistakes: Error Awareness. Neuroscientist. 20 (3), 291-304 (2014).
  4. Raoof, R., Willemen, H. L., Eijkelkamp, N. Divergent roles of immune cells and their mediators in pain. Rheumatology. , (2017).
  5. Ren, K., Dubner, R. Interactions between the immune and nervous systems in pain. Nat Med. 16 (11), 1267-1276 (2010).
  6. Milligan, E. D., Penzkover, K. R., Soderquist, R. G., Mahoney, M. J. Spinal interleukin-10 therapy to treat peripheral neuropathic pain. Neuromodulation. 15 (6), 520-526 (2012).
  7. Grace, P. M., et al. Behavioral assessment of neuropathic pain, fatigue, and anxiety in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and attenuation by interleukin-10 gene therapy. Brain Behav Immun. 59, 49-54 (2017).
  8. Kiguchi, N., et al. Peripheral administration of interleukin-13 reverses inflammatory macrophage and tactile allodynia in mice with partial sciatic nerve ligation. J Pharmacol Sci. 133 (1), 53-56 (2017).
  9. Eijkelkamp, N., et al. IL4-10 Fusion Protein Is a Novel Drug to Treat Persistent Inflammatory Pain. J Neurosci. 36 (28), 7353-7363 (2016).
  10. Schott, H. Affinity Chromatography: Template Chromatography of Nucleic Acids and Proteins. , Dekker. New York. (1984).
  11. Scopes, R. K. Strategies for protein purification. Curr Protoc Protein Sci. , Chapter 1 Unit 1 2 (2001).
  12. Gregory, N. S., et al. An overview of animal models of pain: disease models and outcome measures. J Pain. 14 (11), 1255-1269 (2013).
  13. Wang, H., et al. Balancing GRK2 and EPAC1 levels prevents and relieves chronic pain. J Clin Invest. 123 (12), 5023-5034 (2013).
  14. Willemen, H. L., et al. Microglial/macrophage GRK2 determines duration of peripheral IL-1beta-induced hyperalgesia: contribution of spinal cord CX3CR1, p38 and IL-1 signaling. Pain. 150 (3), 550-560 (2010).
  15. Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
  16. Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
  17. Robinson, I., Sargent, B., Hatcher, J. P. Use of dynamic weight bearing as a novel end-point for the assessment of Freund's Complete Adjuvant induced hypersensitivity in mice. Neurosci Lett. 524 (2), 107-110 (2012).
  18. He, Y., Tian, X., Hu, X., Porreca, F., Wang, Z. J. Negative reinforcement reveals non-evoked ongoing pain in mice with tissue or nerve injury. J Pain. 13 (6), 598-607 (2012).
  19. Bottros, M. M., Christo, P. J. Current perspectives on intrathecal drug delivery. J Pain Res. 7, 615-626 (2014).
  20. Eijkelkamp, N., et al. A role for Piezo2 in EPAC1-dependent mechanical allodynia. Nat Commun. 4, 1682 (2013).
  21. Bradman, M. J., Ferrini, F., Salio, C., Merighi, A. Practical mechanical threshold estimation in rodents using von Frey hairs/Semmes-Weinstein monofilaments: Towards a rational method. J Neurosci Methods. 255, 92-103 (2015).
  22. Krukowski, K., et al. CD8+ T Cells and Endogenous IL-10 Are Required for Resolution of Chemotherapy-Induced Neuropathic Pain. J Neurosci. 36 (43), 11074-11083 (2016).

Tags

चिकित्सा अंक १३४ क्रोनिक दर्द औषध विकास neuroimmunology फ्यूजन प्रोटीन विरोधी भड़काऊ साइटोकिंस प्रोटीन
रिकॉमबिनेंट प्रोटीन के विकास के लिए पुराने दर्द का इलाज
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Prado, J., Popov-Celeketic, J.,… More

Prado, J., Popov-Celeketic, J., Steen-Louws, C., Raoof, R., Hack, E., Eijkelkamp, N. Development of Recombinant Proteins to Treat Chronic Pain. J. Vis. Exp. (134), e57071, doi:10.3791/57071 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter