Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Utviklingen av rekombinante proteinene til å behandle kroniske smerter

Published: April 11, 2018 doi: 10.3791/57071

Summary

I denne artikkelen gir vi detaljer for metoder for produksjon og kvalitetskontroll av en IL4-10 rekombinant fusion protein. Vi viser også hvordan du teste effektiviteten av dette proteinet løse smerter i en musemodell av inflammatorisk smerte.

Abstract

Kronisk smerte er vanskelig å behandle og nye tilnærminger til løse vedvarende smerte er presserende nødvendig. Anti-inflammatorisk cytokiner er lovende kandidater for behandling av ødeleggende smertetilstander på grunn av deres evne til å regulere avvikende Nevro-immune interaksjoner. Men de arbeider fysiologisk i et nettverk av ulike cytokiner, og derfor deres terapeutiske effekten kan ikke være optimal som frittstående narkotika. For å overkomme denne begrensningen, utviklet vi et fusion protein av den anti-inflammatoriske cytokiner IL4 og IL10. Her beskriver vi metodene for produksjon og kvalitetssikring av IL4-10 rekombinant fusion protein og vi teste effektiviteten av IL4-10 fusion protein løse smerter i en musemodell av vedvarende inflammatorisk smerte.

Introduction

Kronisk smerte er fortsatt en av de mest ødeleggende og under-behandlet medisinske problemer av det 21st århundre, påvirker > 20% av den voksne befolkning1,2. Men behandlinger for å gi lindring fra kronisk smerte er ofte ineffektive eller må avsluttes på grunn av alvorlige bivirkninger3. Viktigere, for tiden tilgjengelig narkotika bare gi symptomatisk lindring, men ikke vesentlig endre eller kurere kronisk smerte. Selv om kroniske smerter synes å være en nevrologisk lidelse, tyder involvering av immunsystemet i kroniske smerter utvikling4,5. Videre er immun-baserte tilnærminger til å behandle smerter voksende. For eksempel hemme anti-inflammatoriske cytokiner smerte i flere modeller av kroniske smerter6,7,8. Men har anti-inflammatoriske cytokiner kort halveringstid, redusere deres potensielle smerte-hemmende effekter. Dessuten, anti-inflammatorisk cytokiner fungerer mest optimalt sammen med hverandre. For å overvinne disse begrensningene, smeltet vi nylig den anti-inflammatoriske cytokiner interleukin-4 (IL4) og interleukin-10 (IL10) i ett molekyl. IL4-10 fusion protein viser overlegen effekt i hemme kronisk inflammatorisk og nevropatisk smerte sammenlignet med personlige cytokiner9. Beskriver her vi hvordan slike fusion protein som produseres, renset, og hvordan kvaliteten er kontrollert.

IL4-10 fusion protein er produsert i menneskelige celler av forbigående transfection HEK293-F celler med en pUPE uttrykk vektor bærer cDNA sekvensen koding IL4-10 fusion protein. HEK293-F celler er valgt for post-translasjonell modifikasjon av protein, noe som ikke forekommer i bakteriell uttrykk systemer. Hvis du vil optimalisere glycan capping med sialic acid, cDNA koding beta-galactoside-2, er 3-sialyl-transferase innarbeidet i vektoren som en andre transgene. Fusion protein er renset bruker affinitet protein rensing av kulturen supernatant fordi det er kraftigere enn rensing av andre metoder f.eks størrelse-utestenging eller ionebytte kromatografi10,11. For å rense IL4-10 fusion protein, brukte vi huset gjort monoklonale antistoffer mot IL4. Evaluering av renhet og bioactivity renset IL4-10 fusion protein utføres som en del av kvalitetskontroll. Renheten av produsert grupper er evaluert av natrium Dodecyl Sulfate polyakrylamid Gel gelelektroforese (SDS-side) og høyt trykk størrelse utelukkelse kromatografi (HP-SEC). Bioactivity av IL4-10 fusion protein beregnes ved å måle kapasiteten å hemme lipopolysakkarid (LPS)-indusert tumor nekrose faktor-alpha (TNFα) produksjon i fullblod kulturer, og sammenligne den kombinasjonen av enkelt cytokiner.

Til slutt, for å teste kapasiteten til IL4-10 fusion proteiner å hemme kronisk smerte, beskriver vi hvordan fusion protein kan bli testet som smertestillende i brukte musen modeller av vedvarende inflammatorisk smerte12,13,14 . Her beskriver vi metoder for en inflammatorisk smerte modell. Det er imidlertid viktig å merke seg at andre smerte modeller kan brukes (f.eksnevropatisk smerte modeller), avhengig av forskningen spørsmål som må besvares. For å vurdere smerter i disse modellene, er det viktig å bruke en rekke atferdsmessige tiltak som inkluderer fremkalt og ikke-utløste smerter tiltak. Her beskrevet vi metoder for vurdering for endringer i mekanisk og termisk vakte atferdsdata svar. Mekanisk følsomhet til ufarlige stimuli vurderes ved hjelp av Von Frey testen, mens termiske følsomhet vurderes ved hjelp av Hargreaves testen. Viktigere, måles ikke-utløste hyperalgesia/allodynia ved hjelp av dynamiske vekt bærende testen. Disse tiltakene er allment akseptert som smerte mål og gi viktig informasjon om smerte terskler og potensielle smerter oppleves av dyr15,16,17. Andre tiltak for å vurdere ikke utløste smerter (f.eks, stimulans uavhengig), for eksempel betinget sted preferanse testen, kan være verdifulle18. For å vurdere potensialet av stoffet å hemme smerte, utført vi intratekal administrasjon av fusion protein, som med denne bruksmåten mindre protein dose er nødvendig for å nå smerte-relaterte områder og unngå systemisk (side-) effekter19, 20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med internasjonale retningslinjer og forhåndsgodkjenning fra den lokale eksperimentelle etiske komiteen. Fullblod er Hentet fra tjenesten Mini giver (Mini giver Dienst, MDD) på den University Medical Center Utrecht (UMCU) for i Nederland. MDD har fått positiv godkjennelse fra medisinsk etikk av UMCU (Medisch Ethische Toetscommissie) for protokoll-nummer 07-125/C.

1. protein produksjon og karakterisering

  1. Cellekultur
    Merk: Se Tabell for materiale for kultur medium brukes.
    1. Tine HEK293-F cellene på 37 ° C før det er en liten klynge av isen. Overføre tinte cellene umiddelbart til 10 mL av iskalde middels (4 ° C) og sentrifuge celle suspensjon ved romtemperatur (RT) i 4 minutter (min) på 500 x g.
    2. Fjern mediet og resuspend celle pellet i 10 mL av fersk medium på RT, etterfulgt av sentrifugering 500 x g for 4 min.
    3. Fjern nedbryting og resuspend celle pellet i 5 mL av middels på RT. Legg til celle suspensjon direkte i en 125 mL kolbe inneholder 25 mL av forvarmes medium (37 ° C). Kultur cellene på 37 ° C og 8% CO295% fuktighet på en orbital shaker roterer med en hastighet på 125 rpm.
    4. Subkultur cellene to ganger i uken. Bruke en automatisert celle counter (se Tabell for materiale) for å vurdere celle nummer og celle levedyktighet. Frø levedyktig celler i en konsentrasjon av 3 x 105 celler/mL i Erlenmeyer flasker. Hold det totale volumet av kultur middels på 1/5 av det totale volumet av kultur Erlenmeyer flasker til enhver tid for å holde lufting optimal.
  2. Hva
    Merk: Subkultur cellene tre til fire ganger før transfection og transfect dem når cellen levedyktigheten > 90%. Cellen levedyktighet vurderes av en automatisert (elektrisk felt flerkanals) cellcounting basert på integriteten til plasma membran. Se Tabellen for materiale for transfection reagensen.
    1. Sentrifuge celler på RT for 4 min 500 x g; resuspend celle pellet i 10 mL forvarmes kultur medium (37 ° C) og fortynne celle suspensjon å ~1.0 x 106 celler/mL i et totalt volum på 1 L. Aliquot celle suspensjon i 10 dele 100 mL i 500 mL Erlenmeyer flasker.
    2. Fortynne 1 mg plasmider DNA i 33 mL redusert serum minimal viktig medium (MEM, se Tabellen for materiale) av mild miksing. I en separat tube, fortynne 1,330 µL av transfection reagensen i MEM av mild miksing. Inkuber begge løsninger på RT for 5 min. Legg og bland DNA fortynnet i MEM til transfection reagensen i MEM og Inkuber en miks for 30 min på RT.
    3. Legge til DNA-transfection reagens blandingen til cellene (kultivert i Seksjon 1); legge til 6,6 mL mix hver 500 mL Erlenmeyer kolbe som inneholder 100 mL celler i kultur medium. Opprettholde cellene i de tidligere nevnte oppdrettsforholdene. Høste kultur nedbryting inneholder utskilles IL4-10 fusion protein tre dager etter hva.
    4. Bestemme konsentrasjonen av IL4-10 fusion protein i kultur supernatant ved å utføre en IL10 ELISA etter produsentens protokollen (se Tabell for materiale).
      Merk: I optimal kultur forhold, konsentrasjon av fusjon protein kan forventes å være mellom 2,5 og 5 µg/mL.
  3. Protein rensing av affinitet kromatografi
    Merk: Affinitet kromatografi utføres ved romtemperatur. Men holdes alle fraksjoner (kultur nedbryting, belastning, strømme gjennom og elueringsrør brøkdeler) på is under prosedyren.
    1. Par 10 mg en i-in-House-laget monoklonalt antistoff mot IL4 til 1 g CNBr-aktivert sepharose 4B, ifølge produsentens protokollen (se Tabell for materiale). Hell 2,5 mL av kombinert sepharose perler sakte i glass kromatografi kolonnen (30 cm lengde og 1,5 cm indre diameter, se Tabellen for materiale).
    2. Blokkere de resterende bindende områder av perler ved å sende 50 mL av fosfat bufret saltvann (PBS) som inneholder 1% Bovine Serum Albumin gjennom kolonnen. Vask kolonnen med 25 mL PBS (pH = 7.4) etterfulgt av 12.5 mL 0.1 M glysin buffer (pH = 2,5) og 25 mL PBS (pH = 7.4).
    3. Passere 100 mL 10 ganger konsentrert HEK293 cellekultur supernatant gjennom kolonnen på en strømningshastighet på 1 mL/min. vask kolonnen med 50 mL av PBS.
    4. Elute bundet IL4-10 fusion protein med 12.5 mL 0.1 M glysin buffer (pH = 2,5) på en strømningshastighet på 1 mL/min og samle fraksjoner 2,5 ml. Legge til 350 µL av 1 M Tris buffer (pH = 9) til hver fraksjon å bringe pH til 7. Dialyze men fraksjoner natten mot 2 L PBS (pH = 7.4).
      1. Bruke dialyse rør med 16 mm tørr diameter og en 3,5 K molekylvekt cut-off. Sterile filtrere dialyzed fraksjoner bruke engangs filtre med 0,45 µM pore diameter. Lagre sterile IL4-10 fusion protein løsning i dele på-80 ° C.
    5. Evaluere renheten av elut IL4-10 fusion protein av Coomassie-farget 12% SDS side gel og HP-SEC (3 µm SEC-2000 kolonne). For HP-SEC analyse, lastes 40 µL av protein på konsentrasjonen av ~ 1 mg/mL på kolonnen. Bruke 100 mM natrium fosfatbuffer med 150 mM natriumklorid (pH = 6.8) som en mobil fase. Angi flow rate på 1 mL/min.
    6. Bestemme konsentrasjonen av hvert sett med renset IL4-10 fusion protein av IL10-ELISA og Bicinchoninic syre Protein analysen (BCA Protein analysen Kit, se Tabellen for materiale) i henhold til produsentens protokoller.
    7. Bruk rekombinant menneskelige IL10 for å opprette en standard kurve i ELISA-analysen. Korrigere størrelsen forskjellen mellom rekombinant IL10 (18 kDA) og IL4-10 fusion protein (34 kDa), multiplisere innhentet konsentrasjonen med en faktor på 1,8.
  4. Bioactivity IL4-10 fusion protein
    Merk: Fullblod analysen utføres for hvert sett med IL4-10 fusion protein som produseres og aktiviteten til forskjellige bunker sammenlignes som en del av kvalitetskontroll. Fullblod analysen utføres i frisk menneskeblod samlet dag analysen i heparin rør. Blod er Hentet fra friske frivillige i vår interne donor-tjeneste. Prøver bør behandles som potensielt biologiske farer.
    1. Forberede 3-fold føljetong pre fortynninger av renset IL4-10 fusion proteinet i RPMI medium (se Tabell for materiale) over en konsentrasjon varierer 5-1,215 ng/mL.
    2. Forberede pre fortynninger av LPS (100 ng/mL) og menneskelig blod som er fortynnet 4 ganger i RPMI medium.
    3. Pipetter pre fortynninger av IL4-10 fusion protein, LP-plater og menneskelig blod i en 48-vel plate. I hver brønn, legge til 50 µL IL4-10 fusion protein (siste konsentrasjon 1-243 ng/mL), 75 µL RPMI medium, 25 µL LPS (siste konsentrasjon 10 ng/mL) og 100 µL menneskeblod (endelig fortynnet).
      Merk: Totalt volum per brønn er 250 µL.
    4. Inkuber platen på 37 ° C og 8% CO295% fuktighet 18 h.
    5. Evaluere konsentrasjonen av TNFα i kultur supernatants bruker en TNFα ELISA, ifølge produsentens protokollen.
    6. Beregne hemming av inflammatorisk respons ved IL4-10 fusion protein formelen: % hemming = (1-(A-B)/(C-B)) x 100
      Merk: Her A = TNFα nivåer i LPS stimulert kulturer behandlet med IL4-10 fusion protein, B = TNFα nivåer i unstimulated kultur og C = TNFα nivåer i LPS stimulert kultur.

2. musen modell for vedvarende inflammatorisk smerte

Merk: Det er viktig å bruke både mannlige og kvinnelige mus (C57Bl/6) fordi dette aktiverer identifisering av sex-avhengige effekter. Generelt, er musene som brukes mellom 8-16 uker gamle. For å bestemme antall dyr kreves, skal makt beregningene utføres. Webbaserte verktøy til å utføre slike beregninger er lett funnet på Internett (f.eks, http://www.powerandsamplesize.com; http://www.sample-size.net).

  1. Induksjon av kronisk inflammatorisk smerte
    Merk: Indusere vedvarende inflammatorisk smerte i voksen mus med intraplantar injeksjoner av karragenan eller fullstendig Freuds Adjuvant (CFA). De ulike testene forstyrrer ikke hverandre.
    1. Klargjør karragenan (2% w/v) ved oppløsning λ-karragenan (se Tabell for materiale) i 0,9% NaCl av løsningen passerer en 23-gauge nål slik at karragenan skal oppløses. Utarbeide en fersk løsning direkte før injeksjon utføres.
    2. Alternativt hvis CFA, blande CFA løsningen riktig før injisere det intraplantarly, fordi CFA er en vann-i-olje emulsjon som inneholder 1 mg Mycobacterium tuberkulose (H37Ra) varme drept og tørket, 0,85 mL parafinolje og 0,15 mL mannide monooleate (se Tabell for materiale).
      Merk: Glass Hamilton sprøyter med metall stempler anbefales for sprøytebruk denne forbindelsen fordi gummi stempler kan reagere med olje i adjuvant.
    3. Intraplantar injeksjon
      1. Opprettholde sammensatt (trinn 2.1.1 eller 2.1.2) i sprøyten på RT i minst 15 min før injeksjon tillate justering RT. injisere 20 µL av sammensatt (eller dissolvent som en kontroll) subcutaneously inn i hind labben av ikke-anesthetized musen bruker en 30-måler nål.
      2. Sette inn nålen i bunnen av tommelen regi til hælen og injisere sammensatt når nålen settes ca 0,5 cm. Etter injeksjon, sakte trekke nålen mens du roterer litt sprøyten for å unngå lekkasje av løsning av injeksjonsstedet.

3. smerte målinger

Merk: Kontroller at forskere utfører atferdsmessige eksperimenter er blind for musen behandling. Det er viktig å acclimatize dyr til testing miljøet før du utfører noen mål. Helst er uken før eksperimentene, dyr plassert 1 - 2 ganger i 15-30 min i hver av de forskjellige enhetene som brukes for å utføre testene. Ved håndtering av menn og kvinner i samme eksperiment, evaluere menn uavhengig av kvinner. Ren burene og flater grundig mellom de ulike gruppene å unngå potensielle uønskede effekter på oppførselen til ulike kjønnene. Måle planlagte uttak ventetider eller mekanisk terskler to til tre ganger å nøyaktig fastslå planlagte terskler og finne ut om dette er stabilt før intraplantar injeksjon av enhver forbindelse.

  1. Von Frey test: mekanisk følsomhet til ufarlige stimuli
    1. Plasserer dyrene individuelt akryl bur på en ledning maske stand og tillate mus til acclimatize i minst 15 min før mål.
    2. Vurdere mekanisk følsomhet ved å måle pote uttak terskelen som svar på en kalibrert rekke von Frey hår spenner fra 0,02 til 4 g. vurdere enhver bevegelse av paw fra anvendt hår som positive uttak svar. Bruke filamenter vinkelrett på labben overflaten med tilstrekkelig styrke til å forårsake litt bøyd mot huden og holder ~ 3 s. gjør at håret ikke vri under søknad til labben.
    3. Beregne 50% pote-uttak terskelen bruker opp metoden15,21.
      Merk: Den første filament gjelder er 0,4 g (andre Start filamenter kan brukes avhengig av tersklene disse musene vise ved baseline). Mangel på respons på en filament angir at den neste tykkere filament brukes i følgende stimulering, mens en positiv respons viser bruken av den neste tynnere filament. Hvor mange hår presentasjoner bestemmes av første differensial svaret. etter at blir 5 flere programmer utført. Beregne 50% terskelen ifølge metodene beskrevet tidligere15,21.
  2. Termisk følsomhet: Hargreaves test
    1. Plasserer dyrene bur på en glassplate forvarmes (30 ° C) og la mus til acclimatize i minst 15 min før målinger, vente til dyrene sitte stille.
    2. Bestemme varme uttak ventetid ganger ved å varme labben av dyrene av en fokusert synlig lysstråle med en Hargreaves apparater (se Tabell for materiale).
      Merk: Intensiteten av strålen er satt til 12%, fordi denne eksperimentelt bestemt intensitet innstillingen, lysstrålen fremkaller en tilbaketrekning respons av en gjennomsnittlig tid på 8 s ved baseline på C57Bl/6 mus. Innstilling for bildeintensitet bør fastsettes per individ maskin og mus belastning. Maksimal stengetider 20 s eller mer brukes til å unngå skade på dyrene.
    3. Måle uttak ventetid ganger ~ 4 ganger per dyr. Gjennomsnittlig alle svar målt. Mål hver pote uavhengig, og med minst 1 min intervaller mellom etterfølgende målinger i samme pote.
  3. Postural underskudd: dynamisk vekt bærende test
    1. Måle kroppsvekten av hvert dyr før testen, siden vektbærende analyse krever kroppsvekten til hvert individuelle dyr som inndataparameter.
    2. Sett dyrene individuelt i et gulv-instrumenterte dynamisk vektbærende system monteres på en cover støtter et kamera som registrerer musebevegelser. La dyret akklimatisere seg i 0,5 til 1 min før innspilling for 5 min.
      Merk: I denne testen, bare en fritt flyttende dyr kan vurderes om gangen.
    3. Justere for å utføre vekt bærende og analysere dataene.
      Merk: I disse eksperimentene, bruker vi følgende parametere: (i) lav vekt terskelen 0,6 g: denne er den minimal vekten nødvendig å aktivere en av cellene i sensoren. (ii) høy vekt grensen på 1 g: Dette nummeret angir vekten for å fullt aktivere én celle. (iii) overflate terskelen på 2 celler: Dette tallet indikerer antallet celler ved siden av hverandre som må aktiveres for å bli tatt i betraktning. (iv) minimum antall bilder er 5: det tar 0,1 s å fange hvert bilde. Nummeret angir minimal antall rammer som musen ikke flytte. Som sådan, en verdi på 5 betyr at musen holdning må være stabile > 0,5 s å oppnå et mål som er tatt i betraktning for analyse.
    4. Utføre analyse av hver video ved replaying videoen, og sikre at hvert Lem er riktig gjenkjent av programvaren på tidsrammen som er angitt av programvaren.
      Merk: Minimum 1 min av registrert tid må valideres. Den dynamiske vektbærende programvaren beregner og gir følgende parametere: (i) vekten til hver individuelle pote gram, og som en prosent av hele kroppen vekt. (ii) vekten kombinert foran labben eller kombinert bak poter gram og som en prosent av hele kroppen vekt. (iii) forholdet mellom venstre/høyre paws vekt bærende eller foran/bak vekt bærende. (iv) areal på hver pote eller kombinert foran/bak labber som aktivert pressure sensitive puten. (v) middelverdi og standardavvik for hver parameter. (vi) varigheten av ulike stillinger (oppdrett, 3 paws eller 4 labber) under hele eksperimentet. (vii) tid (s) hver pote bærer vekt under hele eksperimentet.

4. intratekal injeksjon av IL4-10 fusion protein for analgesi

Merk: Kontroller at ventilasjonen i rommet er åpen å sikre tilstrekkelig luftstrøm. For å teste effekten av IL4-10 fusion protein (1 µg/mus, 5 µL totale injeksjon volum) bør det testes mot kjøretøy injeksjoner og injeksjoner av kombinasjonen av individuelle cytokiner (IL4 + IL10, 0,5 µg + 0,5 µg/mus, 5 µL totale injeksjon volum).

  1. Bedøve musen med 3-4% isoflurane med en oksygen flow rate på 2 L/min i induksjon kammeret. Sjekk svarer at musen er riktig anesthetized ved pinching labben for å sikre at dyret ikke.
  2. Sted musen på tabellen med hodet plassert i nesen kjegle av apparater og opprettholde musen sedasjon med 1,5-2% isoflurane med en oksygen flow rate på 2 L/min mens utfører intratekal injeksjon.
  3. Tilbake-fyll den injiserbare forbindelser i en ren 25 µL glass Hamilton sprøyte koblet til en 27-gauge nål.
  4. Hold musen av ryggraden bakenfor ribbeina og litt løfte musen. Plasser nålen mellom lumbal ryggvirvlene L5 og L6 og nøye sette det gjennom huden rett på midten av lumbal ryggvirvlene. Plass nålen i intervertebral plass.
    Merk: Finne intervertebral plass krever noen 'søk' av bevege nålen langs rostral ventrale aksen, trykke lett nålen før tap av motstand av bein vev er følte.
    1. Bekrefte riktig målgruppe ved å bekrefte at en hale flick oppstod. Injiser 5 µL av sammensatt sakte, vent et par sekunder og så sakte trekke nålen. Hvis bare en enkelt pote flick er observert, er nålen sannsynlig ikke plassert riktig.
  5. Etter injeksjon, sjekke musen tett i de første 30 min etter utvinning fra anestesi sikrer alle motor verdifall/lammelse.
    Merk: Smerte atferd kan være målt (som beskrevet i avsnitt 3) 15 minutter etter utvinning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et representativt bilde av en SDS side gel inneholder forskjellige fraksjoner fikk under affinitet kromatografi rensing er vist i figur 1A. I belastning (L) og flyt gjennom (FT) fraksjoner, er alle proteiner i HEK293 nedbryting observert. Ingen protein er observert i vask (W) fraksjonen. I elueringsrørets (E) fraksjonen, er to band av 35 og 37 kDa observert tilsvarer to ulike glycoforms IL4-10 fusion protein (piler). I figur 1B, en representant styrke analysen i en fullblod vises analysen av to forskjellige IL4-10 fusion protein bunker. En doseavhengig hemming av LPS-indusert TNFα utgivelse er observert, viser tilsvarende bioactivity for de to IL4-10 fusion protein grupper.

Deretter vises en eksempel av testresultater representant eksperimenter som IL4-10 fusion protein er testet for å hemme vedvarende inflammatorisk smerte (figur 2). Vedvarende inflammatorisk smerte ble indusert ved intraplantar injeksjon av 2% karragenan. Mekanisk (figur 2A) samt termisk (figur 2B) hyperalgesia ble fulgt over tid. På dag 6 etter induksjon av inflammatorisk smerte, ble musene injisert øret med IL4-10 fusion protein eller bilen som en kontroll. IL4-10 betydelig løst både mekanisk (figur 2A) og termisk (figur 2B) hyperalgesia, og nådde sin maksimal effekt etter 24 timer etter injeksjon. Ideelt sett bør effekten av fusion proteinet i smerte hemming også testes mot ekvimolare konsentrasjoner av personlige cytokiner å teste om sin evne til å hemme smerte er bedre enn summen av personlige cytokiner. Disse dataene vises ikke her, men vi refererer til en nylig publikasjon som viser denne data9.

Effektiviteten av IL4-10 fusion protein ble sist testet i CFA-indusert inflammatorisk smerte modell9. I dette eksperimentet var flere injeksjoner av IL4-10 fusion protein administrert øret. Flere injeksjoner løst helt CFA-indusert vedvarende inflammatorisk hyperalgesia, målt ved hjelp av von Frey og Hargreaves tester, demonstrere potensialet i IL4-10 fusion protein som et smertestillende behandling9. Her viser vi at intraplantar CFA injeksjon også indusert reduksjon vekt bærende av berørte paw (Figur 3A-B). Intratekal injeksjon IL4-10 fusion protein på dag 7 etter intraplantar CFA injeksjon dempes reduksjon i vekt bærende av berørte labben sammenlignet med bilen-injisert mus 2 dager etter IL4-10 fusion protein administrasjon (Figur 3B ).

Figure 1
Figur 1 : Rensing og karakterisering av IL4-10 fusion protein. (A) Coomassie-farget SDS side analyse av affinitet kromatografi fraksjoner: L: belastning, FT: strømme gjennom, W: vask, E: elueringsrør. (B) funksjonelle analysen: IL4-10 fusion protein dose dependently hemmer TNFα produksjon i LPS stimulert fullblod kultur (uttrykt som prosent hemming forhold til kulturer stimulert med LPS alene). Dataene er representert som gjennomsnittlig ± SD. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Hemming av inflammatoriske hyperalgesia ved IL4-10 fusion protein. Inflammatorisk smerte ble indusert ved en intraplantar injeksjon av 20 µL av 2% karragenan (bil). Seks dager etter intraplantar injeksjon mus fikk intratekal injeksjon (pil) 1 µg IL4-10 fusion protein eller kjøretøy (PBS). (A) mekanisk overfølsomhet (Logg 50% terskel (g)) ble målt over tid med Von Frey test og (B) termisk følsomhet (ventetid (s)) ble målt med Hargreaves test. Dataene er representert som ± SEM. stjerner representere betydelige forskjeller analysert av toveis VARIANSANALYSE, mellom kjøretøy og IL4-10 injisert dyr. **, *** = p < 0,01 og p < 0,001, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Betennelse-induserte endringer i vekt bærende. Inflammatorisk smerte ble indusert ved en intraplantar injeksjon av 20 µL av komplett Freuds Adjuvant (CFA). Vekt bærende på hver labben ble målt ved hjelp av dynamiske vekt bærende enheten. Vekt bærende i gram berørte paw (ipsilateral bakben pote) og total vekt bærende på uberørt paws (foran paws og kontralateral pote) vises, og forholdet mellom vekt bærende ipsilateral labb sammenlignet med andre 3 paws. (A) selvfølgelig vektbærende under CFA-indusert betennelser (n = 10). (B) dag 7 etter intraplantar CFA, mus mottatt intratekal injeksjon 1 µg IL4-10 fusion protein eller kjøretøy (PBS). Vekt bærende ble målt på 0 og 7 dager etter intraplantar CFA og 2 dager etter administrasjon av IL4-10 fusion protein. Vekt bærende ipsilateral labb sammenlignet med andre 3 paws representeres (n = 3-4). Dataene er representert som gjennomsnittlig ± SEM. *** = p < 0,001; ** = p < 0.01; * = p < 0,05 sammenlignet med planlagte (dag 0). # = p < 0,05 sammenlignet kjøretøy behandlet dyr. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette manuskriptet beskriver metoder for produksjon og karakterisering av en rekombinant IL4-10 fusion protein og metoder for å teste effektiviteten i hemme inflammatorisk hyperalgesia i musen modeller av vedvarende inflammatorisk smerte. Produksjon og rensing av IL4-10 fusion protein utføres på en liten skala. HEK293 celler er merket som et uttrykk for protein produksjon fordi de aktivere post-translasjonell endringer som kan oppnås i prokaryote uttrykk systemer. Post-translasjonell modifikasjoner er relevante for protein-funksjonen, og fraværet av slike endringer kan påvirke den terapeutiske effekten av IL4-10 fusion protein. Proteinet er renset fra kultur supernatant ved affinitet kromatografi. Vi valgte å bruke huset gjort monoklonalt antistoff mot IL4 for affinitet rensing og ikke å produsere en IL4-10 fusion protein inneholder en kode for å tillate rensing med en affinitet tag-systemet. Grunnen til dette var å unngå muligheten for tag-relaterte endringer i proteinfolding og funksjon. Likevel, hvis en svært selektive monoklonalt antistoff mangler, et protein med et merke må utvikles, f.eks en sin tag. I så fall vil det være viktig å avgjøre om C - eller N-terminus av protein er best egnet for tag å unngå å påvirke protein-funksjonen.

Fra 1 L HEK293 nedbryting, ca 3 mg renset IL4-10 fusion protein er oppnådd, men dette kan variere fra parti til parti. Kolonnen for affinitet rensing kan brukes for flere rensing sykluser før forkaster. Det mest sensitive skrittet i den rensing prosedyren er tilsettes IL4-10 fusion protein fra kolonnen av lav pH, fordi den lave pH kan forårsake irreversibel protein rødsprit og protein nedbør. Dermed er vedlikehold av innfødte proteinstruktur og fravær av protein aggregater avgjørende for god kvalitet bunker. Derfor, må evaluering av bioactivity av fusion protein være testet i vitro før og etter rensing med forskjellige elueringsrør buffere. Etter rensing av IL4-10 fusion protein, ble bioactivity ikke redusert i forhold til ikke-renset protein. Videre, samlet dannelsen var fraværende når elueringsrør trinnet ble utført med 0.1 M glysin buffer (pH = 2,5), og pH i elueringsrørets fraksjoner ble umiddelbart nøytralisert med 1 M Tris buffer (pH = 9).

Konsentrasjonen av renset IL4-10 fusion protein er beregnet på grunnlag av menneskelig IL10 ELISA resultater. BCA protein analysen brukes til å bekrefte protein konsentrasjoner. Gjenoppretting av proteinet etter rensing evalueres basert på konsentrasjoner målt i belastning, strømme gjennom, vask og elueringsrør fraksjoner av IL10-ELISA. BCA protein konsentrasjon fastsettelse av IL4-10 fusion protein kan evalueres bare i dialyzed elueringsrør fraksjoner. Non-dialyzed elueringsrør fraksjoner inneholder imidazole, et stoff som påvirker BCA målingen. Non-renset fraksjoner inneholder andre proteiner fra HEK293 kultur medium.

Fastsetting av bioactivity av IL4-10 fusion protein utføres i en fullblod analysen. Bioactivity IL4-10 fusion protein bør vurderes i hele blodet av flere givere til å bestemme om funksjonelle aktiviteten beholdes. Flere givere er nødvendig fordi giver til donor varians finnes i egenskap av IL10 og IL4 å hemme LPS-indusert TNFα utgivelse. Videre kan uttrykk for IL4R og IL10R variere mellom givere, påvirker kapasitet IL4-10 fusion protein å hemme LPS-indusert TNFα produksjon.

I metodene beskrevet detaljert vi 2 musen modeller av vedvarende inflammatorisk smerte å evaluere effekten av IL4-10 fusion protein løse smerte i vivo. For fullstendig vurdering av smertestillende potensialet av rekombinant fusion proteiner, bør likevel molekylene testes i andre modeller av kroniske smerter også. Disse modellene inkluderer, men er ikke begrenset til modeller av nerve-skade og kjemoterapi-indusert nevropatisk smerte9,22. Selv om von Frey test og Hargreaves test brukes vanligvis for testing smertestillende midler, har det blitt klart at en ekstra test (f.eks dynamisk vekt bærende test) bør tas for å vurdere effekten på ikke-utløste smerter behaviorsand også med operant smerte analysen (f.eks betinget sted preferanse (CPP) som gjenkjenner ikke utløste smerter atferd17,18). For å utføre CPP, bør utbruddet av smerte-hemmende effekten av fusion protein tas i betraktning, fordi condition av dyrene ved smertelindring krever raske fungerende analgetika (som utøver effekter på mindre enn 15 min). Likevel kan CPP fortsatt brukes til å teste om sammensatt hemmet smerte hvis testen sammensatte har en treg smertestillende utbruddet, men er sannsynlig å indusere langvarig smerte hemming (mer enn 4 dager). I dette tilfellet, må stoff-indusert tap av condition med hurtigvirkende analgetika vurderes.

Intratekal injeksjoner er valgt som en rute med administrasjonen, som sammensatte vil nå smerte relevante områder som dorsal root Ganglion og ryggmargen. Spesielt intratekal levering av smertestillende midler har blitt vanlig praksis som behandling av pasienter med kroniske smerter, som dette reduserer dosen av smertestillende medikament nødvendig og reduserer toksisitet og systemisk bivirkninger. Likevel har denne administrasjonen ruten noen begrensninger; det krever veltrente personell, og på grunn av liten subarachnoid space, volumet av injeksjon bør være begrenset til 5 µL i mus, krever svært konsentrert løsninger av fusion protein. Teknikken av intratekal injeksjoner krever opplæring. Slik trening kan utføres på ikke-gjenopprette bedøvet dyr med injeksjon av fargestoff å bekrefte riktig intratekal injeksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Del av dette arbeidet har vært finansiert av en Utrecht University biovitenskap gi

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FreeStyle 293-F cells Invitrogen R790-07 Human embryonic kidney cells 
GIBCO FreeStyle 293 Expression Medium Life technologies 12338018 Culture medium
293fectin Reagent Invitrogen 12347019 Transfection reagent
GIBCO Opti-MEM + GlutaMAX Life technologies 51985026 Reduced Serum Medium for use during cationic lipid transfections 
GIBCO RPMI Medium 1640 (1x) Life technologies 52400-025
CNBr-Activated Sepharose 4B GE Healthcare 17-0430-01 pre-activated media for coupling antibodies or other large proteins
Hydrochloric acid fuming 37%  Merck 1003171000
Sodium chloride Sigma S7653-1kg
Sodium bicarbonate  Sigma 31437
Trizma hydrochloride Sigma T3253-500G TRIS hydrochloride 
Acetic Acid 100%                                Merck 1.00063.1000 
Glycin-HCl                                           Sigma G2879             
PBS                                                     Pharmacie, UMCU Phosphate-Buffered Saline
10X TGS BIO-RAD 161-0772 Tris/Glycine/SDS Buffer for SDS electrophoresis
Mini-PROTEAN TGX Gels BIO-RAD 456-1046 12% SDS precast gels
Trans-Blot Turbo Transfer Pack BIO-RAD 170-4157 Western blot transfer packs
Yarra 3u SEC-2000 column Phenomenex
InstantBlue Protein Stain Expedeon ISB1L ready to use Coomassie protein stain for polyacrylamide gels
Human IL-10 DuoSet ELISA R&D DY217B
Human TNFα ELISA Set Diaclone 851570020
BCA Pierce Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23227
Carrageenan Sigma-Aldrich 22049 plant mucopolysaccharide
CFA Sigma-Aldrich F5881 vaccine adjuvant
Hamilton syringe Sigma-Aldrich 20779 glass syringe
Animal Enclosure IITC Life Science 433 Animal Enclosure
Von Frey mesh stand IITC Life Science 410 Mesh Stand
von Frey hairs  Stoelting 58011 touch test sensory probes
Plantar Test (Hargreaves Method) IITC Life Science 390G plantar test with heated glass
Dynamic Weight Bearing test Bioseb BIO-DWB-AUTO-M postural deficit test
Glass Econo-Column Columns, 1.5 × 30 cm BIO-RAD 7371532 glass chromatography column  
SnakeSkin Dialysis Tubing  Thermo Scientific 88242
Minisart NML Syringe Filter  Sartorius 16555-K single use filter unit, 0.45 μM
CASY Cell Counter and Analyzer Roche

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Breivik, H., Collett, B., Ventafridda, V., Cohen, R., Gallacher, D. Survey of chronic pain in Europe: prevalence, impact on daily life, and treatment. Eur J Pain. 10 (4), 287-333 (2006).
  2. Gerdle, B., et al. Prevalence of widespread pain and associations with work status: a population study. BMC Musculoskelet Disord. 9, 102 (2008).
  3. Borsook, D., Aasted, C. M., Burstein, R., Becerra, L. Migraine Mistakes: Error Awareness. Neuroscientist. 20 (3), 291-304 (2014).
  4. Raoof, R., Willemen, H. L., Eijkelkamp, N. Divergent roles of immune cells and their mediators in pain. Rheumatology. , (2017).
  5. Ren, K., Dubner, R. Interactions between the immune and nervous systems in pain. Nat Med. 16 (11), 1267-1276 (2010).
  6. Milligan, E. D., Penzkover, K. R., Soderquist, R. G., Mahoney, M. J. Spinal interleukin-10 therapy to treat peripheral neuropathic pain. Neuromodulation. 15 (6), 520-526 (2012).
  7. Grace, P. M., et al. Behavioral assessment of neuropathic pain, fatigue, and anxiety in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and attenuation by interleukin-10 gene therapy. Brain Behav Immun. 59, 49-54 (2017).
  8. Kiguchi, N., et al. Peripheral administration of interleukin-13 reverses inflammatory macrophage and tactile allodynia in mice with partial sciatic nerve ligation. J Pharmacol Sci. 133 (1), 53-56 (2017).
  9. Eijkelkamp, N., et al. IL4-10 Fusion Protein Is a Novel Drug to Treat Persistent Inflammatory Pain. J Neurosci. 36 (28), 7353-7363 (2016).
  10. Schott, H. Affinity Chromatography: Template Chromatography of Nucleic Acids and Proteins. , Dekker. New York. (1984).
  11. Scopes, R. K. Strategies for protein purification. Curr Protoc Protein Sci. , Chapter 1 Unit 1 2 (2001).
  12. Gregory, N. S., et al. An overview of animal models of pain: disease models and outcome measures. J Pain. 14 (11), 1255-1269 (2013).
  13. Wang, H., et al. Balancing GRK2 and EPAC1 levels prevents and relieves chronic pain. J Clin Invest. 123 (12), 5023-5034 (2013).
  14. Willemen, H. L., et al. Microglial/macrophage GRK2 determines duration of peripheral IL-1beta-induced hyperalgesia: contribution of spinal cord CX3CR1, p38 and IL-1 signaling. Pain. 150 (3), 550-560 (2010).
  15. Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
  16. Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
  17. Robinson, I., Sargent, B., Hatcher, J. P. Use of dynamic weight bearing as a novel end-point for the assessment of Freund's Complete Adjuvant induced hypersensitivity in mice. Neurosci Lett. 524 (2), 107-110 (2012).
  18. He, Y., Tian, X., Hu, X., Porreca, F., Wang, Z. J. Negative reinforcement reveals non-evoked ongoing pain in mice with tissue or nerve injury. J Pain. 13 (6), 598-607 (2012).
  19. Bottros, M. M., Christo, P. J. Current perspectives on intrathecal drug delivery. J Pain Res. 7, 615-626 (2014).
  20. Eijkelkamp, N., et al. A role for Piezo2 in EPAC1-dependent mechanical allodynia. Nat Commun. 4, 1682 (2013).
  21. Bradman, M. J., Ferrini, F., Salio, C., Merighi, A. Practical mechanical threshold estimation in rodents using von Frey hairs/Semmes-Weinstein monofilaments: Towards a rational method. J Neurosci Methods. 255, 92-103 (2015).
  22. Krukowski, K., et al. CD8+ T Cells and Endogenous IL-10 Are Required for Resolution of Chemotherapy-Induced Neuropathic Pain. J Neurosci. 36 (43), 11074-11083 (2016).

Tags

Medisin problemet 134 kroniske smerter narkotika utvikling neuroimmunology fusion protein anti-inflammatorisk cytokiner protein
Utviklingen av rekombinante proteinene til å behandle kroniske smerter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Prado, J., Popov-Celeketic, J.,More

Prado, J., Popov-Celeketic, J., Steen-Louws, C., Raoof, R., Hack, E., Eijkelkamp, N. Development of Recombinant Proteins to Treat Chronic Pain. J. Vis. Exp. (134), e57071, doi:10.3791/57071 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter