Summary
In questo documento vengono forniti dettagli per i metodi di produzione e controllo di qualità di una proteina di fusione ricombinante IL4-10. Mostriamo anche come testare l'efficacia di questa proteina a risolvere il dolore in un modello murino di dolore infiammatorio.
Abstract
Dolore cronico è difficile da trattare e sono urgentemente necessari nuovi approcci per risolvere il dolore persistente. Citochine antinfiammatorie sono promettenti candidati per il trattamento di condizioni debilitanti di dolore a causa della loro capacità di regolare le interazioni neuro-immunitaria aberrante. Tuttavia, fisiologicamente lavorano in una rete di varie citochine, e di conseguenza il loro effetto terapeutico potrebbe non essere ottima quando usati come farmaci stand-alone. Per ovviare a questa limitazione, abbiamo sviluppato una proteina di fusione delle citochine antinfiammatorie IL4 e IL10. Qui, descriviamo i metodi di produzione e controllo di qualità della proteina di fusione ricombinante IL4-10 e testiamo l'efficacia della proteina di fusione IL4-10 a risolvere il dolore in un modello murino di dolore infiammatorio persistente.
Introduction
Dolore cronico rimane uno dei problemi medici più debilitanti e sotto-trattata del XXI secolo, che interessano > 20% della popolazione adulta1,2. Tuttavia, trattamenti per fornire sollievo dal dolore cronico sono spesso inefficaci o devono essere interrotto a causa di gravi effetti collaterali3. Cosa importante, attualmente disponibili farmaci solo fornire sollievo sintomatico, ma non significativamente modificare o curare il dolore cronico. Anche se il dolore cronico sembra essere un disturbo neurologico, prova suggerisce la partecipazione del sistema immunitario nel dolore cronico sviluppo4,5. Inoltre, gli approcci basati su immunitario per trattare il dolore stanno emergendo. Ad esempio, citochine antinfiammatorie inibiscono il dolore in diversi modelli di dolore cronico6,7,8. Tuttavia, citochine antinfiammatorie hanno una breve emivita, riducendo i loro potenziali effetti d'inibizione dolore. Inoltre, citochine antinfiammatorie funzionano più in modo ottimale in concerto con l'altro. Per superare queste limitazioni, abbiamo recentemente fuso le citochine anti-infiammatorie interleukin-4 (IL4) e interleukin-10 (IL10) in una molecola. La proteina di fusione di IL4-10 Mostra la superiore efficacia nell'inibizione del dolore infiammatorio e neuropatico cronico rispetto ai singoli citochine9. Qui descriviamo come tale proteina di fusione viene prodotto, purificato, e come la sua qualità è controllata.
Proteina di fusione di IL4-10 viene prodotta in cellule umane di trasfezione transiente di cellule HEK293-F con un vettore di espressione di pUPE che trasportano la sequenza di cDNA che codifica la proteina di fusione di IL4-10. Cellule HEK293-F sono scelti per consentire la modificazione post-traduzionale della proteina, qualcosa che non si verifica in sistemi di espressione batterica. Per ottimizzare glycan tappatura con acido sialico, cDNA che codifica beta-galactoside-2, 3-sialil-transferasi è incorporata nel vettore come un transgene secondo. La proteina di fusione viene purificata mediante purificazione di affinità della proteina del surnatante della cultura, perché è più potente di purificazione da altri metodi ad esempio esclusione dimensionale o scambio ionico cromatografia10,11. Per purificare la proteina di fusione di IL4-10, abbiamo usato in-house made anticorpi monoclonali contro IL4. Valutazione della purezza e bioattività di proteina di fusione purificata IL4-10 viene eseguite come parte del controllo di qualità. La purezza del prodotto batch viene valutata dal sodio dodecil solfato elettroforesi del Gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) e alta pressione Size Exclusion Chromatography (HP-SEC). La bioattività della proteina di fusione IL4-10 viene valutata misurando la capacità di inibire il lipopolisaccaride (LPS)-ha indotto la produzione di fattore di necrosi tumorale-alfa (TNFα) in colture di sangue intero e nel confronto alla combinazione dell'individuo citochine.
Infine, al fine di verificare la capacità delle proteine di fusione di IL4-10 di inibire il dolore cronico, descriviamo come la proteina di fusione possa essere testata come analgesico in modelli murini ampiamente usato di dolore infiammatorio persistente12,13,14 . Qui descriviamo i metodi di un modello di dolore infiammatorio. Tuttavia, è importante notare che altri modelli di dolore può essere usato (ad es., modelli di dolore neuropatico), a seconda della ricerca domande che hanno bisogno di essere risolta. Per valutare il dolore in questi modelli, è importante utilizzare una varietà di misure comportamentali che includono evocate e di dolore non-evocati. Qui, abbiamo descritto i metodi di valutazione per i cambiamenti nelle risposte comportamentali meccanicamente e termicamente evocate. Sensibilità meccanica agli stimoli innocui viene valutata utilizzando il test di Von Frey, mentre la sensibilità termica è valutata con il test di Hargreaves. Cosa importante, non evocato iperalgesia/allodinia è misurata tramite il test dinamico cuscinetto di peso. Queste misure sono ampiamente accettate come misure di dolore e rendere le informazioni importanti sulle soglie di dolore e potenziale dolore esperto di animali15,16,17. Altre misure per valutare il dolore non-evocati (ad es., stimolo indipendente), come il test di preferenza di posto condizionata, può essere prezioso18. Per valutare il potenziale della droga per inibire il dolore, abbiamo effettuato la somministrazione intratecale della proteina di fusione, come con questa via di somministrazione meno dose di proteine è necessaria per raggiungere settori legati al dolore ed evitare sistemica (lato-) effetti19, 20.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità alle linee guida internazionali e previa approvazione del comitato etico sperimentale locale. Sangue intero è stato ottenuto dal servizio donatore Mini (Mini donatore Dienst, MDD) presso University Medical Center Utrecht (UMCU) nei Paesi Bassi. MDD ha ricevuto l'approvazione positiva dal comitato di etica medica della UMCU (Medisch Ethische Toetscommissie) per il numero protocollo 07-125/C.
1. caratterizzazione e produzione di proteine
- Coltura cellulare
Nota: Vedere la Tabella materiali per mezzo di coltura utilizzato.- Scongelare le cellule HEK293-F a 37 ° C fino a quando c'è un piccolo ammasso di ghiaccio. Trasferire immediatamente le cellule scongelate 10 mL di terreno ghiacciato (4 ° C) e centrifugare la sospensione cellulare a temperatura ambiente (TA) per 4 minuti (min) a 500 x g.
- Rimuovere il mezzo e risospendere il pellet cellulare in 10 mL di medium fresco a RT, seguita da centrifugazione a 500 x g per 4 min.
- Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 5 mL di terreno in RT. aggiungere la sospensione cellulare direttamente in un matraccio di 125 mL contenente 25 mL di terreno pre-riscaldato (37 ° C). Coltura le cellule a 37 ° C, 8% CO2e 95% di umidità su agitatore orbitale ruota ad una velocità di 125 giri/min.
- Sottocultura le cellule due volte a settimana. Utilizzare una cella automatizzata del contatore (Vedi Tabella materiali) per valutare il numero di cell e attuabilità delle cellule. Cellule vitali di seme ad una concentrazione di 3 x 105 cellule/mL in matracci di Erlenmeyer. Mantenere il volume totale del terreno di coltura a 1/5 del volume totale di matracci di Erlenmeyer cultura in qualsiasi momento per mantenere ottimale aerazione.
- Trasfezione
Nota: Sottocultura le cellule tre a quattro volte prima di transfezione e transfect li quando l'attuabilità delle cellule è > 90%. La vitalità cellulare è valutata da un automatizzato (campo elettrico multi-canale) cellcounting sistema basato sull'integrità della membrana plasmatica. Vedi la Tabella materiali per il reagente di transfezione.- Centrifugare le cellule a RT per 4 min a 500 x g; Risospendere il pellet cellulare in 10 mL di terreno di coltura pre-riscaldata (37 ° C) e diluire la sospensione di cellule ~1.0 x 106 cellule/mL in un volume totale di 1 L. aliquota della sospensione di cellule in 10 aliquote di 100 mL in beute Erlenmeyer da 500 mL.
- Diluire 1 mg di DNA plasmidico in medium essenziale minimo di 33 mL siero ridotto (MEM, Vedi Tabella materiali) di miscelazione delicata. In un tubo separato, diluire 1.330 µ l di reagente di transfezione in MEM di miscelazione delicata. Incubare per entrambe le soluzioni a temperatura ambiente per 5 min, aggiungere e mescolare il DNA diluito in MEM per il reagente di transfezione in MEM e incubare la miscela per 30 minuti a TA.
- Aggiungere il mix di reagente di transfezione del DNA per le cellule (coltivate nella sezione 1); aggiungere 6,6 mL della miscela ogni 500 mL beuta contenente 100 mL di cellule in terreno di coltura. Mantenere le cellule in condizioni di coltura menzionati in precedenza. Raccogliere il supernatante di coltura contenente secernuta proteina di fusione di IL4-10 tre giorni dopo la trasfezione.
- Determinare la concentrazione della proteina di fusione IL4-10 nel surnatante della cultura mediante l'esecuzione di un test ELISA IL10 secondo il protocollo del produttore (Vedi Tabella materiali).
Nota: In condizioni di coltura ottimale, la concentrazione della proteina di fusione può essere devono essere compresi tra 2,5 e 5 µ g/mL.
- Purificazione della proteina di cromatografia di affinità
Nota: La cromatografia di affinità è eseguita a temperatura ambiente. Tuttavia, tutte le frazioni (cultura surnatante, carico, flusso attraverso ed eluizione frazioni) sono mantenute sul ghiaccio durante la procedura.- Coppia 10 mg di un in-house-made anticorpo monoclonale contro IL4 a 1 g di CNBr - attivato sepharose 4B, secondo il protocollo del produttore (Vedi Tabella materiali). Versare lentamente 2,5 mL di perline sepharose accoppiato la colonna di cromatografia di vetro (30 cm di lunghezza e 1,5 cm diametro interno, Vedi Tabella materiali).
- Bloccare i restanti siti dei branelli di legame passando 50 mL di tampone fosfato salino (PBS) contenente l'1% di sieroalbumina bovina attraverso la colonna. Lavare la colonna con 25 mL di PBS (pH = 7,4) seguita da 12,5 mL di tampone di glicina 0.1 M (pH = 2.5) e 25 mL di PBS (pH = 7.4).
- Passare 100 mL di coltura di cellule HEK293 concentrato 10 volte surnatante attraverso la colonna ad un flusso di 1 mL/min. lavare la colonna con 50 mL di PBS.
- Eluire la proteina di fusione di IL4-10 associata con 12,5 mL di tampone di glicina 0.1 M (pH = 2.5) ad un flusso di 1 mL/min e raccogliere le frazioni di 2,5 mL. Aggiungere 350 µ l di tampone Tris 1 M (pH = 9) per ogni frazione per portare il pH a 7. Dializzare neutralizzate frazioni durante la notte contro 2 L di PBS (pH = 7.4).
- Utilizzare tubi di dialisi con secco diametro 16 mm e un peso molecolare di 3,5 K cut-off. Sterile filtrare le frazioni dializzate utilizzando filtri monouso con 0,45 µM di diametro dei pori. Memorizzare la soluzione di proteine di fusione IL4-10 sterile in aliquote a-80 ° C.
- Valutare la purezza della proteina di fusione IL4-10 eluita di Coomassie macchiati di gel di SDS-PAGE 12% e HP-SEC (colonna 3 µm SEC-2000). Per analisi di HP-SEC, carico 40 µ l di proteina a concentrazione di ~ 1 mg/mL sulla colonna. Utilizzare 100 mM tampone sodio fosfato con 150 mM di cloruro di sodio (pH = 6,8) come fase mobile. Impostare la portata a 1 mL/min.
- Determinare la concentrazione di ciascun lotto di purificato della proteina di fusione di IL4-10 da ELISA IL10 e analisi della proteina di acido bicinconinico (BCA Protein Assay Kit, Vedi Tabella materiali) secondo i protocolli del produttore.
- Utilizzare IL10 umano ricombinante per creare una curva standard nel test ELISA. Per correggere la differenza di dimensioni tra IL10 ricombinante (18 kDA) e proteina di fusione di IL4-10 (34 kDa), moltiplicare la concentrazione ottenuta per un fattore pari a 1,8.
- Bioattività della proteina di fusione di IL4-10
Nota: L'analisi di sangue intero viene eseguita per ogni batch di IL4-10 proteina di fusione prodotta e l'attività di diversi lotti è paragonata come parte del controllo di qualità. L'analisi di sangue intero viene eseguita nel sangue umano fresco raccolti il giorno del test in tubi di eparina. Sangue è stato ottenuto dai volontari sani nel nostro servizio di donatore in-House. I campioni devono essere manipolati come pericoli potenzialmente biologici.- Preparare 3 volte pre-diluizioni seriali della proteina di fusione purificata IL4-10 nel medium RPMI (Vedi Tabella materiali) oltre una concentrazione intervallo 5-1.215 ng/mL.
- Preparare pre-diluizioni di LPS (100 ng/mL) e sangue umano che viene diluito 4 volte nel medium RPMI.
- Dispensare il pre-diluizioni della proteina di fusione di IL4-10, LPS e sangue umano in una piastra a 48 pozzetti. Aggiungere in ciascun pozzetto proteina di fusione di IL4-10 µ l 50 (concentrazione finale 1-243 ng/mL), 75 µ l RPMI media, 25 µ l LPS (concentrazione finale di 10 ng/mL) e 100 µ l di sangue umano (finale diluito).
Nota: Il volume totale per pozzetto è 250 µ l. - Incubare la piastra a 37 ° C, 8% CO2e 95% di umidità per 18 h.
- Valutare la concentrazione di TNFα in surnatanti usando un ELISA di TNFα, secondo il protocollo del produttore.
- Proteina di fusione di IL4-10 secondo la formula per calcolare l'inibizione della risposta infiammatoria: inibizione % = (1-(A-B)/(C-B)) x 100
Nota: Qui A = livelli di TNFα nelle culture stimolate LPS trattate con proteina di fusione di IL4-10, B = livelli di TNFα in cultura non stimolata e C = livelli di TNFα in cultura stimolata LPS.
2. topo per persistente dolore infiammatorio
Nota: È importante utilizzare topi maschi e femminili (C57Bl/6) perché ciò consentirà l'identificazione degli effetti di sesso-dipendente. In generale, i topi utilizzati sono tra 8-16 settimane di vita. Per determinare il numero di animali necessari, calcolo della potenza deve essere eseguita. Strumenti Web-based per eseguire tali calcoli si trovano facilmente su internet (ad es., http://www.powerandsamplesize.com; http://www.sample-size.net).
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Induzione di dolore infiammatorio cronico
Nota: Indurre persistente dolore infiammatorio in topi adulti con iniezioni intraplantar del carrageenano o adiuvante completo di Freud (CFA). I vari test non interferiscano tra loro.- Carragenina (2% p/v) di preparare sciogliendo λ-carragenina (Vedi Tabella materiali) nello 0,9% NaCl passando la soluzione attraverso un ago di 23 gauge per garantire che la carragenina correttamente è dissolto. Preparare una soluzione fresca direttamente prima di eseguita l'iniezione.
- In alternativa, se viene utilizzato il CFA, mescolare la soluzione CFA correttamente prima di iniettarlo intraplantarly, perché il CFA è un'emulsione acqua in olio contenente 1 mg di Mycobacterium tubercolosi (H37Ra) calore uccise e secchi, 0,85 mL di olio di paraffina e 0,15 mL mannide sorbitano (Vedi Tabella materiali).
Nota: Siringhe di vetro Hamilton con metallo stantuffi sono raccomandati per iniettando questo composto perché tuffatori di gomma possono reagire con l'olio in adiuvante. -
Iniezione intraplantar
- Mantenere il composto (passaggi 2.1.1 o 2.1.2) nella siringa a temperatura ambiente per almeno 15 minuti prima dell'iniezione per consentire la regolazione a RT. iniettare 20 µ l del composto (o solventi come un controllo) per via sottocutanea nella zampa posteriore del mouse non anestetizzati con un 30-calibro ago.
- Inserire l'ago alla base del pollice verso il tallone e iniettare il composto quando l'ago è inserito circa 0,5 cm. Dopo l'iniezione, ritirare lentamente l'ago mentre ruotando leggermente la siringa per evitare perdite di soluzione fuori del sito di iniezione.
3. dolore misure
Nota: Assicurarsi che i ricercatori eseguono esperimenti comportamentali sono ciechi per il trattamento del mouse. È importante acclimatare gli animali all'ambiente di prova prima di eseguire qualsiasi misurazione. Preferibilmente, la settimana prima di iniziare gli esperimenti, gli animali sono collocati 1 - 2 volte per 15-30 min in ciascuno dei diversi dispositivi utilizzati per effettuare le prove. Quando si gestiscono i maschi e le femmine nello stesso esperimento, valutare i maschi indipendentemente dalle femmine. Gabbie pulite e superfici ampiamente tra i diversi gruppi per evitare potenziali effetti indesiderati sul comportamento dei sessi differenti. Misurare le latenze di prelievo basale o soglie meccaniche due a tre volte per determinare le soglie della linea di base con precisione e identificare se questi sono stabili prima iniezione intraplantar di qualsiasi composto.
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Test di von Frey: sensibilità meccanica agli stimoli innocui
- Posizionare gli animali individualmente nelle gabbie acriliche su un banco della rete metallica e consentire i topi acclimatare per almeno 15 minuti prima della misurazione.
- Valutare la sensibilità meccanica misurando la soglia di ritiro di zampa in risposta ad una serie calibrata di peli di von Frey che variano da 0,02 a 4 g. considera qualsiasi movimento della zampa lontano dai capelli applicata come risposta positiva ritiro. Applicare i filamenti perpendicolarmente alla superficie di zampa con forza sufficiente da causare lieve flessione contro la pelle e tenere premuto per 3 ~ s. Make sicuro i capelli non si attorcigli durante l'applicazione per la zampa.
- Calcolare la soglia di zampa-ritiro 50% utilizzando il metodo altalenante15,21.
Nota: Il primo filamento da applicare è 0,4 g (altri filamenti di partenza possono essere utilizzati a seconda delle soglie questi topi visualizzare al basale). Una mancanza di risposta ad un filamento indica che il prossimo filamento più spesso viene utilizzato nella stimolazione seguente, mentre una risposta positiva indica l'uso del filamento sottile successivo. Il numero di presentazioni dei capelli è determinato dalla prima risposta differenziale; Dopo di che, 5 altre applicazioni vengono eseguite. Calcolare che la soglia del 50% secondo i metodi descritti precedentemente15,21.
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Sensibilità termica: test di Hargreaves
- Sistemare gli animali in gabbie su una lastra di vetro pre-riscaldata (30 ° C) e consentire i topi acclimatare per almeno 15 min prima di misurazioni, in attesa fino a quando gli animali stare fermo.
- Determinare i tempi di latenza ritiro calore riscaldando la zampa degli animali da un fascio concentrato di luce visibile utilizzando un apparato di Hargreaves (Vedi Tabella materiali).
Nota: L'intensità del fascio è impostato su 12%, poiché con questa impostazione intensità determinato sperimentalmente, il fascio di luce evoca una risposta di ritiro di un tempo medio di 8 s alla linea di base su topi C57Bl/6. L'impostazione di intensità deve essere determinata per singola macchina e topo. Orari di accettazione massima di 20 s o più vengono utilizzati per evitare lesioni agli animali. - Misurare i tempi di latenza di ritiro ~ 4 volte per animale. Media di tutte le risposte misurate. Misurare ogni zampa in modo indipendente e con almeno 1 min intervalli tra le misurazioni successive nella stessa zampa.
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I deficit posturali: prova del cuscinetto di peso dinamico
- Misurare il peso corporeo di ciascun animale prima della prova, dal momento che richiede analisi del cuscinetto di peso il peso corporeo di ogni singolo animale come parametro di input.
- Sistemare gli animali individualmente in un sistema portante dinamico strumentati piano montato su una copertina sostenendo una telecamera che registra i movimenti del mouse. Lasciate che l'animale acclimatare per 0,5 a 1 min prima della registrazione per 5 min.
Nota: In questa prova, un solo animale liberamente commovente può essere valutato in un momento. - Regolare le impostazioni eseguire cuscinetto di peso e analizzare i dati.
Nota: In questi esperimenti, utilizziamo i seguenti parametri: soglia di peso (i) bassa di 0,6 g: questo è il peso minimo necessario per attivare una delle celle del sensore. (ii) ad alto peso soglia di 1 g: questo numero indica il peso necessario per attivare completamente una cella. (iii) superficie soglia delle 2 cellule: questo numero indica il numero di celle adiacenti tra loro che devono essere attivati per essere prese in considerazione. (iv) minimo numero di immagini è 5: prende 0,1 s per catturare ogni immagine. Il numero indica il numero minimo di fotogrammi in cui il mouse non si muove. Come tale, deve essere stabile per un valore di 5 indica che il mouse posturale > 0,5 s per ottenere una misura che viene presa in considerazione per l'analisi. - Eseguire l'analisi di ciascun video riproducendo il video e garantire che ogni arto è riconosciuta correttamente dal software presso il lasso di tempo indicato dal software.
Nota: Un minimo di 1 minuto di tempo registrato deve essere convalidato. Il carico dinamico cuscinetto software calcola e fornisce i seguenti parametri: (i) il peso a carico di ogni zampa individuo in grammi e come percentuale del peso del corpo intero. (ii) il peso a carico della zampa anteriore combinata o le zampe posteriori combinate in grammi e in percentuale del peso del corpo intero. (iii) il rapporto di sinistra/destra zampe cuscinetto di peso o peso cuscinetto posteriore/anteriore. (iv) la superficie di ogni zampa o combinate zampe anteriore/posteriore che ha attivato il pad sensibile di pressione. (v) media e deviazione standard per ogni parametro. (vi) durata di diverse posture (allevamento, 3 zampe o 4 zampe) durante l'intero esperimento. (vii) tempo (s) ogni zampa ha un peso durante l'intero esperimento.
4. Intrathecal iniezione di IL4-10 proteina di fusione per analgesia
Nota: Verificare che la ventilazione della camera è aperta per assicurare il corretto flusso dell'aria. Per verificare l'efficacia della proteina di fusione IL4-10 (1 µ g/mouse; 5 µ l di volume di iniezione totale) dovrebbe essere esaminato contro veicolo iniezioni e iniezioni della combinazione delle singole citochine (IL4, 0,5 µ g + IL10 e 0,5 µ g/mouse, 5 µ l di volume di iniezione totale).
- Anestetizzare il mouse con isoflurano 3-4% con un tasso di flusso di ossigeno di 2 L/min nella camera di induzione. Controllare che il mouse è adeguatamente anestetizzato pizzicando la zampa per garantire che l'animale non è reattivo.
- Posto il mouse sul tavolo con la testa posta nel cono di naso dell'apparato e mantenere la sedazione del mouse con isoflurane 1.5-2% con un tasso di flusso di ossigeno di 2 L/min quando si esibiva l'iniezione intratecale.
- Retro-riempimento composti iniettabili in un bicchiere pulito 25 µ l siringa Hamilton collegato ad un ago calibro 27.
- Impugnare il mouse dalla spina dorsale posteriore alle costole e sollevare leggermente il mouse. Posizionare l'ago verticalmente tra le vertebre lombari L5 e L6 e inserire con attenzione attraverso la pelle proprio al centro delle vertebre lombari. Posizionare l'ago nello spazio intervertebrale.
Nota: Trovare lo spazio intervertebrale può richiedere alcuni 'ricerca' di spostare l'ago lungo l'asse ventrale rostrale, premendo leggermente l'ago finché non si avverte una diminuzione della resistenza del tessuto osseo.- Confermare la corretta destinazione verificando che si è verificato un colpo di coda. Iniettare lentamente 5 µ l del composto, attendere un paio di secondi e poi lentamente ritrarre l'ago. Se si osserva un colpo di zampa singolo, solo l'ago è probabile non posizionato correttamente.
- Dopo l'iniezione, è possibile controllare il mouse molto attentamente per i primi 30 min dopo il recupero dall'anestesia per garantire l'assenza di qualsiasi danno/paralisi motoria.
Nota: I comportamenti di dolore possono essere misurati (come descritto nella sezione 3) 15 minuti dopo il recupero.
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Representative Results
Un'immagine rappresentativa di un gel di SDS-PAGE che contiene diverse frazioni ottenute durante la purificazione di cromatografia di affinità è illustrata nella Figura 1A. Del carico (L) e il flusso attraverso le frazioni (FT), si osservano tutte le proteine presenti nel surnatante HEK293. Nessuna proteina è osservata nella frazione di lavaggio (W). Nella frazione di eluizione (E), due bande di kDa 35 e 37 sono osservate corrispondenti a due diverse glicoforme IL4-10 della proteina di fusione (frecce). In Figura 1B, un saggio di potenza rappresentativa in un sangue intero dosaggio di due lotti di proteina di fusione di IL4-10 diversi si vede. Un'inibizione dose-dipendente di rilascio LPS indotta TNFα è osservata, mostrando la bioattività comparabili per i due lotti di proteina di fusione IL4-10.
Successivamente, è riportato un esempio dei risultati di test di rappresentante esperimenti in cui la proteina di fusione di IL4-10 viene testata per inibire il dolore infiammatorio persistente (Figura 2). Persistente dolore infiammatorio è stata indotta tramite l'iniezione intraplantar del carrageenano 2%. Meccanico (Figura 2A) così come l'iperalgesia termica (Figura 2B) è stata seguita nel corso del tempo. Al giorno 6 dopo induzione di dolore infiammatorio, i topi sono stati iniettati per via intratecale con la proteina di fusione di IL4-10 o il veicolo come un controllo. IL4-10 significativamente risolto sia meccanica (Figura 2A) e iperalgesia termica (Figura 2B) e ha raggiunto il suo massimo effetto dopo 24 h dopo l'iniezione. Idealmente, l'efficacia della proteina di fusione nell'inibizione del dolore dovrebbe essere testato anche contro le concentrazioni equimolari di citochine individuali per verificare se la sua capacità di inibire il dolore è meglio che la somma delle singole citochine. Questi dati non vengono visualizzati qui, ma ci riferiamo a una recente pubblicazione che consente di visualizzare questo dati9.
L'efficacia della proteina di fusione IL4-10 è stato recentemente testato nel dolore infiammatorio indotto da CFA modello9. In questo esperimento, iniezioni multiple della proteina di fusione IL4-10 erano somministrato per via intratecale. Le iniezioni multiple completamente risolto CFA-persistente infiammatorio iperalgesia indotta, misurata utilizzando test di Hargreaves, che dimostra il potenziale della proteina di fusione IL4-10 come un trattamento analgesico9e von Frey. Qui indichiamo che iniezione intraplantar CFA inoltre ha indotto una riduzione in peso cuscinetto della zampa interessata (Figura 3A-B). Iniezione intratecale di proteina di fusione di IL4-10 al giorno 7 dopo l'iniezione intraplantar CFA ha attenuato la riduzione in peso cuscinetto della zampa colpita rispetto ai topi iniettati veicolo 2 giorni dopo la somministrazione di IL4-10 fusione della proteina (Figura 3B ).
Figura 1 : Purificazione e caratterizzazione della proteina di fusione di IL4-10. Analisi (A), macchiato di Coomassie SDS-PAGE delle frazioni di cromatografia di affinità: l: carico, FT: flusso attraverso, lavaggio w:, e: eluizione. (B) analisi funzionale: dose di proteine di fusione IL4-10 dipendente inibisce la produzione di TNFα in cultura di sangue intero stimolata LPS (espresso come percentuale inibizione rispetto alle culture stimolati con LPS da solo). I dati vengono rappresentati come media ± SD. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Inibizione di iperalgesia infiammatoria della proteina di fusione di IL4-10. Dolore infiammatorio è stata indotta tramite un'iniezione intraplantar di 20 µ l di carragenina 2% (auto). Sei giorni dopo l'iniezione intraplantar i topi hanno ricevuto un'iniezione intratecale (freccia) di 1 µ g proteina di fusione IL4-10 o veicolo (PBS). (A) meccanica ipersensibilità (soglia di 50% di registro (g)) è stata misurata nel tempo utilizzando test di Von Frey e (B) sensibilità termica (latenza (s)) è stata misurata utilizzando test di Hargreaves. Dati sono rappresentati come media ± SEM. asterischi rappresentano differenze significative analizzate mediante ANOVA a due vie, tra veicolo e IL4-10 iniettato animali. * *, * * * = p < 0.01 e p < 0,001, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Cambiamenti indotti da infiammazione in peso cuscinetto. Dolore infiammatorio è stata indotta tramite un'iniezione intraplantar di 20 µ l di adiuvante completo di Freud (CFA). Il carico su ogni zampa è stato misurato utilizzando il dispositivo di cuscinetto di peso dinamico. Cuscinetto di peso in grammi della zampa interessata (zampa posteriore ipsilateral) e il cuscinetto di peso totale delle zampe non interessato (zampe anteriori e zampa controlaterale) viene visualizzato, così come la riduzione di peso cuscinetto della zampa ipsilaterale rispetto per le altre 3 zampe. (A) corso del cuscinetto di peso durante l'infiammazione indotta da CFA (n = 10). (B) al giorno 7 dopo intraplantar CFA, i topi hanno ricevuto un'iniezione intratecale di 1 µ g IL4-10 proteina di fusione o di un veicolo (PBS). Cuscinetto di peso è stato misurato a 0 e 7 giorni dopo intraplantar CFA e 2 giorni dopo la somministrazione della proteina di fusione di IL4-10. Cuscinetto di peso della zampa ipsilaterale rispetto per le altre 3 zampe è rappresentato (n = 3-4). I dati vengono rappresentati come media ± SEM. * * * = p < 0,001; * * = p < 0.01; * = p < 0,05 rispetto alla baseline (giorno 0). # = p < 0,05 rispetto al veicolo trattato gli animali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo manoscritto descrive metodi per la produzione e la caratterizzazione di un recombinant della proteina di fusione di IL4-10 e i metodi per testare la sua efficacia nell'inibire la iperalgia infiammatoria in modelli murini di dolore infiammatorio persistente. La produzione e purificazione della proteina di fusione IL4-10 viene eseguita su piccola scala. Cellule HEK293 sono selezionate come un sistema di espressione per la produzione di proteine perché permettono modifiche post-traduzionali che non possono essere realizzate in sistemi di espressione procariotici. Modificazioni post-traduzionali sono rilevanti per la funzione della proteina, e l'assenza di tali modifiche potenzialmente poteva influenzare l'efficacia terapeutica della proteina di fusione IL4-10. La proteina è purificata da supernatante di coltura da cromatografia di affinità. Abbiamo scelto di utilizzare internamente fatto anticorpo monoclonale contro IL4 per purificazione di affinità e non per produrre una proteina di fusione di IL4-10 contenente un tag consentono di purificazione con un sistema di tag di affinità. La ragione di questo è stato per evitare possibilità di cambiamenti relativi tag nella piegatura della proteina e la funzione. Tuttavia, se è priva di un anticorpo monoclonale altamente selettivo, una proteina con un tag deve essere sviluppata, ad esempio un suo tag. In tal caso, sarà importante determinare se il C - o N-terminale della proteina è più adatto per il tag evitare di compromettere la funzione della proteina.
Da 1 L del surnatante HEK293, si ottiene circa 3 mg di proteina di fusione purificata IL4-10, ma questo può variare da lotto a lotto. La colonna per purificazione di affinità può essere utilizzata per diversi cicli di purificazione prima di gettare via. Il passo più sensibile nella procedura di purificazione è l'eluizione della proteina di fusione di IL4-10 dalla colonna di pH basso, perché il basso pH può indurre denaturazione proteica irreversibile e precipitazione della proteina. Così, il mantenimento della struttura della proteina nativa e l'assenza di aggregati di proteine è essenziale per i batch di buona qualità. A tal fine, valutazione di bioattività della proteina di fusione deve essere testata in vitro prima e dopo la purificazione con buffer di eluizione differenti. Dopo la purificazione della proteina di fusione IL4-10, la bioattività non è stato ridotto rispetto alla proteina non purificate. Inoltre, la formazione aggregata era assente quando è stato effettuato il passaggio di eluizione con tampone glicina 0.1 M (pH = 2.5), e il pH delle frazioni eluizione immediatamente è stato neutralizzato con tampone Tris 1 M (pH = 9).
La concentrazione di proteina di fusione purificata IL4-10 è stimata sulla base di risultati di IL10 ELISA umani. Analisi della proteina di BCA è usato per confermare le concentrazioni di proteina. Recupero della proteina dopo purificazione viene valutata basato sulle concentrazioni misurate in carico, il flusso attraverso, frazioni di lavaggio e di eluizione di IL10 ELISA. La determinazione di concentrazione nella proteina BCA della proteina di fusione di IL4-10 può essere valutata solo in frazioni di eluizione dializzati. Frazioni di eluizione dializzata non contengono imidazolo, un composto che influenza la valutazione di BCA. Le frazioni purificate non contengono altre proteine da terreno di coltura HEK293.
La determinazione di bioattività della proteina di fusione IL4-10 viene eseguita in un'analisi di sangue intero. La bioattività di proteina di fusione di IL4-10 dovrebbe essere valutata nell'intero sangue di donatori diversi per determinare se l'attività funzionale viene mantenuta. Diversi donatori sono necessari perché il donatore a donatore varianza esiste nella capacità di IL10 e IL4 di inibire il rilascio di LPS indotta TNFα. Inoltre, espressione di IL4R e IL10R può differire tra i donatori, che influenzano la capacità della proteina di fusione di IL4-10 per inibire la produzione LPS indotta TNFα.
Nei metodi descritti, abbiamo dettagliato 2 modelli murini di dolore infiammatorio persistente per valutare l'efficacia della proteina di fusione di IL4-10 a risolvere il dolore in vivo. Tuttavia, per una valutazione completa del potenziale analgesico di proteine di fusione ricombinante, le molecole devono essere testate in altri modelli di dolore cronico come bene. Questi modelli includono, ma non sono limitati a, modelli di lesione del nervo e dolore neuropatico indotta da chemioterapia9,22. Anche se il test di von Frey e Hargreaves test sono comunemente usati per testare i farmaci analgesici, è diventato chiaro che deve essere incluso un test aggiuntivo (ad es. test di cuscinetto di peso dinamico) per valutare gli effetti sul dolore evocato da non behaviorsand anche con il dosaggio di dolore dell'operatore (ad es. condizionata posto preferenza (CPP) che rilevano il dolore non-evocati comportamenti17,18). Per eseguire il CPP, l'insorgenza degli effetti d'inibizione dolore della proteina di fusione deve essere presi in considerazione, perché condizionata degli animali di dolore richiede analgesici ad azione rapida (che esercitano effetti in meno di 15 min). Tuttavia, se la sostanza in esame ha una lenta insorgenza analgesica, ma è probabile indurre inibizione del dolore di lunga durata (più di 4 giorni), CPP può ancora essere utilizzato per verificare se il composto ha inibito il dolore. In questo caso, perdita indotta da composto di condizionamento con analgesici ad azione rapida deve essere valutata.
Iniezioni intratecali sono selezionate come una via di somministrazione, come il composto raggiungerà dolore pertinenti settori quali i gangli spinali e il midollo spinale. In particolare, consegna intrathecal di farmaci analgesici è diventata pratica comune come trattamento di pazienti con dolore cronico, come questo approccio riduce la dose di farmaco analgesico necessario e diminuisce la tossicità e effetti collaterali sistemici. Tuttavia, questa via di somministrazione ha alcune limitazioni; richiede personale ben addestrato e, a causa del piccolo spazio subaracnoideo, il volume di iniezione deve essere limitato a 5 µ l in topi, che richiedono soluzioni altamente concentrate della proteina di fusione. La tecnica di iniezioni intratecali richiede formazione. Tale formazione può essere eseguita su non-recupero animali anestetizzati con iniezione di un colorante per verificare iniezione intratecale corretta.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Parte di questo lavoro è stato finanziato da un Utrecht University Life Sciences concedere
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FreeStyle 293-F cells | Invitrogen | R790-07 | Human embryonic kidney cells |
| GIBCO FreeStyle 293 Expression Medium | Life technologies | 12338018 | Culture medium |
| 293fectin Reagent | Invitrogen | 12347019 | Transfection reagent |
| GIBCO Opti-MEM + GlutaMAX | Life technologies | 51985026 | Reduced Serum Medium for use during cationic lipid transfections |
| GIBCO RPMI Medium 1640 (1x) | Life technologies | 52400-025 | |
| CNBr-Activated Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0430-01 | pre-activated media for coupling antibodies or other large proteins |
| Hydrochloric acid fuming 37% | Merck | 1003171000 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1kg | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 31437 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-500G | TRIS hydrochloride |
| Acetic Acid 100% | Merck | 1.00063.1000 | |
| Glycin-HCl | Sigma | G2879 | |
| PBS | Pharmacie, UMCU | Phosphate-Buffered Saline | |
| 10X TGS | BIO-RAD | 161-0772 | Tris/Glycine/SDS Buffer for SDS electrophoresis |
| Mini-PROTEAN TGX Gels | BIO-RAD | 456-1046 | 12% SDS precast gels |
| Trans-Blot Turbo Transfer Pack | BIO-RAD | 170-4157 | Western blot transfer packs |
| Yarra 3u SEC-2000 column | Phenomenex | ||
| InstantBlue Protein Stain | Expedeon | ISB1L | ready to use Coomassie protein stain for polyacrylamide gels |
| Human IL-10 DuoSet ELISA | R&D | DY217B | |
| Human TNFα ELISA Set | Diaclone | 851570020 | |
| BCA Pierce Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Carrageenan | Sigma-Aldrich | 22049 | plant mucopolysaccharide |
| CFA | Sigma-Aldrich | F5881 | vaccine adjuvant |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20779 | glass syringe |
| Animal Enclosure | IITC Life Science | 433 | Animal Enclosure |
| Von Frey mesh stand | IITC Life Science | 410 | Mesh Stand |
| von Frey hairs | Stoelting | 58011 | touch test sensory probes |
| Plantar Test (Hargreaves Method) | IITC Life Science | 390G | plantar test with heated glass |
| Dynamic Weight Bearing test | Bioseb | BIO-DWB-AUTO-M | postural deficit test |
| Glass Econo-Column Columns, 1.5 × 30 cm | BIO-RAD | 7371532 | glass chromatography column |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 88242 | |
| Minisart NML Syringe Filter | Sartorius | 16555-K | single use filter unit, 0.45 μM |
| CASY Cell Counter and Analyzer | Roche |
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