Summary
مختبر الإسكان تركواز killifish يمكن زيادتها إلى البيت ورفع كفاءة آلاف أسماك الفردية في نظام تنقية مياه مركزية، تستخدم نفس البنية الأساسية المستخدمة لمرافق الزرد القياسية. هنا نحن بالتفصيل قائمة بإجراءات موحدة تسمح killifish كفاءة الصيانة.
Abstract
تطوير ممارسات تربية الأسماك المختبر غير النموذجية المستخدمة لأغراض تجريبية قد استفاد كثيرا من إنشاء مرجع الأسماك نظم نموذجية، مثل الزرد والميداكا. في السنوات الأخيرة، اعتمد أسماك ناشئة – killifish الفيروز (فورزيري نوثوبرانتشيوس) – بعدد متزايد من المجموعات البحثية في المجالات البيولوجيا الشيخوخة والإيكولوجيا. مع فترة حياة الأسير من 4-8 شهور، هذه الأنواع هي فقاريات شورتيستليفيد التي أثيرت في الأسر ويسمح المجتمع العلمي للاختبار – في وقت قصير – التدخلات التجريبية التي يمكن أن تؤدي إلى تغييرات معدل الشيخوخة ومتوسط العمر المتوقع. نظراً لبيولوجيا فريدة من نوعها لهذه الأنواع، وتميزت ديبوس الجنينية، النضج الجنسي المتفجرة، تميز مظهري الجنسي المورفولوجية والسلوكية-وفترة حياتها قصيرة نسبيا الكبار-تربية المخصصة الممارسات في العاجلة الطلب. ويفيد هذا البروتوكول مجموعة من التدابير الرئيسية تربية تسمح killifish الفيروز الأمثل مختبر الرعاية، وتمكين المجتمع العلمي على اعتماد هذه الأنواع كنموذج حيوانات مختبرية قوية.
Introduction
نظراً لفترة قصيرة في الحياة ودورة الحياة السريع، تتزايد killifish الفيروز سريعاً ككائن نموذج جديد يبشر بالخير في البيولوجيا1،،من23. وتتميز هذه الأنواع بدوره الحياة فريدة من نوعها تيليوست، تتألف من ديبوس الجنينية، السريع النضج الجنسي، وحياة الأنثوية تمديد مرحلة4،5. العمل الأخيرة قد ساهم في توضيح البيولوجيا من هذا النوع في الأسر وفي البرية6،7. ويعيش killifish الفيروز في مسطحات المياه العذبة الموسمية هذا النموذج أثناء موسم الأمطار في السافانا الأفريقية في زيمبابوي وموزمبيق. خلال موسم الجفاف، الأجنة البقاء على قيد الحياة في الطين الجاف وفي غياب المياه بحكم مرحلة حياة مقاوم لإجهاد تسمى ديبوس.
الخرائط الوراثية لهذه الأنواع قد ولدت8،9، وعلى الجينوم في الآونة الأخيرة المتتابعة وتجميعها10،11. ووضعت العديد من السلالات السمكية مختبر الفطرية، وأصبحت متاحة في هذه الأنواع، الواقع تعزيز killifish الفيروز ككائن نموذج فقاريات مختبر تنافسية ترانسجينيسيس والجينوم التحرير عن طريق كريسبر/Cas9 1213،،14.
على الرغم من أن بروتوكول مختبر تم نشرة بالفعل لهذه الأنواع15، في هذا البروتوكول أننا وضع قائمة شاملة من المبادئ التوجيهية المختبرية التجريبية التي تستهدف على وجه التحديد الدراسات التحقيق في الشيخوخة والبقاء على قيد الحياة. ويتيح هذا البروتوكول الباحثين دراية الزرد والميداكا تربية تصبح على دراية بتربية killifish الفيروز باعتماد عدد أدنى من التعديلات الرئيسية. في الوقت نفسه، يوفر هذا البروتوكول الباحثين دون خبرة سابقة في مجال تربية الأسماك مع الأدوات الأساسية لرفع مستعمرة killifish الفيروز مزدهرة.
Protocol
تربى الأسماك في 28 درجة مئوية في نظام إعادة تدوير مياه (انظر المعلمات المياه)، مع تصريف المياه اليومية 10-20%. ويوصي بثلاثة أحجام مختلفة للدبابات: 0.8 L و 2.8 L 9.5 ل. ويتلقى كل صهريج تدفق مياه مستمر من 2 مل/ثانية.
1-إعداد الكواشف (غير المدرجة في المواد)
ملاحظة: يمكن توفير killifish الفيروز الأفريقية (فورزيري نوثوبرانتشيوس) من مختبرات المنشأة مخزون. يمكن شحن الأجنة killifish مقاومة للجفاف السنوي عن طريق البريد. من المهم أن السفينة الأجنة داخل نطاق درجة الحرارة 8-30 درجة مئوية.
- تحضير الأحماض الدبالية (الفقس) الحل بإذابة الأحماض الدبالية 1 غرام/لتر في نظام المياه. اﻷوتوكﻻف ومخزن عند 4 درجة مئوية لمدة 10 أسابيع.
- لإعداد تخصيب "الارتيميا هوفا"، إضافة هوفا تخصيب اليورانيوم إلى هاتشر الماء المالح الروبيان يوميا في تركيز 500 ميليلتر/لتر من الماء المالح الروبيان الحل.
- تحضير حل أزرق الميثيلين بإذابة 100 ميليلتر/لتر من الميثيلين الأزرق حل المخزون في النظام السابق يعقم المياه. منذ الميثيلين الأزرق حساسة للضوء، يبقى الحل في زجاجات داكنة، أو تغطية مع إحباط. مخزن في الرايت
- إعداد ألياف جوز الهند كركيزة صلبة لاحتضان الجنين. وبدلاً من ذلك، استخدم ورقة تصفية (انظر القسم 1، 5).
- بريسواك ألياف جوز الهند مع الماء المقطر. اﻷوتوكﻻف ومخزن عند 4 درجة مئوية لمدة 5 أسابيع.
- في يوم نقل الأجنة، تحضير طبق بيتري مع ألياف جوز الهند رطبة.
- ملء قطرها 90 ملم طبق بيتري مع ألياف جوز الهند تحت غطاء دخان بجوار لهب، للحد من التلوث بالبكتريا والخميرة.
- ضغط ألياف جوز الهند بارتفاع 1 سم، مع الأنسجة عقيمة. إزالة معظم الرطوبة من ألياف جوز الهند عن طريق الضغط على منشفة ورقية فوق اللوحة، ترك ورقة لامتصاص المياه الزائدة. الحرارة ملعقة معدنية على الشعلة، واضغط باستمرار على كامل السطح من ألياف جوز الهند. وهذا ما يمنع التلوث البكتيرية الفطرية/ألياف جوز الهند.
- إعداد ورقة تصفية كركيزة صلبة لاحتضان الجنين.
- في يوم نقل الأجنة، ضع 3 طبقات من ورق الترشيح الأقراص التي تناسب الطبق بيتري 90 ملم. إضافة 5 مل من محلول الأحماض الدبالية الاحتفاظ بالرطوبة.
2-تربية
-
تربية killifish الفيروز للحفاظ على السلالة
ملاحظة: بعد هذا البروتوكول، النضج الجنسي هو التوصل إلى ~ 4 أسابيع قمم بعد الفقس والخصوبة بين 7-9 أسابيع. من الأهمية بمكان أن نلاحظ أن الخصوبة يعتمد على التغذية وتواتر ونوعية الأغذية؛ ولذلك، يوصي اﻹطعام اثنين على الأقل يوميا لتربية الدبابات لرفع الغلة الأجنة (انظر القسم 5، 6).- إعداد خزان تربية ل 9.5. ملء مع نظام المياه وإضافة أحد الذكور والإناث اثنين من الأسماك.
- كما عرض killifish الفيروز الأفريقية الذكور هيمنة أثناء التزاوج، والتي قد تؤدي إلى التحرش بالإناث، اختر من الذكور مع حجم جسم أصغر قليلاً من الأنثى لتقليل الإجهاد التزاوج وزيادة الناتج الإنجابية. إعداد عمرها 5 أسبوع من الذكور مع الإناث 6/7 الأسبوع عمرها.
- ملء حاوية بلاستيكية (10 × 10 × 5 سم) مع الرمل يعقم الوصول إلى عمق نهائي ~ 2-3 سم ومكان مربع الرمل في وسط التفريخ.
- واسمحوا الفيروز killifish تتوالد باستمرار، وحصاد الأجنة مرة واحدة في أسبوع لاحتضان الجنين.
ملاحظة: استخدام الركيزة الرملية تفرض تحديات على أنظمة تنقية مركزية وينبغي الاستعاضة عن الأساليب البديلة في المستقبل. يمكن أن تكون البدائل الممكنة استخدام الزرد تربية الدبابات.
-
تربية ترانسجينيسيس
ملاحظة: الأجنة لاستخدامها للحقن تحتاج إلى مزامنة في مرحلة واحدة الخلية، وهذا يتطلب أن تكون جمعها مباشرة بعد التسميد.- لحصاد الأجنة مرحلة واحدة خلية لاستخدام الحقن وتوليد خطوط محوره وراثيا، إعداد التفريخ مع ذكر واحد واثنين من الأسماك الإناث (نفس 2.1.).
- يومين قبل جمع الأجنة، وعزل الذكور في دبابة فردية وتبقى الذكور في الاتصال البصري مع الكبار من الإناث.
- في يوم جمع، إضافة الذكر ومربع رمل للتفريخ والسماح لهم تفرخ ح 2.
3. تربية الجنين
-
جمع الجنين
ملاحظة: يتم جمع الجنين بالنخل وحصاد الأجنة من مربع الرمل. في ظل الظروف العادية، ينبغي أن يتضمن كل مربع الرمل من 30 إلى 200 من الأجنة.- في يوم جمع، إزالة مربع الرمل من التفريخ. إفراغ مربع الرمل في مصفاة (حجم السلالة مم ~0.9) وشطف مع نظام المياه. يمكن أن يتم ذلك عبر خزان كبير جمع الرمال للتعقيم.
- جزئيا تغرق في المصفاة في نظام المياه ودوامه بلطف، السماح للأجنة مجموعة معا في المركز.
- جمع الأجنة مع 10 مل ماصة باستور.
- نقل الأجنة إلى 90 مم طبق بيتري في ~ 40 مل من نظام المياه.
- فحص الأجنة في طبق بتري تحت ستيريوميكروسكوبي خفيفة وإزالة تلك التي عرضها تمزق المشيمة وعلامات على الضرر.
- متابعة مباشرة تبيض الجنين.
ملاحظة: استخدم دائماً مصفاة واحدة كل سلالة الأسماك منعا للتلوث عبر إجهاد الجنين المحتملة.
-
الجنين تبيض
ملاحظة: تبيض الجنين يمنع الكائنات المجهرية الموجودة في أحواض الأسماك من تلويث الإعلام الحضانة.- قبل التبييض، استخدام ماصة باستور المتاح لإزالة الماء النظام من طبق بتري يحتوي على الأجنة التي تم جمعها.
- لمنع نمو الفطريات والبكتيريا غير المرغوب فيها، إضافة 50 مل من الطازجة ح2س2 (1% v/v في نظام يعقم المياه) للأجنة التي تم جمعها.
- اهتز الأجنة لمدة 5 دقائق بسرعة منخفضة في أطباق بتري 90 ملم في حل 50 مل.
- إزالة ح2س2 الحل مع ماصة باستور المتاح وتغسل الأجنة ثلاث مرات لمدة 5 دقائق مع 50 مل من حل الميثيلين الأزرق. إزالة الحل الميثيلين الأزرق.
- إضافة 50 مل ح2س2 (1% v/v في نظام يعقم المياه) للأجنة ويهز لمدة 5 دقائق.
- إزالة ح2س2 الحل وتغسل ثلاث مرات لمدة 5 دقائق مع 50 مل أزرق الميثيلين الحل.
- تبني الأجنة عند 28 درجة مئوية لزيادة تطوير الأجنة متزامن، في أقصى كثافة الأجنة 100 الواحدة 90 مم طبق بيتري في 40 مل من محلول أزرق الميثيلين.
ملاحظة: لا تشمل حضانة الجنين في الحل تبيض. وهذا قد يسبب الضرر للمشيمة بيضة وزيادة وفيات الأجنة. تبيض الجنين يمكن أن تسبب التغيرات الفيزيائية-الكيميائية الرئيسية في المشيمة البيض الذي يمكن أن يسفر عن المشيمة غيرت علم وظائف الأعضاء والفقس النجاح.
-
حضانة الجنين الميثيلين الأزرق
ملاحظة: يمنع نمو الطفيليات حضانة السائل في محلول أزرق الميثيلين وتمكن من كشف أجنة ميتة والبيض المخصبة.- فحص الأجنة المحتضنة، إزالة أي أجنة ميتة (الملون أزرق بأزرق الميثيلين) من طبق بيتري للحيلولة دون تلوث الفطرية والبكتيرية التي تؤثر على بقاء الأجنة الحية صحية.
- إزالة الحل الميثيلين الأزرق القديم واستبدل بحل جديد.
- العودة طبق بيتري إلى حاضنة 28 درجة مئوية (الشكل 1A). في غضون 7-10 أيام، ضمان أن الأجنة المتقدمة تظهر العيون السوداء مرئية. نقل هذه الأجنة لألياف جوز الهند أو المتوسطة الركيزة الصلبة ورق الترشيح (الشكل 1B).
- الاحتفاظ بالأجنة غير مطورة باللون الأزرق الميثيلين ورصد يوميا ونقل إلى الركيزة الصلبة المتوسطة ذات مرة قد وضعت العيون السود.
- كرر الخطوات 3.3.1-3.3.3 يوميا حتى الأجنة قد تظهر العيون السود.
ملاحظة: التعرض المستمر للأجنة إلى أزرق الميثيلين قد تؤدي التغيرات الطويلة الأجل في فسيولوجيا الأسماك الكبار.
-
نقل الأجنة بورق الترشيح
ملاحظة: يمكن وضع الأجنة killifish الفيروز على الركازة جافة, حظيا الظروف الطبيعية. بالإضافة إلى ذلك، تمكن حضانة الجنين الجافة الباحثين مزامنة الأجنة والتظليل عليها في نفس اليوم.- كما سيكون لها الأجنة المتقدمة العيون السوداء مرئية في غضون 7-10 أيام، استخدام ماصة باستور المتاح أو ملاقط منحنى غرامة نقل الأجنة من محلول الميثيلين الأزرق على لوحة ورق الترشيح معدّة مسبقاً.
- انتشار الأجنة ~ 5 ملم بعيداً مع الملقط، ما يصل إلى 100 من أجنة كل لوح 90 ملم (الشكل 1B).
- ختم طبق بيتري مع بارافيلم.
- تبني الأجنة عند 28 درجة مئوية عن 2-3 أسابيع، حتى أنها وضعت تماما قزحيات الذهبي ومستعدون الفقس (الشكل 1).
ملاحظة: لا نطيل حضانة الأجنة جاهزة لفتحه لفترة أطول من أسبوعين كما سيتم خفض قابليتها جذريا.
-
نقل الأجنة إلى ألياف جوز الهند
ملاحظة: ألياف جوز الهند العقيمة، ويعقم (أو العضوية peat moss) يمكن استخدام كوسيلة بديلة صالحة لتفريخ الركيزة الصلبة.- استخدام ماصة باستور المتاح أو ملاقط المنحنية الجميلة لنقل الأجنة من محلول أزرق الميثيلين على صفيحة ألياف جوز الهند جاهزة للاستخدام.
- انتشار الأجنة ~ 5 مم عن بعضها البعض، ما يصل إلى 100 من أجنة كل لوح 90 ملم (الشكل 1B).
- ختم طبق بيتري مع بارافيلم.
- تبني الأجنة عند 28 درجة مئوية عن 2-3 أسابيع، حتى أنها وضعت تماما قزحيات الذهبي (على سبيل المثال في الشكل 1).
ملاحظة: للتخزين طويل الأجل (تصل إلى سنة)، نقل الأجنة في جمع بعد 3 أيام من حلول الميثيلين الأزرق إلى صفيحة الركيزة الصلبة في 17 درجة مئوية. تبني الأجنة حتى أنها تضع العيون السود.
4-الفقس Killifish الفيروز
ملاحظة: killifish الفيروز الأجنة يمكن أن يكون بنجاح تحاك في حل الأحماض الدبالية14.
- استخدام الملقط المنحنية الجميلة، نقل بدقة 50-100 وضع الأجنة داخل المربع الفقس مليئة بالحل الأحماض الدبالية في 4 درجات مئوية. الحل الأحماض الدبالية يتكون من الأحماض الدبالية 1 غرام/لتر في نظام المياه. اﻷوتوكﻻف ومخزن عند 4 درجة مئوية لمدة 10 أسابيع. تأكد من أن جميع الأجنة مغمورة تماما. يجب أن يكون الحل الأحماض الدبالية الضحلة، ولا أعمق من 2 سم.
ملاحظة: درجة حرارة منخفضة من حل الأحماض الدبالية يحسن الفقس والغمر الكامل للأجنة في الحل يسمح الفقس متزامنة. - ضع مربع الفقس إلى حاضنات تفريخ 28 درجة مئوية. تغطية مربع الفقس مع الغطاء. توفير تهوية كافية، توصيل مربع الفقس من الأنابيب مع العرض الجوي.
ملاحظة: التهوية غير كافية أثناء الاحتضان يؤدي إلى معدلات عالية من جمهورية يوغوسﻻفيا الاتحادية غير قادرة على ملء المثانة الغاز (النمط الظاهري "بطن-المنزلق"، راجع الملاحظة في مقطع 5.1) - اعتبارا من اليوم بعد الفقس، الحفاظ على جودة الماء الكافي في المربع الفقس، إضافة نظام يعقم الماء مرة واحدة في يوم بنسبة 1:1، الحفاظ على عمق 2 سم نهائي.
- نقل الأجنة لم يفقس إلى الركيزة الصلبة، ومحاولة الفقس بعد ذلك بأسبوع.
ملاحظة: عند الفقس، killifish الفيروز سهولة قادرة على امتصاص وتستهلك الغذاء الحي. للنمو الأمثل، وتغذية اليرقات مرتين في اليوم الواحد مع الزائدة فقست حديثا الماء المالح الروبيان (سالينا الارتيميا). هو علامة على شبع كامل البطن اللون البرتقالي من جمهورية يوغوسﻻفيا الاتحادية بعد 10-15 دقيقة لكل تغذية. سيفون بالجمبرى محلول ملحي الزائد والمأكولة ومتحللة باستخدام ماصة باستور على أساس يومي.
5-تربية الأسماك من الأحداث والبالغين
- في خمسة أيام بعد الفقس، نقل الأحداث إلى نظام إعادة دوران المياه. استخدام الماصات البلاستيك القابل للصرف (أو ملعقة بلاستيكية)، بعناية الأحداث نقل خمسة كل خزان 0.8 L مزودة بشاشة 400 ميكرون فراي (الشكل 2).
ملاحظة: من الممكن أن سوف لا تعبئة جزء من الأحداث killifish المثانة الغاز، ونتج عنه نموذجي "بطن-منزلق" النمط الظاهري، تتميز بالأسماك التوصل إلى ازدهار السليم، إجبارهم على السباحة باستمرار، ولا يسبب تشوهات شديدة في الأسماك الكبار. هذه الأسماك لا يمكن استخدامه لفحوصات البقاء على قيد الحياة، أو لتربية تتسم بالكفاءة، وتحتاج إلى أن يكون للرقابة. - تغذية الأحداث مرتين في اليوم الواحد مع الجمبري أجاج فقست حديثا في الزائدة حتى 14 يوما بعد الفقس. سيفون بالحطام من أسفل كل صهريج يوميا.
- في 14 يوما عمر، تجهيز نقل الأسماك إلى خزان ل 2.8 مع شاشة ميكرومتر 850 جمهورية يوغوسﻻفيا الاتحادية. من هذه النقطة فصاعدا، قم بتسمية كل صهريج مع معرف السمك، يشير إلى تاريخ هاتش، المعلومات السلالة والجنسين الأسماك والأسماك رقم تعريف (الشكل 3). لفحوصات البقاء على قيد الحياة، منزل على حدة كل الأسماك في دبابة واحدة من هذه النقطة فصاعدا.
- لمدة 7 أيام التالية، تغذية الأحداث مرتين في اليوم الواحد مع ~ 2 مل من محلول ملحي الجمبري كل الأسماك. وفي هذه المرحلة يمكن استكمال الأسماك مع ديدان الدم يعيش 1-3 (في حال يرقات دودة الدم كبيرة جداً بالنسبة الأسماك، ختم لهم إلى أجزاء أصغر مع شفرة حلاقة). لمنع تدهور نوعية المياه، سيفون الأغذية المأكولة ونفايات إضافية مرتين في الأسبوع.
- بعد 3 أسابيع من الفقس، إزالة الشاشة جمهورية يوغوسﻻفيا الاتحادية من الجزء الخلفي الدبابة والبدء في تغذية كل الأسماك مرتين يوميا ~ 2 مل من محلول ملحي الجمبري و 0.5 مل من دودة الدم. في هذه المرحلة، الأحداث ينبغي أن يكون التوصل إلى 1 سم في حجم الجسم، وينبغي أن تكون قادرة على تناول دودة الدم كاملة الحجم.
- في 4 أسابيع من العمر، تغذية كل الأسماك مرتين في اليوم الواحد مع ~ 2 مل من محلول ملحي الجمبري و 1 مل من دودة الدم. يمكن أن يكون إيواء الإناث شارك في كثافة الإناث تصل إلى 3 كل خزان ل 2.8.
- وفي هذه المرحلة ضمان أن تصل الأسماك إلى النضج الجنسي الكامل. التحقق من وجود الزعانف الظهرية والشرجية والذيلية كبيرة مع علامات التلون في الذكور وجولة البطن كاملة من البيض في الإناث.
ملاحظة: تربية الأسماك الكبار في صهاريج الفردية للدراسات الفوجية البقاء على قيد الحياة قد يؤثر سلبا على سلوك الأسماك والصحة. مع ذلك، يضيف مجموعة مساكن للدراسات الفوجية بقاء عوامل التباس بسبب إنشاء الهيمنة الاجتماعية والأقاليم الذكور، مما يؤدي إلى الهرمية الاجتماعية الصارمة.
6-التغذية
ملاحظة: يمكن تغذية killifish مختبر الفيروز مزيجاً من طفل الماء المالح الروبيان (سالينا الارتيميا النوبليوس) والدم دودة (اليرقاتChironomus spp. ). جمهورية يوغوسﻻفيا الاتحادية killifish الفيروز تتغذى حصرا الرضيع الماء المالح الروبيان. ويتم تغذية الأسماك من الأحداث والبالغين مرتين في يوم الماء المالح الروبيان والدم دودة (الشكل 2). ومن الناحية المثالية، يمكن تغذية الأسماك عدة مرات يوميا، يتجاوز اﻹطعام 2 المبينة في هذا البروتوكول.
-
استزراع الجمبري محلول ملحي
- إضافة 10 لتر مياه التناضح العكسي (RO) و 350 غ من ملح البحر الأحمر إلى هاتشر الماء المالح الروبيان وتذوب بتهوية مع أنبوب تهوية.
- إثراء الثقافة مع 5 مل الأحماض الدهنية غير المشبعة عالية (هوفا).
- إضافة 20 جرام من الجمبري أجاج الخراجات في الحل الفقس. فحص أن الخراجات الماء المالح الروبيان لا تطفو على سطح الماء والتأكد من الأوكسجين السليم وتعميم الثقافة.
ملاحظة: يمكن تخزين مختبرين اليومية الخراجات الجافة الماء المالح الروبيان في 4 درجات مئوية. - بعد ظهر اليوم التالي، توفير الثقافة مع قاسمة آخر 5 مل من هوفا.
-
حصاد مظلل الماء المالح الروبيان
ملاحظة: بعد ح ~ 36 من ثقافة الانطلاق، الماء المالح الروبيان جاهزة للحصاد (الطور الثاني المرحلة).- جمع 5 لتر للثقافة في حاوية استخدام برنامج المشورة التقنية في الجزء السفلي من هاتشر، والسماح للجلوس لمدة 10 دقائق.
- بعد 10 دقيقة، إزالة الماء المالح الروبيان قذائف (اللون البنى) من أعلى الحاوية 5 لتر وتصفية الجمبري أجاج مظلل (اللون البرتقالي) من خلال شبكة. إيلاء الاهتمام لاستبعاد الرواسب وجدت في الجزء السفلي من الحاوية كما أنه يحتوي على البيض غير دبرت والميت الماء المالح الروبيان.
- شطف مظلل الماء المالح الروبيان مع المياه RO في حاوية ل 2، والسماح للجلوس لمدة 10 دقائق.
- بعد 10 دقيقة، تصفية الماء المالح الروبيان مرة أخرى من خلال شبكة وجمع في 2 لتر مياه ريال عماني.
- كرر الخطوات الثلاث السابقة حتى يتحرر من قذائف الخراجات والماء المالح الروبيان غير دبرت حل الماء المالح الروبيان.
- نقل الماء المالح الروبيان من الحاوية 2 لتر في زجاجات الضغط للتغذية.
ملاحظة: استزراع الجمبري أجاج إلى حد ما قوية وموثوق بها. ومع ذلك، لتجنب النقص في الماء المالح الروبيان في حالة فشل الفقس، يمكن استخدام أصغر هاتشيرس النسخ الاحتياطي (500 مل).
-
إعداد هاتشر النسخ الاحتياطي
- حل 17.5 غرام ملح البحر الأحمر في 500 مل الماء RO بالتهوية.
- إثراء الثقافة مع 500 ميليلتر من هوفا.
- إضافة 2 غ من الجمبري أجاج الخراجات.
- بعد 18-24 ساعة، توفير ثقافة مرة أخرى مع 500 ميليلتر من هوفا.
ملاحظة: الماء المالح الروبيان جاهزة للحصاد بعد ~ 24 ساعة.
-
إعداد دودة الدم لايف
- فورا قبل اﻹطعام، تصفية مبلغ مناسب من دودة الدم من خلال مصفاة استخدام المياه ريال عماني.
ملاحظة: يمكن تخزين دودة الدم يعيش عند 4 درجة مئوية لمدة 7-10 أيام. - شطف دودة الدم مع كمية صغيرة من المياه RO في وعاء من بلاستيك.
- مع باستور بلاستيك يستغرق ماصة (إزالة تلميح الضيقة)، خليط دودة الدم للتغذية.
ملاحظة: تغذية killifish مختبر المستعمرات مع الغذاء الحي من المصادر التي تسيطر عليها الأمم المتحدة يضيف خطرا للتلوث الخارجي من الطفيليات والمجتمعات الميكروبية المسببة للأمراض المحتملة. في المستقبل، وينبغي تطوير أعلاف معقمة مخصصة.
- فورا قبل اﻹطعام، تصفية مبلغ مناسب من دودة الدم من خلال مصفاة استخدام المياه ريال عماني.
7-killifish المختبر سلالة التنميط
ملاحظة: للتمييز بين سلالات killifish الفيروز، كذلك لتحديد الجنس داخل كل سلالة، يمكن علامات وراثية محددة (ساتل) تستخدم9 (الجدول 1).
-
أخذ العينات
- عقد السمك بشكل أمن في شبكة على رأس اسفنجة مبللة.
- مسحه جداول 2-3 من جسم الأسماك من أوبيركولوم إلى fin والذيلية استخدام مسحات القطن.
- اختيار جداول من المسحة ونقل الجداول 2-3 في أنبوب 1 مل يحتوي على حل هيدروكسيد الصوديوم (200 ميليلتر 0.5 mol/L هيدروكسيد الصوديوم، 1% β-ميركابتوثانول، والبولي فينيل بولي 0.5%).
- تدور أنابيب PCR لمدة 15 ثانية للتأكد من أن جداول مغمورة تماما في حل هيدروكسيد الصوديوم.
-
عزل الحمض النووي الجينومي
- احتضان العينة لمدة 20 دقيقة عند 95 درجة مئوية.
- بارد في RT، وتحييد عينة بحجم 1/10 من 1 م تريس-HCl، pH 8.0.
- الطرد المركزي العينة لمدة 5 دقائق بأقصى سرعة.
8-المياه المعلمات
ملاحظة: يتطلب تربية الكائنات الحية التي الاستخدام المقصود هو phenotyping الكبار ظروف تربية عالية مستقرة طوال فترة الحياة للأنواع المستهدفة. ولذلك، استزراع الكائنات المائية، مثل killifish الفيروز، يستلزم رقابة صارمة على خواص المياه. إعادة تدوير المياه، مع الخطوات الأربع الإضافية تنقية المياه، ويضمن أساسا قويا لتحقيق السيطرة على المعلمات المياه، توفير جميع الدبابات بنفس الشروط المياه مع مرور الوقت. من المستحسن إعادة تشكيل نظام مياه التناضح العكسي (RO) المياه، ويضاف مع الملح البحري التجاري وبيكربونات الصوديوم.
- مخطط نظام تداول المياه: أولاً، خزانات مياه من الأسماك التدفقات من خلال تصفية المعادن الجسيمات الصلبة التي تلتقط جميع بقايا الطعام يؤكل الأمم المتحدة والجسيمات الأكبر حجماً. مرشحات معدنية هي تشطف ثلاث مرات في أسبوع؛ ثانيا، في بواليع كبيرة نقل الماء عقب الترشيح الميكانيكية الأولى، وثم ضخها إلى بيوفيلتير، حيث البكتيريا بتحويل الأمونيا إلى والنتريتات والنترات؛ ثالثا، من بيوفيلتير، يتم ضخ المياه إلى 25 ميكرون تصفية الأكمام، التي تعوض أدق حجم الجسيمات. وأخيراً، يتدفق الماء من خلال مصابيح الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) أن تعقيم المياه من البكتيريا والفيروسات. وبعد هذه الخطوات الأربع، إرجاع تصفية المياه للدبابات الأسماك.
- للحد من نمو الكائنات الدقيقة في الدبابات ومنع تراكم النترات وتقليل عموما التخلص من الملوحة، 10-20% الماء النظام على أساس يومي.
- الحفاظ على المياه درجة حرارة ثابتة عند 28 درجة مئوية، الماء pH ثابت داخل نطاق 7.0 إلى 7.5.
- على الرغم من أن killifish تتسامح مع طائفة واسعة من الملوحة، لتجنب أوودينوسيس، الحفاظ على التوصيل داخل نطاق 650-710 الصغرى-سيمنز. ويضمن دورة ضوء/الظلام مدته 12 ح مستعمرة الصحة والإنتاجية.
ملاحظة: يمكن أن يتسامح مع Killifish موصلية الماء ما يصل إلى 1500 الصغرى-سيمنز.
Representative Results
نتائج تربية سليمة killifish الفيروز في متوسط بقاء تتراوح ما بين 12-18 أسبوعا في سلالة جرز (مثل الشكل 4A). التغيرات في متوسط بقاء تعتمد على النظام الغذائي والتغذية التردد، ودرجة الحرارة ظروف السكن. نتائج تربية الفقراء في منحنيات البقاء على قيد الحياة تقديم زيادة الوفيات المبكرة وقطرات المفاجئة المتكررة، والبقاء على قيد الحياة طوال الوقت، تتميز بعدة نقاط الانعطاف (الشكل 4 باء).
رقم 1: مراحل النمو الجنينية الممثل مع الركازة الحضانة الخاصة بكل منها. (أ) طازجة جمع الأجنة، المحتضنة في محلول أزرق الميثيلين في الحاضنة عند 28 درجة مئوية. (ب) تصفية الأجنة جاهزة لنقلها إلى المتوسطة الصلبة، أما ألياف الورق أو جوز الهند. (ج) الأجنة جاهزة لتكون دبرت، عرض نموذجي قزحيات الذهبي. شريط مقياس يساوي إلى 1 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: مراحل الفيروز killifish بعد الفقس التنمية- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الأسماك الممثل معرف العلامة للأسماك من المرحلة 3 فصاعدا- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: منحنى بقاء الممثل ل 70 killifish الفيروز الذكور. (أ) منحنى بقاء نموذجية للمختبر آثار killifish الفيروز. (ب) الحصول على مقارنة منحنيات البقاء على قيد الحياة من الأسماك التي أثيرت في إطار ظروف تربية الأمثل (أسود) وتربية الفقراء (الأحمر والأزرق). خط أفقي متقطع أحمر يشير إلى 50 ٪ البقاء على قيد الحياة، منحنى بقاء المتقاطعة في متوسط العمر المتوقع (المشار إليها في المحور س). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| معرف | التمهيدي إلى الأمام | عكس التمهيدي | حجم مجموعة (bp) | ||
| * NfuSU0007 | جكتاجككتجكتجاكاجا | كاججاجكتجاااككتكاج | 166-214 | ||
| * NfuSU0010 | كجكاجتكتجاتكااتكجتجت | تجتتجاجتكاكاتكاتاتك | 220-272 | ||
| NfuSU0016 | كاتجكتااككجتجاتجا | جاجاكجككاجكتاتجاج | 209-240 | ||
| NfuSU0022 | آكاكاجكتكتكجتاجاجتا | تكاجاكتجتكتاكتاككاتجتت | 198-238 | ||
| NfuSU0027 | تككاجكتجاتكجتاتجا | آآكتكجاججتجكاتكتج | 164-226 | ||
| NfuSU0049 | كتجاكااجتجككاتكاك | كتكككاكاجتكككاااكات | 196-197 | ||
| NfuSU0050 | ككاجاتجاكاتاكتكاجاتكا | جكاجكتاجتتاتجاتاتكاكاتج | 252-295 | ||
| NfuSU0060 | كتاجككاكتككككتجتتا | ككجتكاكجاتجتجكتجاتاك | 216-248 | ||
| NfuFLI0030 | كاجاجكتااجككاجاكج | ججااكاتاججاككاك | 174-205 | ||
| * NfuFLI0091 | أكجكتجاكتكتاكككاجتك | كتجككتجكتاكتجاكاتج | 355-373 | ||
| *-الجنس علامات التصميم | |||||
الجدول 1: التنميط كبسولة تفجير لتحديد السلالة.
Discussion
يمكننا وصف بروتوكول لاستزراع المختبر من killifish الفيروز، بما في ذلك جمع الجنين، والحضانة، فضلا عن السكن الأسماك الكبار، والتربية، والتغذية. لدينا بروتوكول يستهدف على وجه التحديد إلى مختبرات أبحاث تركز على الأسماك الكبار، وبخاصة للدراسات التجريبية المتعلقة بالشيخوخة ومدى الحياة. ويمكن رفع killifish الفيروز على مرفق الزرد قياسية؛ ومع ذلك، تختلف جوانب هامة لتربية killifish الزرد معيار الرعاية16. وتشمل هذه التعديلات الانتقال المبكر من اتباع نظام غذائي فقط الماء المالح الروبيان بحمية تستكمل مع دودة الدم الغني بالبروتين، فضلا عن اتخاذ خطوات محددة في حضانة الجنين، تتكون من مرحلة الحضانة السائلة والجافة.
وتشمل الخطوات الحاسمة في إطار البروتوكول الأجنة الشحن داخل نطاق درجة الحرارة 8-30 درجة مئوية. في حالة تربية، الخصوبة يعتمد على التغذية وتواتر ونوعية الأغذية؛ ولذلك، نوصي اﻹطعام اثنين على الأقل يوميا لتربية الدبابات لرفع الغلة الأجنة (انظر الفرع 5.6.). أثناء تبيض الجنين، لا تمتد حضانة الجنين في الحل تبيض. وهذا قد يسبب الضرر للمشيمة بيضة ووفيات الأجنة زيادة. عند حضانة الأجنة مع أزرق الميثيلين، لا نطيل حضانة الأجنة جاهزة لفتحه لفترة أطول من أسبوعين كما سيتم خفض قابليتها جذريا. الفقس killifish الفيروز، يحسن درجة الحرارة منخفضة لحل الأحماض الدبالية الفقس والغمر الكامل للأجنة في الحل يسمح الفقس متزامنة. تهوية غير كافية خلال نتائج حضانة في المعدلات العالية لجمهورية يوغوسﻻفيا الاتحادية غير قادرة على ملء المثانة الغاز (النمط الظاهري "بطن-المنزلق"، انظر الملاحظات في المقطع 5.1).
يتضمن القيد للبروتوكول من أجل تربية استخدام الركيزة الرملية التي تطرح تحديات على مركزية نظم الترشيح وينبغي الاستعاضة عن الأساليب البديلة في المستقبل. يمكن أن تكون البدائل الممكنة استخدام الزرد تربية الدبابات. تبيض الجنين يمكن أن تسبب التغيرات الفيزيائية-الكيميائية الرئيسية في المشيمة البيض الذي يمكن أن يسفر عن المشيمة غيرت علم وظائف الأعضاء والفقس النجاح. التعرض المستمر للأجنة إلى أزرق الميثيلين قد تؤدي التغيرات الطويلة الأجل في فسيولوجيا الأسماك الكبار. تربية الأسماك الكبار في صهاريج الفردية للدراسات الفوجية البقاء على قيد الحياة قد تؤثر سلبا على سلوك الأسماك والصحة. مع ذلك، يضيف مجموعة مساكن للدراسات الفوجية بقاء عوامل التباس بسبب إنشاء الهيمنة الاجتماعية والأقاليم الذكور، مما يؤدي إلى الهرمية الاجتماعية الصارمة. ولذلك نحكم أن عزل الأسماك الذكور للدراسات البقاء على قيد الحياة حل وسط معقول. إضافة تغذية المستعمرات killifish المختبر مع الغذاء الحي من المصادر التي تسيطر عليها الأمم المتحدة خطر للتلوث الخارجي من الطفيليات والمجتمعات الميكروبية المسببة للأمراض المحتملة. في المستقبل، وينبغي تطوير أعلاف معقمة مخصصة.
إدخال تحسينات في المستقبل على هذا البروتوكول سيركز على نظام غذائي الخاضعة للمراقبة، وغير مباشر، الأمر الذي لا يزال يؤدي إلى استكمال النضج الجنسي في 3-4 أسابيع. وباختصار، يقدم لدينا بروتوكول الوصول إلى killifish الفيروز استزراع مختبر لمجتمع علمي على نطاق واسع.
Disclosures
كافة الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية وغير المالية.
Acknowledgments
نشكر سيليرينو أليساندرو، تايرون جندي، برونيه أن، شارب سابرينا، ميكي بأول، Keil سيمون، كيم Yumi، باتريك سميث، مطهر كاي وجميع الأعضاء في مختبر فالينزانو في معهد ماكس بلانك "علم الأحياء للشيخوخة" للإسهام في جوانب مختلفة بروتوكول تربية killifish الحالية على مر السنين.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Probe calibration buffer solution pH=7.0 | Roth | A518.1 | 1L buffer solution pH=7.0 to calibrate water system pH-electrode |
| Probe calibration buffer solution pH=4.0 | Roth | P712.1 | 1L buffer solution pH=4.0 to calibrate water system pH-electrode |
| Conductivity standard | VWR | 83607.260 | 500 mL Conductivity standard 1,413 uS/cm to calibrate water system conductivity-electrode |
| Easy Strips Test 6in1 | JBL | 2533900 | Test strips for determination chlorine values of system water |
| Ammonia Test | JBL | 2536500 | Test to determine ammonia content of system water |
| Red Sea Salt | Red Sea | 22 kg bucket | |
| Sodium hydrogen carbonate | VWR | 27780.360 | |
| Humic acid | Sigma- Aldrich | 53680-50G | |
| New HUFA Artemia enrichment | ZM Systems UK | 75g bottle | |
| Methylene blue | Roth | AE64.1 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma- Aldrich | 31642-1L | 30% (w/w) |
| Coconut fiber | Dragon | ZCS010 | |
| Whatman paper | GE healthcare | 3030-690 | |
| Ethanol pure | VWR | 20821.467 | 100% |
| Silica sand | local pet shop | ||
| Artemia Eggs Premium Grade | Sanders | ||
| Bloodworm | local distributor | Poseidon Aquakultur Germany | |
| dNTPs solution mix | Biolabs | N04472 | 10mM |
| Taq DNA polymerase | Invitrogen | 18038-042 | 5U/uL |
| PCR 10x Buffer | Invitrogen | 18038-042 | |
| MgCl2 | Invitrogen | 18038-042 | 50mM |
| NaOH | Sigma- Aldrich | S8045-500g | 50mM |
| Tris-HCl, pH=8.0 solution | Sigma- Aldrich | T2694-1L | 1M |
| HCl 37% | Sigma- Aldrich | H1758-500mL | |
| Fish tanks | Aquaneering | volume: 0.8L, 2.8L, 9.5L; equipped with baffles, fry mesh and lids | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-100 | model 5000 |
| Microbiological incubator | Thermo Scientific, Heratherm | 50125882 | model IMC18; for storage embryos in the liquid phase, set to t=27-28°C |
| Cooling Incubator | Binder | 9020-0209 | model KT115; for storage embryos in the solid phase, set to t=27-28°C |
| Hatching incubator | Thermo Scientific, Heratherm | 51028114 | model OGS180; for embryos hatching, set to t=27-28°C |
| Stereomicroscope | Leica | model M80 | |
| Breeding sand/hatching boxes | Roth | 1598.1 | 1000mL |
| Petri dish | Sarstedt | 82.1473 | 92x16mm |
| 50 mL Conical tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
| 15 mL Conical tube | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Disposable Plastic Pasteur pipette | Roth | EA71.1 | 2mL; For fish feeding with bloodworms, or embryos selection cut off the tip to open 3-4mm diameter |
| Serological pipette | Sarstedt | 86.1689.001 | 50mL |
| Syringe | Henke Sass Wolf | 4100-000V0 | 10mL |
| Metal strainer | fineness <1mm; for embryos collection | ||
| Tweezers | Dumont | 0508-5/45-PO | type5/45; for embryos transfer |
| 25 L Brine shrimp hatcher | Aquaneering | ZHBS25 | main hatcher |
| 500 mL Brine shrimp hatcher | JBL | 6106100 | model Artemio 1; backup hatcher |
| Narrow-mesh fish nets | JBL | ||
| Sand beaker | VWR | BURK7102-5000 | 5000mL |
| Brine shrimp separation beaker | VWR | BURK7102-2000 | 2000mL |
| Plastic zipper bag | Roth | P279.2 | for dead fish storage |
| Pipetboy | Integra | 155000 | model Pipetboy acu2 |
| Parafilm | P-Lab | P701605 | |
| Air tubing | www.zajac.de | AQ380 | 4-6 mm diameter |
| 1 L Glass bottle | VWR | 215-1595 | |
| 2 L Glass bottle | VWR | 215-1596 | |
| 500 mL Squeeze bottle | Roth | K665.1 | for fish feeding with brine shrimp |
| 120-μm brine shrimp strainer | Florida Aqua Farms | BB-PC2 | for brine shrimp/bloodworm collection |
| Finish filter socks | Aquaneering | MFVB025C | 25-μm |
| Central filtration fish housing system | Aquaneering, Techniplast, Aquatic Habitats, Aqua Schwarz |
References
- Valenzano, D. R., Aboobaker, A., Seluanov, A., Gorbunova, V. Non-canonical aging model systems and why we need them. EMBO J. 36 (8), 959-963 (2017).
- Harel, I., Brunet, A. The African Turquoise Killifish: A Model for Exploring Vertebrate Aging and Diseases in the Fast Lane. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 80, 275-279 (2015).
- Smith, P., et al. Regulation of life span by the gut microbiota in the short-lived African turquoise killifish. Elife. 6, (2017).
- Cellerino, A., Valenzano, D. R., Reichard, M. From the bush to the bench: the annual Nothobranchius fishes as a new model system in biology. Biol Rev Camb Philos Soc. 91 (2), 511-533 (2016).
- Kim, Y., Nam, H. G., Valenzano, D. R. The short-lived African turquoise killifish: an emerging experimental model for ageing. Dis Model Mech. 9 (2), 115-129 (2016).
- Blazek, R., et al. Repeated intraspecific divergence in life span and aging of African annual fishes along an aridity gradient. Evolution. 71 (2), 386-402 (2017).
- Terzibasi, E., et al. Large differences in aging phenotype between strains of the short-lived annual fish Nothobranchius furzeri. PLoS One. 3 (12), e3866 (2008).
- Kirschner, J., et al. Mapping of quantitative trait loci controlling lifespan in the short-lived fish Nothobranchius furzeri--a new vertebrate model for age research. Aging Cell. 11 (2), 252-261 (2012).
- Valenzano, D. R., et al. Mapping loci associated with tail color and sex determination in the short-lived fish Nothobranchius furzeri. Genetics. 183 (4), 1385-1395 (2009).
- Reichwald, K., et al. Insights into Sex Chromosome Evolution and Aging from the Genome of a Short-Lived Fish. Cell. 163 (6), 1527-1538 (2015).
- Valenzano, D. R., et al. The African Turquoise Killifish Genome Provides Insights into Evolution and Genetic Architecture of Lifespan. Cell. 163 (6), 1539-1554 (2015).
- Harel, I., et al. A platform for rapid exploration of aging and diseases in a naturally short-lived vertebrate. Cell. 160 (5), 1013-1026 (2015).
- Valenzano, D. R., Sharp, S., Brunet, A. Transposon-Mediated Transgenesis in the Short-Lived African Killifish Nothobranchius furzeri, a Vertebrate Model for Aging. G3. 1 (7), Bethesda. 531-538 (2011).
- Harel, I., Valenzano, D. R., Brunet, A. Efficient genome engineering approaches for the short-lived African turquoise killifish. Nat Protoc. 11 (10), 2010-2028 (2016).
- Polacik, M., Blazek, R., Reichard, M. Laboratory breeding of the short-lived annual killifish Nothobranchius furzeri. Nat Protoc. 11 (8), 1396-1413 (2016).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
